KR102502129B1 - Pna 프로브를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 생산성에 막대한 피해를 입히는 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돼지 흉막폐렴균의 협막(capsule) 유전자(capsular polysaccharide, cps) 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 9 내지 15의 진단방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PNA 프로브는 기존의 PCR 방법에 비해 고민감도와 높은 정확도로 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 감별할 수 있을 뿐만 아니라, 위양성 판별도 용이하여, 양돈농가의 흉막폐렴 진단 및 백신개발에도 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 생산성에 막대한 피해를 입히는 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돼지 흉막폐렴균의 협막(capsule) 유전자(capsular polysaccharide, cps) 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 9 내지 15의 진단방법 및 키트에 관한 것이다.
돼지 흉막폐렴(Porcine pleuropneumoniae)은 전염성이 매우 높은 급성, 열성 전염병으로, 전 세계 양돈 산업에 막대한 경제적인 피해를 주고 있는 질병이다. 이 질병의 원인체인 Actinobacillus pleuropneumoniae(A. pleuropneumoniae, App)는 주로 공기를 통하거나(aerosol), 직접적인 접촉에 의해 전파되며, 감염된 돼지는 고열, 침울, 식욕부진, 호흡곤란으로 인한 개구복식호흡 및 기침증세를 보인다. 또한, 부검시 폐엽의 종창과 섬유소의 석출, 폐흉막의 비후 및 폐의 간변화를 관찰할 수 있고 현미경적 소견으로는 폐포의 비대 및 호중구의 침윤, 폐포 내 화농성 삼출물과 섬유소가 특징적이다. 돼지 흉막폐렴은 모든 연령의 돼지에서 감수성을 보이고 감염되나, 대개 12주령 이상의 돼지에서 심각한 임상증상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 국내에서의 발생은 포유기의 모돈과 자돈을 제외한 모든 연령대에서 발생하고 있어 국내 양돈 산업에 막대한 경제적인 피해를 주고 있다.
돼지의 흉막폐렴균은 성장인자로 NAD(nicotine adenine dinucleotide)의 의존형에 따라 2개의 생물형(biovar)와 협막을 구성하는 다당류의 차이에 따라 15종으로 구분하고 있다. 이 중에서 일부는 질병을 유발하지 않는 비병원성이지만, 다른 것들은 매우 심각한 질병을 유발한다. 균주 1, 5, 9, 11 및 12는 매우 치명적이고, 균주 3과 6은 매우 온순하다. 이러한 흉막폐렴균은 국가나 지역에 따라 다양하게 보고되고 있다. 흉막폐렴의 주요한 특징은 동일한 혈청형이라도 지역에 따라 병원성이 다를 수 있다는 것이다. 현재 시판중인 백신은 혈청형간 교차반응이 낮아 해당 국가 및 지역에 맞는 혈청형을 분리하고 이를 백신주로 사용하는 자가백신(autogeneous vaccine)도 사용하고 있는 실정이다.
혈청형의 확인방법으로 과거에는 공통항원간 교차반응을 이용한 혈청응집반응, 한천겔확산법, 간접혈구응집반응법 등을 혼합사용하였다. 따라서 표준혈청 등을 보유한 실험실에서만 혈청형 동정이 이루어졌다. 최근에는 유전자검사법의 발달로 다양한 혈청형에 대한 유전자검사법이 개발되었다(Jessing, J Clin Microbiol, 2003, pp 4095-4100., Angen, O Vet Microbiol, 2008, pp. 312-318). 이러한 진단기술을 바탕으로 현재 국내에서 혈청형 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10 및 12형 등이 보고되고 있다.
그러나, 현재까지 개발된 유전자 검사법은 혈청형간 유사성이 높아 유사혈청형 구별을 위하여 3-4종의 유전자 검사를 실시하는 혈청형을 동정하며, 일부 혈청형은 구분이 어려운 부분이 존재한다.
