KR101531296B1

KR101531296B1 - Streptococcus iniae의 병원성 판별용 유전자 마커 및 펩티드핵산을 이용한 병원성 결정 마커 검사키트

Info

Publication number: KR101531296B1
Application number: KR1020140180340A
Authority: KR
Inventors: 김명석; 최혜승; 정승희; 한현자; 도정완
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2014-12-15
Publication date: 2015-06-24
Also published as: WO2016098953A1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 Streptococcus iniae의 cpsD 서열에서 T368C 또는 T385G의 단일염기다형성 변이를 포함하는 서열단편과 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있는 Streptococcus iniae의 유전형 판별용 프로브에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 병원성에 영향을 주는 유전형을 DNA와의 결합력이 우수한 펩티드핵산(PNA)을 이용하여 유전형마다 서로 다른 융해온도를 나타내게 함으로써, S. iniae의 병원성을 간단, 신속, 정확하게 판별하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

Streptococcus iniae의 병원성 판별용 유전자 마커 및 펩티드핵산을 이용한 병원성 결정 마커 검사키트{Genetic markers for identifying virulence of Streptococcus iniae and identifying method using peptide nucleic acids and real-time PCR}

Streptococcus iniae는 그람양성 구균으로 1972년에 Amazon River dolphin (Inia geoffrensis)에서 최초로 분리되었고, 세계적으로 많이 양식되는 틸라피아, 방어, 무지개송어, 넙치에 감염되어 높은 폐사를 일으키고 있다. S. iniae는 사람에게 감염되어 세포염(cellulitis)을 일으킬 수 있고 S. iniae가 어류를 통해 사람에게 감염된 사례가 미국, 캐나다, 홍콩, 대만, 싱가폴에서 20 건 이상 보고되고 있어 감염성 및 병원성의 판별이 중요시되고 있다.

1995년부터 1997년까지 이스라엘의 무지개송어 양식장에서 Streptococcus iniae 백신이 어류의 세균성 질병인 streptococosis를 예방하기 위해 사용되었으나 백신을 주사한 무지개송어에서 아르기닌 분해검사(Arginine dihydrolase)에서 음성인 새로운 개체의 S. iniae가 분리되었다. 먼저 분리된 S. iniae는 혈청형 I 이라고 명명되었으며, 이후에 분리된 혈청학적으로 다른 S. iniae는 혈청형 II로 명명되어 S. iniae는 2개의 혈청형(serotype)으로 구분되었다.

임의증폭 다형성 DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD) 분석은 PCR을 기반으로 하여 DNA의 불특정한 패턴을 얻어내어 종간 및 종내의 유전학적 다양성을 신속하게 구분할 수 있는 방법이다. Streptococcus iniae의 2개 혈청형을 RAPD로 구분하였으며(Bachrach et al., Appl Environ Microbiol., 67:3756-3758, 2001), 이 방법을 이용하여 한국에서 분리된 94개의 Streptococcus iniae는 3개의 유전형 (genotype)으로 분류되었지만 이들 유전형 (genotype)에 대한 병원성에 대한 연구는 부족하다(Jung YU and Heo MS, Kor J Life Sci., 16:345-351, 2006).

연쇄구균 종(Streptococcal species)들의 경우 세포외 캡슐(extracellular capsule)이 존재하며, 캡슐 오페론(capsule operons)에는 협막다당(capsular polysaccharide, cps) A, B, C, D, E 유전자가 존재한다. 그 중에서 cpsD 유전자는 페렴구균(Streptococcus pneumoniae)에서 autophosphorylating protein tyrosine kinase를 암호화하고 있어 캡슐(capsule) 형성에 꼭 필요한 것으로 생각되며, cpsD 유전자를 제거한 ΔcpsD Streptococcus iniae는 야생형 S. iniae에 비해 캡슐(capsule)이 감소하고 잡종농어에서 병원성을 나타내지 않아, cpsD 유전자는 연쇄구균 종(Streptococcal species)들의 캡슐(capsule) 형성과 어류의 폐사를 유도하는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. S. iniae의 캡슐(capsule)을 형성하는데 역할을 하는 유전자인 cps 유전자와 phosphoglucomutase 유전자의 유전적 변이는 감염력과 병원성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고 S. iniae의 가장 외막에 존재하는 캡슐(capsule)이 병원성을 결정하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 S. iniae를 구분할 수 있는 혈청형을 대신할 수 있는 유전학적 수준의 좀 더 세분화된 분류가 필요하다.

