KR102027157B1 - 장관병원성 대장균 (Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)과 장관조직 침입성 대장균 (Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC) screening이 가능한 검출용 primer 및 PNA probe와 이를 이용한 대장균 Real-time multiplex PCR 검출 방법 - Google Patents

장관병원성 대장균 (Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)과 장관조직 침입성 대장균 (Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC) screening이 가능한 검출용 primer 및 PNA probe와 이를 이용한 대장균 Real-time multiplex PCR 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 검체시료의 핵산을 추출하고 Real-Time PCR을 이용해서 증폭하고 이 증폭된 표적핵산이 형광물질이 포함된 PNA 프로브와 혼성화를 이룸으로 인해 발생하는 형광신호를 온도별로 분석하여, 장관병원성 대장균(EPEC)과 장관조직 침입성 대장균(EIEC)의 특이적인 유전자마커와 동일한 염기서열이 나타남을 확인하여 상기 병원성 대장균을 동시에 그리고 신속하게 검출할 수 있게 하는 검출용 조성물, 키트 및 검출방법이 기재된다.

Description

장관병원성 대장균 (Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)과 장관조직 침입성 대장균 (Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC) screening이 가능한 검출용 primer 및 PNA probe와 이를 이용한 대장균 Real-time multiplex PCR 검출 방법{Screening method of Enteropathogenic Escherichia coli and Enteroinvasive Escherichia coli associated gastrointestinal infection by PNA based real-time PCR}
본 발명은 대장균 검출용 유전자 마커를 이용한 장관병원성 대장균 (Enteropathogenic Escherichia coli)과 장관조직침입성 대장균 (Enteroinvasive Escherichia coli)을 검출하는 검출용 조성물, 키트 및 그 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 병원성 대장균 의심환자의 검체 시료로부터 Real-Time PCR을 이용하여 장관병원성 대장균과 장관조직 침입성 대장균을 검출하고자 함이다.
보다 자세하게는, 장관감염증 관련 병원체인 대장균이 가진 병원성 유전자를 특이적으로 검출할 수 있도록 증폭시킬 수 있는 primer를 이용하여 대장균 유전자를 증폭시킨다. 이후 얻게 된 증폭산물을 상기 병원체별 특이적으로 인식하는 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)과 온도 조절을 통한 혼성화과정을 통해 온도별 융해곡선을 획득한다. 상기 획득한 융해곡선을 이용하여 해당 검체에서 상기 병원성 대장균을 특이적으로 검출할 수 있다.
추가적으로, 본 발명에서는 상기 질병의 특성상 신속한 검출이 필요한바, 기존의 PCR 수행시 검출시간을 단축할 수 있는 Fast PCR 조건을 제시하여 질병 확산 방지에 도움을 줄 수 있다.
대장균(Escherichia coli)은 Salmonella spp. 혹은 Vibrio spp.와 함께 장염을 유발하는 박테리아로 설사, 발열, 구토, 복통 등의 증상을 나타내며 전 연령층에서 발생할 수 있는 대표적인 장관감염증 원인균으로 알려져 있다. 대장균의 경우 정상적인 면역 시스템을 가진 사람의 장내세균으로 이미 자리 잡고 있으나, 병원성 대장균은 질병을 일으킬 수 있는 병원성 독소 유전자 혹은 침습성 유전자를 가지거나 외부에서 침입하게 되었을 경우 사람에게 질병을 발생시킬 수 있다. 이런 병원성 대장균은 오염된 토양, 수질 환경, 식자재, 그리고 조리환경 등을 통해 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 또한, 통상의 조건 하에서 이러한 대장균의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 균이라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 이러한 상황에서 병원성 대장균에 감염된 경우, 적절한 처방 및 치료를 위해서는 일반적인 장내세균과 병원성 대장균이 가진 독소 유전자의 구분이 가능한 검출 키트가 필수적이다.
장관감염증을 유발시키는 병원성 대장균에 감염된 경우, 적절한 치료를 위해 항생제를 처방해야 하므로, 비병원성 대장균과 병원성 대장균이 구분하여 진단이 가능한 적절한 screening 방법으로 이루어져야 할 것이다. 전통적으로 이루어지던 배지검출방법은 병원성 대장균과 비병원성 대장균의 구분이 모호하여 독성테스트가 이루어져야만 했고, 이는 숙련된 전문가에 의해 비교적 많은 시간이 소모되어야 알 수 있었다. 전염성이 높은 병원체에 대해서는 신속한 검출과 초동대응이 중요한 만큼, 전통적인 방법은 부합하지 않는 면이 다소 많았다. 최근 병원체를 진단하기 위한 방법으로 다양한 분자진단 방법이 개발되었고, 일반적으로 혈청학적 방법(ELISA) 혹은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, PCR)법을 이용하는 것이다. 혈청학적 방법은 효소 결합 면역흡수 검정법(Enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)으로 항원 항체 반응을 이용한 검출 방법으로, ELISA는 일반적으로 PCR방법보다 검출 빈도가 낮고 분석시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 전통적인 중합효소 연쇄반응(PCR)은 병원성 대장균의 특이적인 유전자부위를 증폭하여 전기영동으로 size를 확인하며, 확인이 명확하지 않은 경우(gray zone)는 증폭된 PCR 산물을 sequencing 분석을 진행하여 확인하는 검증단계를 거쳐야 한다. 이러한 검증은 분석 절차가 추가되며 많은 시간과 인력을 추가적으로 소모하는 문제점을 가지고 있어 병원균의 빠른 진단으로 신속한 약제 처방이 필요한 질병의 경우 일반적인 혈청학적 방법 또는 전통적인 PCR 방법의 적용은 많은 단점을 불러올 수 있다.
이러한 검출 시간 및 낮은 민감도와 같은 단점을 보완하기 위해 최근 새로운 분자진단 방법으로 real-time PCR이 점차 도입되어 많은 분야에서 적용되고 있는 시점에서 병원성 대장균을 검출하기 위한 진단 방법에도 이러한 기술이 적용되어야 한다. 이러한 기술적 발전에 근거하여 본 개발자들은 검출하고자 하는 병원성 대장균의 검출용 유전자 마커를 새롭게 발굴하고, 상기 유전자 마커에 특이적인 펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA) 및 프라이머를 이용하여 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 나타내게 함으로써 병원성 대장균을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기의 목적에 따라서 장관병원성 대장균(EPEC)과 장관조직 침입성 대장균(EIEC)을 검출하기 위한 방법을 제시하고, 상기 병원성 대장균을 검출함에 있어서 필요한 유전자마커, 형광측정용 PNA 프로브, 증폭용 프라이머세트 및 이들을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출용 조성물과 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명은 상기의 프라이머 및 PNA 프로브를 포함하며 real-time PCR 및 fast real-time PCR이 가능한 각각의 키트를 개발하여 현장에서 최적으로 필요한 방법으로 적용시킬 수 있는 방법을 각각 제공하는 데 있다.
