CN112126697B

CN112126697B - 根癌农杆菌的微滴数字pcr检测引物探针组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112126697B
Application number: CN202011056966.9A
Authority: CN
Inventors: 武瑶; 王莉; 苏鸓; 崔璇; 王忠勤
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112126697A

Abstract

本发明涉及根癌农杆菌检测技术领域，具体涉及根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物探针组、试剂盒及其应用。本发明提供根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物探针组，其包括序列如SEQ ID NO.2‑3所示的引物对和序列如SEQ ID NO.4所示的探针。本发明根据根癌农杆菌Ti质粒上的VirD2基因序列设计特异性引物和荧光探针，该引物和探针具有较高的特异性，扩增的线性相关良好，灵敏度高，可应用于实际植物样本的定量检测，准确性高，为植物冠瘿病的早期发现、预防和治疗提供高效的绝对定量检测方法，具有重要的应用价值。

Description

根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物探针组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及根癌农杆菌检测技术领域，具体涉及根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物探针组、试剂盒及其应用。

背景技术

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种植物病原细菌，属于革兰氏阴性菌，寄主范围广泛，包括绝大多数的双子叶植物和少数的单子叶植物。根癌农杆菌侵染可引起植物的冠瘿病，严重时导致植物死亡(Pacurar,D.I.；Thordal-Christensen H.；Pacurar M.L.；Pamfil, D.；Botez,C.；Bellini,C.；Agrobacterium tumefaciens:Fromcrown gall tumors to genetic transformation.Physiological and Molecular PlantPathology.2011,76(2),76-81)。

根癌农杆菌含有一个200-250kb的Ti质粒，在侵染致病过程中起到决定性的作用(Gordon,Jay E.；Christie,Peter J.The Agrobacterium Ti Plasmids.MicrobiolSpectr.2014,2(6),1-29)。Ti质粒上的一段 T-DNA序列所携带的致瘤相关基因可以被任何外源基因所替代转入到宿主细胞中，因此根癌农杆菌作为植物转基因的重要工具菌被广泛应用(McCullen,Colleen A.；Binns,Andrew N.Agrobacterium tumefaciens and PlantCell Interactions and Activities Required for Interkingdom MacromolecularTransfer.Annual Review of Cell and Developmental Biology.2006,22,101-127)。

Ti质粒中T-DNA区和毒性区域Vir区(Virulence region)是和T-DNA 转移直接相关的区域。Vir基因包括VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、 VirF、VirG、VirH，编码约25个毒性蛋白(Shinji Yamamoto；Katsunori Suzuki.Development of a reinforced Ti-evictionplasmid useful for construction of Ti plasmid-free Agrobacteriumstrains.Journal of Microbiological Methods.2012,89,53-56)。根癌农杆菌在侵染植物过程中Vir基因不整合到植物基因组，但毒性蛋白VirD2发挥关键作用 (Padavannil,A.；Jobichen,C.；Qinghua,Y.；Seetharaman,J.； Velazquez-Campoy,A.；Yang,L.；Shen Q.P.；Sivaraman,J.Dimerization of VirD2 Binding Protein Is Essential forAgrobacterium Induced Tumor Formation in Plants.PLOS Pathogens.2014,10,e1003948)。目前已有利用实时荧光定量PCR检测根癌农杆菌的方法，该方法的缺点是需要建立标准曲线、依赖Ct值判断结果、检测的特异性和灵敏度差等(Voegel Tanja；NelsonLouise.Quantification of Agrobacterium vitis from Grapevine Nursery Stock andVineyard Soil using Droplet Digital PCR. Plant Disease.2018,102,2136-2141)。