세균의 유전형을 분석하기 위한 다양한 방법이 개발되고 있으며, 유전자 염기서열 분석법 (sanger sequencing), random amplified polymorphic DNA (RAPD), restriction fragment length polymorphism (RFLP)법 등이 사용되고 있으나, 여전히 분석 시간이 길고 절차가 까다롭다는 문제점을 가지고 있다. 여기에 추가로, 병원성을 나타내는 유전형 및 유전체 마커의 개발을 필요로 하며, 이러한 유전형에 따른 병원성을 분석하여 상관관계를 확인하기 위해 신속하고 간편한 분석을 위한 유전형(genotype) 및 유전체 마커의 개발 및 유전체 마커를 손쉽게 판별할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.

일반적으로, 펩티드핵산(Peptide nucleic acid, PNA)은 핵산염기가 인산 결합이 아닌 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 Nielsen 등에 의해 처음으로 합성되었다. 펩티드핵산은 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. 펩티드핵산은 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 통해 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 또한, 펩티드핵산은 단일 염기 부정합(single base mismatch) 때문에 이중 가닥이 불안정해지는 정도가 크기 때문에 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 검출하는 능력이 천연핵산보다 더 뛰어나다. 펩티드핵산은 화학적으로 안정할 뿐만 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. 또한, 펩티드핵산은 LNA(Locked nucleic acid), MNA(Mopholino nucleic acid)처럼 유전자 인식 물질의 하나로서, 기본 골격이 폴리아마이드로 구성되어 있다. 펩티드핵산은 친화도(affinity)와 선택성(selectivity)이 매우 우수하고, 열/화학적으로 물성 및 안정성이 높아 보관이 용이하고 쉽게 분해되지 않는 장점이 있다.

이에, 본 발명자는 신속하고 간편한 방법으로 Streptococcus iniae의 병원성을 판별하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, S. iniae의 병원성을 판별하기 위한 유전자 마커 및 상기 DNA와 결합력이 우수한 펩티드핵산(PNA)을 이용하여 유전형마다 서로 다른 융해온도를 나타내게 함으로써, S. iniae의 병원성을 간단, 신속, 정확하게 판별할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 Streptococcus iniae의 타겟 유전자의 염기다형성 및 유전형을 판별할 수 있는 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 S. iniae의 염기다형성 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브를 포함하는 S. iniae의 유전형 판별방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 Streptococcus iniae의 cpsD 서열에서 T368C 또는 T385G의 단일염기다형성 변이를 포함하는 서열단편과 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있는 Streptococcus iniae의 유전형 판별용 프로브를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로브의 융해곡선 분석법을 이용한 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 DNA와의 결합력이 우수한 펩티드핵산(PNA)을 이용하여 Streptococcus iniae의 각 유전형을 가지는 종마다 서로 다른 융해온도(Tm)를 나타내게 함으로써, S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 이용하여 S. iniae의 병원성을 간단, 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 한국의 양식 넙치에서 분리한 S. iniae 균주를 대상으로 실시한 rep-RCR의 결과이다.
도 2는 S. iniae의 유전형을 결정하는 cpsD 유전자 상에서 펩티드핵산이 포함하고 있는 염기변이 부분을 설명하기 위한 유전자 위치도이다.
도 3은 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 펩티드핵산의 cpsD 유전자내 결합위치와 유전형에 따른 각각의 펩티드핵산에 대한 서로 다른 혼성화 정도를 설명하기 위한 모식도이다.
도 4는 펩티드핵산을 이용한 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별 방법의 혼성화 단계와 융해곡선을 얻는 단계를 설명하기 위한 모식도이다.
도 5는 펩티드핵산을 이용한 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별 방법에서 융해곡선(melting curve)으로부터 융해피크곡선(melting peak)을 얻는 단계를 설명하는 그래프이다.
도 6는 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 펩티드핵산의 기술적 특징을 설명하기 위한 개념도이다.
도 7은 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별 결과 및 동일 샘플의 염기서열 분석결과를 비교분석한 결과이다.
도 8 S. iniae의 유전형별 펩티드핵산의 융해곡선 그래프로부터 얻은 융해온도(Tm)를 유전코드로 정리한 표이다.