따라서, 본 발명의 최종목적은 병원성 대장균 중에서 서로 다른 병증을 보이는 장관병원성 대장균(EPEC)와 장관조직 침입성 대장균(EIEC)를 신속하게 구분·검출하여 즉각적인 대응과 적절한 치료와 예방할 수 있게 하고자 함이다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명의 개시내용에 따르면,
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머세트; 및
서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머세트;
를 포함하는 프라이머 조성물을 제공된다.
또한, 본 발명의 개시내용에 따르면,
(a) 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13 중 적어도 하나의 염기서열을 포함하는 장관병원성 대장균(EPEC) 특이적 검출용 PNA 프로브와
(b) 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16 중 적어도 하나의 염기서열을 포함하는 장관조직 침입성 대장균(EIEC) 특이적 검출용 PNA 프로브를 제공된다.
또한, 본 발명의 개시내용에 따르면,
상기 프라이머 조성물에 상기 (a) 및 (b)의 PNA 프로브 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장관병원성 대장균(EPEC) 및 장관조직 침입성 대장균(EIEC)을 특이적으로 검출할 수 있는 검출용 조성물과 키트가 제공된다.
또한, 본 발명의 개시내용에 따르면,
상기 프라이머 조성물과 상기 PNA 프로브를 사용하여 장관병원성 대장균(EPEC) 및 장관조직 침입성 대장균(EIEC)을 특이적으로 검출할 수 있는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명의 개시내용에 따르면,
상기 검출방법으로는 Real-time PCR을 이용하여 실시간으로 분석할 수 있는 방법과 보다 신속한 검출을 위해 Fast PCR 조건이 제공된다.
본 발명은 병원성 대장균 검출용 유전자를 선별하고, 선별된 유전자에 특이적인 증폭용 프라이머 및 상보적인 PNA 프로브를 사용하여 장관병원성 대장균(EPEC) 및 장관조직 침입성 대장균(EIEC)을 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 검출함으로써, 장관감염증 병원체 중 가장 보편적으로 발견되고 있는 상기 병원성 대장균의 감염 및 확산을 조기에 차단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 hybridization로 작동하는 PNA probe가 Cycle threshold(Ct) 와 Melt curve를 나타내는 개념도이다. 이 하이브리드 형성체에 온도를 상승시키면 하이브리드 해리작용이 발생하여 형광의 시그널 변동이 발생하며 온도(Tm)의 변화에 따른 형광변동값을 분석하여 나타낸다.
도 2는 PNA probe에 의해 Melt peak Tm이 발생되는 방법을 나타내는 개념도이다.
도 3은 병원성 대장균 strain들의 유전자를 분석 및 계통수를 구축하여 병원성 대장균별 group화를 표현한 것이다..
도 4a 및 도 4b는 병원성 대장균 strain들의 유전자를 분석하여 확인한 특이적인 프라이머 및 PNA probe의 위치를 표시한 것이다.
도 5는 병원성 대장균 strain들의 유전자를 분석하여 확인한 병원성 대장균별 PNA 프로브 정보를 나타낸 것이다.
도 6은 PNA 프로브가 선별한 유전자 마커에 결합할 때 발생하는 melting peak(Tm)을 확인한 것이다.
도 7 및 도 8은 병원성 대장균 검출 키트 조성물을 이용하여 Normal PCR 조건 방법에 따라 증폭곡선과 융해곡선 그래프를 얻은 결과이다.
도 9 및 도 10은 병원성 대장균 검출 키트 조성물을 이용하여 Fast PCR 조건 방법에 따라 증폭곡선과 융해곡선 그래프를 얻은 결과이다.
도 11은 병원성 대장균 검출 키트 조성물을 이용하여 Normal PCR 및 Fast PCR 조건 방법 별 병원성 대장균의 검출 대표 도면이다.
도 12은 병원성 대장균 검출 키트 조성물에 의한 민감도 측정 결과이다.
도 13는 병원성 대장균 검출 키트 조성물에 의한 특이도 측정 결과이다.
본 발명은 첨부된 도면과 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있을 것이다. 다만, 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 용어의 정의는 하기에 기재된 것과 같다.
"장관병원성 대장균 (Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)″는 장관독소원성형 대장균(ETEC)과 달리 독소를 생성하지는 않지만, 장관내 상피세포막에 밀착되어 미세 융모의 소실을 보이며 설사·패혈증 등을 일으키는 병원성 대장균으로 이해할 수 있다.
"장관조직 침입성 대장균 (Enteroinvasiv Eschierichia coli, EIEC)″는 adhesin 단백질을 이용하여 장세포막에 결합하여 세포내로 침투하여 이를 파괴하는 등 장벽을 심하게 손상시켜 설사와 고열증상을 보이는 병원성 대장균으로 이해할 수 있다.
"프라이머 (primer)″는 DNA 합성시 DNA 중합효소가 합성을 시작할 수 있도록 3′-OH를 제공하는 DNA 짧은 가닥으로 의미할 수 있으며, 중합효소연쇄반응 (PCR)시 이 프라이머를 시발점으로 하기 위하여 합성하여 사용할 수 있다.
"펩티드핵산 프로브(Peptide nucleic acid probe, PNA probe)″이란 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로써 중합효소연쇄반응시 증폭하고자 하는 유전자와 상보적인 결합을 이루어 증폭된 유전자를 실시간으로 정량적인 확인을 위해 사용되는 것으로 이해될 수 있다.
"유전자 마커″라는 용어는 본 발명에서 검출하고자 하는 병원성 대장균의 특정 유전자에서만 발견되는 염기서열로서 이를 이용하여 각 병원성 대장균을 특이적으로 검출할 수 있게 된다고 이해될 수 있다.
"상보적″이라는 용어는 핵산 사이의 염기쌍을 혼성화할 수 있는 것을 의미하며, 통상 A와 T(또는 U), 또는 C와 G를 두고 상보적이라고 할 수 있다.
"혼성화(hybridization)″란 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중가닥을 이루는 과정을 의미하는 것으로 양 염기서열의 상보성이 높으면 안정한 혼성화가 이루어질 수 있다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
"중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)″이라는 용어는 최초의 주형 DNA를 반복과정(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 다량의 동일 DNA가 증폭되는 일련의 과정을 의미할 수 있다. 여기에는 (ⅰ) 증폭하고자하는 주형 DNA, (ⅱ) 복제의 시발점이 되는 프라이머, (ⅲ) DNA를 합성할 수 있는 효소인 DNA polymerase 그리고 (ⅳ) DNA의 재료가 되는 dNTPs 등이 필요하다.
"Real time PCR″이라는 용어는 증폭되는 유전자의 정량적인 정보를 실시간으로 확인할 수 있는 PCR 기법으로 이해될 수 있다. PNA probe가 증폭된 염기서열과 결합하면서 형광을 발생시키고 이것이 해리되면서 소광되는 현상을 측정·분석하여 증폭된 표적핵산의 정량적 정보를 획득할 수 있다.
