CN111094595A - 用于检测金黄色葡萄球菌的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸的组合物、试剂盒和方法。在一些实施例中，所述组合物、试剂盒和方法可以用于检测类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi SCCmec右端连接(MREJ)MRSA核酸中的一种或多种和mecA、mecC和/或另外的金黄色葡萄球菌特异性基因中的一种或多种。
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本文的实施例涉及检测传染原的领域，更具体地通过使用组合物和方法来检测金黄色葡萄球菌细菌，其包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，如一种或多种MRSA，包括类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv，或xxi SCCmec右端连接(MREJ)。
金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的机会致病菌，所述机会致病菌负责医院感染，包含皮肤和术后伤口，食物中毒和中毒性休克综合症。还已知会引起菌血症、肺炎、脓肿、骨髓炎以及心脏(心内膜炎、心肌炎和心包炎)和中枢神经系统(脑炎和脑膜炎)的感染。金黄色葡萄球菌可以很容易地在医院环境中传播，包含通过表面接触传播。
MRSA具有多药耐药性，并且与甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA或SA)不同，MRSA通常被视为最后的防线，因此需要使用更昂贵和/或有毒的抗生素进行治疗。MRSA携带mecA或mecC基因，所述基因编码β-内酰胺-耐药的青霉素结合蛋白，其赋予对β-内酰胺抗生素(包含但不限于甲氧西林和青霉素)的耐药性。mecC基因还被称为mecALGA251。mecA或mecC基因位于称为SCCmec的移动遗传元件内，所述元件通常还含有端反向和直接重复以及一组位点特异性重组酶基因(ccrA、ccrB和ccrC)，所述重组酶基因可以催化SCCmec整合到金黄色葡萄球菌染色体上的orfX基因上，从而将MSSA转化为MRSA(Ito等人,1999,《抗微生物剂化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother.)》43:1449-1458；Katayama等人,2000,《抗微生物剂化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother.)》44:1549-1555；Huletsky等人,美国专利公开号2008/0227087)。
快速鉴定MRSA对于促进治疗感染的受试者和控制及限制其传播两者的适当反应是非常重要的，包含抗生素治疗和其它感染控制措施，如隔离、消毒等。因此，需要用于快速基于核酸的MRSA检测的组合物和方法。
然而，基于核酸的MRSA检测由于多个因素而变得复杂化。其它葡萄球菌属包含凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)(例如，表皮葡萄球菌，是正常人皮肤菌群的一部分)可以携带mec基因，因此仅检测mecA或mecC不足以鉴定MRSA。实际上，美国食品和药物管理局(US Foodand Drug Administration)已建议将其它葡萄球菌属与MRSA进行区分。参见“建立基于核酸的体外诊断装置的性能特征以用于检测和区分耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和金黄色葡萄球菌(SA)”，FDA草案指南，2011年1月5日,第22-23页，可从FDA网站获得，其网址为/downloads/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/GuidanceDocuments/UCM238851.pdf。仅检测SCCmec序列也是不够的，因为并非所有SCCmec元件均由于空盒或缺失现象而携带mecA或mecC，也就是说，某些MSSA菌株显示SCCmec阳性，并且可能在MRSA试验中注册为假阳性，所述MRSA试验本身不检测mecA或mecC基因序列。参见，例如，Rupp等人,《临床微生物杂志(J.Clin.Microbiol.)》44:2317(2006)。并且SCCmec本身是高度多态的，其中已经描述了至少21种MREJ类型(参见美国专利公开号2013/0266942)。
因此，需要可以提供快速且准确地鉴定一种或多种不同类型的MRSA和/或将其与MSSA进行区分的组合物和方法，包含空盒SCCmec阳性MSSA和/或耐甲氧西林的CNS。本公开旨在满足这些需求、提供其它益处，或至少向公众提供有用的选择。
本文提供了以下实施例。实施例1是一种组合物或试剂盒，其包括至少一种orfX扩增低聚物、至少第一SCCmec右端连接(MREJ)扩增低聚物和多种mec扩增低聚物，其中：所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；所述MREJ扩增低聚物被配置成与SCCmec序列特异性杂交；所述orfX扩增低聚物和所述MREJ扩增低聚物被配置成产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的orfX/SCCmec连接扩增子；所述多种mec扩增低聚物包括第一mecA/mecC扩增低聚物和第二mecA/mecC扩增低聚物；所述第一mecA/mecC扩增低聚物被配置成与位点特异性杂交，所述位点包括：SEQ ID NO:13的位置1394和SEQ ID NO:14的位置1285，或SEQ ID NO:13的位置1484和SEQ ID NO:14的位置1376；所述第二mecA/mecC扩增低聚物被配置成与包括SEQ IDNo:13的位置1312和SEQ ID NO:14的位置1203的位点特异性杂交；并且所述第一mecA/mecC扩增低聚物和所述第二mecA/mecC扩增低聚物被配置成产生mec扩增子。
实施例2是一种组合物或试剂盒，其包括至少一种orfX扩增低聚物、至少第一MREJ扩增低聚物以及至少第一GAPDH扩增低聚物和第二GAPDH扩增低聚物，其中：所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；所述MREJ扩增低聚物被配置成与SCCmec序列特异性杂交；所述orfX扩增低聚物和所述MREJ扩增低聚物被配置成产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的orfX/SCCmec连接扩增子；所述第一GAPDH扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:15的位置169或位置212的位点特异性杂交；所述第二GAPDH扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:15的位置279、位置312或位置421的位点特异性杂交；并且所述第一GAPDH扩增低聚物和所述第二GAPDH扩增低聚物被配置成产生GAPDH扩增子。