微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是第三代PCR技术，是一种可实现绝对定量的PCR。ddPCR通过油包水微滴化处理PCR体系，PCR扩增后利用荧光检测通道检测每个孔中的阳性和阴性微滴数，利用泊松原理计算，直接得到模板的拷贝数。目前该技术已在微生物检测、转基因植物检测、疾病诊断、食品安全等方面发挥重要作用 (Hindson,B.J.；Ness,K.D.；Masquelier,D.A.；Belgraderet P.；et al. High-Throughput DropletDigital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.AnalyticalChemistry.2011,83,8604-8610)。但目前尚没有关于根癌农杆菌的微滴数字PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物探针组和试剂盒，本发明的另一目的是提供该引物探针组、试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明针对根癌农杆菌VirD2基因设计用于微滴数字PCR检测的引物和探针。本发明通过对VirD2基因的序列和结构进行分析，确定了在不同根癌农杆菌中高度保守且具有根癌农杆菌种特异性的检测靶区域，并针对该靶区域设计引物和探针。与普通 PCR的引物和探针相比，微滴数字PCR对于引物和探针的特异性要求更高，ddPCR扩增片段长度一般在100-200bp之间，扩增片段要求具有最小二级结构，同时还需避免引物自身、引物和探针、引物之间形成3个以上的连续配对以及避免引物自身形成环状发卡结构等。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物探针组，包括序列如SEQ IDNO.2-3所示的引物对和序列如SEQ ID NO.4所示的探针。

以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为例，其 Ti质粒上的VirD2基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

以上引物对和探针的序列具体如下：

VirD2 Forward：5’-CGGGACCTCAGTCAATCGTTC-3’(SEQ ID NO.2)；

VirD2 Reserve：5’-AGGAAGTCTCAATCCCGAAATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

VirD2 Probe：5’-AACCATCCGCGTCCAAAATCCCT-3’(SEQ ID NO.4)。

以上所述的探针的5’端荧光基团标记，3’端采用淬灭基团标记， 5’端标记的荧光基团可选自FAM、VIC、HEX、CY5、TET、JOE、 CY3、TAMRA、ROX中的任一种，3’端标记的淬灭基团可选自BHQ1、 BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

作为本发明的优选方案，以上所述的探针的5’端采用FAM荧光基团标记，3’端采用BHQ1淬灭基团标记。

本发明提供所述引物探针组在制备用于检测根癌农杆菌的试剂盒中的应用。

本发明还提供包含序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物探针组的试剂盒。该试剂盒为基于微滴数字PCR的根癌农杆菌检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括选自PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、 dNTP、微滴发生油、阳性标准品和阴性标准品中的一种或多种。

以上所述的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP可单独包装，或混合后已预混液的形式提供。

以上所述的阳性标准品可为含有根癌农杆菌的VirD2基因的质粒，例如：将VirD2基因与T载体连接得到的重组质粒VirD2-T。

以上所述的阴性标准品可为无核酸酶超纯水。

本发明还提供所述引物探针组或包含所述引物探针组的试剂盒在检测根癌农杆菌中的应用。

本发明还提供所述引物探针组或包含所述引物探针组的试剂盒在植物冠瘿病检测或转基因植物检测中的应用。

本发明提供一种根癌农杆菌的检测方法，其为以植物基因组DNA 为模板，利用序列如SEQ ID NO.2-3所示的引物对和序列如SEQ ID NO.4所示的探针进行微滴数字PCR扩增。

具体地，所述微滴数字PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性 5-10min；95℃变性25-35s，55-56℃退火40-50s，72℃延伸25-35s，共 35-45个循环；98℃固化微滴6-12min。

优选的微滴数字PCR扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55.7℃退火45s，72℃延伸30s，共40个循环；98℃固化微滴 10min。

具体地，所述微滴数字PCR扩增的反应体系中，所述引物对的浓度为0.45-0.75μM，所述探针的浓度为0.15-0.25μM。

优选的微滴数字PCR扩增的20μL反应体系为：2×ddPCR supermix for probes 10μL，DNA模板1μL，上下游引物(10μmol/L)

各1.5μL，探针(10μmol/L)0.4μL，ddH₂O 5.6μL。

以上所述的方法中，根据阳性微滴数量判断是植物是否被根癌农杆菌侵染或根癌农杆菌侵染的拷贝数。

具体地，本发明提供根癌农杆菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以提取的基因组DNA为模板，配制包含SEQ ID NO.2-3所示的引物对和SEQ IDNO.4所示的探针的反应体系；

(3)利用微滴发生卡将步骤(2)的反应体系制备为微滴，将制备好的微滴转入PCR板中进行PCR扩增反应；

(4)完成扩增反应后，将PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，经检测数据分析获得检测结果。

上述步骤(3)中，微滴的制备方法为：将步骤(2)中的20μL 反应体系与70μL微滴发生油在微滴发生卡上制备为油包水微滴体系。

上述步骤(4)中，若出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，则将该反应孔记为阳性扩增孔，表明待测样品基因组中携带根癌农杆菌。