"Fast PCR″은 PCR의 기법 중 하나로, 증폭단계의 반복과정을 간결화하여 짧은 시간에 유전자를 증폭시킬 수 있는 일체의 PCR 기법을 의미할 수 있다.
"증폭″은 주형 DNA의 적어도 하나의 세그먼트의 복수개 복제물을 형성하기 위하여 반복적으로 일어나는 일련의 반응을 의미할 수 있다.
"검체 시료″는 다양한 시료를 포함하며 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 대장균을 분리해낸 배양 시료이거나 상기 대장균에 감염된 개체(객담, 전혈, 혈장 등)의 시료일 수 있으며 인간 및 세균 기원의 생물시료가 분석될 수 있으며 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함된다. 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 안구 유액, 타액 및 조직 추출물이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
"키트″는 버퍼, DNA 중합효소 및 dNTPs와 같은 표적 핵산 증폭 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 통상적으로 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트에 있어서, 특정 반응에 사용되는 시약의 최적량은 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다. 여기서, DNA 중합효소는 Taq 중합효소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
- 본 발명의 개요
본 발명자들은 병원성 대장균에 감염 여부를 진단하는 방법과 유전자의 실시간 유전자 증폭법 및 병원성과 관련된 strain을 진단하고자 하였다. 그 결과, 병원성 대장균의 특이적 유전자를 확보하고 상기 유전자에 대응하는 검출용 프라이머를 이용하여 증폭한 후 펩티드 핵산 프로브(peptide nucleic acid probe, PNA probe)를 이용한 혼성화 과정으로 얻어진 Tm값으로 병원성 대장균을 간단ㆍ신속ㆍ정확하게 검출할 수 있게 되었다.
상세히 설명하면,
(1) 각 병원성 대장균을 특이적으로 판단할 수 있는 유전자 마커를 특이적인 검출용 프라이머로 증폭시키고;
(2) PNA 프로브와 증폭된 유전자 마커를 혼성화하면서 발생한 형광의 변동을 통해 증폭곡선을 획득하고;
(3) 증폭된 이중가닥 염기서열이 변성 및 재결합되는 과정에서 PNA 프로브에 의해 발생되는 온도별 융해곡선을 획득하고;
(4) 상기 증폭곡선과 융해곡선을 분석하여 병원성 대장균을 구별할 수 있게 되었다.
따라서, 본 발명을 실시하기 위하여 장관병원성 대장균(EPEC)과 장관조직 침입성 대장균(EIEC)을 특이적으로 구별할 수 있는 유전자 마커가 필요하고, 이 유전자 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작해야하며, 증폭된 유전자 마커를 통해 증폭곡선과 융해곡선을 얻기 위하여 유전자 마커와 완벽히 상보적인 결합을 이룰 수 있는 PNA 프로브를 제작해야 한다.
-유전자 마커의 염기서열
장관병원성 대장균(EPEC)과 장관조직 침입성 대장균(EIEC)을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 및 PNA 프로브를 제작하기 위하여 각 대장균의 특이적인 target 유전자가 요구된다. 이를 위하여 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 데이터베이스에 등록된 염기서열을 수집하였다. 이에 따라 장관병원성 대장균(EPEC)의 “eaeA gene”을 선별하고 유전자 분석을 통해 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열을 장관병원성 대장균(EPEC)의 유전자 마커로 확보하였다. 또한, 장관조직침입성 대장균(EIEC)의 “ipaH gene”을 선별하고 유전자 분석을 통해 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 장관조직 침입성 대장균(EIEC)의 유전자 마커로 확보하였다.
-병원성 대장균 검출용 프라이머
프라이머는 DNA 합성시 시발점이 되는 DNA 짧은 가닥으로 DNA polymerase에게 3´-OH를 제공한다. 표적핵산을 증폭하고자 할 때, 표적핵산만을 증폭할 수 있도록 시발점을 지정해주는 역할을 하며, 표적핵산에 따라 다양한 프라이머가 존재할 것이다. 프라이머세트(종래 프라이머쌍)라고 함은 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머(Reverse primer)를 포함하는 것을 의미한다.
실시예에 따르면, 본 발명은 장관감염성 대장균 502종의 유전자와 장관조직 침입성 대장균 6종의 유전자를 얼라인먼트하여 상기 병원성 대장균은 특이적으로 검출하되, 다른 장관감염증 병원체 Salmonella spp., E.coli spp.(ETEC, EHEC, EAEC), Vibrio spp. Norovirus GI, Norovirus GII, Rotavirus, Sapovirus GI, Sapovirus GII, Sapovirus GIV 등의 균주 혹은 바이러스는 검출하지 않는 프라이머를 선별하였다. 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 장관병원성 대장균(EPEC)의 정방향 프라이머이고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열은 장관병원성 대장균(EPEC)의 역방향 프라이머이다. 서열번호 3로 표시되는 염기서열은 장관조직 침입성 대장균(EIEC)의 정방향 프라이머이고, 서열번호 4로 표시되는 염기서열은 장관조직 침입성 대장균(EIEC)의 역방향 프라이머이다. 따라서, 본 발명은 장관병원성 대장균 검출용 프라이머세트와 장관조직 침입성 대장균의 검출용 프라이머세트를 포함하는 프라이머 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공된 프라이머의 염기서열은 본 발명을 실시함에 있어서, 보다 자세하게는 PCR 수행시 증폭단계가 본 발명의 의도와 부합하게 이루어지는 범위내에서 염기서열의 부가·결실·치환이 가능한 실질적으로 동일한 염기서열까지를 포함할 것이다.
-PNA probe (PNA 프로브)
펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)이란 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로써 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었으며 자연에서는 발견되지 않으므로 인위적인 화학방법으로 합성하여 사용할 수 있다.
PNA는 LNA와 같은 유사 DNA의 한 종류로, 기본 골격은 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 결합 친화도 (binding affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하며 핵산 분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다는 장점을 가진다. 또한, 열/화학적으로 안정성이 높아 보관이 용이하여 쉽게 분해되지 않으며, 상보적인 염기서열이 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통한 이중가닥 형성을 이룬다. PNA의 결합 친화도가 높아 PNA-DNA 결합력이 높으며, 1개의 뉴클레오티드 미스 매치(nucleotide mismatch)로 인하여 융해온도(Tm, melting temperature)값이 5∼10℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 Tm값으로 분석할 수 있는데, 이를 이용하여 SNP 및 Insertion/Deletion의 뉴클레오티드의 변화를 검출할 수 있게 된다.
PNA 염기서열의 길이는 제한되어 있지 않으나, 높은 결합력으로 말미암아 기본적으로 Tm값이 높게 형성되어 짧은 길이로 제작이 가능하다. 본 발명에서는 대장균 특정 염기서열이 포함되도록 12∼17mer 길이로 제작되었다. 이 때, PNA 프로브의 Tm값은 프로브의 서열에 따라 다르게 나타나므로 원하는 Tm값을 가지도록 조절이 가능하여, 본 발명 역시 원하는 Tm값을 가지도록 디자인하였다.
