CN113862399B - 基于ddPCR的痘苗病毒lister株定量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于ddPCR的痘苗病毒lister株定量测定方法，属于PCR检测技术领域。本发明提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述方法为先提取样本中的病毒DNA，再以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用ddPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行定量分析；所述方法基于ddPCR，ddPCR可对核酸分子进行绝对定量且灵敏度高，同时，ddPCR无需标准品，变量少，准确度更高，检测下限更低，更适合拷贝数低的痘苗病毒lister株定量测定，因此，使用所述方法定量测定样本中痘苗病毒lister株具有灵敏度高、准确性高且检测下限低的优势。
Description
技术领域
本发明涉及基于ddPCR的痘苗病毒lister株定量测定方法，属于PCR检测技术领域。
背景技术
痘苗病毒(vaccinia virus)属痘病毒(Poxvirus)，在血清学和免疫学上与天花病毒及牛痘病毒有密切关系。过去，痘苗病毒一直被用作预防天花的疫苗。随着分子生物学的发展，人们又发现了它的新价值——基因工程的有利载体。
痘苗病毒的改造是在痘苗病毒lister株(野生型)的原始TK片段中，删除特异性片段并插入外源目的片段。痘苗病毒的TK基因编码胸苷激酶，在TK基因中删除特异性片段并插入外源目的片段的改造痘苗病毒毒力较痘苗病毒lister株明显下降，因此，改造痘苗病毒在作为基因工程的有利载体中极具应用前景。
为了更好的发挥其载体功能，在痘苗病毒的改造中尽可能的减少其痘苗病毒lister株含量十分关键，相应的，高灵敏度的检测改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株含量的方法必不可少。
目前，对于改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株含量的测定方法主要包括普通PCR或qPCR。其中，普通PCR检测灵敏度不够，无法定量，仅能定性检测改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株的含量，无法得知痘苗病毒lister株在改造痘苗病毒中的占比；qPCR虽然能定量检测，但检测下限较高，对于痘苗病毒lister株含量极少的情况下，不足以准确定量，影响实验结果，同时，qPCR的检测结果准确性依赖于标准品定量，标准品浓度的准确度、稀释标准品操作的正确性都影响qPCR结果的准确性。
因此，亟需找到灵敏度高、准确性高且检测下限低的定量测定改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株的原始TK片段中，删除特异性片段并插入目的片段获得的，所述方法包括如下步骤：
提取步骤：提取样本中的病毒DNA；
检测步骤：以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用ddPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行定量分析，得到样本中痘苗病毒lister株的绝对浓度；
所述ddPCR采用的上游引物和下游引物能够特异性扩增原始TK片段以及删除特异性片段并插入目的片段后的TK片段。
在本发明的一种实施方式中，所述特异性片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
在本发明的一种实施方式中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
在本发明的一种实施方式中，所述ddPCR的反应体系包含ddPCR Supermix forprobes 11μL、浓度100nM的上游引物0.198μL、浓度100nM的下游引物0.198μL、浓度5μM的探针0.55μL、浓度100μM的Template 9.9μL以及H2O0.154μL。
在本发明的一种实施方式中，所述原始TK片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
在本发明的一种实施方式中，所述痘苗病毒lister株全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1。
本发明还提供了一种用于定量测定样本中痘苗病毒lister株的试剂盒，所述试剂盒的成分包含探针、上游引物以及下游引物；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
在本发明的一种实施方式中，所述上游引物和下游引物的浓度为100nM。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含ddPCR Supermix forprobes。
本发明还提供了上述方法或上述试剂盒在痘苗病毒lister株定量测定中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述方法为先提取样本中的病毒DNA，再以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用ddPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行定量分析，得到样本中痘苗病毒lister株的绝对浓度；所述方法基于ddPCR，ddPCR可对核酸分子进行绝对定量且灵敏度高，同时，ddPCR无需标准品，变量少，准确度更高，检测下限更低，更适合拷贝数低的痘苗病毒lister株定量测定，因此，使用所述方法定量测定样本中痘苗病毒lister株具有灵敏度高、准确性高且检测下限低的优势。
进一步地，所述方法使用的ddPCR反应体系包含ddPCR Supermix for probes 11μL、浓度100nM的上游引物0.198μL、浓度100nM的下游引物0.198μL、探针0.55μL、Template9.9μL以及H2O 0.154μL；优化反应体系，采用更高浓度的引物，可在有限的体系中扩大模板量，构建更适合改造痘苗病毒lister株检测的体系，提高痘苗病毒lister株检测的灵敏度和准确性，更有利于对改造痘苗病毒的工艺开发。
附图说明
图1：样本中痘苗病毒lister株含量的普通PCR检测结果。