본 발명에서는 Streptococcus iniae의 유전형에 따른 병원성을 신속하고 간편하게 분석하고자 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성 마커를 선별하였다.

구체적으로, 본 발명자는 감염된 한국의 넙치로부터 29개의 S. iniae DNA를 분리하여 repetitive sequence-based PCR(rep-PCR) 및 random amplified polymorphic DNA(RAPD)를 통하여 이들 S. iniae가 두 개의 유전형으로 나뉜다는 것을 확인하였고, S. iniae의 cpsD 유전자의 염기서열을 이용한 이들의 계통수 결과와 일치함을 확인하였다. S. iniae의 두 개의 유전형을 cpsD 단백질의 알려진 기능 도메인들과 비교하고, rep-PCR을 통해 이 두 유전자형 간의 cpsD 유전자 내 368번째 및 385번째에서 단일염기다형성(SNP)이 존재한다는 것과 이 부위가 C 또는 G인 경우 S. iniae가 병원성을 나타낸다는 것을 확인하였다.

상기의 단일염기다형성 부위는 S. iniae의 유전형을 판별할 수 있고, 펩티드핵산의 DNA에 대한 결합력이 DNA 상호간의 결합력보다 매우 우수하여(DNA-DNA< PNA-DNA), 펩티드핵산은 1개 nucleotide의 불완전한 혼성화(mismatch)에도 융해온도(Tm)가 10~15℃ 가량 차이가 난다. 결국, 펩티드핵산 프로브의 nucleotide와 이에 상보적으로 결합하는 DNA의 nucleotide 차이에 따라서도 Tm값이 변화를 나타내기 때문에, 본 발명은 이를 이용하여 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하고자 한다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 Streptococcus iniae의 cpsD 서열에서 T368C 또는 T385G의 단일염기다형성 변이를 포함하는 서열단편과 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있는 Streptococcus iniae의 유전형 판별용 프로브에 관한 것이다.

또한, 펩티드핵산 프로브는 TaqMan probe의 hydrolysis method와는 다른 hybridization method를 이용하여 분석할 수 있으며, 비슷한 역할을 하는 probe로는 molecular beacon probe, scorpion probe가 있다.

따라서, 상기 프로브는 양말단에 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)를 가지는 것을 특징으로 하는 PNA인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브는 양 말단에는 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching)할 수 있는 소광자(quencher)가 결합될 수 있다. 상기 리포터(reporter)는 FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy -4,7-dichlorofluorescein) 및 CY5로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 Dabcyl을 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명에 따른 펩티드핵산의 염기서열 길이는 특별히 제한되지는 않지만, Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 5~30 mer 길이로 제작할 수 있으며, 바람직하게는 9~17mer 길이로 제작할 수 있다.

펩티드핵산 프로브의 길이를 조절하여 원하는 Tm값을 가지도록 프로브를 제작할 수 있고, 같은 길이의 펩티드핵산 프로브라도 염기서열에 변화를 주어 Tm 값을 조절하는 것도 가능하다.