상기의 PNA 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 소광자(quencher)를 결합시킬 수 있으며, 리포터에 의해 형광이 발생하고 소광자에 의해 형광이 소광된다. 보다 자세하게는, 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 리포터에 의해 형광 신호가 발생하며, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적 핵산과 해리되어 소광자에 의해 형광 신호가 소광된다. 이러한 온도 변화에 따른 형광변동 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 염기 유무를 검출할 수 있다. 상기 PNA 프로브는 표적 핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이는 것이 특징이다.
PNA 프로브의 뉴클레오티드와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 뉴클레오티드의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 애플리케이션(application)의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 가수분해방법(hydrolysis method)과는 다른 혼성화방법(hybridization method)를 이용하여 분석하며 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 비컨 프로브(molecular beacon probe), 스코피언 프로브(scorpion probe)가 있다.
상기의 리포터(reporter)에는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetra -chloro-6-carboxy-4,7-dichloro-fluorescein), Texas red, 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), 플루오레신 (fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린 (Oregon green), Cy5, JOE (6-carboxy-4＇,5＇-dichloro-2＇,7＇-dimethoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X -rhodamine), TAMRA(N,N,N＇,N＇-tetramethyl-6-carboxyrhodamine) 및 TET(2＇, 7＇-dichloro-6-carboxy-4,7-dichloro -fluorescein)의 구성 중 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으며, 소광자로는 BHQ1, BHQ3, 이클립스 딥 다크 퀸처(DDQ), 아이오와 블랙 FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 및 Dabcyl로 구성되는 구성군 중 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명은 서열번호 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 염기서열로 표시되는 병원성 대장균을 구분하는 PNA 프로브에 관한 것이다. 실시예에 따르면, 본 발명은 장관감염성 대장균 502종의 유전자와 장관조직 침입성 대장균 6종의 유전자를 얼라인먼트하여 상기 병원성 대장균은 특이적으로 검출하되, 다른 장관감염증 병원체 Salmonella spp., E.coli spp.(ETEC, EHEC, EAEC), Vibrio spp. Norovirus GI, Norovirus GII, Rotavirus, Sapovirus GI, Sapovirus GII 및 Sapovirus GIV 등의 균주 혹은 바이러스는 검출하지 않는 PNA 프로브를 선별하였다. 상기 염기서열과 리포터 및 소광자로 PNA 프로브를 제작하였으며 PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다. 표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 이차구조는 피하여 디자인 하였다.
본 발명에서 제공된 PNA 프로브의 염기서열은 본 발명을 실시함에 있어서, 보다 자세하게는 증폭된 표적핵산과의 상보성이 본 발명의 의도와 부합하게 이루어지는 범위 내에서 염기서열의 부가·결실·치환이 가능한 실질적으로 동일한 염기서열까지를 포함할 것이다.
-병원성 대장균 검출용 조성물 및 키트
본 발명은 다른 관점에서, 상기 프라이머 및 상기 PNA 프로브를 포함하는 병원성 대장균 검출용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 병원성 대장균 검출용 키트는 특정 염기서열을 인식하는 염기서열이 포함된 PNA 프로브, 주형 template를 증폭시킬 수 있는 정방향/역방향(Forward/Reverse) 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭될 유전자 마커인 주형 염기서열(template)과 dNTPs, DNA중합효소 및 일련의 PCR반응이 일어날 수 있는 PCR premix만 있으면 충분할 것이나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자가 구상할 수 있는 구성 역시 포함할 것이다.
본 발명의 키트에 포함되는 프라이머 조성물은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하는 프라이머세트와 서열번호 3 및 4의 염기서열을 포함하는 프라이머세트를 포함하고 있다. 또한, 본 발명의 또 다른 키트에는 서열번호 11, 12 및 13으로 표시되는 장관병원성 대장균(EPEC) 특이적 검출용 PNA 프로브와 서열번호 14, 15 및 16으로 표시되는 장관조직 침입성 대장균(EIEC) 특이적 검출용 PNA 프로브 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 조성물을 포함하기도 한다. PNA 프로브를 포함하는 키트를 이용할 경우, PNA 프로브에 의한 증폭 및 융해곡선 분석을 통하여 표적 핵산의 존재를 효과적으로 검출할 수 있으며 병원성 대장균 검출 및 질병 진단이 용이하다.
-병원성 대장균 특이적 검출방법
본 발명자들은 병원성 대장균에 대하여 NCBI blast data를 이용한 유전자 염기서열을 비교 분석하여, 서열번호 5 내지 10으로 표시되는 염기서열을 각 병원성 대장균의 유전자 마커로서 확보하였다. 유전자 마커를 주형 DNA로 하여 PCR로 증폭하기 위한 검출용 프라이머를 제작하였고, 이를 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 표시하였다. 이를 이용하여 합성된 이중가닥의 PCR 증폭산물에 PNA 프로브를 혼성화시켜 얻은 증폭곡선과 융해곡선으로부터 각 병원성 대장균의 융해온도(Tm)를 확인하여 각각의 병원성 대장균을 특이적으로 검출하고 상기 병원성 대장균의 감염 여부를 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 병원성 대장균을 검출하는 방법에 있어서,
(a) 검체 시료로부터 추출된 표적 핵산을 실험에 적용하는 단계;
(b) 표적핵산의 염기서열을 주형으로 사용하여 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머를 이용하여 특이적인 유전자 마커의 염기서열을 증폭시키며 서열번호 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 염기서열로 표시되는 병원성 대장균 검출용 PNA 프로브와의 혼성화로 발생하는 형광을 측정하여 실시간 증폭곡선을 확인하는 단계;
(c) 증폭된 이중가닥 염기서열이 변성 및 재결합되는 과정에서 PNA 프로브에 의해 발생되는 온도별 융해곡선을 얻는 단계;
(d) 상기 (a-c) 단계에서 얻은 증폭곡선 및 융해곡선의 분석을 통해 병원성 대장균을 검출하는 단계;
를 포함하는 병원성 대장균 검출 방법에 관한 것으로, (a) - (d) 단계를 수행하는 조건 및 시간은 본 발명이 속한 기술분야의 숙련된 전문가들에게 용이한 범위에서 선택할 수 있다.
상기 PCR 조건은 기존의 방법을 사용가능하며 PCR이 끝난 후 융해(melting) 과정이 필요하고 1℃ 씩 증가할 때마다 형광의 세기를 측정하여 Tm값을 얻는다. 특히 일반적인 실시간 PCR(real-time PCR) 장치는 널리 보급되어 있으며 HRM(High resolution melting)과 같이 부가적인 프로그램 구입이나 세밀한 온도변화를 요구하지 않는 장점이 있다.