本发明的有益效果在于：本发明根据根癌农杆菌Ti质粒上的 VirD2基因序列设计特异性引物和荧光探针，通过对引物和探针以及反应体系和反应条件的优化，建立了可对根癌农杆菌实现准确定量的微滴数字PCR检测方法。本发明的引物和探针与发根农杆菌K599、苜蓿根瘤菌Rm1021、大豆根瘤菌USDA 207、USDA257、水稻白叶枯病菌Xoo、野油菜黄单胞菌Xcc 33913、野油菜黄单胞菌Xcc 8004均无交叉反应，具有良好的特异性；而且扩增的线性相关良好(R²＝0.9993)；灵敏度达到75copies/μL，是实时荧光PCR(qPCR)的两倍。经实验验证，本发明的根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物和探针以及检测方法可应用于实际植物样本的检测，准确定量核酸拷贝，结果准确可靠，为植物冠瘿病的早期发现、预防和治疗提供高效的绝对定量检测方法，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中筛选第二组和第三组引物和探针的 ddPCR结果图，图中A05-H05是使用第二组引物和探针的扩增结果， A06-H06是使用第三组引物和探针的扩增结果；A05-H05、A06-H06 分别使用的质粒模板是1.5×10⁶copies/μL、7.5×10⁵copies/μL、1.5×10⁵ copies/μL、7.5×10⁴copies/μL、1.5×10⁴copies/μL、1.5×10³copies/μL、 1.5×10²copies/μL。

图2为本发明实施例3中ddPCR退火温度优化结果图，退火温度从左到右依次设为65℃、63.8℃、62℃、59.1℃、55.7℃、52.9℃、51.0℃、 50.0℃。

图3为本发明实施例4中实时荧光PCR扩增VirD2的曲线图，1、2、 3、4、5、6、7、8采用的阳性标准品浓度分别为:1.5×10⁹copies/μL,1.5 ×10⁸copies/μL,1.5×10⁷copies/μL,1.5×10⁶copies/μL,1.5×10⁵ copies/μL,1.5×10⁴copies/μL,1.5×10³copies/μL和1.5×10²copies/μL。

图4为本发明实施例4中ddPCR扩增不同浓度阳性标准品模板的微滴散点图，从左到右的阳性标准品拷贝数依次为1.5×10⁵copies/μL、 3.75×10⁴copies/μL、1.5×10⁴copies/μL、7.5×10³copies/μL、1.5×10³ copies/μL、7.5×10²copies/μL，7.5×10¹copies/μL，阴性对照NTC。

图5为本发明实施例4中ddPCR和qPCR方法检测根癌农杆菌的标准曲线，其中，A为ddPCR的标准曲线，B为qPCR的标准曲线。

图6为本发明实施例5中ddPCR检测根癌农杆菌的特异性分析结果，从左到右依次为根癌农杆菌LBA4404、苜蓿根瘤菌Rm1021、大豆根瘤菌USDA207、大豆根瘤菌USDA257、水稻白叶枯病菌Xoo、野油菜黄单胞菌Xcc 33913、野油菜黄单胞菌Xcc 8004、发根农杆菌K599、阴性对照。

图7为本发明实施例6中实际植物样本的ddPCR检测结果，其中， A和B分别是两批不同的植物样本，A是一批植物样本，从左至右分别是两份甘蓝，两份烟草和两份苜蓿样本以及ddH₂O阴性对照的扩增结果；B是另一批植物样本，从左至右分别是两份甘蓝，两份烟草和两份苜蓿样本以及ddH₂O阴性对照的扩增结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的试剂、耗材及仪器，如无特殊说明，均可从商业途径购买。其中，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，2×Real Star Probe FastMixture购自Genstar公司，数字PCR 扩增试剂2×Supermix、微滴生成油、微滴发生卡、密封垫等购自美国Bio-Rad公司。Phusion High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶购自美国thermo公司、多功能DNA纯化回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司、M5 HiperpTOPO-Blunt Cloning Kit购自北京聚合美生物科技有限公司、高纯度质粒小量快速提取试剂盒购自博迈德生物技术有限公司。实时荧光定量PCR仪CFX96 TM、微滴式数字PCR仪QX200、普通PCR仪T100TM均购自美国Bio-Rad公司、超微量分光光度计Nanodrop 1000购自美国thermo公司。

