CN109153699A - 用于检测博德特氏菌属的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供用于确定表现出百日咳样症状的患者是否从抑制霍氏博德特氏菌(Bordetella holmesii)的治疗剂的治疗中获益的方法。这些方法基于通过分别测定IS481、IS1001和hIS1001靶重复元件的存在来检测生物样品中的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和霍氏博德特氏菌。还提供用于实施所述方法的试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月24日提交的美国申请号62/312,883的权益和优先权,其内容通过提述以其整体并入本文。
技术领域
本公开提供用于确定表现出百日咳样症状的患者是否从抑制霍氏博德特氏菌(Bordetella holmesii)的治疗剂的治疗中获益的方法。这些方法基于通过测定IS481、IS1001和hIS1001靶向重复序列的存在来检测生物样品中的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和霍氏博德特氏菌。还提供用于实施所述方法的试剂盒。
背景技术
提供以下对本公开的背景的描述仅为了帮助读者理解本公开,而不承认描述或构成本公开的现有技术。
百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌通常在人类中引起百日咳,一种高传染性和急性呼吸系统疾病。Hoppe JE.,Pediatr Infect Dis J.18:375-81(1999);Mattoo等,Clin.Microbiol.Rev.,18:326-382(2005)。百日咳的症状包括剧烈咳嗽的发作伴随吸气性咳嗽和有时呕吐。在极端情况下,百日咳症状可导致低氧、永久性脑损害或者甚至死亡。在一些情况下,支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)和霍氏博德特氏菌感染可导致百日咳样症状。
在其早期诊断百日咳可为困难的,尤其是因为其症状类似于其他常见的呼吸疾病(如支气管炎、感冒或流感)中观察到的那些症状。传统上,细菌培养物已经用于明确诊断百日咳。粘液获自患者鼻子和/或喉咙,且送至医学实验室用于培养。虽然阳性结果被认为是决定性的,但博德特氏菌属培养通常需要5到7天以获得诊断。由于该细菌的苛刻本性,博德特氏菌属菌种细菌培养物还易于得到假阳性结果。
抗体测定(包括ELISA)还用于通过检测特征的细菌抗原来诊断博德特氏菌属菌种。最常见的是,百日咳毒素蛋白的检测作为博德特氏菌属感染的指标。虽然这些基于抗体的测定具有良好的灵敏度和特异性,但它们通常需要患者的血液样品,而不是非侵入性获得的粘液样品,并且需要感染处于早期和/或恢复期。如果在疾病进展期间没有在适当的时间窗口获得患者样品,则这些测定可能得到假阴性结果。用于检测博德特氏菌属感染的其他方法包括直接荧光抗体(DFA)测试,其受限于灵敏度的缺乏。
因此,对于能够快速检测和区分单个生物样品中多个相关的博德特氏菌属菌种(如百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌)的更稳固和灵敏的方法存在巨大需求。
发明内容
本公开提供用于检测和区分生物样品中多个相关的致病性博德特氏菌属菌种(即百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌)的组合物和方法。在另一方面,本技术的方法和组合物在为表现出百日咳样症状的受试者选择最佳治疗方案中是有用的。预期本文公开的方法允许快速、灵敏和同时检测对应于IS481、IS1001和hIS1001多拷贝插入序列(IS)的一个或多个靶核酸序列。生物样品中IS481、IS1001和hIS1001重复元件的检测在分别确定百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌的存在中是有用的。在一些实施方案中,治疗方案包括氟喹诺酮类(fluoroquinolones)、碳青霉烯类(carbapenems)、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)、霍氏博德特氏菌-特异性抗体、全细胞(wP)百日咳博德特氏菌疫苗、无细胞百日咳博德特氏菌疫苗、泰利霉素(telithromycin)和大环内酯类抗生素中的一种或多种。本技术的方法可在未处理的生物样品上实施,得到直接的、流线化的样品至结果过程。
因此,在一方面,本公开提供用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在的方法,其包括:(a)使该生物样品与下列接触:(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;和(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)通过评价各靶核酸的荧光信号来检测该生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在,由此(i)当检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号时,在该生物样品中检测到霍氏博德特氏菌(B.holmesii);(ii)当检测到针对IS1001靶核酸的荧光信号时,在该生物样品中检测到副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis);和(iii)当检测到针对IS481靶核酸的荧光信号且未检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号时,在该生物样品中检测到百日咳博德特氏菌(B.pertussis),其中该致病性博德特氏菌属菌种是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌中的一种或多种;且其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。实时PCR扩增可在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。该生物样品可包括鼻咽(NP)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。
在接触生物样品前,所有引物对可一起包含在扩增主混合物中,该混合物进一步包括DNA聚合物、dNTPs和PCR缓冲液。此外,该扩增主混合物可进一步包括在严格条件下特异性杂交至对照靶核酸的第四对引物对。
该生物样品可单独或同时接触到这些引物对的一个或多个。其中该接触同时发生(即多路技术),第一、第二和第三引物对中的一个或多个与该生物样品接触且互相接触以扩增靶核酸序列。
在该方法的一些实施方案中,第一引物对由包括5’CCATAAGCATGCCCGATT 3’(SEQID NO:11)的第一正向引物和包括5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10)的第一反向引物组成。此外或可替换地,在一些实施方案中,第二引物对由包括5’CGGCTCGACGAATTGC3’(SEQ ID NO:7)的第二正向引物和包括5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8)的第二反向引物组成。在任一上述实施方案中,第三引物对由包括5’GGCACGGATCGAGGTTTTT 3’(SEQ ID NO:4)的第三正向引物和包括5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA 3’(SEQ ID NO:5)的第三反向引物组成。
任选地,对照核酸和与对照核酸的区段互补的第四引物对可包括于扩增混合物中。在一些实施方案中,对照核酸包括SEQ ID NO:13。在某些实施方案中,该第四引物对由包括5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQ ID NO:17)的第四正向引物和包括5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)的第四反向引物组成以生成SEQ ID NO:20的对照靶核酸。
在一些实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ IDNO:1的IS481靶核酸的区段的第一核酸探针接触,其中该第一核酸探针是可检测标记的,且包括5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC3’(SEQ ID NO:12)。此外或可替换地,在一些实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ ID NO:2的IS1001靶核酸的互补物的区段的第二核酸探针接触,其中该第二核酸探针是可检测标记的,且包括5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9)。此外或可替换地,在一些实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ ID NO:3的hIS1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触,其中该第三核酸探针是可检测标记的,且包括5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA 3’(SEQ ID NO:6)。
在该方法的某些实施方案中,该第一核酸探针是用FAM荧光团标记的,且该第二核酸探针是用CRF610荧光团可检测标记的,且该第三核酸探针是用JOE荧光团可检测标记的。
在任一上述实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触,其中该第四核酸探针是可检测标记的且包括5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)。在一些实施方案中,该第四核酸探针是用Q670荧光团可检测标记的。
在另一方面,本公开提供用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;和(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)如果检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号,选择患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗,其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。在一些实施方案中,实时PCR扩增在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。该生物样品可包括鼻咽(NP)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。
在该方法的一些实施方案中,第一引物对由包括5’CCATAAGCATGCCCGATT 3’(SEQID NO:11)的第一正向引物和包括5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10)的第一反向引物组成。此外或可选择地,在一些实施方案中,第二引物对由包括5’CGGCTCGACGAATTGC3’(SEQ ID NO:7)的第二正向引物和包括5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8)的第二反向引物组成。在任一上述实施方案中,第三引物对由包括5’GGCACGGATCGAGGTTTTT 3’(SEQ ID NO:4)的第三正向引物和包括5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA 3’(SEQ ID NO:5)的第三反向引物组成。
任选地,对照核酸和与对照核酸的区段互补的第四引物对可包括于扩增混合物中。在一些实施方案中,该对照核酸包括SEQ ID NO:13。在某些实施方案中,第四引物对由包括5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQ ID NO:17)的第四正向引物和包括5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)的第四反向引物组成以生成SEQ ID NO:20的对照靶核酸。
在一些实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ IDNO:1的IS481靶核酸的区段的第一核酸探针接触,其中该第一核酸探针是可检测标记的且包括5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC 3’(SEQ ID NO:12)。此外或可替代地,在一些实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ ID NO:2的IS1001靶核酸探针的互补物的区段的第二核酸探针接触,其中该第二核酸探针是可检测标记的且包括5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9)。此外或可替代地,在一些实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ ID NO:3的hIS1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触,其中该第三核酸探针是可检测标记的且包括5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA 3’(SEQ ID NO:6)。
在该方法的某些实施方案中,该第一核酸探针是用FAM荧光团可检测标记的,该第二核酸探针是用CFR610荧光团可检测标记的,和该第三核酸探针是用JOE荧光团可检测标记的。
在任一上述实施方案中,该方法进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触,其中该第四核酸探针是可检测标记的且包括5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)。在一些实施方案中,该第四核酸探针是用Q670荧光团可检测标记的。