实施例3是一种检测MRSA核酸的方法，其包括：制备根据实施例1或实施例2所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含或怀疑包含MRSA核酸的样品；使所述组合物经受扩增条件；以及检测所述orfX/SCCmec连接扩增子以及mec扩增子和所述GAPDH扩增子中至少一种存在与否。
实施例4是一种组合物或试剂盒，其包括：orfX扩增低聚物，所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；至少一种检测低聚物，所述至少一种检测低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置201或位置210的位点的特异性杂交；以及至少第一MREJ扩增低聚物和第二MREJ扩增低聚物，其中：所述orfX扩增低聚物和所述第一MREJ扩增低聚物被配置成从一种或多种第一MREJ类型的MRSA产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的第一orfX/SCCmec连接扩增子；并且所述orfX扩增低聚物和所述第二MREJ扩增低聚物被配置成从不同于所述一种或多种第一MREJ类型的一种或多种第二MREJ类型的MRSA产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的第二orfX/SCCmec连接扩增子。
实施例5是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少一种的SCCmec序列特异性杂交。
实施例6是一种组合物或试剂盒，其包括：orfX扩增低聚物，所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；以及至少第一MREJ扩增低聚物，其中所述第一MREJ扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:17的位置491和SEQ ID NO:18的位置555的位点特异性杂交，其中：所述orfX扩增低聚物和第一MREJ扩增低聚物被配置成从MREJ类型xv的MRSA产生第一orfX/SCCmec连接扩增子。
实施例7是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括至少第二和第三MREJ扩增低聚物，每个扩增低聚物被配置成与彼此不同并且不同于所述第一MREJ扩增低聚物被配置成特异性杂交的一种或多种MREJ类型的MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少一种的至少一个SCCmec序列特异性杂交并产生长度范围为约50个核苷酸到约2000个核苷酸的orfX/SCCmec连接扩增子。
实施例8是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括多个MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少一种的至少一个SCCmec序列特异性杂交，其中所述试剂盒或组合物的所述至少一种orfX引物和所述MREJ扩增低聚物共同被配置成从MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种或14种产生orfX/SCCmec连接扩增子，其中所述orfX/SCCmec连接扩增子的长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸。
实施例9是一种检测MRSA核酸的方法，其包括：制备根据实施例4到8中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含或怀疑包含MRSA核酸的样品；使所述组合物经受扩增条件；以及使用所述至少一种检测低聚物来检测至少一种orfX/SCCmec连接扩增子存在与否。
实施例10是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ IDNO:1的位置277、位置287或位置293中至少一个的位点处与MREJ类型i核酸特异性杂交。实施例11是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:2的位置613、位置622、位置721、位置731或位置737中至少一个的位点处与MREJ类型ii核酸特异性杂交。实施例12是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ IDNO:8的位置473或位置654的位点处与MREJ类型ix核酸特异性杂交。实施例13是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:11的位置482、位置584或位置765的位点处与MREJ类型xiv核酸特异性杂交。实施例14是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型i、ii、viii、ix和xiv中至少一种特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:50-55或69-72之一的序列。实施例15是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:52、53或55之一的序列。实施例16是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:50的序列。实施例17是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:51的序列。实施例18是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:53或54的序列。实施例19是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:69-72的序列。实施例20是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:3的位置668、位置738或位置750中至少一个的位点处与MREJ类型iii核酸特异性杂交。实施例21是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型iii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:73-75之一的序列。实施例22是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:73-75之一的序列。