以下实施例中所用的菌株包括根癌农杆菌LBA4404、苜蓿根瘤菌Rm1021、大豆根瘤菌USDA207、大豆根瘤菌USDA257、水稻白叶枯病菌Xoo、野油菜黄单胞菌Xcc 33913、野油菜黄单胞菌Xcc 8004、发根农杆菌K599。植物材料包括甘蓝、烟草、苜蓿。菌株(除发根农杆菌外)及植物材料均由植物基因组学国家重点实验室提供，发根农杆菌K599由农科院作物研究所周美亮课题组提供。

实施例1根癌农杆菌微滴数字PCR检测引物和探针的设计和筛选

本发明针对根癌农杆菌VirD2基因设计用于微滴数字PCR检测的引物和探针。首先对根癌农杆菌VirD2基因的序列和结构进行分析(根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404的Ti质粒上的VirD2 基因的序列如SEQ ID NO.1所示)，确定了在不同根癌农杆菌中高度保守且具有根癌农杆菌种特异性的检测靶区域，并针对该靶区域设计引物和探针。

为实现特异、灵敏的微滴数字PCR检测，本发明同时设计了多对候选引物和探针，并对其进行了实验验证和筛选，以下为本发明设计的候选引物和探针中的部分举例和效果说明。

(1)第一组

VirD2 Forward：CAACCCGACATGACAAACAACC(SEQ ID NO.7)；

VirD2 Reserve:GCGACATAGGAAGTCTCAATCCC(SEQ ID NO.8)；

VirD2 Probe:AACCATCCGCGTCCAAAATCCCT(SEQ ID NO.9)。

(2)第二组

VirD2 Forward：5’-CGGGACCTCAGTCAATCGTTC-3’(SEQ ID NO.2)；

VirD2 Reserve：5’-AGGAAGTCTCAATCCCGAAATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

VirD2 Probe：5’-AACCATCCGCGTCCAAAATCCCT-3’(SEQ ID NO.4)。

(3)第三组

VirD2 Forward：5’-CATTTCGATCGGACCCATCTA-3’(SEQ ID NO.10)；

VirD2 Reserve：5’-AGGAAGTCTCAATCCCGAAATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

VirD2 Probe：5’-AACCATCCGCGTCCAAAATCCCT-3’(SEQ ID NO.4)。

其中，第三组的反向引物和探针与第二组相同。

使用第一组的引物和探针进行qRT-PCR检测，结果显示，阴性对照也有明显干扰，说明引物和探针可能存在结合。而第二组和第三组引物和探针进行qRT-PCR实验时，阴性对照没有明显干扰。进一步采用ddPCR方法在相同条件下比较以不同质粒浓度和阴性对照为模板的扩增结果，如图1所示，A05-H05是采用第二组引物和探针的扩增结果、A06-H06采用第三组引物和探针的扩增结果，对比H05和H06 阴性对照孔的微滴结果，H05的阴性对照的微滴数更少，结果更优。

经筛选和验证，本发明最终确定的检测效果最佳的特异性引物和探针为第二组，具体序列如下：

VirD2 Forward：5’-CGGGACCTCAGTCAATCGTTC-3’(SEQ ID NO.2)；

VirD2 Reserve：5’-AGGAAGTCTCAATCCCGAAATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

VirD2 Probe：5’-AACCATCCGCGTCCAAAATCCCT-3’(SEQ ID NO.4)。

其中，探针VirD2 Probe的5’端采用FAM荧光基团标记，3’端采用BHQ1淬灭基团标记。

实施例2阳性标准品的制备

以VirD2-F、VirD2-R为扩增引物，采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶试剂盒对提取的根癌农杆菌LBA4404的基因组 DNA进行PCR扩增。VirD2基因的目标序列全长为1275bp，将目标长度的PCR产物胶回收并与载体M5 Hiper pTOPO-Blunt载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板进行筛选，挑取菌落划平板，同时进行菌落PCR鉴定。将筛选的阳性重组菌株提取质粒VirD2-T进行测序验证，测序正确的重组质粒作为阳性标准品。