또한, 펩티드핵산은 DNA보다 결합력이 우수하여 기본적인 Tm값이 높기 때문에 DNA보다 짧은 길이로 제작이 가능하여 가깝게 이웃한 펩티드핵산이라도 판별이 가능하다. 기존의 HRM method에 의하면 Tm값의 차이가 약 0.5℃로 매우 적어서 추가적인 분석프로그램이나 세밀한 온도 변화 또는 보정을 필요로 하고, 이 때문에 2개 이상의 펩티드핵산이 나타날 경우에는 분석이 어려웠지만, 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브는 프로브서열과 펩티드핵산에 대해서 영향을 받지 않아 간편하게 분석이 가능하다.

본 발명의 상기 펩티드핵산 세트는 두개의 펩티드핵산을 포함하는 하나의 튜브를 포함할 수 있고, 상기 튜브에 포함된 펩티드핵산은 서로 다른 리포터로 구성될 수 있는 것이 특징이다.

또한, 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브는 표적핵산과 염기변이를 가지는 표적핵산의 융해온도(Tm) 차이를 위해, 표적핵산의 염기변이 위치가 펩티드핵산 프로브의 가운데 부분(center position)에 오도록 디자인하는 것이 바람직하다. 염기변이 부분이 프로브의 가운데 부분(center position)에 위치하여 프로브의 구조적 차이를 만들게 되고, 펩티드핵산 프로브는 루프(loop)를 형성하면서 결합하게 되어, 이런 구조적 차이로 인해 융해온도(Tm)차이가 크게 나타날 수 있다.

이러한 이유로, 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브가 13개 내지 17개 범위 의 염기서열을 포함하는 경우에는, 6번째 내지 9번째 위치 중 하나 이상의 위치에 단일염기다형성(SNP) 부위에 상응하는 서열을 가지는 것이 바람직하다.

이러한 펩티드핵산은 염기서열의 가운데 부분에 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별부위에 상응하는 서열을 포함하여 구조적인 변형을 가질 수 있고, 이를 통해 완전한 혼성화를 이루는 표적핵산(perfect match)과의 융해온도(Tm) 차이를 더욱 크게 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 펩티드핵산은 결합하는 염기서열(또는 SNP)에 따라 다른 융해온도(Tm)를 나타내기 때문에, 하나의 펩티드핵산(또는 프로브)으로 2개 이상의 염기서열을 검출할 수 있고, 또한 2개 이상의 펩티드핵산을 하나의 튜브에 포함시켜서 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 펩티드핵산은 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 기술에 관한 것으로 본 발명의 펩티드핵산을 S. iniae의 표적핵산과 혼성화시키고 융해곡선을 분석함으로써 S. iniae의 단일염기다형성을 간단, 신속, 정확하게 판별할 수 있다.

본 발명에서 핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 "엄격한 조건"은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 단일염기다형성(SNP) 판별을 통한 Streptococcus iniae의 유전형의 결정방법에 관한 것이다.

구체적으로 (a) S. iniae로부터 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) S. iniae의 표적핵산을 본 발명의 펩티드핵산과 혼성화(hybridization)하는 단계; 및 (c) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (d) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 단일염기다형성(SNP) 판별을 통한 Streptococcus iniae의 유전형의 결정방법이다.

상기 혼성화하는 단계는 본 발명에 따른 펩티드핵산을 S. iniae의 표적핵산과 반응시키는 것이다. 이 단계는 PCR 과정을 포함할 수 있고, PCR을 위한 Forward / Reverse primer set를 이용하는 것이 가능하다. 이러한 혼성화 단계와 PCR 조건은 이 기술 분야에서 보통의 지식을 가진 자(이하, '당업자'라고 함)에게 널리 알려진 다양한 모든 방법을 포함할 수 있다. 또한, PCR이 끝난 후에는 melting 과정을 포함하는 것도 가능하다.