한국등록특허 제1527847호(215.06.04)에는 돼지 세균성 호흡기 질병 원인체 감별을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단키트에 관한 것으로, 돼지 세균성 호흡기 질병을 유발하는 원인체 검출 및 감별하기 위한 프라이머 세트, 상기 원인체를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 돼지 세균성 호흡기 질병의 원인체를 검출할 수 있는 돼지 세균성 호흡기 질병 원인체 검출방법에 관한 내용이 기재되어 있으며,
한국등록특허 제1756736호(2015.06.30)에는 다중 실시간 PCR을 통해서 임상샘플로부터 돼지 흉막폐렴균을 신속 탐지하는 방법 및 그 장치에 관한 것으로, 돼지의 폐조직으로부터 임상샘플을 수집하고, 상기 수집한 임상샘플로부터 DNA를 추출하며, 상기 추출한 DNA를 탬플릿으로 하여 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 1, 2, 7 및 12의 동시적 종식별과 혈청형 결정을 수행함으로써, 유전자 증폭을 수행하는 특정 프라이머를 사용해서 실시간 다중 PCR을 수행하는 돼지 흉막폐렴균의 신속탐지 방법 및 그 장치에 관한 내용이 기재되어 있으나, 그 정확도가 낮다는 단점이 있다.
한편, PNA는 peptide nucleic acids의 약자로 LNA (Locked nucleic acid), MNA (Morpholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로 인공적으로 합성하며 기본 골격이 전기적으로 중성인 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA의 경우 국내 원천특허로 국가 경쟁력을 가지는 소재로, PNA는 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하고, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소 (restriction enzyme)로 분해되지 않는 특징이 있다. 또한, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. DNA-DNA 결합 대비 PNA-DNA 결합력이 우수하며 융해 온도(melting temperature)가 약 2배 이상 높으므로, 1개의 뉴클레오티드 미스매치(nucleotide miss match)에도 융해 온도에서 10～15℃ 가량 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP 및 In/Del의 핵산 변화를 효과적으로 검출할 수 있게 된다.
PNA 프로브 혼성화 방법(Hybridization method)의 분석 방법으로는 FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis)를 주로 이용하는데, FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후, 만들어진 산물과 넣어준 프로브간의 결합력의 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 방법이다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 9～15 mer의 염기서열을 이용하여 제작하며, 원하는 Tm값을 가지는 프로브를 디자인하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절하거나, PNA 골격 gamma 위치에 Lysine, Glutamic acid 또는 Alanine 등 아미노산을 연결하여 Tm 값을 조절할 수 있다.
PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하고 따라서 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 기존의 HRM(High resolution melting) 방법은 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되어 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면 PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 정밀한 분석이 가능한 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 돼지 흉막폐렴균의 협막 단백질 유전자(capsular protein gene, cps)를 이용하여 혈청형 9 내지 15를 구분할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 돼지 흉막폐렴균의 협막유전자를 프라이머로 증폭한 다음, 유전자 특이적 PNA 프로브로 융해 곡선을 분석할 경우, 신속하고 정확하게 흉막폐렴균의 혈청형 9 내지 15를 구분할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 돼지 흉막폐렴균의 협막 유전자(cps)를 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 및 프라이머 쌍을 이용한 돼지 흉막폐렴균 협막유전자 검출을 통한 돼지 흉막폐렴 진단방법 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자(capsular polysaccharide, cps) 검출용 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (iii) 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (iv) 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (v) 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; (vi) 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 또는 (vii) 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 증폭용(primer pair)을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단방법을 제공한다:
(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 및;
(d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 결정하는 단계.
본 발명에 따른 PNA 프로브는 기존의 PCR 방법에 비해 고민감도와 높은 정확도로 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 감별할 수 있을 뿐만 아니라, 위양성 판별도 용이하여, 양돈농가의 흉막폐렴 진단 및 백신개발에도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법의 개념을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 내부 대조군의 프라이머 및 PNA 프로브의 결합 위치를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 협막 유전자의 증폭조건 및 융해곡선 분석 조건을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 표준균주와 내부대조군 및 각혈청형별 융해곡선을 형광 표지를 기준으로 정렬한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 혈청형에 따른 융해곡선 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 융해곡선 분석결과 공통되는 형광표지로 묶어서 정렬한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 PNA 프로브의 분석적 민감도를 표준균주를 이용하여 평가한 그래프이다.
도 8의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 특이도를 확인하기 위한 균주 리스트이며, (B)는 확인 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 PNA 프로브를 이용한 진단법과 종래 PCR법을 비교한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 내부 대조군의 프라이머 및 PNA 프로브의 결합 위치를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 협막 유전자의 증폭조건 및 융해곡선 분석 조건을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 표준균주와 내부대조군 및 각혈청형별 융해곡선을 형광 표지를 기준으로 정렬한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 혈청형에 따른 융해곡선 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 돼지 흉막폐렴균의 융해곡선 분석결과 공통되는 형광표지로 묶어서 정렬한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 PNA 프로브의 분석적 민감도를 표준균주를 이용하여 평가한 그래프이다.