한편, 본 발명에서 기존의 방법의 PCR 조건 이외에도 Fast PCR 검출방법을 이용할 수 있다. Normal PCR조건은 (b) 및 (c)가 수행되는 시간이 140∼150분 및 Fast PCR 조건의 경우 (b) 및 (c)가 수행되는 시간이 70∼90분을 넘지 않는다. 보다 바람직하게는, Fast PCR 조건으로는 70∼80분을 넘지 않는 것을 특징으로 한다. 이 경우, 기존의 conventional PCR 방법을 이용하는 키트보다 검출시간을 60∼80분 단축시킬 수 있어 더욱 빠른 시간 내에 동등하거나 더 우월한 특이성으로 병원성 대장균의 신속한 검출이 가능하며, 동시에 분석하여 장관감염성 대장균(EPEC)과 장관조직침입성 대장균(EIEC)을 구별하여 검출이 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
-Real-Time PCR
본 발명의 리얼타임 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 방법은, 실시간으로 증폭 과정을 확인하기 위해, 형광물질이 PCR 과정에서 단일가닥(single strand) DNA 사슬에 혼성화(hybridization)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 형광의 세기가 점차 증가하는 방식으로 확인한다. PCR이 끝난 뒤에는 온도를 높여 주어 DNA-PNA 혼성화 가닥을 풀어줌으로써 존재하는 형광의 세기가 점차 감소하게 되어 융해곡선이 나오게 되며, 융해곡선의 패턴인 DNA-PNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 특정 염기서열의 유무로 병원성 대장균 유형의 검출 혹은 판별이 가능하다. 전통적인 기존의 PCR 방법은 표적유전자를 size를 확인하며 전기영동으로 증폭정도를 판단할 수 있었기 때문에 실시간으로 정량적인 판단을 할 수가 없고, 표적유전자의 size를 모르는 경우 증폭된 PCR 산물을 sequencing 분석을 진행해야하는 등의 추가적인 검증 단계를 필요로 한다. 신속을 요하는 전염병에 대한 검출이 필요한 경우, 기존의 방법은 부합하지 못한 면이 있었고, Real-time PCR 방법이 대두되었다.
-융해곡선 분석 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)
본 발명의 융해곡선 분석은 표적 핵산인 DNA와 PNA 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 대상의 특정 염기서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드를 형성시킨다. 계속해서 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를, 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한다. 그리고 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 특정 염기서열의 유무를 판단하는 방법이다.
Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 검출 대상의 특정 염기서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면 표적 DNA에 특정 염기서열이 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준값보다 낮으면 미스매치 즉, 표적 DNA에 변이가 존재한다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
이하, 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허 청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
실시예 1: 병원성 대장균 검출용 유전자 마커, 및 상기 대장균에 특이적인 프라이머 및 PNA 프로브 제작
장관병원성 대장균을 검출하기 위한 프라이머 및 PNA 프로브를 제작하기 위하여 target 유전자는 “eaeA gene”을 선별하였으며 특이적으로 증폭하는 프라이머를 제작하기 위해 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열을 수집하였고 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이 장관병원성 대장균을 대표하는 502종의 유전자에 대해 유전자 분석을 진행하여 대표(consensus) 염기서열로 제작하였고, 이를 분석하여 유전자 마커를 선별하였다. 또한, 장관조직침입성 대장균을 검출하기 위한 프라이머 및 PNA 프로브를 제작하기 위하여 target 유전자는 “ipaH gene”을 선별하였으며 특이적으로 증폭하는 프라이머를 제작하기 위해 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 뉴클레오티드 DB(nucleotide database)에 등록된 염기서열을 수집하였고 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이 장관병원성 대장균을 대표하는 6종의 유전자에 대해 유전자 분석을 진행하여 대표(consensus) 염기서열로 제작하였고, 이를 분석하여 유전자 마커를 선별하였다.
Subtype Accession number
장관병원성 대장균 CP022664.1, AP018808.1, CP028126.1, CP028116.1, CP028112.1, CP027599.1, CP027577.1, CP027572.1, CP027555.1, CP027442.1, CP027390.1, CP027387.1, CP027361.1, CP027352.1, CP027338.1, CP010240.1, CP010119.1, CP012693.1, LM997125.1, LM996694.1, LM995947.1, LM995831.1, LM995751.1, LM995690.1, LM997319.1, AP010953.1, FM201464.1, FM201463.1, FJ609812.1, AB426060.1, AB647427.1, CP027313.1, CP017631.1, CP014670.1, CP014583.1, KT591213.1, KT591200.1, KT591197.1, LM996749.1, LM996450.1, LM996314.1, LM995981.1, LK931504.1, AB647586.1, AB647470.1, AB647454.1, AB647410.1, AB647378.1, FJ609815.1, AF453441.1, AJ277443.1, AF200363.1, AJ223063.1, U59502.2, U60002.1, CP027546.1, AB647597.1, AB647394.1, CP030939.1, CP027582.1, CP027472.1, CP027335.1, CP027331.1, AB647612.1, AB647529.1, AB647480.1, AB647463.1, AB647449.1, AB647424.1, AB647396.1, U59504.2, U59503.1, CP027587.1, KT591226.1, AB647615.1, AB647428.1, AB647447.1, CP027597.1, AB647475.1, AB647379.1, AY255520.1, KT591228.1, AB647523.1, CP027591.1, CP023673.1, CP024618.1, CP024056.1, AF253560.1, KT591225.1, KT591216.1, AF065628.1, U38618.1, AF043226.1, AJ876653.1, AB647436.1, FJ609807.1, DQ523605.1, AJ715407.1, CP019455.1, AB647493.1, AB647432.1, FJ609816.1, KT591333.1, AB647437.1, KT591304.1, AB647553.1, CP024127.1, AB647443.1, AB647404.1, AJ876651.1, AJ308552.1, KT591308.1, DQ523603.1, DQ523611.1, AJ875027.1, AJ877230.1, CP027388.1, CP027219.1, CP024479.1, CP014752.1, KT591277.1, LM997219.1, LM996653.1, AB647381.1, AP010958.1, DQ523606.1, AJ303141.2, CP028110.1, CP027464.1, CP027454.1, CP027435.1, CP027351.1, CP027317.1, CP022407.1, LM996922.1, AB647399.1, AB647594.1, KT591278.1, LN554925.1, LM996081.1, LM996051.1, U66102.1, KT591282.1, AB647462.1, AF116899.1, CP027355.1, CP024155.1, CP027675.1, CP024134.1, AJ705051.1, CP027459.1, CP027445.1, DQ523610.1, AB647593.1, DQ523612.1, CP027363.1, CP027325.1, CP013029.1, AB647596.1, AF479581.1, AJ877229.1, AJ876649.1, AJ781125.1, AF319597.1, AF301015.1, AM116755.1, AB040740.1, FM872417.1, LM996404.1, AP018802.1, AP018796.1, CP028432.1, CP028429.1, CP029692.1, CP028117.1, CP027593.1, CP027573.1, CP027544.1, CP027380.1, CP027347.1, CP027307.1, CP027221.1, CP014092.2, CP021339.1, CP021