在一些实施方案中,抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:氟喹诺酮类、碳青霉烯类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑和霍氏博德特氏菌-特异性抗体。在某些实施方案中,该氟喹诺酮类选自下组:环丙沙星(ciprofloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、格雷沙星(grepafloxacin)、替马沙星(temafloxacin)、洛米沙星(lomefloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星(enoxacin)和莫西沙星(moxifloxacin)。在一些实施方案中,该碳青霉烯类选自下组:亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、厄他培南(ertapenem)、多利培南(doripenem)、帕尼培南(panipenem)、比阿培南(biapenem)、阿祖培南(razupenem)(PZ-601)、替比培南(tebipenem)、来那培南(lenapenem)、托莫培楠(tomopenem)和噻嗯培南(thienpenem)(噻烯霉素(Thienamycin))。
在一方面,本公开提供一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用霍氏博德特氏菌-特异性抗体和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ IDNO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸的;(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)如果检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号和针对IS1001靶核酸的荧光信号,则选择患者使用霍氏博德特氏菌特异性抗体和额外的治疗剂治疗,其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
在一些实施方案中,额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。
在一方面,本公开提供一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:(i)扩增IS481的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(ii)扩增IS1001的第二引物对,其包括与SEQID NO:2或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;和(iii)扩增hIS1001的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)如果(i)检测到针对IS481靶核酸的荧光信号和针对IS1001靶核酸的荧光信号,且(ii)未检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号,则选择患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗,其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
在该方法的一些实施方案中,其中额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。
在该方法的一些实施方案中,其中抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:全细胞(wP)百日咳博德特氏菌疫苗、非细胞百日咳博德特氏菌疫苗、泰利霉素和大环内酯类抗生素。在某些实施方案中,该大环内酯类抗生素选自下组:阿奇霉素(azithromycin)(希舒美(Zithromax))、克拉霉素(clarithromycin)(Biaxin)、红霉素(erythromycin)(E-Mycin、Eryc、Ery-Tab、PCE、Pediazole、无味红霉素(Ilosone))和罗红霉素(roxithromycin)。
在另一方面中,本公开提供包含寡核苷酸的试剂盒,所述寡核酸酸可为用于进行如本文所述的扩增的引物或探针。
发明详述
本公开提供用于确定表现出百日咳样症状的患者是否从抑制霍氏博德特氏菌(Bordetella holmesii)的治疗剂的治疗中获益的方法。这些方法基于通过分别利用实时PCR测定IS481、IS1001和hIS1001靶重复序列的存在来检测生物样品中的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和霍氏博德特氏菌。该公开的方法包括:(a)使该生物样品与以下接触:(i)与IS481重复元件的靶核酸序列(如果存在的话)特异性结合的第一引物对;(ii)与IS1001重复元件的靶核酸序列(如果存在的话)特异性结合的第二引物对;和(iii)与hIS1001重复元件的靶核酸序列(如果存在的话)特异性结合的第三引物对,以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使该反应-样品混合物经受实时聚合酶链式反应(PCR)条件,在该条件下,扩增生物样品中存在的每种该靶核酸以产生荧光信号;(c)使用整合的热循环系统检测由各荧光团产生的荧光信号的量;和(d)通过比较由各靶核酸产生的荧光量并应用本文公开的算法来确定该生物样品中百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌中的一种或多种的存在。还提供了用于实施该方法的试剂盒。
定义
除非另有定义,本文所用的所有技术和科技术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所用,除非另有说明,单数形式“一个/一种(a,an)”和“所述/该(the)”包括复数指称。因此,例如,对“寡核苷酸”的提及包括多个寡核苷酸分子,和对“核酸”的提及是指一个或多个核酸。
如本文所用,关于数字的术语“约”通常被认为包括在数字的任一方向(大于或小于)的1%-10%范围内的数字,除非另有说明或以其他方式从上下文中明显的。
如本文所用,关于核酸序列的术语“扩增(amplify/amplication)”指增加样品中核酸序列的群体的代表的方法。在扩增反应中体外产生的特定靶核酸序列的拷贝被称为“扩增子”或“扩增产物”。扩增可为指数的或线性的。靶核酸可为DNA(如,例如,基因组DNA和cDNA)或RNA。虽然下文所述的例示方法涉及使用聚合酶链式反应(PCR)的扩增,但是许多其他方法(如等温方法,滚环方法等)是本领域技术人员已知的。技术人员会理解,可使用这些其他方法代替PCR方法或与PCR方法一起使用。参见,例如Saiki,“Amplification ofGenomic DNA”in PCR PROTOCOLS,Innis等编,Academic Press,San Diego,CA 1990,pp13-20;Wharam,等,Nucleic Acids Res.29(11):E54-E54(2001)。
本文所用的“扩增混合物”包括用于核酸扩增反应中的试剂的混合物,但其不含有引物或样品。扩增混合物包括缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。扩增混合物可进一步包括MgCl2、KCl、非离子和离子洗涤剂(包括阳离子洗涤剂)。
“扩增主混合物”包括扩增混合物和用于扩增一种或多种靶核酸的引物,但不含待扩增的样品。
本文所用的涉及多核苷酸(即核苷酸序列,如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补物(complement)”、“互补的(complentary)”或“互补性(complementarity)”指沃森/克里克(Watson/Crick)碱基配对规则。如本文所用的核酸序列的互补物指当与核酸序列比对使得一个序列的5'末端与另一个序列的3'末端配对时,处于“反向平行关联”的寡核苷酸。例如,序列“5'-A-G-T-3”与序列“3’-T-C-A-5”互补。本文所述的核酸中可包括在天然存在的核酸中不常见的某些碱基。这些碱基包括,例如,肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸。互补性不需要是完美的;稳定的双链体可含有错配的碱基对,退化的或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可凭借经验考虑许多变量(例如寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸的序列、离子强度和错配碱基对的发生率)来确定双链体的稳定性。互补序列还可为与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列,且还可为cDNA。
本文所用术语“基本互补”意指在严格杂交条件下两个序列杂交。技术人员会理解,基本互补序列不需要沿其全部长度杂交。特别地,基本互补序列可包含不与靶序列杂交的连续碱基序列,位于在严格杂交条件下与靶序列杂交的连续碱基序列的3'或5'。
如本文所用,分析物的“循环阈值”(Ct)是荧光信号穿过特定荧光阈值的PCR循环。该Ct取决于扩增反应效率,其包括起始模板拷贝数、生物体裂解、PCR扩增、荧光探针的杂交或切割和检测的灵敏度。Ct提供PCR反应中靶核酸浓度的相对量度。除了靶核酸浓度之外的许多因素可影响Ct的绝对值。然而,改变与Ct计算相关的荧光测量的来自反应混合物或仪器的误差会导致Ct值的模板非依赖的改变。
如本文所用,术语“检测”指确定样品中靶核酸的存在。检测不需要该方法提供100%灵敏度和/或100%特异性。
如本文所用,术语“直接扩增”指在核酸扩增反应,其中从样品中扩增靶核酸,而无先前的纯化、提取或浓缩。
如本文所用,术语“提取”指从样品中存在的其他(非核酸)材料中移出核酸而采取的任何活动。术语提取包括机械或化学裂解,添加洗涤剂或蛋白酶,或沉淀和去除非核酸如蛋白质。
如本文所用的术语“荧光团”指以特定波长(激发频率)吸收光且随后发射较长波长(发射频率)的光的分子。如本文所用的术语“供体荧光团”意指当其紧邻淬灭剂模块时,向淬灭剂捐献或转移发射能量的荧光团。由于向淬灭剂模块捐献能量,该供体荧光团本身会以在没有紧密定位的淬灭剂模块的情况下具有的特定发射频率发射较少的光。
如本文所用的术语“杂交”指两个基本互补的核酸链(在一段至少14至25个核苷酸延伸段上至少约65%、至少约75%或至少约90%互补)在适当的严格条件下彼此退火以通过在互补碱基对间形成氢键来形成双链体或异源双链体的过程。杂交通常并优选用探针长度的核酸分子进行,优选长度为15-100个核苷酸,更优选长度为18-50个核苷酸。核酸杂交技术是本领域中已知的。参见,如Sambrook,等,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.。杂交和杂交强度(即核酸间的关联强度)受到因素如核酸之间的互补性程度、涉及的条件的严格性和形成的杂交体的热熔点(Tm)的影响。本领域技术人员理解如何估计和调整杂交条件的严格性,使得具有至少所需水平的互补性的序列会稳定地杂交,而那些具有较低互补性的序列则不会。关于杂交条件和参数的实例,参见,例如Sambrook等,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.;Ausubel,F.M等1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Secaucus,N.J.。在一些实施方案中,特异性杂交在严格的杂交条件下发生。特异性针对靶核酸的寡核苷酸或多核苷酸(例如探针或引物)会在适合的条件下与靶核酸“杂交”。
如本文所用,术语“个体”、“患者”或“受试者”可为个体生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在优选的实施方案中,该个体、患者或受试者是人。
如本文所用,术语“多重PCR”指在同一反应容器内同时产生两种或多种PCR产物或扩增子。使用独特的引物对引发每种PCR产物。多重反应可进一步包括针对用不同可检测模块标记的每种产物的特异性探针。
如本文所用,“寡核苷酸”指在骨架上具有核酸碱基序列的分子,所述骨架主要由以限定的间隔的相同单体单元组成。碱基以这样的方式排列在骨架上,使得它们可与具有与寡核苷酸碱基互补的碱基序列的核酸结合。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸单元的骨架。可区分在2'位置不具有羟基的寡脱氧核糖核苷酸和在2'位置具有羟基的寡核糖核苷酸。寡核苷酸还可包括衍生物,其中羟基的氢被有机基团(例如烯丙基)取代。作用为引物或探针发挥功能的寡核苷酸一般为长度至少约10-15个核苷酸或长度多至约70、100、110、150或200个核苷酸,且更优选长度至少约15至25个核苷酸。用作特异性扩增或特异性检测具体靶核酸的引物或探针的寡核苷酸一般能够与该靶核酸特异性地杂交。
如本文所用,“致病性博德特氏菌属菌种”指能够引起受试者(例如人)中百日咳或相关病况的博德特氏菌属的任何微生物体。具体的致病菌包括,例如,百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌。
如本文所用的“阳性对照核酸”或“内部阳性扩增对照”是已知以一定量或水平存在于样品中的核酸。在一些实施方案中,阳性对照核酸并非天然存在于样品中,且在用于检测样品中致病性博德特氏菌属菌种的存在的公开方法中使反应样品混合物进行实时聚合酶链式反应之前将其加入样品中。
如本文所用,术语“引物”是指寡核苷酸,当其置于引发与靶核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下,即在适当的缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子等)中和适合的温度在不同核苷酸三磷酸和聚合酶存在下时,其能够作为核酸序列合成的起始点。引物的一个或多个核苷酸可例如通过添加甲基、生物素或洋地黄毒苷部分、荧光标签或通过使用放射性核苷酸而进行修饰。引物序列不需要反映模板的确切序列。例如,非互补核苷酸片段可附接至引物的5′端,引物序列的其余部分与链基本上互补。本文所用的术语引物包括可合成的所有形式的引物,其包括肽核酸引物、锁核酸引物、硫代磷酸酯修饰的引物,标记的引物等。如本文所用的术语“正向引物”意指与双链DNA(dsDNA)的反义链退火的引物。“反向引物”与dsDNA的有义链退火。