상기의 S. iniae의 표적핵산은 상기한 본 발명의 cpsD 유전자에 존재하는 염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 것이 바람직하다. S. iniae의 표면에서 발현되는 cpsD 유전자의 유전적 변이는 감염력과 병원성에 영향을 미치는 것을 본 발명에서 확인하였으며, S. iniae의 감염력과 병원성을 판별하는데 효과적이다.

또한, 상기 온도별 융해곡선을 얻는 단계는 S. iniae 표적핵산의 융해온도(Tm)를 얻기 위한 것이다. 이를 위하여, 상기 혼성화한 산물의 온도를 높이면서 형광의 세기를 측정하여, 온도에 따른 형광세기 변화를 온도별 융해곡선으로 얻을 수 있다. 즉, Hybridization method 분석 방법으로 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용할 수 있고, 상기 FMCA는 PCR 반응이 끝나고 난 후 만들어진 산물과 넣어준 프로브간의 결합력 차이를 Tm으로 구분하여 분석하는 것이다. 예를 들어, 일반적인 real-time PCR 장치를 이용하여, 1℃ 증가시킬 때마다 형광의 세기를 측정함으로서 Tm값을 얻을 수 있다.

상기 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하는 단계는 상기 얻은 융해곡선의 융해온도로부터 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하는 것이다. 예를 들어, 상기 얻은 융해곡선의 융해온도를 이미 알고 있는 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)의 융해온도와 비교하여 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별할 수 있다. S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)마다 본 발명에 따른 펩티드핵산을 적용한 융해곡선은 서로 다른 융해온도(Tm)를 가지며, 이러한 차이를 이용하여 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별이 가능하다.

도 5는 본 발명에 따른 펩티드핵산을 이용한 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별 방법에서 융해곡선으로부터 융해피크곡선을 얻는 단계의 일례를 설명하기 위한 그래프이고, 여기에 나타난 바와 같이 상기 융해곡선의 기울기 값을 이용하여 온도별 융해피크곡선을 얻을 수 있으며, 이러한 융해피크곡선은 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)의 융해온도(Tm)를 파악하기에 용이하다. 이를 위하여, 상기 온도별 융해곡선을 얻는 단계는, 상기 얻은 온도별 융해곡선으로부터 온도별 융해피크곡선을 얻는 단계를 포함하고, 상기 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하는 단계는 상기 얻은 융해피크곡선의 융해온도로부터 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 프로브를 포함하는 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 다중 타겟 DNA 또는 단일 타겟 DNA의 염기 다형성 분석용인 것을 특징으로 하는 키트이다.

상기 키트의 프로브는 PNA인 것을 특징으로 하는 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 프로브이다.

상기 키트는 버퍼, DNA 중합효소 조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있으며, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함하는 것도 가능하다.

이러한 키트를 이용하면, 펩티드핵산 프로브에 의한 용해곡선 분석을 통하여 표적핵산의 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있고, 이를 통하여 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)의 판별이 가능하며 병원성을 결정할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : Streptococcus iniae 의 유전형 관여 단일염기다형성(SNP) 부위의 개발

2000년과 2005년 사이에 한국의 부산, 거제, 울산, 제주 및 완도 등에서 양식한 넙치로부터 29종의 Streptococcus iniae를 분리하였고, Kavit 과 Colorni에 의해 정립된 박테리아 게놈 DNA 분리법에 의해 DNA를 분리하여 실시예에 사용하였다.

기존에 알려진 Streptococcus iniae(ATCC 29178)와 한국의 양식 넙치에서 분리한 29개의 S. iniae 균주를 대상으로 rep-RCR(repetitive sequence-based PCR)을 실시하여 두 개의 유전형(genotype)으로 구분되는 것을 확인하였고, 각각 유전형 1과 2로 명명한 이들은 유전형 1(86.2%)이 유전형 2(13.8%)에 비하여 출현율이 우세하게 나타났다. 서열번호 2의 BoxA 프라이머는 S. iniae의 cpsD 유전자를 타겟으로 하며 사용한 BoxA 프라이머의 염기서열 및 rep-RCR 조건은 다음과 같다.