335.1, CP020107.1, KT591258.1, KT591253.1, LM997087.1, LM996972.1, LM996576.1, LM996367.1, LM996117.1, LM995613.1, LM995535.1, LM995466.1, LM997407.1, AB647601.1, AB647527.1, AB647520.1, AB647418.1, AB647375.1, AP010960.1, FM986650.1, AB334563.1, AJ833638.1, AB647361.1, AB647481.1, CP027766.1, CP027552.1, CP025318.1, KT591255.1, KT591246.1, KT591241.1, AB647488.1, AB647446.1, AB647414.1, AB647401.1, AB647373.1, AB647366.1, AF449418.1, CP027344.1, KT591250.1, KT591242.1, KT591240.1, AB647530.1, FM872418.1, AB647359.1, AF025311.1, AB647435.1, KT591238.1, KT591321.1, KT591321.1, FJ609811.1, FJ609811.1, FJ609810.1, LC053401.1, AB647569.1, AJ705052.1, AF253561.1, AB647607.1, AB647395.1, CP027103.1, CP027550.1, AB647617.1, AB647471.1, AB647360.1, AB647362.1, FM872424.1, DQ523601.1, AJ308551.1, AB647430.1, AB647365.1, KT591302.1, AB647415.1, AB647389.1, FM872426.1, CP010238.1, KT591272.1, AB647457.1
Subtype Accession number
장관병원성 대장균 DQ523614.1, AF530557.1, AB647370.1, AJ633129.1, AB647439.1, AB647425.1, DQ523602.1, KT591275.1, AB647369.1, FM872425.1, KT591266.1, KT591262.1, DQ523609.1, KT591323.1, AJ715409.1, FJ609809.1, FM872421.1, KT591265.1,AB647440.1, KT591322.1, FM872419.1, AF449417.1, AF449416.1, AB334560.1, CP030767.1, AP018488.1, BA000007.3, CP022050.2, CP022689.1, CP015843.2, CP016755.1, CP018250.1, CP018252.1, CP018245.1, CP018243.1, CP018241.1, CP018239.1, CP018237.1, CP017669.1, CP017251.1, CP017249.1, CP017446.1, CP017444.1, CP017442.1, CP017440.1, CP017438.1, CP017436.1, CP017434.1, CP015855.1, CP016625.1, CP015846.1, CP015842.1, CP015832.1, CP015831.1, CP015241.1, KT591261.1, CP015023.1, CP015020.1, CP014314.1, CP012802.1, CP010304.1, CP008957.1, CP008805.1, CP001925.1, CP003109.1, CP001846.1, GQ338312.1, CP001368.1, CP001164.1, EU871626.1, AE005174.2, AF081185.1, AB334558.1, AF081182.1, AF071034.1, KT591287.1, AB647509.1, AB647407.1, FJ609822.1, FJ609813.1, AJ876652.1, CP018247.1, KT591267.1, LM996611.1, FJ609829.1, FJ609799.1, FJ609798.1, AB334565.1, X60439.1, KT591288.1, CP028379.1, CP027763.1, CP027319.1, LT903847.1, LT827011.1, LM997001.1, LM996776.1, CP007136.1, CP007133.1, CP006027.1, CP006262.1, AB647528.1, AB647525.1, AB647431.1, AB647374.1, FJ609803.1, FM180568.1, AF022236.1, M58154.1, CP027362.1, KT591289.1, KT591291.1, AB647551.1, AB647539.1, EU871627.1, FJ609823.1, Z11541.1, CP027548.1, CP020106.1, CP020092.1, KT591328.1, AB647610.1, GU944693.1, GU944691.1, FM986652.1, FM986651.1, AJ271407.1, AJ298279.1, CP027104.1, AB647460.1, AB647391.1, DQ523600.1, AF530555.1, KT591327.1, AY223510.1, AB647618.1, EU871628.1, KT591271.1, AJ744865.1, FM872416.1, EF540940.1, EF540939.1, EF540941.1, FJ609820.1, DQ523604.1, AJ308550.1, AB647558.1, KT591313.1, AB647412.1, DQ523607.1, AJ705049.1, AJ705050.1, LC053400.1, AB647605.1, AJ877227.1, DQ523613.1, CP024131.1, AB647487.1, AB647383.1, AJ748082.1, AJ876647.1, CP025747.1, CP010134.1, AB647408.1, FJ609818.1, KT591317.1, AB647398.1, EF204933.1, EF204931.1, KT591300.1, AB647371.1, AF530553.1, AJ633130.1, AY520904.1, EU816360.1, AM180616.1, AM180617.1, AM180620.1, JQ996412.1, EU627771.1, AJ879901.1, AF099072.1, AF099073.1, AF099074.1, AF130315.1, AF099075.1, AF099076.1, AF099077.1, JQ350701.1, JQ350704.1, JQ350703.1, DQ486634.1, AF099078.1, AJ275091.1, U62656.1, U62655.1, Y13111.1, HQ834724.1, HQ834728.1, KM406185.1, KM406188.1, FJ666595.1, KU553346.1, FJ660916.1, AJ629917.1, AJ629916.1, KX911252.1, EU499354.1, AJ875030.1, AJ875092.1, AJ875097.1, AJ875095.1, AJ746302.1, MH085928.1, JQ809332.1, AJ715824.1, AJ705054.1, AJ705055.1, AJ705053.1, AJ744873.1, AJ705056.1, HQ834727.1, AJ275098.1, JQ700206.1, FJ666095.1, HQ834726.1, KY466167.1, AJ875040.1, Y13112.1, KF032630.1, AB118868.1, AB118858.1, KX343937.1, AB118867.1, AB118866.1, HQ428078.1, AB118860.1, AB118869.1, AJ715986.1, AJ875033.1, AJ715826.1, EU499352.1
장관조직 침입성 대장균 KT248235.1, CP011419.1, CP001064.1, CP011416.1, GU186373.1, JQ638638.1
그 결과, 장관병원성 대장균의 바이오마커로 서열번호 5로 표시되는 5'-TGACCAAATGCCAGC-3', 서열번호 6인 5'-AGTGAACTACCGTCAA-3' 및 서열번호 7인 5'-TGCCGTTCCATAATG-3' 염기서열 3종을 확보하였으며 장관조직 침입성 대장균의 바이오마커로 서열번호 8로 표시되는 5'-CTGTTCACGGAATC-3', 서열번호 9로 표시되는 5'-CGGAATCCGGAGGTA-3' 및 서열번호 10인 5'-CTCTTCATGTTCAA-3' 염기서열 3종을 확보하였다. 상기에서 병원성 대장균 검출용 유전자마커로 선별한 염기서열에서 장관병원성 대장균을 검출하기 위한 서열번호 11의 염기서열 5'-GCTGGCATTTGGTCA-3', 서열번호 12인 5'-TTGACGGTAGTTCACT-3' 및 서열번호 13인 5'-CACTTATGGAACGGCA-3' 염기서열 3종을 PNA 프로브로 제작하였으며 장관조직 침입성 대장균을 검출하기 위하여 서열번호 14의 염기서열인 5'-GATTCCGTGAACAG-3', 서열번호 15인 5'-TACCTCCGGATTCCG-3' 및 서열번호 16인 5'-TTGAACATGAAGAG-3' 염기서열 3종을 PNA 프로브로 제작하였다. 또한, 상기에서 선별한 유전자 마커를 포함하는 병원성 대장균 검출을 위해 특이적 장관병원성 대장균를 증폭하는 서열번호 1 및 2로 나타내는5'-AGTTGCAGGCYTGGTTACAA-3', 5'-GCAAATTTAGGTGCGGGTCA-3'와 장관조직 침입성 대장균을 증폭하는 서열번호 3 및 4로 나타내는5'-GATGTATCACAGATATGGCATGC-3', 5'-GCGCTCACATGGAACAAT-3' 프라이머를 제작하였다. 병원성 대장균을 증폭시키기 위한 프라이머에서 사용된 mixed base인 Y는 표 3에 나타난 바와 같이 공식적인 base code를 바탕으로 표기 하였으며, 상세하게는 Y로 표기된 염기서열은 염기 C와 T를 인식 가능한 것이다.