图2：实施例1的标准曲线。
图3：对比例3的标准曲线。
图4：对比例4的标准曲线。
图5：对比例5的标准曲线。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法(ddPCR)
本实施例提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株(全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1)的原始TK片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)中，删除特异性片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)并插入目的片段获得的，具体步骤如下：
提取步骤：使用病毒DNA提取试剂盒提取改造痘苗病毒中的病毒DNA，每次使用100μL病毒进行提取，50μL elution buffer洗脱；
检测步骤：以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用ddPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行定量分析，得到样本中痘苗病毒lister株的绝对浓度；
ddPCR采用核苷酸序列为SEQ ID NO:2的上游引物以及核苷酸序列为SEQ ID NO:3的下游引物；
ddPCR采用的反应体系包含ddPCR Supermix for probes 11μL、浓度100nM的上游引物0.198μL、浓度100nM的下游引物0.198μL、浓度5μM的探针0.55μL、浓度100μM的Template 9.9μL以及H2O 0.154μL；
ddPCR的具体过程如下：采用QX200TMAutoDGTMDroplet DigitalTMPCR仪，配制22μL反应体系(2μL损耗)；将22μL反应体系加入到96孔板中，以一列8个孔为单位，如果不足8个样品时用稀释一倍的22μL 1×buffer control补足，注意不要引入气泡。将膜有红线标记的一面(反光亮面)朝上置于96孔板上并固定好，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，180℃，5s。样品96孔板放入Automated Droplet Generator相应位置，取新的96孔板，放在冰盒上，一起放置于Automated Droplet Generator相应位置，用于接收生成的微滴。Start Run后，开始生成微滴，微滴生成结束后，将盛有微滴的96孔板从冰盒上取下，再次封膜。封好膜之后在30分钟内进行PCR反应，或放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，反应程序见表1；将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件，读取数据，校正，保存。
上述方法中，QX200TMAutoDGTMDroplet DigitalTMPCR仪购自伯乐公司，病毒DNA提取试剂盒购自赛默飞公司，引物和探针由金斯瑞公司合成，ddPCR Supermix for probes购自伯乐公司。
表1 ddPCR的反应程序
对比例1：一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法(普通PCR)
本对比例提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株(全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1)的原始TK片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)中，删除特异性片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)并插入目的片段获得的，具体步骤如下：
提取步骤：使用病毒DNA提取试剂盒提取改造痘苗病毒中的病毒DNA，每次使用100μL病毒进行提取，50μL elution buffer洗脱；
检测步骤：以提取得到的病毒DNA作为模板，使用普通PCR对样本中的痘苗病毒lister株进行分析；
普通PCR采用核苷酸序列为SEQ ID NO:5的上游引物以及核苷酸序列为SEQ IDNO:6的下游引物；
普通PCR的反应体系见表2，反应程序见表3；上样电泳，120V，30min；电泳完毕在紫外灯下观察，拍照。
表2普通PCR的反应体系
| 试剂 | 使用量(μL) |
| PrimeSTAR Max Premix(2×) | 10 |
| 上游引物，0.5μM | 0.5 |
| 下游引物，0.5μM | 0.5 |
| Template，100μM | 1 |
| H2O | 8 |
表3 ddPCR的反应程序
| Temp(℃) | Time |
| 98 | 10min |
| 98 | 30s |
| 58 | 5s |
| 72 | 1min |
| 72 | 10min |
对比例2：一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法(qPCR)
本对比例提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株(全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1)的原始TK片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)中，删除特异性片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)并插入目的片段获得的，具体步骤如下：
提取步骤：使用病毒DNA提取试剂盒提取改造痘苗病毒中的病毒DNA，每次使用100μL病毒进行提取，50μL elution buffer洗脱；
检测步骤：以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用qPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行分析，得到样本中痘苗病毒lister株的绝对浓度；
qPCR采用核苷酸序列为SEQ ID NO:2的上游引物以及核苷酸序列为SEQ ID NO:3的下游引物；