将阳性标准品利用超微量分光光度计nanodrop进行定量检测，计算出拷贝数后进行10倍比梯度稀释，-20℃保存备用。

VirD2-F(含ECORI)：GAATTCATGCCCGATCGCGCTCAAG (SEQ ID NO.5)；

VirD2-R(含XbaI)：TCTAGACTAGGTCCCCCCGCGCCCA(SEQ ID NO.6)。

实施例3根癌农杆菌ddPCR的反应条件优化和方法建立

ddPCR的反应条件中，退火温度是重要的关键参数。因此，本发明针对退火温度进行优化。

以3.0×10⁴copies/μL的阳性标准品为模板，采用VirD2 Forward (SEQ IDNO.2)、VirD2 Reserve(SEQ ID NO.3)和探针VirD2 Probe (SEQ ID NO.4)进行退火温度优化实验。将退火温度分别设为65℃、 63.8℃、62℃、59.1℃、55.7℃、52.9℃、51.0℃、50.0℃。根据生成的有效微滴数以及荧光信号差异情况来确定最佳退火温度。

ddPCR的反应体系为：2×ddPCR supermix for probes 10μL，模板 1μL，引物(10μmol/L)3μL，探针(10μmol/L)0.4μL，ddH₂O 5.6μL。

ddPCR的退火温度优化实验结果如图2所示，根据生成的有效微滴数以及荧光信号强弱确定55.7℃为最佳退火温度。

最终确定的ddPCR的最佳反应程序为：95℃10min；95℃30s， 55.7℃45s，72℃30s，40个循环；98℃10min。经过优化的ddPCR反应条件对VirD2的扩增结果较好，阴阳性微滴分界清晰。

当以不同浓度的阳性标准品为模板时，随着模板浓度降低，阳性微滴的数量随着减少(图4)。由图2和图4可知，以上建立的ddPCR反应条件适合用于绝对定量分析。

实施例4根癌农杆菌ddPCR检测标准曲线的建立和灵敏度分析

对阳性标准品进行梯度稀释，分别得到拷贝数依次为1.5×10⁵ copies/μL、3.75×10⁴copies/μL、1.5×10⁴copies/μL、7.5×10³copies/μL、 1.5×10³copies/μL、7.5×10²copies/μL、7.5×10¹copies/μL的阳性标准品，分别以不同浓度的阳性标准品为模板，利用实施例3确定的最佳的ddPCR反应条件进行扩增。

作为对照，以上述不同浓度的阳性标准品为模板进行qPCR扩增。

利用引物VirD2 Forward(SEQ ID NO.2)、VirD2 Reserve(SEQ ID NO.3)和探针VirD2 Probe(SEQ ID NO.4)建立实时荧光qPCR方法。

qPCR的10μL反应体系为：2×RealStar Probe Fast Mixture 5μL；上下游引物(10μmol/L)各0.5μL；探针(10μmol/L)0.2μL；模板1μL； ddH₂O 2.8μL。

qPCR的反应程序为：95℃10min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

将1.5×10⁹copies/μL质粒标准品VirD2-T进行10倍比例连续稀释，各浓度模板加入1μL到荧光定量PCR反应体系中，每个浓度做三次重复，得到荧光定量PCR扩增曲线如图3所示，qPCR的标准曲线如图5 的B所示，结果表明该方法可检测到1.5×10²copies/μL的质粒。

不同浓度的阳性标准品ddPCR扩增的微滴散点图如图4所示。 ddPCR的标准曲线如图5的A所示，ddPCR的R²值为0.9993，斜率为 0.9643，最低检测限为75copies/μL的VirD2-T，拷贝数均值约为 3.2copies/μL；qPCR的R²值为0.993，斜率为-4.3046，最低检测限为150copies/μL的VirD2-T。结果表明，ddPCR和qPCR均有较好的线性关系， ddPCR的最低检测限低于qPCR。

实施例5根癌农杆菌ddPCR检测的特异性分析

提取8个植物病原菌：根癌农杆菌LBA4404、苜蓿根瘤菌Rm1021、大豆根瘤菌USDA207、大豆根瘤菌USDA257、水稻白叶枯病菌Xoo、野油菜黄单胞菌Xcc 33913、野油菜黄单胞菌Xcc 8004、发根农杆菌 K599菌的基因组DNA。将提取到的核酸稀释至10ng/μL，分别取1μL 作为模板，利用实施例3确定的ddPCR反应体系和反应条件进行扩增，验证ddPCR的特异性。