IUPAC nucleotide code Base
A Adenine
C Cytosine
G Guanine
T (or U) Thymine *or Uracil)
R A or G
Y C or T
S G or C
W A or T
K G or T
M A or C
B C or G or T
D A or G or T
H A or C or T
V A or C or G
N any base
도 3에 병원성 대장균 strain들의 유전자를 분석하여 계통수를 구축하고 병원성 대장균별로 group화를 확인 하였으며 도 4와 도 5를 통해 표현한 바와 같이, 병원성 대장균 subtype별 염기서열로부터 도출된 프라이머와 PNA 프로브 부위를 표시 및 PNA 프로브의 정보를 표기하였다.
구분 서열번호 서열(5'->3') 변형 Target
프라이머 서열번호 1 AGTTGCAGGCYTGGTTACAA - EPEC E.coli
프라이머 서열번호 2 GCAAATTTAGGTGCGGGTCA
프라이머 서열번호 3 GATGTATCACAGATATGGCATGC - EIEC E.coli
프라이머 서열번호 4 GCGCTCACATGGAACAAT
유전자마커 서열번호 5 TGACCAAATGCCAGC - EPEC E.coli
유전자마커 서열번호 6 AGTGAACTACCGTCAA
유전자마커 서열번호 7 TGCCGTTCCATAATG
유전자마커 서열번호 8 CTGTTCACGGAATC - EIEC E.coli
유전자마커 서열번호 9 CGGAATCCGGAGGTA
유전자마커 서열번호 10 CTCTTCATGTTCAA
PNA 프로브 서열번호 11 GCTGGCATTTGGTCA HEX, Dabcyl EPEC E.coli
PNA 프로브 서열번호 12 TTGACGGTAGTTCACT
PNA 프로브 서열번호 13 CATTATGGAACGGCA
PNA 프로브 서열번호 14 GATTCCGTGAACAG HEX, Dabcyl EIEC E.coli
PNA 프로브 서열번호 15 TACCTCCGGATTCCG
PNA 프로브 서열번호 16 TTGAACATGAAGAG
또한, 표 4에 나타난 바와 같이 염기서열과 리포터 및 소광자로 PNA 프로브를 제작하였으며 PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법으로 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였다. 표적 핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 이차구조는 피하여 디자인 하였다.
실시예 2: PNA Tm 확인 oligo test 결과
실시예 1에서 제작된 PNA 프로브를 이용하여, 병원성 대장균 유전자 마커에 결합하였을 때 발생하는 Tm값을 확인하기 위하여 PNA 프로브의 target으로 주형 oligomer를 제작하였다. 이 주형 oligomer는 PNA 프로브에 상보적인 서열로써 PNA 프로브가 결합할 때 발생되는 Tm값을 확인하도록 진행하였다. 상기의 분석방법은 CFX96TM Real-Time 시스템 (Bio-Rad, 미국)을 이용하여 수행하였으며 조성으로는 1test 기준으로 10pmole PNA probe 1ul, Normal qPCR 2X PreMIX (티엔에스, 한국) 10ul, oligomer 1ul 및 Destilled water를 이용하여 전체 volume 20ul가 되도록 혼합하였다.
95℃에서 2분의 시간을 주고 50℃에서 80℃까지 1℃씩 5초간 시간을 주면서 형광 촬영을 하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 장관병원성 대장균을 검출할 수 있는 서열번호 11은 66℃, 서열번호 12은 66℃ 및 서열번호 13은 66℃의 Tm을 확인하였고, 장관조직 침입성 대장균을 검출할 수 있는 서열번호 14는 62℃, 서열번호 15은 62℃ 및 서열번호 16은 63℃의 Tm을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 실시간 유전자 증폭 병원성 대장균 키트의 최적화
실시예 1에서 제작된 프라이머를 이용하여, 병원성 대장균 핵산 샘플에 대하여 증폭곡선 및 용해곡선을 도출하고, 이를 분석하여 실시간 유전자 증폭 확인 조건을 최적화하고자 하였다. Real-time PCR 반응은 CFX96™ Real-Time 시스템(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 수행하였으며 조성으로는 1 test 기준으로 1 pmol forward primer 1 ul, 10 pmol reverse primer 1 ul이 사용되었고, PNA 프로브는 10 pmol PNA probe 1 ul 씩, Normal qPCR 2X PreMIX (티엔에스, 한국) 10ul, DNA 1∼5ul 및 Destilled water 최대 volume 20 ul가 되도록 혼합하였으며, 표 5는 반응 조건으로 실시간 유전자 증폭을 진행하였다.
Normal PCR 조건 온도(℃) 반응시간 및 사이클 반응시간
유전자 증폭 및 실시간 유전자 확인 95 10 min 143 min
95 30 sec 45 cycle
55* 30 sec
72 30 sec
융해(Melting)** 95 2 min
50 to 80 Increment 1.0℃, 5 sec (FAM, HEX)
*단계에서는 형광 촬영을 통해 실시간 유전자 증폭을 확인한다.
**단계에서는 Melting curve를 얻기 위해 형광 촬영을 하는 단계이다.
그 결과 도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이, 실시간 유전자 증폭방법을 이용하여 병원성 대장균을 검출을 확인 할 수 있었다.
장관병원성 대장균을 검출하기 위한 PNA 프로브 서열번호 11, 12 및 13을 이용한 분석을 통하여 서열번호 11은 증폭곡선 20과 융해곡선 65℃, 서열번호 13은 증폭곡선 16과 융해곡선 65℃의 결과를 확인하였으나 서열번호 12는 증폭곡선과 융해곡선에서 결과확인이 되지 않았으며, 예상치 못한 문제로 PNA probe 결합이 원활히 이루어지지 않는 것으로 추측된다.
장관조직 침입성 대장균을 검출하기 위한 PNA 프로브 서열번호 14, 15 및 16을 이용한 분석을 통하여 서열번호 14는 증폭곡선 14와 융해곡선 62℃, 서열번호 16은 증폭곡선 17과 융해곡선 63℃의 결과를 확인하였으나 서열번호 15는 증폭곡선과 융해곡선에서 결과확인이 되지 않았으며, 예상치 못한 문제로 PNA probe 결합이 원활히 이루어지지 않는 것으로 추측된다.