引物通常为至少10、15、18或30个核苷酸长度或至多约100、110、125或200个核苷酸长度。在一些实施方案中,引物优选为约15至约60个核苷酸长度,且最优选的是约25至约40个核苷酸长度。在一些实施方案中,引物为15至35个核苷酸长度。对于最佳杂交或聚合酶链式反应扩增没有标准长度。特定引物应用的最佳长度可容易地以H.Erlich,PCRTechnology,PRINCIPLES AND APPLICATION FOR DNA AMPLIFICATION,(1989)中描述的方式确定。
“引物延伸反应”是指一种合成反应,其中,寡核苷酸引物与靶核酸杂交,且通过单个互补核苷酸的聚合酶依赖性3’-添加来产生靶核酸的互补拷贝。在一些实施方案中,该引物延伸反应是PCR。
如本文所用,术语“引物对”是指正向和反向引物对(即左和右引物对),其可以一起用于扩增感兴趣的核酸的给定区域。
如本文所用“探针”是指经由杂交与靶核酸相互作用的核酸。探针可与靶核酸序列完全互补或部分互补。互补的程度会取决于(一般来说)基于该探针功能的许多因素。探针可以是标记的或非标记的,或者以本领域公知的许多方法的任一个进行修饰。探针可与靶核酸特异性杂交。探针可为DNA、RNA或RNA/DNA杂合体。探针可为寡核苷酸、人工染色体、片段化人工染色体、基因组核酸、片段化基因组核酸、RNA、重组核酸、片段化重组核酸、肽核酸(PNA)、锁核酸、环状杂环寡聚体或核酸偶联物。探针可包括修饰的核碱基、修饰的糖模块和修饰的核苷酸间键。探针可用于检测甲基化的靶核酸的存在或缺失。探针通常为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100个或以上核苷酸长度。
如本文所用的“探针元件”是指一段核苷酸,(a)其与引物相关联,因其与引物核酸序列连接或位于引物核酸序列附近,且(b)在严格条件下与待检测的靶核酸特异性杂交。
如本文所用,术语“引物探针检测系统”是指一种用于实时PCR的方法。此方法利用双功能分子(在本文中称为引物-探针),其含有通过聚合酶阻断基团与探针元件共价连接的PCR引物元件。此外,各引物-探针分子含有与淬灭剂相互作用以降低背景荧光的荧光团。引物-探针,如本文所用,可包括具有5'延伸的探针尾的3'引物,其包括具有荧光团/淬灭剂对的发夹结构。在PCR期间,通过包含六甘醇(HEG)阻止聚合酶延伸到探针尾部。在第一轮扩增期间,3'靶特异性引物与靶核酸退火并延伸,使得引物-探针立即掺入新合成的链中,其具有新合成的5'探针靶区域。在下一轮变性和退火期间,引物-探针发夹环的探针区域会与靶物靶物杂交,从而分离荧光团和淬灭剂并产生可测量信号。这些引物-探针在Whitcombe等,Nature Biotech 17:804-807(1999)中描述。SCORPION引物是例示的引物-探针。
如本文所用的术语“淬灭剂模块”意指吸收由供体产生的发射能量并且消散作为热量的能量或发射比供体的发射波长更长波长的光的分子,其靠近供体的荧光团。在后一种情况中,淬灭剂被认为是受体荧光团。淬灭模块可通过近端(即碰撞)淬灭或通过或荧光共振能量转移(“FRET”)起作用。通过FRET的淬灭一般用于探针,而近端淬灭用于分子信标和ScorpionTM型探针。
如本文所用“反应样品混合物”是指含有扩增主混合物和样品的混合物。
如本文所用,术语“样品”是指获自患者或分离的微生物的临床样品。在优选的实施方案中,样品获自生物来源(即生物样品),如组织、体液或收集自受试者的微生物。样品来源包括但不限于粘液、痰(处理的或未处理的)、支气管肺泡灌洗物(BAL)、支气管洗涤物(BW)、血液、体液、脑脊液(CSF)、尿液、血浆、血清或组织(例如活组织检查材料)。优选的样品来源包括鼻咽和/或咽喉拭子或鼻洗涤物。
如本文中涉及本技术的方法所用的术语“灵敏度”是方法检测异源序列群体中预选序列变体的能力的量度。如果假定样品中预选序列变体以样品中序列的至少F%存在,针对F%的变体,方法具有S%的灵敏度,该方法可以C%的预选置信度、S%的时间/次数检测预选序列。举例来说,如果假定样品中预选的变体序列以样品中序列的至少5%存在,针对5%的变体,方法具有90%的灵敏度,该方法可以99%的预选置信度、10次中的9次检测预选序列(F=5%;C=99%;S=90%)。例示性灵敏度包括至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%和99%。
如本文所用,关于寡核苷酸引物的术语“特异性”是指当核苷酸与核酸对齐时,引物的核苷酸序列具有与待扩增核酸的一部分至少12个碱基的序列同一性。对于核酸特异性的寡核苷酸引物是在严格杂交或洗涤条件下能够与感兴趣的靶物杂交并且基本上不与不感兴趣的核酸杂交的寡核苷酸引物。更高水平的序列同一性是优选的,且包括至少75%,至少80%、至少85%、至少90%、至少85-95%和更优选至少98%的序列同一性。可使用商业化可获得的带有采用本领域公知算法的默认设置的计算机程序来确定。如本文所用,具有“高序列同一性”的序列至少在约50%的比对的核苷酸位置,优选至少约60%的比对的核苷酸位置,更优选至少约75%的比对的核苷酸位置具有相同的核苷酸。
“特异性”,如本文所用,是方法区分真正发生的预选序列变体与测序假象或其他密切相关序列的能力的量度。它是避免假阳性检测的能力。假阳性检测可由于在样品制备,测序错误或密切相关序列(如假基因或基因家族成员)的无意测序期间引入感兴趣序列的错误而引起。方法具有X%的特异性,如果,当应用于N总个序列的样本集,其中X真个序列是真正的变体且X非真个不是真正的变体时,则该方法选择至少X%的非真正变体作为非变体。例如,该方法具有90%的特异性,如果,当应用于1000个序列的样本集,其中500个序列是真正的变体且500个不是真正的变体时,则该方法选择此500个非真正变体中的至少90%作为非变体。示范性特异性包括至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%和99%。
如本文所用的术语“严格的杂交条件”是指至少如以下一样严格的杂交条件:在50%甲酰胺、5x SSC、50mM NaH2PO4、pH6.8、0.5%SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼精子DNA和5x Denhart溶液中于42℃过夜杂交;用2x SSC、0.1%SDS在45℃洗涤;并用0.2x SSC,0.1%SDS在45℃洗涤。在另一实例中,严格杂交条件不应允许在一段20个连续核苷酸上相差超过两个碱基的两个核酸的杂交。
如本文所用的“ PCR检测系统”是指一种用于实时PCR的方法。在此方法中,在扩增主混合物中包括与扩增的核酸区段杂交的探针。探针在探针的任一端包含供体和淬灭剂荧光团,并且彼此足够接近,使得供体的荧光被该淬灭剂吸收。然而,当探针与扩增的区段杂交时,Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性切割该探针从而允许供体荧光团发射可以检测到的荧光。
如本文所用的术语“靶核酸”或“靶序列”是指待分析样品中待检测和/或待定量的感兴趣的核酸序列。靶核酸可以由染色体的区段,具有或不具有基因间序列的完整基因,具有或不具有基因间序列的基因的区段或部分,或设计了其探针或引物的核酸序列组成。靶核酸可包括野生型序列,突变,缺失,插入或复制,串联重复元件,感兴趣的基因,感兴趣的基因区域或其任何上游或下游区域。靶核酸可代表特定基因的替代序列或等位基因。靶核酸可源自基因组DNA,cDNA或RNA。
博德特氏菌属菌种概貌分析(profiling)对治疗选择的影响
百日咳持续为全世界发病率和婴儿死亡率的重要原因。世界卫生组织,Wkly.Epidemiol.Rec.80:31-38(2005)。尽管可用百日咳博德特氏菌疫苗,但工业化国家中报告的百日咳发病率在过去20年中一直上升。百日咳的发病率增加归因于几个因素,其包括免疫衰退,公众健康意识和报导增加,以及使用更敏感的诊断如基于PCR的测定法。
一些研究已显示副百日咳博德特氏菌诱导的呼吸道疾病的发病率增加。Watanabe,M.等,Expert Rev.Anti Infect.Ther.2:447-454(2004)。此外,由于霍氏博德特氏菌所致的百日咳样疾病在美国发生。Weber,D.J.等,Infect.ControlHosp.Epidemiol.31:875-877(2010)。而且,支气管炎博德特氏菌是从免疫受损的个体的上呼吸道中偶然分离的。Wernli,D.等,Clin.Microbiol.Infect.17:201-203(2010)。因此,必须进行博德特氏菌属菌种的物种鉴定和确认,以允许准确诊断和管理人类中的百日咳和百日咳样疾病。
多拷贝插入序列IS481经常用作实时PCR测定中的靶核酸序列用于检测百日咳博德特氏菌的感染,因为百日咳博德特氏菌基因组通常包括约50-200个拷贝的IS481,这使得此测定高度灵敏。然而,仅靶向IS481的单一分析物PCR测定可产生百日咳的假阳性结果,因为IS481也在霍氏博德特氏菌(每个基因组8到10个拷贝)和支气管炎博德特氏菌的动物分离物中发现。Register,K.等,J.Clin.Microbiol.44:4577-4583(2006);Reischl,U.等,J.Clin.Microbiol.39:1963-1966(2001)。由于使用IS481作为单个PCR靶物的测定的假阳性结果所致的假性爆发(Pseudo-outbreak)已证明需要基于分析灵敏度和临床相关性的定义的截断值。Lievano,F.A.,等,J.Clin.Microbiol.40:2801-2805(2002);Muyldermans,G.,等,J.Clin.Microbiol.43:30-35(2005)。
由于若干原因,准确鉴定霍氏博德特氏菌是重要的。不同于百日咳博德特氏菌,霍氏博德特氏菌可在免疫受损和免疫活性的受试者两者中引起侵入性疾病。Tartof SY等,Clin Infect Dis 58:e39-43(2014);Jonckheere等,J Med Microbiol 61:874-877(2012);Russell FM等,Clin Infect Dis 33:129-130(2001)。研究显示,全细胞(wP)和无细胞(aP)百日咳博德特氏菌疫苗都不能赋予小鼠中霍氏博德特氏菌感染的治疗保护。Zhang等,Emerging Infectious Diseases 18(11):1771-1779(2012)。在人类中,在俄亥俄州(USA)中的百日咳暴发期间,针对霍氏博德特氏菌的青少年无细胞百日咳加强免疫接种的估计的有效性为36%,相较于针对百日咳博德特氏菌为67%。Rodgers L等,Clin InfectDis 56:322-331(2013)。因此,免疫接种的患者可能无法抵抗霍氏博德特氏菌的感染。而且,随后将霍氏博德特氏菌误诊为百日咳博德特氏菌可被误解为疫苗失败,这可导致不适当的公共卫生措施。此外,目前还不清楚指示病例(如百日咳博德特氏菌感染中)的所有接触者的预防性抗生素治疗是否对于霍氏博德特氏菌的感染是必需的。Weber DJ等,InfectControl and Hosp Epidemiol 31:306-307(2010)。因此,在博德特氏菌属筛选测定中需要高度特异性以避免不必要或不适当的治疗性干预。
本公开提供一种灵敏的和特异性的实时多重PCR测定,其同时靶向IS481、副百日咳博德特氏菌IS1001和霍氏博德特氏菌hIS1001重复元件,从而允许快速鉴定生物样品中的一种或多种致病性博德特氏菌属菌种。
生物样品收集和制备
本技术的方法和组合物可用于通过测定对应于获自受试者的生物样品中的IS481、IS1001和hIS1001多拷贝插入序列的靶核酸序列来检测致病性博德特氏菌属菌种。用于致病性博德特氏菌属菌种检测的样品还可包括在适当培养基上生长以形成菌落的细菌分离物的培养物,其中该培养物从获自受试者的生物样品制备。
本文公开的方法可用于检测和定量源自无菌和/或非无菌位点的生物样品中的致病性博德特氏菌属菌种。“无菌位点”包括体液如全血、血浆、无细胞血浆、尿液、脑脊液、滑液、胸膜液、心包液、眼内液、组织活检或气管内吸出物。如本文所用,“无细胞血浆”是指含有按体积计少于1%细胞的血浆。“非无菌位点”包括痰、粪便、皮肤拭子、腹股沟拭子、鼻拭子和咽拭子。在一些实施方案中,该生物样品包括鼻咽(NP)吸出物或拭子或鼻洗涤物。在其他实施方案中,该生物样品包括在适当培养基上生长以形成菌落的分离的细菌的培养物。样品还可包括细菌分离物。
可怀疑生物样品含有致病性博德特氏菌属菌种和/或一种或多种致病性博德特氏菌属菌种的核酸。另外,可从怀疑被一种或多种致病性博德特氏菌属菌种感染的受试者获得生物样品。可将生物样品与扩增主混合物接触以用于微流体/微电子离心平台。
尽管本公开方法优选采用未处理的生物样品从而形成直接的、流线型的样品至结果过程,但是如果用于根据本领域技术人员已知的任何方法纯化自生物样品的分离的核酸(DNA或RNA)时,本文公开的检测方法来会是有效的。如果需要,可通过离心等收集或浓缩样品。可对样品的细胞进行裂解,如通过用酶、热表面活性剂、超声破碎或其组合处理。可替换地,可使用商业上可获得的核酸提取试剂盒来处理生物样品。
在一些实施方案中,在扩增主混合物中存在一个或多个引物对,该混合物在接触生物样品前还包括DNA聚合酶、dNTPs和PCR缓冲液。IS481、IS1001和hIS1001靶重复元件的扩增优选以多重的形式发生。可替换地,也可使用每个多拷贝插入序列的个体PCR反应。可使生物样品与引物对和/或与扩增主混合物接触以在直接扩增盘中形成反应-样品混合物。例如,可使该生物样品在直接扩增盘中与扩增主混合物接触,如由Focus DiagnosticsInc.(Cypress,Calif.,USA)销售的直接扩增盘,其作为SIMPLEXA直接实时PCR测定的一部分以与3MTM集成循环仪配合工作。直接扩增盘是包含多个指定区域的薄圆盘,每个指定区域包含用于接收扩增主混合物的孔和用于接收未处理的患者样品的相关孔。在添加扩增主混合物和样品之时或之后,在直接扩增盘中产生样品-反应混合物。
实时PCR
可通过本领域已知的多个方法中的任一种检测靶核酸的扩增,如凝胶电泳、柱层析术、与探针杂交、测序、熔解曲线分析或“实时”检测。
对于实时检测,可以可检测地标记引物和/或探针以在引入引物时或当探针杂交时允许荧光差异,例如,并且在能够监测反应期间荧光变化的仪器中扩增。用于核酸扩增的实时检测方法是已知的,且包括,例如,系统、ScorpionTM引物系统和使用用于双链核酸的嵌入染料。
在实时定量PCR中,在靶DNA的标准稀释物和含有未知量靶DNA的样品中连续测量扩增产物的积累。通过将标准样品中的起始模板浓度与产生特定阈值浓度的产物所必需的PCRTM循环(Ct)数目相关联来构建标准曲线。在测试样品中,在相同的Ct之后测量靶PCRTM产物积累,其允许来自标准曲线的靶DNA浓度的插值(interpolation)。
在一些实施方案中,通过与特定的探针杂交来检测扩增的核酸。探针寡核苷酸(与扩增的靶序列的一部分互补)可用于检测扩增的片段。在一些实施方案中,可实时检测杂交。在另一个实施方案中,杂交不是实时检测的。可同时(即在相同反应容器,如多重PCR中)或单独地(即在分开的反应容器中)检测各靶序列的扩增的核酸。在一些实施方案中,多个靶核酸是同时检测的,使用两种或更多种可区别标记的(如通过不同可标记的模块如颜色)基因特异性寡核苷酸探针,其中一个与第一靶序列杂交且另一个与第二靶序列杂交。