도 8의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 특이도를 확인하기 위한 균주 리스트이며, (B)는 확인 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 PNA 프로브를 이용한 진단법과 종래 PCR법을 비교한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 돼지 흉막폐렴균의 협막 유전자(cps)를 PNA 프로브로 검출할 경우, 복잡한 과정을 거치지 않고 융해곡선의 분석만으로 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 동정할 수 있음을 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 돼지 흉막폐렴균의 협막 유전자(cps)에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 설계하고, 이를 이용하여 융해곡선을 분석할 경우, 추가적인 분석 작업 없이 융해곡선의 분석만으로 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 동정할 수 있다는 것을 확인하였다(도 5).
따라서, 본 발명은 일 관점에서,
서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자(capsular polysaccharide, cps) 검출용 PNA 프로브에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 PNA 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, 또는 Alexa680 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, BHQ3 및 Dabcyl로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하고, 온도가 올라감에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 표적핵산과 빠르게 융해되어 형광 신호가 소광되며, 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고 해상도의 융해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있다.
PNA(Peptide Nucleic Acid)는 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로, 인공적으로 합성하며 기본 골격이 폴리아미드(polyamide)로 구성되어 있다. PNA는 친화도(affinity)와 선택성 (selectivity)이 매우 우수하며, 핵산분해효소에 대한 안정성이 높아 현존하는 제한효소(restriction enzyme)로 분해되지 않는다. 또한 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다. 또한 DNA-DNA 결합 대비 PNA-DNA 결합력이 우수하며 융해 온도(melting temperature)가 약 2배 이상 높으므로, 1개의 핵산 불일치(nucleotide mismatch)에도 10~15℃가량 융해온도(Tm) 차이가 난다. 이러한 결합력의 차이를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphism) 및 InDel(insertion/deletion) 핵산 변화를 검출할 수 있게 된다.
본 발명의 용어 "프로브"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, LNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "혼성화"는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. PNA는 단일 염기부정합 때문에 이중가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 SNP를 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명에서 표적핵산은 검출하고자 하는 핵산서열을 의미하며, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
PNA 프로브의 핵산과 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 차이에 따라서도 Tm값의 변화를 나타내어 이를 이용한 응용기술의 개발이 용이하다. PNA 프로브는 TaqMan 프로브의 수화(hydrolysis) 반응과는 다른 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 분석하며, 비슷한 역할을 하는 프로브로는 분자 표지 프로브(molecular beacon probe), 스콜피온 프로브(scorpion probe)가 있다.
혼성화 반응의 분석 방법으로는 형광융해곡선분석(Fluorescence Melting Curve Analysis, FMCA)를 이용하며, 형광융해곡선분석은 PCR 반응 종료 후 생성된 산물과 투입한 프로브 간의 결합력 차이를 융해온도로 구분하여 분석한다. 다른 SNP 검출 프로브와는 다르게 프로브 디자인이 매우 간편하여 SNP를 포함하는 11~18 mer의 염기서열을 이용하여 제작한다. 따라서 원하는 융해온도를 갖는 프로브를 설계하기 위해서는 PNA 프로브의 길이에 따라 Tm값을 조절할 수 있으며, PNA 골격 gamma 위치에 Lysine, Glutamic acid 또는 Alanine 등 아미노산을 연결하여 Tm 값을 조절할 수 있다. PNA는 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 디자인이 가능하여 가깝게 이웃한 SNP라도 검출이 가능하다. 기존의 HRM method는 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 작아 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도변화가 요구되고 2개 이상의 SNP가 나타날 경우 분석이 어렵게 되는 반면, PNA 프로브는 프로브 서열 이외의 SNP에 대해서는 영향을 받지 않아 빠르고 정확한 분석이 가능하다.