qPCR的反应体系见表4，反应程序见表5；qPCR的标准品为含有原始TK片段的质粒，按基因拷贝数公式计算，用水梯度稀释成106、105、104、103、102、101倍；基因拷贝数公式如下：
表4 qPCR的反应体系
| 试剂 | 使用量(μL) |
| Taqman Universal PCR Master Mix | 15 |
| 上游引物，0.5μM | 0.375 |
| 下游引物，0.5μM | 0.375 |
| 探针，5μM | 0.75 |
| Template，100μM | 10 |
| H2O | 3.5 |
表5 qPCR的反应程序
对比例3：一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法(ddPCR)
本对比例提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株(全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1)的原始TK片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)中，删除特异性片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)并插入目的片段获得的，所述方法与实施例1相比，区别在于：
ddPCR采用的反应体系包含ddPCR Supermix for probes 11μL、浓度10nM的上游引物1.98μL、浓度10nM的下游引物1.98μL、浓度5μM的探针0.55μL、浓度100μM的Template1.1μL以及H2O 5.39μL。
对比例4：一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法(ddPCR)
本对比例提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株(全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1)的原始TK片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)中，删除特异性片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)并插入目的片段获得的，所述方法与实施例1相比，区别在于：
ddPCR采用的反应体系包含ddPCR Supermix for probes 11μL、浓度100nM的上游引物0.198μL、浓度100nM的下游引物0.198μL、浓度10μM的探针0.25μL、浓度100μM的Template 9.9μL以及H2O 0.454μL。
对比例5：一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法(ddPCR)
本对比例提供了一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株(全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1)的原始TK片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)中，删除特异性片段(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)并插入目的片段获得的，所述方法与实施例1相比，区别在于：
ddPCR采用的反应体系包含ddPCR Supermix for probes 11μL、浓度50nM的上游引物0.396μL、浓度50nM的下游引物0.396μL、浓度5μM的探针0.55μL、浓度100μM的Template5.5μL以及H2O 4.16μL。
实验例1：改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株的定量测定
本实验例提供了改造痘苗病毒中痘苗病毒lister株的定量测定实验，实验过程如下：
分别使用实施例1和对比例1～5的方法对改造痘苗病毒(改造痘苗病毒由东曜药业有限公司合成，痘苗病毒lister株全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1，目的片段为依次串联的GM-CSF序列和HSP-70序列，其中，GM-CSF序列的Genebank号为：MA883124.1，HSP-70序列的Genebank号为：AX811495.1)中的痘苗病毒lister株进行测定。
对比例1(普通PCR)的实验结果见图1。qPCR读值单位为copies/reaction，模板量10μL，提取病毒DNA用量100μL病毒，50μL elution buffer洗脱，即最终计算值为读值×50copies/mL，对比例2(qPCR)的实验结果见表6～8。ddPCR读值单位为copies/μL，每次反应量copies/reaction＝copies/20μL＝20*copies/μL，模板量9μL，提取病毒DNA用量100μL病毒，50μL elution buffer洗脱，即最终计算值为读值×20×55copies/mL，实施例1以及对比例3～5(ddPCR)的实验结果见表6～8和图2～5。
如图1和表7所示，改造病毒无494bp的TK基因条带，但仅凭肉眼无法确定是否完全没有野生型毒株。比较普通PCR和qPCR的实验结果，普通PCR未检测出野生型条带，但qPCR有数据检出，即普通PCR检测痘苗病毒野生型不够准确。
如图2和表6～8所示，qPCR拷贝数为10尚可检出，但拷贝数为1及以下时无法检出。比较qPCR和ddPCR的实验结果，qPCR中，检测样品拷贝数低于标准品下限(10拷贝数)，会导致检测结果不准确，低于1个拷贝数无法检出，改造痘苗病毒中野生型拷贝数低于qPCR下限，无法检出，而ddPCR可以检出低于1拷贝数的样品，且各拷贝数下的检测结果皆十分准确(标准曲线相对偏差小)。
如图2～5和表6所示，比较对比例3～5和实施例1的实验结果，对比例3～5的检测结果准确度差于实施例1(对比例3～5测得结果的相对偏差高于实施例1测得结果的相对偏差)。
表6改造痘苗病毒的qPCR与ddPCR检测结果对比
表7改造痘苗病毒的qPCR检测结果
| Sample | 读值Copies/reaction | 实际值(×50)Copies/mL |
| Sample | 14.52 | 7.26*10^2 |
表8改造痘苗病毒的qPCR与ddPCR检测结果对比