在一些实施方案中,不同引物对是用不同可区别可检测的模块标记的。因此,例如,HEX和FAM荧光染料可在多重PCR中的不同引物对上存在,且与得到的扩增子相关。在其他的实施方案中,正向引物用一个可检测的模块标记,而反向引物用不同的可检测模块标记,例如FAM染料用于正向引物和HEX染料用于反向引物。使用不同的可检测模块对于在长度相同或长度非常相似的扩增产物之间进行区分是有用的。
对于序列-修饰的核酸,靶物可独立地选自顶链或底链。因此,所有待检测的靶物可包括顶链,底链,或顶链和底链靶物的组合。
用于实时PCR的一种通用方法使用荧光探针,如探针、分子信标和Scorpion引物探针。与其他形式的定量PCR(其检测最终扩增产物的量)相比,实时PCR以更高的特异性、灵敏度和重现性定量模板的初始量,。实时PCR不检测扩增子的大小。ScorpionTM和技术中采用的探针基于荧光淬灭原理,且涉及供体荧光团和淬灭模块。
使用任何合适的能够检测PCR扩增产物积累的仪器进行实时PCR。最常见的是,该仪器能够检测来自一种或多种荧光标签的荧光。例如,仪器(例如ABI实时PCR系统序列检测器)上的实时检测在每个PCR循环期间监测荧光并计算报告物信号的测量值或Rn值。阈值循环或Ct值是荧光与阈值相交的循环。阈值可由序列检测系统软件确定或手动确定。
在一些实施方案中,采用的探针是可检测标记的,且通过检测各扩增产物的探针标签完成检测。淬灭剂可进一步与该可检测的标签相关,其在扩增探针的靶物之前阻止检测标签。探针是这些探针的实例。
探针(Heid等,Genome Res.6:986-994,1996)使用Taq聚合酶的荧光5'核酸外切酶活性以测量DNA样品中靶序列的量。探针是寡核苷酸,其通常在或靠近5'碱基处包含供体荧光团和典型地在或靠近3'碱基处包含淬灭模块。淬灭剂模块可为染料如TAMRA或者可为非荧光分子如4-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)。参见Tyagi等,16Nature Biotechnology 49-53(1998)。当照射时,受激发的荧光供体通过FRET而非发荧光将能量转移至附近的淬灭模块。因此,供体和淬灭剂的紧密接近防止了供体荧光的发射,同时探针是完整的。
设计探针以与PCR产物的内部区域退火。当聚合酶复制与TaqMan探针结合的模板时,其5'核酸外切酶活性切割探针。这终止了淬灭剂(无FRET)的活性,并且供体荧光团开始发射荧光,其在每个循环中与探针切割速率成比例增加。通过监测报告物染料的荧光增加来检测PCR产物的累积。如果该淬灭剂是受体荧光团,则可通过监测受体荧光团的荧光降低来检测PCR产物的累积。
在一些实施方案中,使用双功能引物-探针检测系统(例如ScorpionTM引物)进行实时PCR。用Scorpion引物,使用单分子实现序列特异性引发和PCR产物检测。Scorpion引物在未杂交状态下维持茎环构型。将荧光团附接至5'端,且通过偶联至3'端的模块淬灭,尽管在一些实施方案中,可转换此排布。茎和/或环的3'部分还含有与引物的延伸产物互补并通过不可扩增的单体与特异性引物的5'末端连接的序列。引物模块延伸后,特异性探针序列能够在延伸的扩增子内与其互补序列结合,从而打开该发夹环。这阻止荧光被淬灭,并可观察到信号。通过反向引物和ScorpionTM引物的引物部分来扩增特异性靶物,得到延伸产物。由于ScorpionTM引物的探针元件与延伸产物的结合导致荧光团与淬灭剂分离,产生荧光信号。
在一些实施方案中,在所公开的方法中采用的探针包括经设计以检测具有遗传变异的DNA序列的区段的短荧光标记的DNA序列,或由其构成,如在French等,Mol CellProbes,5(6):363-74(2001)中公开的那些,该文件通过提述以其整体并入本文。是此类型探针的实例。
在该方法的一些实施方案中,扩增反应中的至少一个探针或各引物对中的至少一个引物包括可检测模块。可替换地,可检测模块可在与引物附接的探针上,如引物-探针。在一些实施方案中,可检测模块或标签是荧光团。适合的荧光模块包括但不限于下列荧光团:4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸(4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'disulfonic acid)、吖啶和衍生物(吖啶、异硫氰酸吖啶)、Alexa Fluors(350、488、546、555、Alexa 568、594、647(分子探针(MolecularProbes)))、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基]苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸盐(4-amino-N-[3-vinylsulfonyl)phenyl]naphthalimide-3,5disulfonate)(Lucifer Yellow(萤光黄)VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)、 R-6G、530/550、 FL、Brilliant Yellow(亮黄)、Cal Fluor红(CFR610)、香豆素和衍生物(香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC,香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))、焰红(cyanosine),4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、5',5”-二溴连苯三酚-磺酞(5',5"-dibromopyrogallol-sulfonephthalein)(Bromopyrogallol Red)、7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素、二乙烯三胺五乙酸酯、4,4'-二异硫氰酸二氢-二苯乙烯-2,2'-二磺酸,4,4'-二异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS,丹磺酰氯)、4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)、EclipseTM(Epoch Biosciences Inc.)、曙红和衍生物(曙红,曙红异硫氰酸酯)、赤藓红和衍生物(赤藓红B,赤藓红异硫氰酸酯)、乙锭、荧光素和衍生物(5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯荧光素(TET)、荧光胺、IR144、IR1446、镧系元素荧光体(lanthamide phosphors)、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副玫瑰苯胺(pararosaniline)、酚红、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、Oregon Green碘化丙啶、芘和衍生物(芘,芘丁酸盐,琥珀酰亚胺基1-芘丁酸盐)、7、9、21、35(分子探针)、活性红4( Brilliant Red 3B-A)、罗丹明和衍生物(6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明绿、罗丹明X异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red(德克萨斯红))、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、核黄素、玫瑰酸、铽螯合物衍生物、Quasar和
基于具体荧光团的荧光光谱选择适合的淬灭剂。有用的淬灭剂包括,例如,BlackHoleTM淬灭剂BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3(Biosearch Technologies,Inc.)和ATTO系列的淬灭剂(ATTO 540Q、ATTO 580Q和ATTO 612Q;Atto-Tec GmbH)。
在该方法的一些实施方案中,对反应样品混合物进行实时聚合酶链式反应(PCR)条件,在该条件下扩增生物样品中存在的各靶核酸,并检测和测量扩增产物。在一些实施方案中,将生物样品直接加载到直接扩增盘中,无需单独的前端样品制备,然后在同一盘中进行靶分析物的实时PCR检测并区分。在一些实施方案中,在直接扩增盘(来自FocusDiagnostics,Inc.的8-孔盘)中进行扩增。在一些实施方案中,使用SIMPLEXA直接测定在直接扩增盘中进行实时PCR扩增,且使用集成热循环仪(如由3MTM(St.Paul,Minn.,USA)销售的3MTM集成循环仪)进行检测。3MTM集成循环仪可接纳直接扩增盘,并且能够为每个盘进行多次测定。此装置可以>5℃每秒加热并以>4℃每秒冷却。循环参数可根据待延伸的扩增产物的长度而变化。在一些实施方案中,利用寡核苷酸引物、探针和/或引物-探针,样品中可包括内部阳性扩增对照(IPC)。
检测靶核酸的替代方法
可替换地,通过测量反应的终点可发生靶核酸的检测。在终点检测中,可通过首先对扩增子进行大小分离,然后检测大小分离的扩增子来检测扩增子。可通过凝胶电泳、柱层析术、毛细管电泳或本领域已知的其他分离方法来完成不同大小的扩增子的分离。
可检测标签可以掺入核酸中,与核酸结合或与核酸缀合。标签可通过各种长度的间隔臂附接以减少潜在的空间位阻或对其他有用或所需特性的影响。参见,例如Mansfield,9Mol.Cell.Probes 145-156(1995)。可通过共价或非共价手段将可检测标签并入核酸中,例如,通过转录如通过使用Klenow聚合酶的随机引物标记,或切口平移(nicktranslation),或扩增,或本领域已知的等同物。例如,将核苷酸碱基与可检测模块如荧光染料缀合,然后在核酸合成或扩增期间并入核酸。
有助于检测靶核酸的其他有用标签的实例包括放射性同位素(例如32P,35S,3H,14C,125I,131I)、电子致密试剂(例如金),酶(例如辣根过氧化物酶,β-半乳糖苷酶,荧光素酶,碱性磷酸酶),比色标签(例如胶体金),磁性标记(例如DynabeadsTM),生物素,洋地黄毒苷(dioxigenin),或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。其他标签包括分别能够与相应的受体或寡核苷酸互补物形成复合物的配体或寡核苷酸。该标签可直接并入待检测的核酸,或者其可附接于与待检测的核酸杂交或结合的探针(例如寡核苷酸)或抗体。
在其他实施方案中,荧光核苷酸类似物可用于标记核酸,参见,例如Jameson,Methods.Enzymol.278:363-390(1997);Zhu,Nucl.Acids Res.22:3418-3422(1994)。美国专利号5,652,099和6,268,132还描述了通过酶促或化学合成并入核酸(例如DNA和/或RNA)或寡核苷酸以产生荧光核苷酸的核苷类似物。美国专利号5,135,717描述了用作荧光标记的酞菁和四苯并三氮杂卟啉(tetrabenztriazaporphyrin)试剂。
在一些实施方案中,可检测标记的探针可用于杂交测定中以检测生物样品内的靶核酸序列,该测定包括但不限于Northern印迹、Southern印迹、微阵列、点或狭缝印记和原位杂交测定,如荧光原位杂交(FISH)。一些实施方案可采用杂交方法测量多核苷酸基因产物(如mRNA)的表达。用于进行多核苷酸杂交测定的方法在本领域中已得到充分的开发。杂交测定程序和条件会根据应用而变化,并且根据已知的一般结合方法选择,其包括下面提到的那些:Maniatis等Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版.Cold SpringHarbor,N.Y.,1989);Berger和Kimmel Methods in Enzymology,Vol.152,Guide toMolecular Cloning Techniques(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif,1987);Young和Davis,PNAS.80:1194(1983)。
本技术的博德特氏菌属筛选测定
霍氏博德特氏菌基因组通常包含约3-5个拷贝的hIS1001序列和8-10个拷贝的IS481序列。副百日咳博德特氏菌基因组通常包含约20个拷贝的IS1001序列。百日咳博德特氏菌通常包含约50-200个拷贝的IS481序列。
在本公开的多种实施方案中,引物和探针用于本文所述的方法中以扩增和检测致病性博德特氏菌属菌种的靶核酸序列。在一些实施方案中,靶核酸可包括来自百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌的IS481插入序列(和其片段),来自副百日咳博德特氏菌的IS1001插入序列(和其片段),和来自霍氏博德特氏菌的hIS1001插入序列(和其片段)。此外,引物还可用于扩增一种或多种对照核酸序列。
在一些实施方案中,该对照核酸序列包括5’TAACCCCGCGATAAAGACAGAAGATTATGCATACGAGATCAAAGGAGCCGGCCTTTTCTCTAGAGATCTCTTATTTTCCTTGAAGTCACCTGTTTATGTTAAAGCAGGTGAGCAGGTATACATTCAGTACGATCTGAACAAAAGCAATGCAGAACTTGCTCTCGACTATGGTTTTGTGGAATCAAACCCTAAACGGAACTCATATACTTTAACAATAGAGATACCAGAATCAGACCCATTCTTTGGGGATAAGTTGGATATTGCTGAGAGTAACAAGATGGGTGAGACCGGATACTTTGACATAGTAGACGGCCAGACTCTTCCCGCTGGTATGC TTCAGTACCTTCGGCTTGTGGCTCTTGGCGGTCCAGATGCTTTCTTATTAGAATCTATCTTCAATAACACCATATG GGGTCATCTTGAATTGCCTGTAAGTCGTACAAACGAGGAACTCATATGCCGTGTTGTCAGAGATGCCTGCAAATCTGCTCTGTCTGGTTTTGATACGACCATTGAAGAGGATGAGAAGCTTCTGGACAAAGGAAAGCTTGAGCCTAGGTTGGAAATGGCTCTCAAG 3’(SEQ ID NO:13),且包括5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQ ID NO:17)的正向引物,包括5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)的反向引物和包括5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)的可检测的标记核酸探针用于扩增该对照核酸序列。在一些实施方案中,该对照靶核酸包括5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTGTGGCTCTTGGCGGTCCAGATGCTTTCTTATTAGAATCTATCTTCAATAACACCATATGGGGTCATCTTGAATTGCCTGTAAGTCGTACAAACGAGGAACTCATATGCCGTGTTGTCAGAGATGCCTGCAA 3’(SEQ ID NO:20)。