본 발명에서 "PNA 프로브(probe)"는 표적핵산이 존재하는 경우 표적핵산에 우선적으로 결합하여 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 표적핵산이 없는 경우 내부컨트롤에 결합하여 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있으며, 내부컨트롤과 표적핵산 융해곡선 차이를 이용하여 위양성 및 위음성 시그널을 구분할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 또는
(vii) 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 증폭용 프라이머 쌍(primer pair)에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 프라이머 쌍은 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자(capsular polysaccharide, cps)를 특이적으로 증폭할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자(capsular polysaccharide, cps) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 내부대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 20 및 21의 프라이머 쌍, 및 서열번호 5의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, 서열번호 20 및 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍은 내부대조물질을 증폭시키고, 서열번호 5의 PNA 프로브는 내부대조물질과 혼성화되어, 돼지 흉막폐렴균의 존재 유무와는 상관없이 실시간 PCR(real-time PCR)의 성공 유무를 판별할 수 있다. 따라서, 상기 내부대조물질은 시료에 일반적으로 포함되는 유전자(예를 들어, 하우스 키핑 유전자) 또는 따로 주입하는 주형 핵산을 의미하는 것으로, 바람직하게는 돼지 흉막폐렴균에 존재하지 않는 유전자(본 발명에서는 Cymbidium sinense의 psbA 유전자) 부위, 더욱 바람직하게는 서열번호 34의 염기서열로 표시되는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다. 이와 같은 맥락에서, 해당 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍 및 상기 유전자에 혼성화되는 프로브는, 본 발명에서 제시하는 프라이머 쌍 및 PNA 프로브 이외에도, 당업자가 용이하게 선택하여 적용할 수 있을 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 버퍼(buffer), DNA 중합효소(DNA polymerase), DNA 중합효소 조인자(DNA polymerase cofactor) 및 데옥시리보뉴클레오티드-5-트리포스페이트(dNTP)와 같은 핵산 증폭 반응(예컨대, 중합효소연쇄반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 또한 다양한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 분자, 역전사효소(reverse transcriptase), 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서의 기재사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 장비는 앞서 언급된 구성 성분들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 시약을 포함하는 용기 및 프라이머 또는 프로브를 포함하는 용기를 포함할 수 있다.
상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 돼지 흉막 폐렴균 혈청형 진단방법에 관한 것이다:
(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 결정하는 단계.
본 발명에서, 상기 시료는 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 검출하고자 하는 검체로부터 유래한 것으로, DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 것이고, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형태일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 시료는 자돈의 분변 또는 소장 내용물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 단계의 증폭은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응 방법은, 형광물질이 PCR 과정에서 이중가닥 (double strand) DNA 사슬에 결합(interchelating)되도록 하고 PCR 산물의 증폭과 함께, 온도를 높여 주어 DNA 이중 가닥을 풀어줌으로써 DNA 이중 가닥 사이에 존재하는 형광물질의 양이 줄어들게 되는 융해곡선의 패턴, 특히 DNA가 융해(변성)되는 온도(Tm)를 분석하여 정상 대조군과 돌연변이 사이에서 염기서열의 변이 유무를 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 내부대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 내부대조물질의 증폭은 서열번호 20 및 21의 프라이머쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 5의 프로브로 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 융해곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis; 형광융해곡선분석) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 융해곡선 분석은 타겟 DNA 또는 RNA와 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해온도를 해석하는 방법이다. 이러한 방법은 예컨대, Tm 해석, 또는 상기 이중쇄의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에, 융해곡선 분석이라고 불리고 있다. 검출 목적의 핵산을 포함하는 검출 대상 서열에 상보적인 프로브를 이용하여, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 하이브리드(이중쇄 DNA)를 형성시킨 후, 이 하이브리드 형성체에 가열 처리를 실시하고, 온도 상승에 따른 하이브리드의 해리(융해)를 흡광도 등의 시그널의 변동에 의해 검출한 다음, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값을 결정함으로써, 표적 핵산의 유무를 판단하는 방법이다.
Tm값은 하이브리드 형성체의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 이 때문에, 표적 핵산을 포함하는 검출 대상 서열과 그것에 상보적인 프로브와의 하이브리드 형성체에 대해서 미리 Tm값(평가 기준값)을 구해 두고, 검출 시료의 표적 단일쇄 DNA와 상기 프로브와의 Tm값(측정값)을 측정하여, 측정값이 평가 기준값과 동일한 정도이면, 매치, 즉 표적 DNA가 존재한다고 판단할 수 있고, 측정값이 평가 기준 값보다 낮으면, 미스매치, 즉 타겟 DNA가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
본 발명의 형광융해곡선 분석은 형광물질을 사용하여 융해곡선을 분석하는 방법으로, 보다 구체적으로, 형광물질을 포함하는 프로브를 이용하여 융해곡선을 분석할 수 있다. 형광물질은 리포터 및 소광자일 수 있으며, 인터컬레이팅 형광물질일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단용 프라이머 및 프로브 제작
돼지 흉막폐렴균(APP) 감염여부를 확인하기 위하여 흉막폐렴 검출용 프라이머(apxIV 유전자) 및 혈청형 구분 프로브의 경우 유전자(capsular polysaccharide, cps, NCBI accession No.: S10_GU585379.1, S12_AY496881.1, S13_MG868947.1, S14_AB810251.1, S15_LC507611.1), (outer membrane protein, NCBI accession No.: S1: AB007572, S9: AB007581, S11: AB007583) 유전자의 염기서열 분석을 통하여 고시에 표기된 프라이머와 새롭게 제작한 프라이머를 혼합하여 사용하였으며, 상기 프라이머를 이용한 증폭산물 안에서 혼성화할 수 있는 PNA 프로브를 제작하였다(표 1).