서열번호 2 : BoxA primer 5ㅄ-ACGTGGTTTGAAGAGATTTTTTCG-3'

rep-PCR 조건 : initial denaturation step : 95℃, 7 min

denaturation : 95℃ , 30s ┐

annealing : 40℃, 1min │ 35 cycles

extension :65℃, 8 min ┘

final extension step : 65℃, 16 min

약 1,000 bp 근처에서 유전형 1에서 관찰되지 않으나 유전형 2에서는 관찰되는 amplified product를 확인하였다(도 1).

Streptococcus iniae 유전형 1과 유전형 2의 cpsD 유전자 염기서열을 분석하여 비교한 결과, 각 유전형별로 유의성을 보이는 단일염기다형성(SNP)을 찾았다. 구체적으로 S. iniae strain DGX07의 cpsD 유전자(NCBI database: JF795257.1) 기준 368bp 및 385bp의 염기서열이 두 유전형 간에 차이가 나타나는 것을 확인하였으며, Streptococcus iniae 유전형 1은 C(368bp), G(385bp) 이고 유전형 2는 T(368bp), T(385bp)이다(도 2).

각 유전형에 해당하는 균주의 병원성을 확인하기 위하여, 멸균된 생리식염수(PBS)로 희석한 세균을 실험어, 넙치(평균 체중 18.4g)의 복강 내로 0.1 mL씩 주사하였고, 대조구는 (n=10) 생리식염수를 0.1 mL씩 복강 주사하였다. 실험 수온은 23ㅁ 1^oC를 유지하여 7일 동안 폐사율을 조사하였고 실험기간 중 죽은 고기는 해부하여 Streptococcus iniae를 재분리 하였다. 반수치사균수(LD₅₀)는 Finney의 probit method를 사용하여 계산하였고, S. iniae 유전형 1의 넙치에 대한 반수치사 농도(LD₅₀)는 7.0~7.2 x 10⁵ cfu/fish이고 유전형 2의 넙치에 대한 반수치사 농도는 3.4~3.6 x 10⁸ cfu/fish로 나타나 유전형 1이 2에 비해 넙치에 대해 약 2000배 높은 병원성을 나타냈다.

실시예 2 : Streptococcus iniae 의 단일염기다형성(SNP) 판별용 펩티드핵산의 제조

실시예 1에서 실시한 Streptococcus iniae의 cpsD 유전자의 염기서열을 분석 결과 찾은 단일염기다형성(SNP)을 바탕으로 각 유전형에 관여하는 유전자 특이적인 염기서열을 선택하였다.

구체적으로 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)은 368번 (C/T)이며, 이에 따라 상기 위치를 가운데로 하는 염기서열(서열번호 3)을 본 발명에 따른 펩티드핵산의 염기서열로 구성하였다.

이와 같이, 본 발명에 따른 펩티드핵산의 염기서열을 결정하였고, 하기 표 1에 나타내었다.

	Probe name	Sequence(5'→3')
서열번호3	SSW_SIA	Dabcyl-CAAGTGCCACCAAATC-O-K (FAM)

* 상기 표 1에서 O는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.

상기 표 1에 나타난 바와 같은 염기서열과 리포터 및 소광자로 본 발명에 따른 펩티드핵산 프로브를 제작하였다. 펩티드핵산 프로브는 펩티드핵산 프로브 디자이너(Appliedbiosystems, 미국)를 이용하여 설계하였다. 본 발명에서 사용한 모든 펩티드핵산 프로브는 파나진(Panagene, 한국)에서 HPLC 정제 방법을 통해 합성하였고, 합성된 모든 프로브의 순도는 질량분석법을 이용하여 확인하였으며, 표적핵산과의 더 효과적인 결합을 위해 프로브의 불필요한 이차구조는 피하였다.