실시예 4: 고속 실시간 유전자 증폭 병원성 대장균 키트의 최적화
신속한 검출이 요구되는 현장에서는 보다 빠른 병원성 대장균 검출을 위하여 Fast PCR 조건을 확립하였다.
고속 실시간 유전자 증폭 반응은 CFX96™ Real-Time 시스템(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 수행하였으며 조성으로는 1 test 기준으로 1 pmol forward primer 1 ul, 10 pmol reverse primer 1 ul이 사용되었고, PNA 프로브는 10 pmol PNA probe 1 ul 씩, fast qPCR 2X PreMIX (티엔에스, 한국) 10ul, DNA 1∼5ul 및 Destilled water 최대 volume 20 ul가 되도록 혼합하였으며, 표 6는 반응 조건으로 실시간 유전자 증폭을 진행하였다. 이때 사용된 PNA 프로브는 실시예３에서 선별된 PNA 프로브 바탕으로 진행하였다.
Fast PCR조건 온도(℃) 반응시간 및 사이클 반응시간
유전자 증폭 및 실시간 유전자 확인 95 10 min 75 min
95 10 sec 45 cycle
55* 15 sec
융해(Melting)** 95 2 min
50 to 80 Increment 1 ℃, 5 sec
(FAM, HEX)
*단계에서는 형광 촬영을 통해 실시간 유전자 증폭을 확인한다.
**단계에서는 Melting curve를 얻기 위해 형광 촬영을 하는 단계이다.
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 고속 실시간 유전자 증폭방법을 이용하여 병원성 대장균을 검출을 확인 할 수 있었다.
고속 실시간 유전자 증폭 조건에서 장관병원성 대장균 검출하기 위한 PNA 프로브 서열번호 11 및 13을 이용한 분석을 통하여 서열번호 11은 증폭곡선 16과 융해곡선 66℃의 결과를 확인하였으나 서열번호 13은 증폭곡선과 융해곡선에서 결과확인이 되지 않았으며 이는 고속 실시간 유전자 증폭 과정의 특성으로 발생한 문제로 추측된다.
또한, 장관조직 침입성 대장균을 검출하기 위한 PNA 프로브 서열번호 14, 16을 이용한 분석을 통하여 서열번호 14는 증폭곡선 17과 융해곡선 62℃의 결과를 확인하였으나 서열번호 16은 증폭곡선과 융해곡선에서 결과확인이 되지 않았으며 이는 고속 실시간 유전자 증폭 과정의 특성으로 발생한 문제로 추측된다.
실시예 5: 병원성 대장균 키트의 민감도 와 특이도 확인
각각의 표적핵산을 이용하여 DNA 농도를 107 copies/ul ∼ 101 copies/ul로 준비한 뒤 병원성 대장균 키트로 분석하여 민감도를 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 병원성 대장균 특이적 프라이머 및 PNA 프로브를 이용한 융해곡선이 명확한 융해피크를 나타냄을 확인하였다. 이로써, 107 copies/ul ∼ 101 copies/ul 에 이르는 병원성 대장균 DNA 주형에 대한 민감도 확인할 수 있었다.
또한, 병원성 대장균 이외의 장관감염증을 유발시키는 병원체의 종류로 알려진 Salmonella spp., E.coli spp(ETEC, EHEC, EAEC). Vibrio spp. Norovirus GI, Norovirus GII, Rotavirus, Sapovirus GI, Sapovirus GII 및 Sapovirus GIV의 DNA를 이용하여 병원성 대장균 프라이머 및 프로브와 간섭 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 장관병원성 대장균 및 장관조직 침입성 대장균 외에는 증폭고선 및 융해곡선이 나타나지 않았으며 본원발명에 따른 실시간 병원성 대장균 검출 키트의 특이도를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BongSuk Kim : T&S <120> Screening method of Enteropathogenic Escherichia coli and Enteroinvasive Escherichia coli associated gastrointestinal Infection by PNA based real-time PCR <130> P19DS0075 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of EPEC eaeA gene <400> 1 agttgcaggc ytggttacaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of EPEC eaeA gene <400> 2 gcaaatttag gtgcgggtca 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of EIEC ipaH gene <400> 3 gatgtatcac agatatggca tgc 23 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of EIEC ipaH gene <400> 4 gcgctcacat ggaacaat 18 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 tgaccaaatg ccagc 15 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 agtgaactac cgtcaa 16 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 tgccgttcca taatg 15 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 ctgttcacgg aatc 14 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 cggaatccgg aggta 15 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 ctcttcatgt tcaa 14 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPEC PNA probe <400> 11 gctggcattt ggtca 15 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPEC PNA probe <400> 12 ttgacggtag ttcact 16 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPEC PNA probe <400> 13 cattatggaa cggca 15 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EIEC PNA probe <400> 14 gattccgtga acag 14 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EIEC PNA probe <400> 15 tacctccgga ttccg 15 <210> 16 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EIEC PNA probe <400> 16 ttgaacatga agag 14

Claims (16)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. (a) 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 PNA 프로브; 및
    (b) 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 PNA 프로브;를 포함하는,
    fast real-time PCR을 통한 장관병원성 대장균(EPEC) 및 장관조직 침입성 대장균(EIEC) 특이적 검출용 PNA 프로브.
  4. 삭제
  5. (a) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 장관병원성 대장균의 유전자마커 증폭용 프라이머세트 및
    (b) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 장관조직 침입성 대장균의 유전자마커 증폭용 프라이머세트를 포함하는 프라이머 조성물과;
    제 3항의 PNA 프로브;를 포함하는,
    fast real-time PCR을 통한 장관병원성 대장균 및 장관조직 침입성 대장균 특이적 검출용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 5항의 검출용 조성물을 포함하는 장관병원성 대장균 및 장관조직 침입성 대장균 검출용 키트.
  11. 삭제
  12. (a) 검체 시료로부터 추출된 표적 핵산을 제 5항의 검출용 조성물을 이용한 fast real-time PCR을 수행하여 표적서열을 증폭시키는 단계; 및
    (b) 상기 증폭된 표적서열을 분석하여 장관병원성 대장균 및 장관조직 침입성 대장균을 특이적으로 구별하여 검출하는 단계;
    를 포함하는 장관병원성 대장균 및 장관조직 침입성 대장균 특이적 검출방법.
  13. 삭제
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 (b)의 분석단계는 융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)을 수행하는 것을 특징으로 하는 장관병원성 대장균 및 장관조직 침입성 대장균 특이적 검출방법.
  15. 삭제
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 fast real-time PCR 조건은 증폭단계에서 95℃에서 10초 그리고 55℃에서 15초의 열적 순환을 45회 반복한 것을 특징으로 하는 장관병원성 대장균 및 장관조직 침입성 대장균 특이적 검출방법.
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