고시에 표기된 프라이머는 하기와 같다:
서열번호 22: Serotype1, 9, 11_F_Ref: GTATAAGGAATTTTTTAATGAATATTGCAAC
서열번호 23: Serotype1, 9, 11_R_Ref: GCCACTACATGCGGTAAGCACT
서열번호 24: Serotype10_F_Ref: GGTATGGTTGCCTTAGAGGTGGTGATGGAACAAGGTTATGG
서열번호 25: Serotype10_R_Ref: TTGGAATAGCGACTCTCCTGATGGAA
서열번호 26: Serotype12_F_Ref: GGTATGGTTGCATTAGAGAGTTAGGTTCTTCTCCCATCTGTTGT
서열번호 27: Serotype12_R_Ref: CCTTGGTTAATGTATTTCGAAGGGAAAGC
서열번호 28: Serotype13_F_Ref: GGTATAGTTGCATTAGAATGTAAAGGATCTAAGCCGTGTGTATG
서열번호 29: Serotype13_R_Ref: GTCAGATCAATTCTGAATTCGATTTAGCG
서열번호 30: Serotype14_F_Ref: GGCGTCTGGAGTTCGATTCTCGCTTGGAAGCAATTCAAGATG
서열번호 31: Serotype14_R_Ref: CCTATGTGGTTTATCGAAATGCAATGGG
서열번호 32: Serotype15_F_Ref: GGCATCTGGAGTTCGGGGATCGAAAGGCTATGGTAT
서열번호 33: Serotype15_R_Ref: GGAATTCAGACAACGGTGCATTTGATAC
| 서열번호 | 이름 | Sequence (5'-3') | 비고 |
| 1 | App common | Dabcyl-GCCACCACAGCCA-O-K (FAM) | 프로브 |
| 2 | Serotype 1, 9, 11 | Cy5-AATGGCTAGCTTAGTC-O-K (BHQ3) | 프로브 |
| 3 | Serotype 10, 12, 13 | Dabcyl-GGTATGGTTGCCTTAGA-O-K (HEX) | 프로브 |
| 4 | Serotype 14, 15 | Alexa680-GGCGTCTGGAGTTC-O-K (BHQ3) | 프로브 |
| 5 | IPC | Dabcyl-ATCCGAATTCTCGTTC-O-K (TxR) | 내부대조 프로브 |
| 6 | Common F | GCCACCACAGCCATTATCCGAACTTTGGTTTAGCCGAGA | 프라이머 |
| 7 | Common R | CATATTTGATAAAACCATCCGTC | 프라이머 |
| 8 | Serotype 1, 9, 11_F | GTATAAGGAATTTTTTAATGAATATTGCAAC | 프라이머 |
| 9 | Serotype 1, 9, 11_R | GCCACTACATGCGGTAAGCACT | 프라이머 |
| 10 | Serotype 10_F | GGTATGGTTGCCTTAGAGGTGGTGATGGAACAAGGTTATGG | 프라이머 |
| 11 | Serotype 10_R | TTGGAATAGCGACTCTCCTGATGGAA | 프라이머 |
| 12 | Serotype 12_F | GGTATGGTTGCATTAGAGAGTTAGGTTCTTCTCCCATCTGTTGT | 프라이머 |
| 13 | Serotype 12_R | CCTTGGTTAATGTATTTCGAAGGGAAAGC | 프라이머 |
| 14 | Serotype 13_F | GGTATAGTTGCATTAGAATGTAAAGGATCTAAGCCGTGTGTATG | 프라이머 |
| 15 | Serotype 13_R | GTCAGATCAATTCTGAATTCGATTTAGCG | 프라이머 |
| 16 | Serotype 14_F | GGCGTCTGGAGTTCGATTCTCGCTTGGAAGCAATTCAAGATG | 프라이머 |
| 17 | Serotype 14_R | CCTATGTGGTTTATCGAAATGCAATGGG | 프라이머 |
| 18 | Serotype 15_F | GGCATCTGGAGTTCGGGGATCGAAAGGCTATGGTAT | 프라이머 |
| 19 | Serotype 15_R | GGAATTCAGACAACGGTGCATTTGATAC | 프라이머 |
| 20 | IPC_F | GCTATCTTGTTGGGTTCAGGTGC | 내부대조 프라이머 |
| 21 | IPC_R | GGCACTTATCATTCATTGGCGGG | 내부대조 프라이머 |
동물질병 표준검사법에 명시되어 있는 프라이머 및 새롭게 제작한 프라이머의 경우 코스모진텍(cosmogenetech, 한국)에서 합성하였고, 본 발명에서 사용한 모든 PNA 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였다. 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다. 돼지 흉막폐렴균 혈청형 구별을 위한 PNA 프로브는 융해온도가 75℃ 넘지 않도록 하여 중합효소연쇄반응에 영향을 주지 않도록 제작하였다.