本技术的引物和探针用于本文所述的方法以扩增和检测包括对应于IS481重复元件的SEQ ID NO:1的靶核酸,包括对应于IS1001重复元件的SEQ ID NO:2的靶核酸,和包括对应于hIS1001重复元件的SEQ ID NO:3的靶核酸。在一个实施方案中,该方法涉及采用特异性针对IS481、IS1001和hIS1001重复元件的引物对。利用针对各靶物的单独标签,可以单独地或以多重的形式检测本文所述的靶核酸。
用于扩增和检测对霍氏博德特氏菌特异性的标记基因的全部或片段的特异性引物、探针和引物-探针包括针对存在于霍氏博德特氏菌但不存在于其他博德特氏菌属菌种中的序列的那些。检测霍氏博德特氏菌-特异性基因有助于从可含有另一种致病物种(如百日咳博德特氏菌)的样品中区分出含有霍氏博德特氏菌的样品。合适的标记基因是hIS1001多拷贝插入序列(参加,例如GenBank登录号AY786982.1),并如下所示。
GTGTTGTYAATGCCCTCAACGATGCTGGTGTTGAGCCGGTGGCGACAGCGAGACAGAATCCCGTGCAGATAGGCTTTTAGCTTGAGCGCGAAGTGAGCCAAGGCGGCGATGCCGCTGCCCTGAGCCTGTTGCAGCCAGTGATCCCATGCCTGGCGGGCGTAGCCGGGGTGTTGGTAGAACCACAGCTGTTTGAGCTCATCGCGCATCAGATAAGCGGTGAGCAAGGGCTGGTTGGCCTGGAGCAACTCGTCCAACTTTACCGATTGGCACGGATCGAGGTTTTTGCGATTGCGCAGCAGT AGCCAGCGACTGGACTTGATCACCCGGCGGGCCGGCTTGTCGTGCCGCAACTGGTTCGCTTGGTCTACACGCACCCG GTCTATCACTTCACGGCCGTACTTGGCCACGACGTGGAACAGGTCGTAGACGATCTCGGCGTTGGGGCA
(SEQ ID NO:14)
使用本文公开的方法产生的hIS1001扩增子的核酸序列标有下划线。
在一些实施方案中,hIS1001靶核酸包括5’GGCACGGATCGAGGTTTTTGCGATTGCGCAGCAGTAGCCAGCGACTGGACTTGATCACCCGGCGGGCCGGCTTGTCGTGCCGCAACTGGTTCGCTTGGTCTACACGCACCCGGTCTATCACTTCACGGCCGTA 3’(SEQ ID NO:3)或其片段。用于扩增和检测hIS1001重复元件的例示性引物和标记的探针序列包括:
Fwd引物 | 5’GGCACGGATCGAGGTTTTT 3’(SEQ ID NO:4) |
Rev引物 | 5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA 3’(SEQ ID NO:5) |
探针 | 5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA 3’(SEQ ID NO:6) |
在GenBank登录号JX013521.1中提供了副百日咳博德特氏菌IS1001的核苷酸序列,并如下所示。使用本文公开的方法产生的IS1001扩增子的核酸序列标有下划线:
GCTGGATCGCAAGTTGATGGAGTCGCTGGGAGGCTGGCAGGGCTATGGCGTCGAACGCGTGGAATGGCCCGAAGACCCAGGGCGCACGCTGTCGATCTATTTGAAGCCAACGGCCAAGGTGATGCTGTGCGAGCAGTGCGGCGCGCGGTGTCGCCAGGTGCATGAGACCACGGTTCGACGGGTGCGAGATCTGCCGTTATTCGAGTATCGGGTCGTTCTGCACGTGCCGCGCCGACGCTTGTGGTGTGAGCAATGCGGCGGCCCGCGCCTGGAGCGGCTTGCCTGGCTGGGGCGATATCAACGGGTGACGGATCGGCTGGCGCAGGCCTGCAGCCAATTGCTGCAATCGAGCAACGTGCAGGCGGTGGCGAGGTTCTTCGAGCTGGGTTGGCATACCGTCAAGACGCTGGACAAGGCTCGGCTGCGTGCGTCGGTGCGCGAACCGGATTGGTCCAAGATCGAGTATTTGGCGATGGACGAGTTTGCCCTGCACAAAGGGCATCGCTACGCGACAGTGGTGGTCGATCCGATCGGCAGGCAGGTGCTGTGGATTGGCCCAGGACGCTCACGCGAGACGGCCCGGGCGTTCTTCGAACAATTGCCGCCTGGGGCCGCCCAACGCATCAAGGCCGTTGCCATCGACATGACCACCGCCTACGAGTTGGAGATCCAGGCCCACAGCCCACAGGCGGAGATCGTCTATGACTTGTTCCATGTCGTGGCCAAGTATGGACGAGAGGTCATTGATCGGGTGCGCGTGGATCAGGCCAATCAACTACGCCAGGATCGTCCCGCACGCAGGATCATCAAATCGAGTCGCTGGCTGCTGCTGCGCAACCGTGACAACCTGGATCGGCAGCAGGCCGTCCGGCTCGACGAATTGCTGCAAGCCAACCAGCCGCTGCTGACGGTCTAT GTCCTGCGTGACGAACTCAAACGGCTCTGGTTCTACCAAAGACCTGCCTGGGCAAGACAAGCCTGGAACCACTGGTACGAGCAGGCCGAGCAAAGCGGAATAGCCGCCTTGAACACCTTCGCTCAGCGCTTGAAAGGCTATCTGCACGGCATCCTGGCCAGATGCCGACATCCCCTGAACACCAGCATTGTCGAGGGCATCAACAACACTATCAAGGTCATCAAGCGGCGCGCTTACGGCTACCGCGACCAGGAATACTTCTTCCTCAAAATCC
(SEQ ID NO:15)
在一些实施方案中,IS1001靶核酸包括5’CGGCTCGACGAATTGCTGCAAGCCAACCAGCCGCTGCTGACGGTCTATGTCCTGCGTGACGAACT 3’(SEQ ID NO:2)或其片段。用于扩增和检测IS1001多拷贝插入序列(参见,例如GenBank登记号JX013521.1)的例示性引物和标记的探针序列包括:
Fwd引物 | 5’CGGCTCGACGAATTGC 3’(SEQ ID NO:7) |
Rev引物 | 5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8) |
探针 | 5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9) |
在GenBank登录号AB473880.1中提供了百日咳博德特氏菌IS481的核苷酸序列,并如下所示。使用本文公开的方法产生的IS481扩增子的核酸序列标有下划线:
GTTAGGTGTGAAGATTCAATAGGTTGTATGCATGGTTCATCCGAACCGGATTTGAGAAACTGGAAATCGCCACCCCCCCAGTTCACTCAAGGAGCCCGGCCGGATGAACACCCATAAGCATGCCCGATTGACCTTCCTACGTCG ACTCGAAATGGTCCAGCAATTGATCGCCCATCAAGTTTGTGTGCCTGAAGCGGCCCGCGCCTATGGGGTCACCGCGCCGACTGTGCGCAAATGGCTGGGCCGCTTCCTGGCTCAGGGCCAGGCGGGCTTGGCCGATGCGTCCTCGCGCCCGACGGTCTCGCCCCGAGCGATTGCGCCGGCCAAGGCGCTGGCTATCGTGGAGCTGCGCCGCAAGCGGCTGACCCAAGCGCGCATCGCCCAGGCGCTGGGCGTGTCAGCCAGCACCGTCAGCCGCGTCCTGGCCCGCGCCGGTCTGTCGCACCTGGCCGACCTGGAGCCGGCCGAGCCGGTGGTGCGCTACGAGCATCAGGCCCCCGGCGATCTGCTGCACATCGACATCAAGAAGCTGGGACGTATCCAGCGCCCTGGCCACCGGGTCACGGGCCACCGACGCGATACCGTTGAGGGGGCCGGCTGGGACTTCGTCTTCGTGGCCATCGATGACCACGCCCGCGTGGCCTTCACCGACATCCACCCCGACGAGCGCTTCCCCAGCGCCGTCCAGTTCCTCAAGGACGCAGTGGCCTACTACCAGCGCCTGGGCGTGACCATCCAGCGCTTGCTCACCGACAATGGCTCGGCCTTTCGCAGCCGCGCCTTCGCCGCGCTGTGCCATGAGCTGGGCATCAAGCACCGCTTTACCCGACCTTACCGCCCACAGACCAATGGCAAGGCCGAACGCTTCATCCAGTCGGCCTTGCGTGAGTGGGCTTACGCTCACACCTACCAGAACTCCCAACACCGAGCCGATGCCATGAAATCCTGGTTACACCACTACAACTGGCATCGACCCCACCAAGGCATCGGGCGCGCTGTACCCATCTCCAGACTCAACCTGGACGAATACAACCTATTGACAGTTCACAGTTAGG(SEQ ID NO:16)
在一些实施方案中,IS481靶核酸包括5’CCATAAGCATGCCCGATTGACCTTCCTACGTCGACTCGAAATGGTCCAGCAATTGATCGCCCATCAAGTTTGTGTGCCTGAAGCG 3’(SEQ ID NO:1)或其片段。用于扩增和检测IS481多拷贝插入序列(参见,例如GenBank登记号AB473880.1)的例示性引物和标记的探针序列包括:
Rev引物 | 5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10) |
Fwd引物 | 5’CCATAAGCATGCCCGATT 3’(SEQ ID NO:11) |
探针 | 5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC3’(SEQ ID NO:12) |
因此,使用本公开的方法定性检测和区分霍氏博德特氏菌和百日咳博德特氏菌可以在具有集成循环仪系统的直接扩增盘上利用引物对,标记的探针和用于扩增和检测IS481、IS1001和hIS1001重复元件的实时PCR。利用此方法,在同一反应中通过荧光标记的探针特异性扩增和同时检测靶基因组DNA。与hIS1001重复元件特异性杂交的探针可包括JOE标签,且与IS481和IS1001重复元件特异性杂交的各探针可分别包括FAM标签和CFR610标签。与对照靶核酸特异性杂交的探针可包括Q670荧光团。
因此,在一方面中,本公开提供一种用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在的方法,其包括:(a)使该生物样品与下列接触:(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)通过评价各靶核酸的荧光信号来检测该生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在,由此(i)当检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号时,在该生物样品中检测到霍氏博德特氏菌(B.holmesii);(ii)当检测到针对IS1001靶核酸的荧光信号时,在该生物样品中检测到副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis);和(iii)当检测到针对IS481靶核酸的荧光信号且未检测到针对hIS1001的荧光信号时,在该生物样品中检测到百日咳博德特氏菌(B.pertussis),其中该致病性博德特氏菌属菌种是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌中的一种或多种;而且其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。实时PCR扩增可在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。该生物样品可包括鼻咽(NP)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。
博德特氏菌属感染的治疗
本文公开了用于确定表现出百日咳样症状的患者是否会从用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗中受益的方法,所述治疗剂单独或与靶向其他致病性博德特氏菌属菌种的治疗剂组合。
抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂的实例包括氟喹诺酮类、碳青霉烯类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(例如,Bactrim,Septra)和霍氏博德特氏菌-特异性抗体。在一些实施方案中,该氟喹诺酮类选自下组:环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。在某些实施方案中,该碳青霉烯类选自下组:亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南、比阿培南、阿祖培南(PZ-601)、替比培南、来那培南、托莫培楠和噻嗯培南(噻烯霉素)。
抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂的实例包括全细胞(wP)百日咳博德特氏菌疫苗、非细胞百日咳博德特氏菌疫苗、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(例如Bactrim,Septra)、泰利霉素和大环内酯类抗生素。在一些实施方案中,该大环内酯类抗生素选自下组:阿奇霉素(希舒美)、克拉霉素(Biaxin)、红霉素(E-Mycin、Eryc、Ery-Tab、PCE、Pediazole、无味红霉素)和罗红霉素。
抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂的实例包括甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(例如,Bactrim,Septra)、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。
在一方面中,本公开提供一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)如果检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号,选择患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗,其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
在一些实施方案中,抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:氟喹诺酮类、碳青霉烯类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑和霍氏博德特氏菌-特异性抗体。在一些实施方案中,该氟喹诺酮类选自下组:环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。在一些实施方案中,该碳青霉烯类选自下组:亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南、比阿培南、阿祖培南(PZ-601)、替比培南、来那培南、托莫培楠和噻嗯培南(噻烯霉素)。
在一方面中,本公开提供一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用霍氏博德特氏菌-特异性抗体和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸的;(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)如果检测到针对hIS1001的荧光信号和针对IS1001靶核酸的荧光信号,则选择患者使用霍氏博德特氏菌特异性抗体和额外的治疗剂治疗,其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
在一些实施方案中,额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。
在另一方面中,本公开提供一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制百日咳博德特氏菌治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:(i)扩增IS481的第一引物对,其包括与SEQ IDNO:1或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(ii)扩增IS1001的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;(iii)扩增hIS1001的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和(d)如果(i)检测到针对IS481靶核酸的荧光信号和针对IS1001靶核酸的荧光信号,且(ii)未检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号,则选择患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗,其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
在此方法的一些实施方案中,额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。
在此方法的一些实施方案中,其中抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:全细胞(wP)百日咳博德特氏菌疫苗、非细胞百日咳博德特氏菌疫苗、泰利霉素和大环内酯类抗生素。在一些实施方案中,该大环内酯类抗生素选自下组:阿奇霉素(希舒美)、克拉霉素(Biaxin)、红霉素(E-Mycin、Eryc、Ery-Tab、PCE、Pediazole、无味红霉素(Ilosone))和罗红霉素。
算法
在对样品-反应混合物进行实时PCR,并检测和测量与扩增的IS481,IS1001和hIS1001靶重复元件相关的荧光信号时,本技术的方法还提供用于确定一种或多种相关致病性博德特氏菌属菌种(即百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌)存在的算法,该算法通过匹配来自扩增的靶核酸序列的循环阈值(Ct)来提供最终结果。
在一些实施方案中,使用标记有JOE的探针扩增hIS1001靶核酸序列,使用标记有在可见光谱的红色区域发荧光的氧杂蒽染料(如CFR610)的探针扩增IS1001靶核酸序列,和使用标记有荧光素亚酰胺荧光团(如FAM)的探针扩增IS481靶核酸序列。因此,经由JOE荧光团检测hIS1001信号,经由CRF610荧光团检测IS1001信号和经由FAM荧光团检测IS481信号。
博德特氏菌属菌种算法规定:
N/A=检测到的信号不适用于分析
因此,可基于以下情况确定样品中致病性博德特氏菌属菌种的存在或不存在:
(1)具有对于IS481靶核酸序列的可检测信号(FAM)但没有对于IS1001可检测的CFR610信号且没有对于hIS1001可检测的JOE信号的样品被解释为仅含有百日咳博德特氏菌。
(2)具有对于IS1001靶核酸序列的可检测信号(CRF610)但没有对于IS481可检测的FAM信号且没有对于hIS1001可检测的JOE信号的样品被解释为仅含有副百日咳博德特氏菌。
(3)具有对于hIS1001靶核酸序列的可检测信号(JOE)但没有对于IS1001可检测的CRF610信号的样品被解释为仅含有霍氏博德特氏菌。
(4)当检测到对于IS481靶核酸序列的荧光信号(FAM)和对于IS1001靶核酸序列的荧光信号(CRF610),但未检测到对于hIS1001的荧光信号(JOE)时,将样品鉴定为包含百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌两者。
(5)当检测到对于IS1001靶核酸序列的荧光信号(CRF610)和对于hIS1001靶核酸序列的荧光信号(JOE)时,将样品鉴定为包含霍氏博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌两者。
(6)缺乏对于IS481(FAM),IS100(CFR610)和hIS1001(JOE)的可检测信号的样品被解释为对于百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌为阴性。
试剂盒
本公开还提供用于检测对应于致病性博德特氏菌属菌种的靶核酸序列的试剂盒。
本技术的试剂盒包括至少两个寡核苷酸,所述寡核苷酸可作为引物或引物-探针,该引物或引物-探针用于扩增一种或多种多拷贝插入序列以确定生物样品中致病性博德特氏菌属菌种的存在,所述多拷贝插入序列选自下组:IS481、IS1001和hIS1001。
在一些实施方案中,本技术的试剂盒包括单一引物对,其与选自下组的单一多拷贝插入序列的靶核酸特异性杂交:IS481、IS1001和hIS1001。在其他实施方案中,本技术的试剂盒包括多个引物对,其包括与IS481的靶核酸特异性杂交的第一引物对,和与IS1001或hIS1001的靶核酸特异性杂交的第二引物对。在一些实施方案中,本技术的试剂盒包括对个引物对,其包括与IS1001的靶核酸特异性杂交的第一引物对,和与hIS1001的靶核酸特异性杂交的第二引物对。在一些实施方案中,本技术的试剂盒包括多个引物对,其包括与IS481的靶核酸特异性杂交的第一引物对,与IS1001的靶核酸特异性杂交的第二引物对,和与hIS1001的靶核酸特异性杂交的第三引物对。在上述任一实施方案中,IS481的靶核酸对应于SEQ ID NO:1;IS1001的靶核酸对应于SEQ ID NO:2;且hIS1001靶核酸对应于SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中,该试剂盒包括能够与IS481靶核酸特异性杂交的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸。此外或可替换地,该试剂盒包括能够与IS1001靶核酸特异性杂交的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85%-95%相同的核苷酸。此外或可替换地,该试剂盒包括能够与hIS1001靶核酸特异性杂交的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85%-95%相同的核苷酸。
在一些实施方案中,该试剂盒包括一个或多个引物对,此引物对选自以下当中:5’CCATAAGCATGCCCGATT 3’(SEQ ID NO:11)和5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10)(IS481引物对);5’CGGCTCGACGAATTGC 3’(SEQ ID NO:7)和5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8)(IS1001引物对);以及5’GGCACGGATCGAGGTTTTT 3’(SEQ ID NO:4)和5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA 3’(SEQ ID NO:5)(hIS1001)。此外或可替换地,该试剂盒包括由正向引物和反向引物组成的内部对照引物对,正向引物包括5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQ ID NO:17),反向引物包括5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)。
此外或可替换地,在一些实施方案中,该试剂盒提供与选自下组的单一多拷贝插入序列的靶核酸特异性杂交的单一核酸探针:IS481、IS1001和hIS1001。在其他实施方案中,本技术的试剂盒包括多个核酸探针,其包括与IS481的靶核酸特异性杂交的第一核酸探针,以及与IS1001或hIS1001的靶核酸特异性杂交的第二核酸探针。在一些实施方案中,本技术的试剂盒包括多个核酸探针,其包括与IS1001的靶核酸特异性杂交的第一核酸探针,以及与hIS1001的靶核酸特异性杂交的第二核酸探针。在一些实施方案中,本技术的试剂盒包括多个核酸探针,其包括与IS481的靶核酸特异性杂交的第一核酸探针,与IS1001的靶核酸特异性杂交的第二核酸探针,以及与hIS1001靶核酸特异性杂交的第三核酸探针。
在一些实施方案中,该第一核酸探针能够与SEQ ID NO:1或其互补序列的IS481靶核酸的区段杂交,且是用荧光团可检测标记的。此外或可替换地,在一些实施方案中,该第二核酸探针能够与SEQ ID NO:2或其互补序列的IS1001靶核酸的区段杂交,且是用荧光团可检测标记的。在一些实施方案中,该第三核酸探针能够与SEQ ID NO:3或其互补序列的hIS1001靶核酸的区段特异性杂交,且是用荧光团可检测标记的。
在一些实施方案中,该试剂盒包括一个或多个核酸探针,该核酸探针选自以下当中:5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC 3’(SEQ ID NO:12)或其互补序列(IS481探针);5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9)或其互补序列(IS1001探针);和5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA 3’(SEQ ID NO:6)或其互补序列(hIS1001探针)。此外或可替换地,该试剂盒包括内部对照核酸探针,其包括5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)或其互补序列。
在一些实施方案中,该试剂盒包括含有浓度为250nM或以下的至少一种靶特异性核酸探针的液体介质。利用这种试剂盒,以所需的量提供探针,以根据本技术进行可靠的多重检测反应。在一些实施方案中,该靶特异性核酸探针是可检测标记的。
在一些实施方案中,该试剂盒还包括缓冲液,具有聚合酶活性的酶,具有聚合酶活性且缺少5'→3’核酸外切酶活性或5'→3’和3’→5'核酸外切酶活性两者的酶,酶辅因子如镁或锰,盐,链延伸核苷酸如脱氧核苷三磷酸(dNTPs),修饰的dNTPs,核酸酶-抗性的dNTPs或标记的dNTPs,其为进行测定或反应(如扩增和/或检测对应于致病性博德特氏菌属菌种的靶核酸序列)所必需的。
在一个实施方案中,本技术的试剂盒还包括阳性对照核酸序列和阴性对照核酸序列以确保在实验进行期间测定的完整性。试剂盒可进一步包含用于比较生物样品中和对照核酸样品(如对于IS481、IS1001和hIS1001中的一种或多种具有已知拷贝数的样品)中IS481、IS1001和hIS1001中的一种或多种的拷贝数的手段。该试剂盒还包括使用说明,自动化分析软件,容器,包装如用于商业销售的包装等。
该试剂盒可进一步包括下列中的一种或多种:洗涤缓冲液和/或试剂,杂交缓冲液和/或试剂,标记缓冲液和/或试剂,以及检测手段。该缓冲液和/或试剂通常针对试剂盒所用于的特定扩增/检测技术进行优化。使用这些缓冲液和试剂进行该方法的不同步骤的方案也可包括在试剂盒中。
试剂盒另外可包含测定定义扫描卡和/或说明书,例如用于在测定中使用寡核苷酸的印刷或电子说明书。在一些实施方案中,试剂盒包括扩增反应混合物或扩增主混合物。试剂盒中包含的试剂可以包含在一个或多个容器中,如小瓶。
对于扩增和检测DNA内部对照为特异性的引物、探针和/或引物-探针可作为靶引物对包含在扩增主混合物中以监测潜在的PCR抑制。扩增和检测靶物和内部对照所必需的试剂可配制成一体化扩增主混合物,其可作为单一反应等分试样在试剂盒中提供。
实施例
实施例1:使用SIMPLEXA直接实时PCR检测致病性博德特氏菌属菌种从患者收集鼻咽拭子样品。将50μL未加工和未稀释的鼻拭子样品直接加载到SIMPLEXA直接扩增盘(FocusDiagnostics,Inc.,Cypress,CA,USA)的楔形物1的样品孔中,而不进行单独的前端样品制备步骤。