实施例23是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:4的位置545、位置551或位置559中至少一个的位点处与MREJ类型iv核酸特异性杂交。实施例24是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型iii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:63-65之一的序列。实施例25是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:63-65之一的序列。实施例26是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:5的位置458的位点处与MREJ类型v核酸特异性杂交。实施例27是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型v核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:56的序列。实施例28是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:56的序列。
实施例29是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:6的位置498或位置611的位点处与MREJ类型vi核酸特异性杂交。实施例30是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型vi核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:67-68之一的序列。实施例31是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:67-68之一的序列。
实施例32是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:7的位置563、位置565、位置601或位置629中至少一个的位点处与MREJ类型vii核酸特异性杂交。实施例33是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型vii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:76-79之一的序列。实施例34是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:76-79之一的序列。
实施例35是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括其中MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:9的位置617、位置624或位置630中至少一个的位点处与MREJ类型xii核酸特异性杂交。实施例36是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型xii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:80-82之一的序列。实施例37是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:80-82之一的序列。
实施例38是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括其中MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:10的位置561、位置568、位置605或位置628中至少一个的位点处与MREJ类型xiii核酸特异性杂交。实施例39是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型xiii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:69-72之一的序列。实施例40是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:69-72之一的序列。
实施例41是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ IDNO:12的位置461的位点处与MREJ类型xxi核酸特异性杂交。实施例42是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型xxi核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:57的序列。实施例43是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:57的序列。
实施例44是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:59组成的序列的低聚物竞争与orfX核酸的杂交。实施例45是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:60组成的序列的低聚物竞争与orfX核酸的杂交。实施例46是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186的位点特异性杂交。实施例47是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置192的位点特异性杂交。实施例48是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括具有多达两个错配的SEQID NO:59的序列。实施例49是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括SEQ ID NO:59的序列。实施例50是根据实施例1到47中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括具有多达两个错配的SEQ IDNO:60的序列。实施例51是根据实施例1到47中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括SEQ ID NO:60的序列。
实施例52是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括至少一种初级orfX/SCCmec连接检测低聚物，所述低聚物被配置成与所述orfX/SCCmec连接扩增子序列特异性杂交。实施例53是根据实施例52所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物是不可延伸的。实施例54是根据实施例52或53所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括标记。实施例55是根据实施例52到54中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置201和位置211中至少一个的位点特异性杂交。实施例56是根据实施例52到55中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物被配置成与同所述orfX扩增低聚物被配置成特异性杂交的SEQ ID NO:16中的位点重叠的位点特异性杂交。实施例57是根据实施例52到56中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:61或62组成的序列的检测低聚物竞争与SEQ IDNO:16的杂交。实施例58是根据实施例52到57中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括SEQ ID NO:85、86、97或98中至少一个的序列。实施例59是根据实施例52到58中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:61、62、111或115的序列。实施例60是根据实施例52到59中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括SEQ ID NO:61、62、111或115的序列。