도 3은 본 발명에 따른 S. iniae cpsD 유전자 상에서 펩티드핵산이 포함하고 있는 염기변이 부분의 일례를 설명하기 위한 유전자 위치도이며 숫자는 본 발명에 따른 단일염기다형성 부위를 나타낸다.

실시예 3: 용해곡선의 분석

상기 실시예 2에 따라 제작된 본 발명의 펩티드핵산을 이용하여, Streptococcus iniae 2종의 유전형을 가지는 각각의 DNA에 대하여 용해곡선을 도출하였고, 이를 분석하여 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP)을 판별하였다.

PCR은 CFX96™ Real-Time 시스템(BIO-RAD 사, 미국)을 이용하여 수행하였으며, 모든 실험 조건은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. 비대칭 PCR의 조건은 다음과 같다; 총 볼륨이 20㎕ 이 되도록 1X 시선바이오 리얼타임 FMCA™ 버퍼(SeaSunBio Real-Time FMCA™ buffer, 시선바이오, 한국), 2.5mM MgCl₂, 200μM dNTPs, 1.0 U Taq polymerase, 0.05μM forward primer(서열번호 4) 및 0.5μM reverse primer(서열번호 5, asymmetric PCR, 표 2)에 0.5㎕ 프로브(상기 실시예 2에서 제조된 펩티드핵산), 0.5㎕ S. iniae의 DNA를 첨가한 다음 real-time PCR을 실시하였다.

서열번호	Primer name	Sequence(5'→3')
서열번호4	SPcpsD_F	AGTGGTCGTGATTACAAGGC
서열번호5	SPcpsD_R	CGTAAGCGCCATAAGAACCA

real-time PCR 과정은 95℃에서 5분간 변성시킨 다음, 95℃에서 30초, 58℃에서 45초, 74℃에서 45초 동안 반응시켰다. 이를 38 cycle 반복하였고, 실시간으로 형광을 측정하였다. 융해곡선 분석은 95℃에서 1분간 변성 단계를 거친 다음, 35℃에서 5분간 혼성화한 후, 35℃에서 85℃까지 1℃씩 상승시키며 형광을 측정하는 용해곡선 분석을 수행하였다. 각 단계 사이마다 10초간 정지 상태를 유지하였다(도 4).

도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Streptococcus iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별용 펩티드핵산의 기술적 특징을 설명하기 위한 개념도이고, 여기에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 펩티드핵산은 표적핵산과 혼성화한 후 형광 신호를 발생시킬 수 있으며, 온도가 올라감에 따라 펩티드핵산의 적정 융해온도(Tm)에서 표적핵산으로부터 빠르게 융해되어 형광신호를 소광시킨다. 본 발명은 이러한 온도 변화에 따른 상기 형광 신호로부터 얻어진 고해상도의 융해곡선 분석(fluorescence melting curve analysis; FMCA)을 통하여, 표적핵산의 염기변이 유무를 검출하는 것이다. 본 발명에 따른 펩티드핵산은 표적핵산 염기서열과 완전한 혼성화(perfect match)를 이루는 경우 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이지만, 염기변이가 존재하는 표적핵산과는 불완전한 혼성화(mismatch)를 이루어서 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보이는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 펩티드핵산(표1)을 사용한 분석에서 표적핵산이 S. iniae의 유전형1인 경우에는 완전한 혼성화(perfect match) peak가 나타났으며, 표적핵산이 S. iniae의 유전형 2인 경우에는 불완전한 혼성화(mismatch) peak가 나타났다. 또한,온도별 융해곡선 그래프로부터 얻은 결과와 단일염기다형성의 표준 분석방법인 시퀀싱 결과와 비교한 결과도 다형성부위가 유전형 1은 C, 유전형 2는 T로 일치하였다(도 7).

이에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드핵산을 이용하는 경우 염기서열분석 결과와 동일하게 염기다형성을 분석할 수 있으며, 이를 통하여 본 발명에 따른 펩티드핵산을 이용하면 S. iniae의 유전형을 결정하는 단일염기다형성(SNP) 판별이 가능하다.