将50μL的扩增主混合物抽吸至该盘的楔形物1的反应孔中,其中该扩增主混合物包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、氯化镁、氯化钾、由SEQ ID NO:4-5,7-8和10-11组成的引物、由SEQ ID NO:6,9和12组成的探针和内部对照DNA片段(SEQ ID NO:13)和对于对照片段特异性的引物对和探针(SEQ ID NO:17-19)。将由SEQ ID NO:6,12,9和19组成的TaqMan探针分别用JOE,FAM,CFR610和Q670标记。将掺杂有培养的百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌的阳性对照和阴性对照包括在该测定中。
用箔标定楔形物,然后将直接扩增盘插入3MTM集成循环仪(3M,St.Paul,MN,USA)中,并在循环仪中开始实时PCR。该PCR循环条件包括下列步骤:i)在75℃预加热样品,300秒,1个循环ii)在97℃聚合酶活化,120秒,1个循环,和iii)在97℃变性,10秒在和56℃退火,30秒,进行40个循环。对应于IS481,IS1001和hIS1001的扩增子的特异性荧光阈值浓度分别设定在2000、5000和2000。
通过荧光标记的探针在同一反应中特异性扩增且同时检测靶基因组DNA。通过下列算法确定致病性博德特氏菌属菌种的存在,该算法通过评价FAM、JOE和CFR610通道中的循环阈值(Ct)来提供最终结果。
(1)具有可检测的FAM信号但无可检测的CFR610和JOE信号的样品被解释为百日咳博德特氏菌阳性。
(2)具有可检测的CFR610信号但无可检测的FAM和JOE信号的样品被解释为副百日咳博德特氏菌阳性。
(3)具有可检测的JOE信号但无可检测的CFR610的样品被解释为霍氏博德特氏菌阳性。
(4)在FAM和CFR610通道中具有信号但没有可检测的JOE信号的样品被解释为百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌两者阳性。
(5)在JOE和CFR610通道中具有信号的样品被解释为霍氏博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌两者阳性。
实施例2:博德特氏菌属多重测定的检测限
使用百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌的定量细菌菌株,进行检测限(LoD)研究以确定SimplexaTM博德特氏菌属直接测定在鼻咽拭子基质中的分析灵敏度。将对每个细菌菌株进行筛选以确定推定的LoD并随后进行确认。每个菌株的LoD被确定为对于20个重复具有≥85-95%检测(20个重复中检测到≥19个)的最低浓度。
实施例3:博德特氏菌属多重测定的交叉反应性
对于交叉反应性测定,对照鼻拭子样品会掺有下面列出的测试生物之一(每个生物体n=5)。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) | 肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae) |
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) | 肺炎克莱伯氏菌(Klebsiella pneumonia) |
嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila) | 肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia) |
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) | 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) |
粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis) | 甲型流感病毒(Influenza A) |
乙型流感病毒(Influenza B) | RSV B |
对每个样品进行博德特氏菌属多重测定。在每种情况下,Ct值≤40被解释为百日咳博德特氏菌交叉反应性的阳性结果,Ct值≤40被解释为副百日咳博德特氏菌交叉反应性的阳性结果,以及Ct值≤40被解释为霍氏博德特氏菌交叉反应的阳性结果。
预期对于任何上述微生物物种都不会观察到交叉反应性。
实施例4:将博德特氏菌属SIMPLEXA直接实时PCR结果与双向测序进行比较
使用一组284个鼻咽拭子样本评估SimplexaTM博德特氏菌属直接测定的临床表现。该组包含102个百日咳博德特氏菌阳性,37个副百日咳博德特氏菌阳性,37个霍氏博德特氏菌阳性和108个所有靶物阴性。35个霍氏博德特氏菌阳性样品是人为的。将SimplexaTM测定结果与双向测序结果进行比较以确定阳性和阴性一致性。FAM、JOE、CFR610和Q670的优化阈值分别为2000、2000、5000和5000。
表1:百日咳博德特氏菌一致性
a通过测序8个样品报告为百日咳博德特氏菌阴性,但由Simplexa报告为百日咳博德特氏菌阳性,Ct值分别为39.2,37.1,36.1,36.0,37.3,36.9,38.0和37.1。
b通过测序3个样品报告为百日咳博德特氏菌阳性,但由Simplexa报告为百日咳博德特氏菌阴性。
表2:副百日咳博德特氏菌一致性
c通过测序3个样品报告为副百日咳博德特氏菌阴性,但由Simplexa报告为副百日咳博德特氏菌阳性,Ct值分别为38.2,36.5和39.8。
表3:霍氏博德特氏菌一致性
d通过测序1个样品报告为霍氏博德特氏菌阴性,但由Simplexa报告为霍氏博德特氏菌阳性,Ct值为33.4。
结果使用284个去识别的(de-identified)临床样本,对于临床鼻咽标本,百日咳博德特氏菌的双向测序结果的阳性和阴性一致性百分比分别为97.1%(99/102)和95.6%(174/182)(表1)。对于临床鼻咽样本,副百日咳博德特氏菌的双向测序结果的阳性和阴性一致性百分比分别为100%(37/37)和98.8%(244/247)(表2)。对于临床鼻咽样本,霍氏博德特氏菌的双向测序结果的阳性和阴性一致性百分比分别为100%(37/37)和99.6%(246/247)(表3)。
这些结果证明,SimplexaTM博德特氏菌属直接测定能够直接检测鼻咽样本中的百日咳博德特氏菌,副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌,而无需单独的核酸提取步骤,并且具有与用双向测序所观察到的相当的性能。
等同物
本技术不限于本申请中描述的特定实施方案,其旨在作为本技术的各个方面的单一说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可对本技术进行许多修改和变化,这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外,本技术范围内功能上等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前面的描述中是显而易见的。这些修改和变化旨在落入本技术的范围内。应理解的是本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统,其当然可以变化。还应理解的是本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而不意欲是限制性的。
术语“包括(comprising)”,“包括(including)”,“含有(containing)”等应当被广泛地理解而不受限制。此外,本文所使用的术语和表述已被用作说明的术语而非限制,并且无意使用这些术语和表述来排除所示和所述特征或其部分的任何等同物,但可认识的是在本公开所要求保护的范围内各种修改是可能的。
此外,在根据马库什群组描述本公开的特征或方面的情况下,本领域技术人员将认识到,本公开也因此以马库什群组的任何个体成员或成员的子群的形式描述。
如本领域技术人员可理解的是出于任何和所有目的,特别是在提供书面说明方面,本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可容易地被认为充分描述并使相同的范围分解为至少相等的一半,三分之一,四分之一,五分之一,十分之一等。作为非限制实施例,本文所讨论的每个范围可容易地分解为下三分之一,中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还可理解的是所有语言如“多至”,“至少”,“大于”,“小于”等的包括所记载的数字并且指随后可以分解为如上所述的子范围的范围。最后,如本领域技术人员可理解的是范围包括每个个体成员。因此,例如,具有1-3个细胞的组指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地,具有1-5个细胞的组指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组,等等。
本文所涉及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过提述以其整体(包括所有附图和表格)并入本文,其程度不能与本说明书的明确教导不一致。
Claims (58)
1.一种用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种(Bordetellaspecies)的存在的方法,其包括:
(a)使该生物样品与下列接触:
i.扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;
ii.扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;和
iii.扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;
以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;
(b)使所述反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;
(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的荧光信号;和
(d)通过评估各靶核酸的荧光信号来检测该生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在,由此
i.当检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号时,在该生物样品中检测到霍氏博德特氏菌(B.holmesii);
ii.当检测到针对IS1001靶核酸的荧光信号时,在该生物样品中检测到副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis);和
iii.当检测到针对IS481靶核酸的荧光信号且未检测到针对hIS1001的荧光信号时,在该生物样品中检测到百日咳博德特氏菌(B.pertussis);
其中该致病性博德特氏菌属菌种是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌中的一种或多种;和
其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
2.权利要求1的方法,其中该第一引物对由包含5’CCATAAGCATGCCCGATT 3’(SEQ IDNO:11)的第一正向引物和包含5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10)的第一反向引物对组成。
3.权利要求1或权利要求2的方法,其中该第二引物对由包含5’CGGCTCGACGAATTGC 3’(SEQ ID NO:7)的第二正向引物和包含5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8)的第二反向引物组成。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中该第三引物对由包含5’GGCACGGATCGAGGTTTTT 3’(SEQ ID NO:4)的第三正向引物和包含5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA 3’(SEQ ID NO:5)的第三反向引物组成。
5.权利要求1-4任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQID NO:1的IS481靶核酸的区段的第一核酸探针接触,其中该第一核酸探针是可检测标记的且包含5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC 3’(SEQ ID NO:12)。
6.权利要求5的方法,其中该第一核酸探针是用FAM荧光团可检测标记的。
7.权利要求1-6任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQID NO:2的IS1001靶核酸的互补物的区段的第二核酸探针接触,其中该第二核酸探针是可检测标记的且包含5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9)。
8.权利要求7的方法,其中该第二核酸探针是用CFR610荧光团可检测标记的。
9.权利要求1-8任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQID NO:3的hIS1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触,其中该第三核酸探针是可检测标记的且包含5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA3’(SEQ ID NO:6)。
10.权利要求9的方法,其中该第三核酸探针是用JOE荧光团可检测标记的。
11.权利要求1-10任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与扩增SEQ ID NO:20的对照靶核酸的第四引物对接触。
12.权利要求11的方法,其中该第四引物对由包含5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQID NO:17)的第四正向引物和包含5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)的第四反向引物组成。
13.权利要求11或12的方法,其进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触,该第四核酸探针是可检测标记的且包含5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)。
14.权利要求13的方法,其中该第四核酸探针是用Q670荧光团可检测标记的。