实施例61是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物在严格的条件下与具有由包含胞嘧啶甲基化的SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:84组成的序列的低聚物竞争与MREJ类型xv核酸的杂交。实施例62是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括包含具有多达两个错配的胞嘧啶甲基化的SEQ ID NO:83的序列。实施例63是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括包含胞嘧啶甲基化的SEQ IDNO:83的序列。实施例64是根据实施例1到61中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:84的序列。实施例65是根据实施例64所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:84的序列。
实施例66是根据实施例2到65中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括多个被配置成产生mecA扩增子或mecC扩增子中至少一种的mec扩增低聚物。实施例67是根据实施例1或66所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述多种mec扩增低聚物包括在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:30、34、36、37、39或40组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA核酸的mec扩增低聚物。实施例68是根据实施例1、66或67所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述多种mec扩增低聚物包括包含具有多达两个错配的SEQ ID NO:30、34、36、37、39或40的序列的mec扩增低聚物。实施例69是根据实施例1或66所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述多种mec扩增低聚物包括包含所述SEQ ID NO:30、34、36、37、39或40的序列的mec扩增低聚物。
实施例70是根据实施例1或66到69中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:31、35、38、45、48或49组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA或mecC核酸的mec扩增低聚物。实施例71是根据实施例1或66到70中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含具有多达两个错配的SEQ ID NO:31、35、38、45、48或49的序列的mec扩增低聚物。实施例72是根据实施例1或66到69中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ ID NO:31、35、38、45、48或49的序列的mec扩增低聚物。
实施例73是根据实施例1或66到72中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:34、36、37或39组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA或mecC核酸的mec扩增低聚物。实施例74是根据实施例1或66到73中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含具有多达两个错配的SEQ ID NO:34、36、37或39的序列的mec扩增低聚物。实施例75是根据实施例1或66到72中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ IDNO:34、36、37或39的序列的mec扩增低聚物。
实施例76是根据实施例1或66到75中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:35、48或49组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecC核酸的mec扩增低聚物。实施例77是根据实施例1或66到76中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含具有多达两个错配的SEQ ID NO:35、48或49的序列的mec扩增低聚物。实施例78是根据实施例1或66到75中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ ID NO:35、48或49的序列的mec扩增低聚物。
实施例79是根据实施例1或66到78中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:29、33、41、43、112或116组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA核酸的mec初级检测低聚物。
实施例80是根据实施例1或66到79中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ ID NO:87-91或99-103中至少一个的序列的mec初级检测低聚物。实施例81是根据实施例1或66到80中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含具有多达两个错配的SEQ ID NO:29、33、41、43、112或116的序列的mec初级检测低聚物。实施例82是根据实施例1或66到80中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ ID NO:29、33、41、43、112或116的序列的mec初级检测低聚物。实施例83是根据实施例1或66到82中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:28、32、47、113或117组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecC核酸的mec初级检测低聚物。实施例84是根据实施例1或66到83中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ ID NO:92-94或104-106中至少一个的序列的mec初级检测低聚物。实施例85是根据实施例1或66到84中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含具有多达两个错配的SEQ ID NO:28、32、47、113或117的序列的mec初级检测低聚物。实施例86是根据实施例1或66到84中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ ID NO:28、32、47、113或117的序列的mec初级检测低聚物。