실시예 2. 돼지 흉막폐렴균의 검사결과 비교 분석
PNA 프로브를 이용한 돼지 흉막폐렴균 혈청형의 진단을 위하여 capsular polysaccharide 유전자 안에서 최적의 프라이머 및 PNA 프로브 위치를 선정하였다. 또한 실험 중 오염에 따른 위양성 판별 여부를 판단하기 위해 내부 대조군을 합성 제작하였다(도 2).
실험장비로는 CFX96TM (Bio-Rad, 미국)를 사용하였고, 실험 조성의 경우 하기 표 2와 같은 조성을 사용하였으며, 실시간중합효소연쇄반응 실험 조건은 도 3에서와 같이 진행하였다.
표준균주는 캐나다 몬트리올 수의과대학 Dr. Gottschalk M으로부터 분양받아 사용하였으며, 표준균주의 균주 번호는 하기와 같다:
A. pleuropneumoniae Serotype 1: Shope 4074
A. pleuropneumoniae Serotype 9: CVJ 13261
A. pleuropneumoniae Serotype 10: 22009
A. pleuropneumoniae Serotype 11: 56153
A. pleuropneumoniae Serotype 12: 1096
A. pleuropneumoniae Serotype 13: N-273
A. pleuropneumoniae Serotype 14: 3906
A. pleuropneumoniae Serotype 15: HS143
| 물질 | 양(농도) |
| 표준균주 | 3 ul (4x105 copies) |
| 서열번호 6, 7 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (6 :60 pmol) |
| 서열번호 8, 9 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (6 :60 pmol) |
| 서열번호 10, 11 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (6 :60 pmol) |
| 서열번호 12, 13 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (6 :60 pmol) |
| 서열번호 14, 15 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (6 :60 pmol) |
| 서열번호 16, 17 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (6 :60 pmol) |
| 서열번호 18, 19 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (6 :60 pmol) |
| 서열번호 20, 21 프라이머 (Forward & Reverse) | 각 0.5 ul (2 :10 pmol) |
| 서열번호 1 프로브 | 0.5 ul (5 pmol) |
| 서열번호 2 프로브 | 0.5 ul (5 pmol) |
| 서열번호 3 프로브 | 0.5 ul (5 pmol) |
| 서열번호 4 프로브 | 0.5 ul (5 pmol) |
| 서열번호 5 프로브 | 0.5 ul (1 pmol) |
| 2X qPCR PreMix | 14 ul |
| 서열번호 34 (내부대조군 DNA) | 0.5 ul |
| 전체 부피 | 28 ul |
융해곡선 분석 결과, 도 4 내지 도 6에 기재된 바와 같이, 돼지 흉막폐렴균 표준균주의 경우 FAM의 Tm 값이 67±2℃내부 대조군의 경우 TxR 61±2℃, Serotype 10, 12, 13은 HEX에서 각각 68±2℃56±2℃47±2℃Serotype 14, 15는 Quasar에서 각각 75±2℃66±2℃, Serotype 1, 9, 11은 Cy5에서 69±2℃에서 피크를 보이는 융해곡선을 나타내어 본 발명에 따른 PNA 프로브가 내부대조군과 표준균주를 명확히 판별할 수 있는 것을 확인하였다.