15.权利要求1-14任一项的方法,其中实时PCR扩增在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。
16.权利要求1-15任一项的方法,其中该生物样品是鼻咽(NP)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。
17.一种用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在的试剂盒,其包括:
a.扩增SEQ ID NO:1的IS481靶核酸或其互补物的第一引物对;
b.扩增SEQ ID NO:2的IS1001靶核酸或其互补物的第二引物对;和
c.扩增SEQ ID NO:3的hIS1001靶核酸或其互补物的第三引物对。
18.权利要求17的试剂盒,其进一步包括扩增SEQ ID NO:20的对照靶核酸的第四引物对。
19.权利要求17或18的试剂盒,其中该第一引物对能够与IS481靶核酸特异性杂交,所述IS481靶核酸包括与SEQ ID NO:1或其互补物至少85-95%相同的核苷酸。
20.权利要求17-19任一项的试剂盒,其中该第二引物对能够与IS1001靶核酸特异性杂交,所述IS1001靶核酸包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸。
21.权利要求17-20任一项的试剂盒,其中该第三引物对能够与hIS1001靶核酸特异性杂交,所述hIS1001靶核酸包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸。
22.权利要求17-21任一项的试剂盒,其中该第一引物对由包含5’CCATAAGCATGCCCGATT3’(SEQ ID NO:11)的第一正向引物和包含5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10)的第一反向引物组成。
23.权利要求17-22任一项的试剂盒,其中该第二引物对由包含5’CGGCTCGACGAATTGC3’(SEQ ID NO:7)的第二正向引物和包含5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8)的第二反向引物组成。
24.权利要求17-23任一项的试剂盒,其中该第三引物对由包含5’GGCACGGATCGAGGTTTTT 3’(SEQ ID NO:4)的第三正向引物和包含5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA3’(SEQ ID NO:5)的第三反向引物组成。
25.权利要求17-24任一项的试剂盒,其中该试剂盒进一步包括能够与SEQ ID NO:1的IS481靶核酸的区段或其互补物特异性杂交的第一核酸探针,其中该第一核酸探针是可检测标记的。
26.权利要求25的试剂盒,其中该第一核酸探针包含5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC3’(SEQ ID NO:12),或其互补物。
27.权利要求26的试剂盒,其中该第一核酸探针是用FAM荧光团可检测标记的。
28.权利要求17-27任一项的试剂盒,其中该试剂盒进一步包括能够与SEQ ID NO:2的IS1001靶核酸的区段或其互补物特异性杂交的第二核酸探针,其中该第二核酸探针是可检测标记的。
29.权利要求28的试剂盒,其中该第二核酸探针包含5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9),或其互补物。
30.权利要求29的试剂盒,其中该第二核酸探针是用CFR610荧光团可检测标记的。
31.权利要求17-30任一项的试剂盒,其中该试剂盒进一步包括能够与SEQ ID NO:3的hIS1001靶核酸的区段或其互补物特异性杂交的第三核酸探针,其中该第三核酸探针是可检测标记的。
32.权利要求31的试剂盒,其中该第三核酸探针包含5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA 3’(SEQ ID NO:6),或其互补物。
33.权利要求32的试剂盒,其中该第三核酸探针是用JOE荧光团可检测标记的。
34.一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:
(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:
(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;
(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;和
(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;
以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;
(b)使所述反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;
(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和
(d)如果检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号,则选择患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗,
其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
35.权利要求34的方法,其中该第一引物对由包含5’CCATAAGCATGCCCGATT 3’(SEQ IDNO:11)的第一正向引物和包含5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10)的第一反向引物组成。
36.权利要求34或权利要求35的方法,其中该第二引物对由包含5’CGGCTCGACGAATTGC3’(SEQ ID NO:7)的第二正向引物和包含5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8)的第二反向引物组成。
37.权利要求34-36任一项的方法,其中该第三引物对由包含5’GGCACGGATCGAGGTTTTT3’(SEQ ID NO:4)的第三正向引物和包含5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA 3’(SEQ ID NO:5)的第三反向引物组成。
38.权利要求34-37任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ ID NO:1的IS481靶核酸的区段的第一核酸探针接触,其中该第一核酸探针是可检测标记的且包含5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC 3’(SEQ ID NO:12)。
39.权利要求38的方法,其中该第一核酸探针是用FAM荧光团可检测标记的。
40.权利要求34-39任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ ID NO:2的IS1001靶核酸的互补物的区段的第二核酸探针接触,其中该第二核酸探针是可检测标记的且包含5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9)。
41.权利要求40的方法,其中该第二核酸探针是用CFR610荧光团可检测标记的。
42.权利要求34-41任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQ ID NO:3的hIS1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触,其中该第三核酸探针是可检测标记的且包含5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA 3’(SEQ ID NO:6)。
43.权利要求42的方法,其中该第三核酸探针是用JOE荧光团可检测标记的。
44.权利要求34-43任一项的方法,其进一步包括使该生物样品与扩增SEQ ID NO:20的对照靶核酸的第四引物对接触。
45.权利要求44的方法,其中该第四引物对由包含5’GCTTCAGTACCTTCGGCTTG 3’(SEQID NO:17)的第四正向引物和包含5’TTGCAGGCATCTCTGACAAC 3’(SEQ ID NO:18)的第四反向引物组成。
46.权利要求44或45的方法,其进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触,其中该第四核酸探针是可检测标记的且包含5’TGGCTCTTGGCGGTCCAGATG 3’(SEQ ID NO:19)。
47.权利要求46的方法,其中该第四核酸探针是用Q670荧光团可检测标记的。
48.权利要求34-47任一项的方法,其中实时PCR扩增是在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。
49.权利要求34-48任一项的方法,其中该生物样品是鼻咽(NP)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。
50.权利要求34-49任一项的方法,其中抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:氟喹诺酮类、碳青霉烯类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑和霍氏博德特氏菌-特异性抗体。
51.权利要求50的方法,其中该氟喹诺酮类选自下组:环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星(enoxacin)和莫西沙星。
52.权利要求50的方法,其中该碳青霉烯类选自下组:亚胺培南、美罗培南、厄他培南(ertapenem)、多利培南、帕尼培南、比阿培南、阿祖培南(razupenem)(PZ-601)、替比培南、来那培南、托莫培楠(tomopenem)和噻嗯培南(thienpenem)(噻烯霉素(Thienamycin))。
53.一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用霍氏博德特氏菌-特异性抗体和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:
(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:
(i)扩增IS481靶核酸的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸的;
(ii)扩增IS1001靶核酸的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;和
(iii)扩增hIS1001靶核酸的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸;
以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;
(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;
(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和
(d)如果检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号和针对IS1001靶核酸的荧光信号,选择患者使用霍氏博德特氏菌特异性抗体和额外的治疗剂治疗,
其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
54.权利要求53的方法,其中该额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星和莫西沙星。
55.一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法,其包括:
(a)使获自该患者的生物样品与下列接触:
(i)扩增IS481的第一引物对,其包括与SEQ ID NO:1或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;
(ii)扩增IS1001的第二引物对,其包括与SEQ ID NO:2或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;和
(iii)扩增hIS1001的第三引物对,其包括与SEQ ID NO:3或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸;
以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物;
(b)使反应-样品混合物经受实时PCR条件,在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;
(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号;和
(d)如果(i)检测到针对IS481靶核酸的荧光信号和针对IS1001靶核酸的荧光信号,且(ii)未检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号,则选择患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗,
其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。
56.权利要求55的方法,其中该额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星和莫西沙星。
57.权利要求55或56的方法,其中抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂:全细胞(wP)百日咳博德特氏菌疫苗、非细胞百日咳博德特氏菌疫苗、泰利霉素和大环内酯类抗生素。
58.权利要求57的方法,其中该大环内酯类抗生素选自下组:阿奇霉素(希舒美(Zithromax))、克拉霉素(Biaxin)、红霉素(E-Mycin、Eryc、Ery-Tab、PCE、Pediazole、无味红霉素(Ilosone))和罗红霉素。
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