实施例87是根据实施例1或3到86中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括至少一对金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物，其被配置成产生金黄色葡萄球菌特异性扩增子或金黄色葡萄球菌指示性扩增子。实施例88是根据实施例87所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一对金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物被配置成与金黄色葡萄球菌染色体中的nuc、rRNA、femB、Sa442、葡萄球菌黄素(Staphyloxanthin)或GAPDH之一特异性杂交。实施例89是根据实施例2或87到88中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:20或23组成的序列的低聚物竞争结合到金黄色葡萄球菌GAPDH。实施例90是根据实施例2或87到89中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物包括SEQ ID NO:20或23的序列。实施例91是根据实施例2或87到90中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:21、24或26组成的序列的低聚物竞争结合到金黄色葡萄球菌GAPDH。实施例92是根据实施例2或87到91中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物包括SEQID NO:21、24或26的序列。
实施例93是根据实施例2或87到92中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括至少一种金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物。实施例94是根据实施例93所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:22、25、114或118组成的序列的低聚物竞争结合到金黄色葡萄球菌GAPDH。实施例95是根据实施例93或94所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物包括SEQID NO:95、96、107或108中至少一个的序列。实施例96是根据实施例93到95中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物包括SEQ ID NO:22、25、114或118的序列。
实施例97是根据实施例4到5或9到96中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括一种或多种二级检测低聚物，所述低聚物包括标记并且被配置成与初级检测低聚物的片段相互作用。实施例98是根据实施例97所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物是FRET盒。实施例99是根据实施例97或98所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物包含包括SEQ ID NO:58的序列的二级检测低聚物。实施例100是根据实施例97到99中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物包含包括SEQ ID NO:19的序列的二级检测低聚物。实施例101是根据实施例97到100中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物包含包括SEQ ID NO:27的序列的二级检测低聚物。实施例102是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括具有针对由3'端侵入形成的三链结构的结构特异性活性的核酸酶。
实施例103是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括切割酶或5'核酸酶。实施例104是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括FEN1核酸酶。
实施例105是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括聚合酶。实施例106是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括DNA聚合酶。实施例107是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括耐热DNA聚合酶。实施例108是根据实施例107所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述耐热DNA聚合酶是热启动DNA聚合酶。
实施例109是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括NTP。实施例110是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括脱氧核糖核苷三磷酸。
实施例111是一种检测低聚物，其包括SEQ ID NO:85-96或119-126中任一项中的序列，其中所述检测低聚物进一步包括足够的附加序列以与MRSA扩增子特异性杂交。实施例112是根据实施例111所述的检测低聚物，所述检测低聚物被配置成与SEQ ID NO:97-108中任一项中所阐述的序列的反向互补序列特异性杂交。实施例113是根据实施例111或112所述的检测低聚物，所述检测低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:97-108中任一项中所阐述的序列。实施例114是根据实施例111或112所述的检测低聚物，所述检测低聚物包括SEQ ID NO:97-108中任一项中所阐述的序列。实施例115是根据实施例111到114中任一项所述的检测低聚物，所述检测低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:22、25、28、29、32、33、39、41、43、47、61或62中任一项中所阐述的序列。实施例116是根据实施例111到114中任一项所述的检测低聚物，所述检测低聚物包括所述SEQ ID NO:22、25、28、29、32、33、39、41、43、47、61或62中任一项中所阐述的序列。实施例117是根据实施例111到116中任一项所述的检测低聚物，其中所述检测低聚物是不可延伸的。实施例118是根据实施例111到117中任一项所述的检测低聚物，其中所述检测低聚物包括标记。实施例119是根据实施例111到118中任一项所述的检测低聚物，其中所述检测低聚物的长度为约25到约45个核甘酸。