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 东曜药业有限公司
<120> 基于ddPCR的痘苗病毒lister株定量测定方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaggacagtt ctttccagac attgtt 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acagatttct ccgtgatagg tatcg 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 534
<212> DNA
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atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
ttggaagcaa ctaaactatg tgatgtcttg gaattaatta cagatttctc cgtgataggt 240
atcgatgaag gacagttctt tccagacatt gttgaattct gtgagcgtat ggcaaacgaa 300
ggaaaaatag ttatagtagc cgcactcgat gggacatttc aacgtaaacc gtttaataat 360
attttgaatc ttattccatt atctgaaatg gtggtaaaac taactgctgt gtgtatgaaa 420
tgctttaagg aggcttcctt ttctaaacga ttgggtgagg aaaccgagat agaaataata 480
ggaggtaatg atatgtatca atcggtgtgt agaaagtgtt acatcgactc ataa 534
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgataatcgg ccccatgttt 20
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttctacaca ccgattgata catatcat 28
Claims (3)
1.一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述样本为改造痘苗病毒，所述改造痘苗病毒是通过在痘苗病毒lister株的原始TK片段中，删除特异性片段并插入目的片段获得的，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
提取步骤：使用病毒DNA提取试剂盒提取改造痘苗病毒中的病毒DNA，每次使用100μL病毒进行提取，50μL elution buffer洗脱；
检测步骤：以特异性片段作为探针，以提取得到的病毒DNA作为模板，使用ddPCR对样本中的痘苗病毒lister株进行定量分析，得到样本中痘苗病毒lister株的绝对浓度；
所述ddPCR采用的上游引物和下游引物能够特异性扩增原始TK片段以及删除特异性片段并插入目的片段后的TK片段；
所述痘苗病毒lister株全基因组序列的Genbank号为：KX061501.1，所述原始TK片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，所述特异性片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，所述目的片段为依次串联的GM-CSF序列和HSP-70序列，其中，GM-CSF序列的Genebank号为：MA883124.1，HSP-70序列的Genebank号为：AX811495.1；
所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:3；
所述ddPCR的反应体系包含ddPCR Supermix for probes 11μL、浓度100nM的上游引物0.198μL、浓度100nM的下游引物0.198μL、浓度5μM的探针0.55μL、浓度100μM的Template9.9μL以及H2O 0.154μL；
所述ddPCR的反应程序如表1所示；
表1ddPCR的反应程序
。
2.一种定量测定样本中痘苗病毒lister株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于权利要求1的定量测定样本中痘苗病毒lister株的方法，所述试剂盒的成分包含ddPCRSupermix for probes、浓度5μM的探针、浓度100nM的上游引物、浓度100nM的下游引物以及H2O；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
3.权利要求1所述的方法或权利要求2所述的试剂盒在痘苗病毒lister株定量测定中的应用，其特征在于，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
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| CN105255840A (zh) * | 2015-10-16 | 2016-01-20 | 西安医学院 | 通过去除显性表位b8r重组痘苗病毒的方法及其病毒 |
| CN108842003A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-20 | 中国农业科学院特产研究所 | 用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒及应用 |
| JP2020108358A (ja) * | 2019-01-07 | 2020-07-16 | 株式会社リコー | 標的対象を高感度に検出するための方法 |
| CN113215317A (zh) * | 2021-05-17 | 2021-08-06 | 广州悦洋生物技术有限公司 | 牛结节性皮肤病病毒野毒株的微滴数字pcr检测引物、探针、试剂盒及其应用 |
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2021
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Also Published As
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