结果如图6所示，仅根癌农杆菌LBA4404有明显的阳性液滴，其他核酸均为阴性液滴，且无交叉反应，说明本发明的ddPCR方法的特异性良好。

实施例6利用ddPCR检测实际植物样本

利用实施例3建立的ddPCR方法，对收集的植物材料甘蓝、烟草、苜蓿DNA样本(甘蓝、烟草和苜蓿各4份，共12份)进行检测，各样本均采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)提取基因组DNA。

结果如图7所示，12份样本中有1份为根癌农杆菌侵染的烟草植物，侵染的拷贝数为2288copies/μL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 根癌农杆菌的微滴数字PCR检测引物探针组、试剂盒及其应用

<130> KHP201115873.8

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcccgatc gcgctcaagt aatcattcgc attgtgccag gaggtggaac caagaccctt 60

cagcagataa tcaatcagtt ggagtacctg tcccgtaagg gaaagctgga actgcagcgt 120

tcagcccggc atctcgatat tcccgttccg ccggatcaaa tccgtgagct tgcccaaagc 180

tgggttacgg aggccgggat ttatgacgaa agtcagtcag acgatgatag gcaacaagac 240

ttaacaacac acattattgt aagcttcccc gcaggtaccg accaaaccgc agcttatgaa 300

gccagccggg aatgggcagc cgagatgttt gggtcaggat acgggggtgg ccgctataac 360

tatctgacag cctaccacgt cgaccgcgat catccacatt tacatgtcgt ggtcaatcgt 420

cgggaacttc tggggcacgg gtggctgaaa atatccaggc gccatcccca gctgaattat 480

gacggcttac ggaaaaagat ggcagagatt tcacttcgtc acggcatagt cctggatgcg 540

acttcgcgag cagaaagggg aatagcagag cgaccaatca catatgctga acatcgccgc 600

cttgagcgga tgcaggctca aaagattcaa ttcgaagata cagattttga tgagacctcg 660

cctgaggaag atcgtcggga cctcagtcaa tcgttcgatc catttcgatc ggacccatct 720

accggcgaac cggaccgtgc aacccgacat gacaaacaac cgcttgaaca gcacgcccgt 780

ttccaggagt ccgccggctc cagcatcaaa gccgacgcac ggatccgcgt atcattggag 840

agcgagcgga gtgcccaacc atccgcgtcc aaaatccctg taattgggca tttcgggatt 900

gagacttcct atgtcgctga agccagcgtg cgcaaacgaa gcggcatttt cggtacttct 960

cgcccggtga ctgacgttgc catgcacaca gtcaagcgcc agcagcgatc aaaacgacgt 1020

aatgacgagg aggcaggtcc gagcggagca aaccgtaaag gattgaaggc tgcgcaagtt 1080

gattccgagg caaatgtcgg tgagcaagac actcgcgatg acagcaacaa ggcggctgat 1140

ccggtgtctg cttccatcgg taccgagcaa ccggaagctt ctccaaagcg tccgcgtgac 1200

cgtcacgatg gagaattggg tggacgcaaa cgtgcaagag gtaatcgtcg cgacgatggg 1260

cgcgggggga cctag 1275

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggacctca gtcaatcgtt c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggaagtctc aatcccgaaa tgc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaccatccgc gtccaaaatc cct 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcatgc ccgatcgcgc tcaag 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctagactag gtccccccgc gccca 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacccgaca tgacaaacaa cc 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgacatagg aagtctcaat ccc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaccatccgc gtccaaaatc cct 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catttcgatc ggacccatct a 21

Claims

1.一种根癌农杆菌的检测方法，其特征在于，以植物基因组DNA为模板，利用序列如SEQID NO.2-3所示的引物对和序列如SEQ ID NO.4所示的探针进行微滴数字PCR扩增；

所述微滴数字PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5-10min；95℃变性25-35s，55-56℃退火40-50s，72℃延伸25-35s，共35-45个循环；98℃固化微滴6-12min；

所述引物对的浓度为0.45-0.75μM，所述探针的浓度为0.15-0.25μM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针的5’端采用FAM荧光基团标记，3’端采用BHQ1淬灭基团标记。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，根据阳性微滴的数量判断植物是否被根癌农杆菌侵染或根癌农杆菌侵染的拷贝数。