实施例120是一种组合物或试剂盒，其包括根据实施例111到119中任一项所述的至少一种检测低聚物和至少一种二级检测低聚物，其中所述二级检测低聚物包括至少一个标记并且被配置成与所述检测低聚物的片段相互作用。实施例121是根据实施例120所述的组合物或试剂盒，其中所述二级检测低聚物包括至少两个标记。实施例122是根据实施例121所述的组合物或试剂盒，其中所述至少两个标记包含FRET对。实施例123是根据实施例121或122所述的组合物或试剂盒，其中所述至少两个标记包含淬灭剂。实施例124是根据实施例121到123中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述二级检测低聚物是FRET盒。实施例125是根据实施例120到124中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述检测低聚物的片段是至少约6个核苷酸的5'端皮瓣。实施例126是根据实施例125所述的组合物或试剂盒，其中所述检测低聚物的5'端皮瓣具有包括如SEQ ID NO:22、25、28、29、32、33、39、41、43、47、61或62中任一项中所阐述的位置1-6的序列。
实施例127是一种检测MRSA核酸的方法，其包括：制备根据实施例120到126中任一项所述的组合物或包括实施例111到119中任一项所述的至少一种检测低聚物，并且进一步包括包含或怀疑包含MRSA核酸或至少一种MRSA扩增子的样品；通过进行杂交试验来检测MRSA核酸或MRSA扩增子存在与否；以及确定所述检测低聚物是否与所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子杂交。
实施例128是根据实施例127所述的方法，其中所述组合物包含根据实施例120到126中任一项中所述的至少一种二级检测低聚物，并且所述方法包括确定与所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子杂交的所述检测低聚物是否包括将所述检测低聚物暴露于结构特异性核酸酶，并确定由所述结构特异性核酸酶所产生的所述检测低聚物的片段是否与所述二级检测低聚物相互作用。实施例129是根据实施例128所述的方法，其中所述检测低聚物的片段是5'端皮瓣。实施例130是根据实施例128或129所述的方法，其中所述组合物进一步包括至少一种侵入性低聚物，所述侵入性低聚物与所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子中与所述检测低聚物的杂交位点重叠的位点杂交，并且在所述检测低聚物和所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子存在的情况下，形成被所述结构特异性核酸酶识别为切割的结构。实施例131是根据实施例130所述的方法，其中所述侵入性低聚物在严格条件下与具有由SEQ ID NO:20、21、23、24、30、31、34-40、45、46、48-57、59、60、63-84、109或110中任一个的序列组成的序列的低聚物竞争与MRSA核酸或MRSA扩增子的杂交。实施例132是根据实施例130或131所述的方法，其中所述侵入性低聚物具有包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:20、21、23、24、30、31、34-40、45、46、48-57、59、60、63-84、109或110中任一个的序列的序列。
实施例133是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒、检测低聚物或方法，其中至少一种低聚物包括至少一种甲基化胞嘧啶。实施例134是根据前述实施例中任一项所述的组合物、试剂盒、检测低聚物或方法，其中SEQ ID NO的序列包含序列表中所指示的胞嘧啶甲基化。实施例135是根据实施例1到2、4到8、10到110、120到126或133到134中任一项所述的组合物，或包括根据实施例111到119中任一项所述的检测低聚物，所述检测低聚物是含水的、冷冻的或冻干的，或其中至少一种低聚物结合到固体基质。
实施例136是一种根据实施例1到2、4到8、10到110、120到126或133到135中任一项所述的组合物或试剂盒或根据实施例111到119中任一项所述的检测低聚物的用途，其用于检测样品中的MRSA核酸。
附图说明
图1A-1B示出了使用本公开的示例性低聚物的检测和扩增数据。图1A示出了来自含有MREJ ii的MRSA和含有MREJ xv的MRSA、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)以及阴性对照的MREJ ii、MREJ xv、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和mecA的扩增产物。图1B示出了每个样品在orfX/SCCmec阈值周期[Ct]中所测得的扩增信号。图1A-1B两幅图中的MREJ xv引物浓度均以μM为单位给出。
图2示出了在一组含有MREJ xv序列的MRSA菌株中，相比于Cepheid测试(
SA鼻腔完整)，在包含MREJ xv引物的情况下，本公开的示例性低聚物的性能。orfX/SCCmec和SCC是指通过将SCCmec整合到金黄色葡萄球菌染色体上的orfX基因中所产生的连接。mecA/C和mec是指mecA和/或mecC基因的存在。GAPDH和SPA是指含有金黄色葡萄球菌特异性或指示性的序列的基因。数据以非标准化平均Ct值表示。
图3示出了对四种MRSA菌株的示例性低聚物的检测限(LoD)分析。数据以单个基因和MRSA/SA调用的阳性率百分比表示。
图4示出了在MRSA/MRSE(耐甲氧西林表皮葡萄球菌)混合感染样品中进行的MRSA试验的检测。数据以orfX/SCCmec目标检测的非标准化平均Ct值表示。
图5示出了使用MRSA试验进行测试时，各种含有金黄色葡萄球菌属的试验组的交叉反应性数据。阴影框(表示某些试验组的mecA/C的阳性率)是由于MRSE中存在的mecA基因。IC＝内部对照；SA＝金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
定义