본 발명에 따른 펩티드핵산을 이용하여 미지의 Streptococcus iniae DNA 에 대하여 종을 판별하고자 하는 경우, 도 8과 같은 융해온도별 typing code를 미리 부여하여, 이를 활용하는 것이 가능하다.

구체적으로, 상기 실시예 3에서와 같이 융해곡선 분석을 실시하고 얻은 Tm값이 60℃이상의 peak를 완전한 혼성화(perfect match)로 지정하고, 55℃이하의 peak를 불완전한 혼성화(mismatch)로 지정하였으며, 분석결과를 사용하여 유전형 1은 perfect match, 유전형 2는 mismatch로 code를 부여하여 각 유전형마다 고유의 값을 가지도록 하였다(도 8).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> National Fisheries Research & Development Institute <120> Genetic markers for identifying virulence of Streptococcus iniae and identifying method using peptide nucleic acids and real-time PCR <130> P14-B360 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Streptococcus iniae <400> 1 atgtcacaat taaatttagt aagaagtaaa cgtgagcatt atcagcatgc agaagaatac 60 tataattcca ttcgcactaa tattcagttt agtggtcgtg attacaaggc aattgtctta 120 acctctgttc aacctggtga aggaaagtca accacatcga ttaacttagc catttccttt 180 gcaaaagcag gttttaaaac cctcctcatt gatgcagatg ttcgtaattc agtgatgtca 240 ggtgccttta aatctgatga caggtatgag ggtctttcaa gttatttatc aggaaacgct 300 gaattatcaa gtgttatttc aagaacggat gttccaaatc tcatgttgat cccatcaggt 360 caagtgctac caaatccaac aaccttactt caagatagta attttaattt tatgattgac 420 acagtcaaag agttatttga ctatattatc attgataccc caccaatagg cttgttgatt 480 gattctgcca tcattgcgca aaaagcagac gccactatct tggtaactga agcaggttct 540 attaaacgtc gttttgtgca aaaggcaaaa gaacaaatgg aacaaagtgg tgcacagttc 600 ttaggggtta ttcttaataa agtagatcaa caacttggtt cttatggcgc ttacggttcc 660 tacggagatt atggcaaaac caaaaaatca tccaaaagta aaaaacattc cagaaagtga 720 720 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 acgtggtttg aagagatttt ttcg 24 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe-SSW_SIA <400> 3 caagtgccac caaatc 16 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer-SPcpsD_F <400> 4 agtggtcgtg attacaaggc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer-SPcpsD_R <400> 5 cgtaagcgcc ataagaacca 20

Claims

서열번호 3으로 표시되는 Streptococcus iniae 유전형 판별용 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 양말단에 리포터(reporter) 또는 소광자(quencher)를 가지는 PNA인 것을 특징으로 하는 Streptococcus iniae의 유전형 판별용 프로브.
제1항에 있어서, Streptococcus iniae의 병원성 판별용인 것을 특징으로 하는 프로브.
삭제
삭제
삭제
제1항의 프로브를 포함하는 Streptococcus iniae의 유전형 판별용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 다중 타겟 DNA 또는 단일 타겟 DNA의 염기 다형성 분석용인 것을 특징으로 하는 키트.
다음 단계를 포함하는, 단일염기다형성(SNP) 판별을 통한 Streptococcus iniae의 유전형의 결정방법:
(a) Streptococcus iniae로부터 타겟 DNA를 분리하는 단계;
(b) Streptococcus iniae의 타겟 DNA를 제1항의 프로브와 혼성화(hybridization)하는 단계;
(c) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화한 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
(d) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 Streptococcus iniae의 타겟 DNA 유전형을 결정하는 단계.
제9항에 있어서, 상기 Streptococcus iniae의 타겟 DNA는 capsular polysaccharide(cps) D 유전자의 단일염기다형성(SNP) 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.