사용한 IPC 서열은 서열번호 34와 같다
서열번호 34 IPC:
TGTTCTTAGAACAAGATATTGGGGGATTGCTATCTTGTTGGGTTCAGGTGCTTTTTGCTTCTCTATCCGAATTCTCGTTCTTTATCATAAAAGTTCTCCCCCGCCAATGAATGATAAGTGCCTAGGTGAAGCATAGTATAAGATAAGTCAGAAAAGTCTAAGTCTTATGAAAAAGAAAATAAAT
실시예 3. PNA 프로브을 이용한 새로운 돼지 흉막폐렴균 진단 Kit의 제작 및 성능 확인
돼지 흉막폐렴균(Serotype 1~8, positive A. pleuropneumoniae)을 검출하기 위하여 프라이어 및 PNA 프로브를 이용하여 제품을 제작하고자 하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 장비를 이용한 일반적인 검출 키트의 경우 반응액의 중합효소연쇄반응이 일어나는 데에 문제가 없음을 확인하기 위하여 IPC (Internal Positive Control)를 혼합하여 반응을 진행한다. 따라서 실질적인 제품 안에서 IPC를 첨가하였을 경우, 분석적 특이도의 이상여부를 확인하고자 하였다.
3-1 민감도 확인
실험 방법의 경우, 조건은 도 3과 동일하게 진행하였으며, 조성의 경우, 표2와 같은 조성으로 분석을 진행하였다.
그 결과, 돼지 흉막폐렴균(positive A. pleuropneumoniae) 진단 Kit 안에 IPC를 첨가하여 분석적 민감도를 확인한 결과 증폭곡선 및 융해곡선 Threshold value를 각 RFU 200과 RFU 50을 기준으로 Serotype 1, 9, 11, 13, 15는 100 fg/ul, Serotype 10, 12는 1 fg/ul, Serotype 14는 250 ag/㎕ (100 copies)까지 검출이 가능함을 확인할 수 있었다(도 7).
사용한 IPC 서열은 서열번호 34와 같다.
3-2 특이도 확인
임상시료를 이용한 동물질병표준검사법의 경우, DNA를 추출하는 과정 중 원인균 외에도 다양한 균, 그리고 검체대상의 조직 DNA가 혼재되어 있어 비특이 반응이 빈번하게 일어나 위양성의 결과를 보일 수 있다. 따라서, 상기 키트의 특이도를 확인하기 위하여, 도 8의 (A)에 기재된 균주를 각각 3ul씩 첨가하고, 조건은 도 3과 동일하게 진행하였으며, 조성의 경우, 표 2와 같은 조성으로 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 8에 기재된 바와 같이, 돼지 흉막폐렴균 이외의 다른 균에서는 IPC를 제외한 모든 프로브에서 유의미한 TM 값이 나타나지 않는 것을 확인하여 본 발명에서 제작한 키트의 특이도가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 기존의 공지된 multiplex PCR 방법((Jessing, J Clin Microbiol, 2003, pp 4095-4100; Angen, O Vet Microbiol, 2008, pp. 312-318)과 본 발명의 방법을 국내야외분리주 30균주를 대상으로 비교한 결과, 도 9에 기재된 바와 같이, 100%일치하는 결과를 나타내었다.
상기의 결과를 종합하여 IPC를 포함한 돼지 흉막폐렴균 (positive A. pleuropneumoniae) 진단 키트를 제작하는 경우, 표 3와 같은 돼지 흉막폐렴균 (positive A. pleuropneumoniae) 결정할 수 있다는 것을 확인하였다.