在详细描述本教导之前，应理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化。应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”均包含复数指示物，并且如“一个或多个项目”等表达包括单数指示物。因此，例如，引用“低聚物”包含多种低聚物等；在进一步的实例中，“一种或多种二级检测低聚物是FRET盒”的陈述包含恰好存在一种二级检测低聚物并且所述低聚物是FRET盒的情况。将以包含性的意义来解释连词“或”，即等同于“和/或”，除非包含性的意义在上下文中是不合理的。当存在一类(例如，低聚物)的“至少一个”成员时，引用“所述”成员(例如，低聚物)是指存在的当前成员(如果只有一个)或成员(例如，低聚物)中的至少一个(如果多于一个)。
应当理解，在本公开中讨论的温度、浓度、时间等之前存在隐含的“约”，使得轻微的和非实质性的偏差都处于本发明教导的范围内。通常，术语“约”指示组合物的组分的量的非实质性变化，所述非实质性变化对组合物的活性或稳定性没有任何显著影响，例如在10％、5％、2％或1％内。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，其可以根据期望寻求获得的特性而变化。至少，并且不尝试将等同原则的应用限于权利要求的范围，每个数值参数应至少考虑报告的有效数字的数目并且应用常规的舍入技术来解释。在没有明确排除的情况下，如“不包含终点”，所有范围应解释为包括终点；因此，例如，“在10到15内”包含值10和15。本领域技术人员应理解，本文所叙述的范围包含所述范围内的所有整数和有理数(例如，90％到100％包含92％和98.377％)。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“含有(contain或contains或containing)”和“包含(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，且并不是对本教导的约束。在通过引用并入的任何材料与本公开的明确内容不一致的程度上，以明确内容为准。
除非特别指出，否则说明书中叙述“包括”各个组分的实施例也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；说明书中叙述“由各个组分组成”的实施例也被认为是“包括所述组分”或“基本上由所述组分组成”；并且说明书中叙述“基本上由各个组分组成”的实施例也被认为是“由所述组分组成”或“包括所述组分”(这种可互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。“基本上由……组成”意指那些组合物或方法中可以包含不会实质性改变本文所描述的组合物和方法的基本和新颖特征的一种或多种附加组分、一种或多种组合物或一种或多种方法步骤。此类特征包含检测样品中存在的MRSA核酸序列的能力，所述能力具有将MRSA核酸与MSSA、CNS如MRSE和/或其它非金黄色葡萄球菌、空盒MSSA和其它已知致病菌中的一种或多种或全部进行区分的特异性。在一些实施例中，所述特征包含以足以检测低至约50CFU(菌落形成单位)/mL(毫升)的MRSA的灵敏度来检测MRSA核酸序列的能力。在一些实施例中，所述特征包含当使用循环扩增反应时，在从扩增反应开始的约60分钟内和/或约50个循环内检测MRSA核酸序列的能力。
其中针对组合物或试剂盒的权利要求叙述了具有第一给定特征的低聚物(例如，在严格条件下与具有由SEQ ID NO:29组成的序列的低聚物竞争结合到mecA核酸的杂交)，并且依赖于此的权利要求叙述了具有附加给定特征的低聚物(例如，包括SEQ ID NO:87-91或99-103中至少一个的序列)，然后所述组合物和试剂盒可以包括共同具有特征的多种低聚物或具有第一和附加特征的单个低聚物(包含但不限于当特征是相关的时；例如，在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:29组成的序列的低聚物竞争结合到mecA核酸的杂交，所述序列与包括SEQ ID NO:99的序列有关，因为SEQ ID NO:99是SEQ ID NO:29的子序列)。
“MRSA核酸”通常是指在MRSA中发现的核酸，包含但不限于orfX/SCCmec连接、mecA或mecC和指示金黄色葡萄球菌的序列(例如，金黄色葡萄球菌特异性序列)。“MRSA靶核酸”是一种在根据本公开的方法中被靶向用于扩增和/或检测的MRSA核酸。“MRSA扩增子”是由MRSA核酸的扩增而产生的扩增子。
“orfX/SCCmec连接”包括来自直接连接到SCCmec序列(即一个或多个核苷酸)的金黄色葡萄球菌orfX基因的序列(即一个或多个核苷酸)，如通过将SCCmec整合到金黄色葡萄球菌染色体中而形成。在一些实施例中，orfX/SCCmec连接包括orfX序列的至少约20个核苷酸和SCCmec序列的至少约20个核苷酸。在一些实施例中，orfX/SCCmec连接包括SCCmec序列的至少约30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。
“MREJ”(mec右端连接)是orfX/SCCmec连接的SCCmec衍生的部分。
“样品”是指可能含有MRSA靶核酸的材料，包括但不限于生物样品、临床样品、环境样品和食品样品。环境样品包含环境材料，如表面物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和乳制品加工仪器、仪器、设备、器具、一次性和非一次性物品中获得的样品。“生物”或“临床”样品是指衍生自活体或死亡的人或动物的组织或材料，其可能含有MRSA靶核酸，包含例如皮肤、伤口、鼻咽或咽拭子、鼻或支气管洗液、鼻吸出物、痰、其它呼吸道组织或分泌液、包含淋巴结的活检组织或体液如血液或尿液。可以对样品进行处理来物理地或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内核酸释放到可以含有酶、缓冲液、盐类、洗涤剂等的溶液中，以制备用于分析的样品。这些实例不应解释为限制了适用于本公开的样品类型。
“核酸”和“多核苷酸”是指包含核苷或核苷类似物的多聚体化合物，所述核苷或核苷类似物具有连接在一起形成多核苷酸的含氮杂环碱基或碱基类似物，包含常规的RNA、DNA、混合RNA-DNA及其类似物的聚合物。核酸“主链”可以由多种键构成，包含以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT号：WO 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖，或具有取代(例如，2'甲氧基和/或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)，其类似物(例如，肌苷或其它；参见《核酸的生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)》5-36,Adams等人编辑,第11版,1992)，嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮杂-或氮杂-嘌呤、脱氮杂-或氮杂-嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶；美国专利号5,378,825和PCT号WO 93/13121)。核酸可以包含一个或多个“无碱基”残基，其中主链不包含聚合物的一个或多个位置的含氮碱基(美国专利号5,585,481)。