| Type | Fluor. | Tm (℃) |
| A.pp spp. | FAM | 67 ± 2 |
| Serotype 10, 12, 13 | HEX | 68/56/47 ± 2 |
| Serotype 14, 15 | Quasar | 75/66 ± 2 |
| Serotype 1, 9, 11 | Cy5 | 69 ± 2 |
| IPC | TxR | 61 ± 2 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Method and Kit for Identifying the serotype of Actinobacillus
pleuropneumoniae causing pneumonia in Pigs using PNA probe
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<160> 34
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<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> App common
<400> 1
gccaccacag cca 13
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 1, 9, 11
<400> 2
aatggctagc ttagtc 16
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 10, 12, 13
<400> 3
ggtatggttg ccttaga 17
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 14, 15
<400> 4
ggcgtctgga gttc 14
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IPC
<400> 5
atccgaattc tcgttc 16
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 6
gccaccacag ccattatccg aactttggtt tagccgaga 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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catatttgat aaaaccatcc gtc 23
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<212> DNA
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<223> Serotype 1, 9, 11_R
<400> 9
gccactacat gcggtaagca ct 22
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 10_F
<400> 10
ggtatggttg ccttagaggt ggtgatggaa caaggttatg g 41
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 10_R
<400> 11
ttggaatagc gactctcctg atggaa 26
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 12_F
<400> 12
ggtatggttg cattagagag ttaggttctt ctcccatctg ttgt 44
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 12_R
<400> 13
ccttggttaa tgtatttcga agggaaagc 29
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 13_F
<400> 14
ggtatagttg cattagaatg taaaggatct aagccgtgtg tatg 44
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 13_R
<400> 15
gtcagatcaa ttctgaattc gatttagcg 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 14_F
<400> 16
ggcgtctgga gttcgattct cgcttggaag caattcaaga tg 42
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 14_R
<400> 17
cctatgtggt ttatcgaaat gcaatggg 28
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 15_F
<400> 18
ggcatctgga gttcggggat cgaaaggcta tggtat 36
<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype 15_R
<400> 19
ggaattcaga caacggtgca tttgatac 28
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IPC_F
<400> 20
gctatcttgt tgggttcagg tgc 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IPC_R
<400> 21
ggcacttatc attcattggc ggg 23
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype1, 9, 11_F_Re
<400> 22
gtataaggaa ttttttaatg aatattgcaa c 31
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype1, 9, 11_R_Re
<400> 23
gccactacat gcggtaagca ct 22
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype10_F_Ref
<400> 24
ggtatggttg ccttagaggt ggtgatggaa caaggttatg g 41
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype10_R_Ref
<400> 25
ttggaatagc gactctcctg atggaa 26
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype12_F_Ref
<400> 26
ggtatggttg cattagagag ttaggttctt ctcccatctg ttgt 44
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype12_R_Ref
<400> 27
ccttggttaa tgtatttcga agggaaagc 29
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype13_F_Ref
<400> 28
ggtatagttg cattagaatg taaaggatct aagccgtgtg tatg 44
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype13_R_Ref
<400> 29
gtcagatcaa ttctgaattc gatttagcg 29
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype14_F_Ref
<400> 30
ggcgtctgga gttcgattct cgcttggaag caattcaaga tg 42
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype14_R_Ref
<400> 31
cctatgtggt ttatcgaaat gcaatggg 28
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype15_F_Ref
<400> 32
ggcatctgga gttcggggat cgaaaggcta tggtat 36
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Serotype15_R_Ref
<400> 33
ggaattcaga caacggtgca tttgatac 28
<210> 34
<211> 184
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IPC sequence
<400> 34
tgttcttaga acaagatatt gggggattgc tatcttgttg ggttcaggtg ctttttgctt 60
ctctatccga attctcgttc tttatcataa aagttctccc ccgccaatga atgataagtg 120
cctaggtgaa gcatagtata agataagtca gaaaagtcta agtcttatga aaaagaaaat 180
aaat 184
Claims (11)
- 다음을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 검출용 조성물.
서열번호 1 내지 4의 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자(capsular polysaccharide, cps) 검출용 PNA 프로브; 및 다음 (i)~(vii)의 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 증폭용 프라이머 쌍;
(i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(vii) 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
- 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터와 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 검출용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, 또는 Alexa680 로 구성된 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2, BHQ3 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 검출용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 내부대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 20 및 21의 프라이머 쌍, 및 서열번호 5의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 검출용 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 돼지 흉막폐렴균 혈청형 진단방법:
(a) 검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 서열번호 1 내지 4의 PNA 프로브와 혼성화시키는 및;
(d) 상기 (c) 단계에서 혼성화된 반응물의 융해곡선을 분석하여 돼지 흉막폐렴균의 혈청형을 결정하는 단계;
여기서, 상기 돼지 흉막폐렴균 협막 유전자 증폭용 프라이머 쌍은 하기 (i)~(vii)의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 함;
(i) 서열번호 6의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 8의 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 10의 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 12의 정방향 프라이머 및 서열번호 13의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 14의 정방향 프라이머 및 서열번호 15의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 16의 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(vii) 서열번호 18의 정방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
- 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계는 내부대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법.
- 제10항에 있어서, 상기 내부대조물질의 증폭은 서열번호 20 및 21의 프라이머쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 5의 프로브로 검출하는 것을 특징으로 하는 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법.
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| KR1020210034502A KR102502129B1 (ko) | 2021-03-17 | 2021-03-17 | Pna 프로브를 이용한 돼지 흉막폐렴균의 혈청형 진단방법 및 키트 |
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- 2021-03-17 KR KR1020210034502A patent/KR102502129B1/ko active IP Right Grant
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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