核酸可以仅包括常规的RNA或DNA糖、碱基和键，或可以包含常规的组分和取代(例如，具有2'甲氧基键的常规碱基，或含有常规碱基和一种或多种碱基类似物两者的聚合物)。核酸包含“锁定核酸”(LNA)，一种含有一种或多种LNA核苷酸单体的类似物，其中二环呋喃糖单元被锁定在模拟糖构型的RNA中，这增强了对互补RNA和DNA序列的杂交亲和力(Vester和Wengel,2004,《生物化学(Biochemistry)》43(42):13233-41)。可以影响杂交复合物的稳定性的低聚物的实施例包含PNA低聚物、包含2'-甲氧基或2'-氟取代的RNA的低聚物、或影响杂交复合物的总电荷、电荷密度或空间结合的低聚物，包含含有带电荷的键(例如，硫代磷酸酯)或中性基团(例如，甲基膦酸酯)的低聚物。除非另有说明，否则甲基化胞嘧啶如5-甲基胞嘧啶可以与任何前述主链/糖/键(包含RNA或DNA主链(或其混合物))结合使用。RNA和DNA的等价物具有不同的糖部分(即，核糖相对于脱氧核糖)，并且可以因RNA中的尿嘧啶和DNA中的胸腺嘧啶的存在而不同。RNA与DNA等价物之间的差异不会造成同源性的差异，因为所述等价物对特定序列具有相同程度的互补性。应当理解，当提及低聚核苷酸、扩增子或其它核酸的长度范围时，所述范围包含所有的整数(例如，长度为19到25个连续的核苷酸包含19、20、21、22、23、24和25个)。
除非上下文另有说明，否则“C残基”包含甲基化和未甲基化的胞嘧啶。在一些实施例中，甲基化的胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶或由其组成。
“低聚物”或“低聚核苷酸”是指通常少于1,000个核苷酸(nt)的核酸，包含具有下限约为2到5nt且上限约为500到900nt的大小范围的核酸。一些特定的实施例是处于下限为约5到15、16、17、18、19或20nt且上限为约50到600nt的大小范围中的低聚物，而其它特定实施例的低聚物则处于下限为约10到20nt且上限为约22到100nt的大小范围中。低聚物可以从天然存在的来源纯化，但是可以通过使用任何已知的酶或化学方法进行合成。低聚物可以用功能名称(例如，捕获探针、引物或启动子引物)来指代，但是本领域技术人员将理解，这些术语是指低聚物。低聚物可以通过自杂交或通过与其它多核苷酸杂交形成二级和三级结构。这些结构可以包含但不限于双链体、发夹、十字形、弯曲和三链体。低聚物可以以任何方式产生，包含化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或其组合。在一些实施例中，在反应中产生形成侵入性切割结构的低聚物(例如，通过在酶促延伸反应中引物的延伸)。
“扩增子”或“扩增产物”意指在核酸扩增反应中产生的核酸分子，并且所述核酸分子衍生自靶核酸。扩增子或扩增产物含有可以与靶核酸具有相同或相反意义的靶核酸序列。在一些实施例中，扩增子的长度为约100到2000个核甘酸、约100到1500个核甘酸、约100到1000个核甘酸、约100到800个核甘酸、约100到700个核甘酸、约100到600个核甘酸或约100到500个核甘酸。
“扩增低聚核苷酸”或“扩增低聚物”是指与靶核酸或其补体杂交并参与核酸扩增反应的低聚核苷酸，例如用作引物和/或启动子-引物。特定的扩增低聚物含有至少约10个连续的碱基，以及任选地至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续的碱基，所述连续的碱基与靶核酸序列或其互补链的一个区域互补。连续的碱基可以与扩增低聚物结合的靶序列至少约80％、至少约90％或完全互补。在一些实施例中，扩增低聚物包括介于互补序列的两个片段之间的介入接头或非互补序列，例如，其中低聚物的两个互补片段共同包括至少约10个互补碱基，并且任选地至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个互补碱基。特定的扩增低聚物长约10到约60个碱基，并且任选地可以包含修饰的核苷酸。
“引物”是指与模板核酸杂交并具有通过聚合作用延伸的3'端的低聚物。引物可以任选地被修饰，例如通过包含与靶序列是非互补的5'区域。这种修饰可以包含功能性添加，如标签、启动子或可用于或有益于操纵或扩增引物或靶低聚核苷酸的其它序列。用5'启动子序列修饰的引物可以称为“启动子-引物”。分子生物学或生物化学领域的普通技术人员将理解，可以用作引物的低聚物可以被修饰以包含5'启动子序列，并且然后用作启动子-引物，并且类似地，任何启动子-引物可以用作具有或不具有其5'启动子序列的引物。
“核酸扩增”是指产生靶核酸序列或其互补序列或其片段(即，含有少于完整靶核酸的扩增序列)的多个拷贝的任何体外程序。核酸扩增程序的实例包含转录相关的方法，如转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和其它(例如，美国专利号5,399,491、5,554,516、5,437,990、5,130,238、4,868,105和5,124,246)、复制酶介导的扩增(例如，美国专利号4,786,600)、聚合酶链式反应(PCR)(例如，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159)、连接酶链式反应(LCR)(例如，欧洲专利申请0320308)和链置换扩增(SDA)(例如，美国专利号5,422,252)。复制酶介导的扩增使用自我复制的RNA分子和复制酶(如QB复制酶)。PCR扩增使用DNA聚合酶、引物和热循环步骤以合成DNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝。LCR扩增使用至少四种单独的低聚核苷酸，通过使用杂交、连接和变性的多个循环来扩增靶和其互补链。SDA使用含有限制性内切酶的识别位点的引物，所述限制性内切酶将切割包含靶序列的半修饰DNA双链体的一条链，随后在一系列引物延伸和链置换步骤中扩增。特定的实施例使用PCR或TMA，但是对于本领域的普通技术人员来说将显而易见的是，本文公开的低聚物可以容易地用作其它扩增方法中的引物。
转录相关的扩增使用DNA聚合酶、RNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、含有启动子的低聚核苷酸，并且任选地可以包含其它低聚核苷酸，以最终从核酸模板产生多个RNA转录物(详细描述于美国专利号5,399,491和5,554,516；Kacian等人，美国专利号5,437,990；Burg等人，PCT号WO 88/01302和WO 88/10315；Gingeras等人，美国专利号5,130,238；Malek等人，美国专利号4,868,105和5,124,246；Urdea等人，PCT号WO 94/03472；McDonough等人，PCT号WO 95/03430，和Ryder等人)。先前详细地描述了使用TMA的方法(美国专利号5,399,491和5,554,516)。
在实时检测扩增子的循环扩增方法中，术语“阈值循环”(ct)是与靶的扩增相关的信号出现时间的量度，并且可以是例如标准化报告信号的大约10倍标准偏差。一旦扩增达到“阈值循环”，通常就认为探针结合的序列是阳性扩增产物。然后可以通过本领域技术人员已知的方法来确定扩增产物的身份，如凝胶电泳、核酸测序和其它此类已知的方法。
“检测低聚物”或“探针”是指与靶核酸相互作用以形成可检测的复合物的低聚物。实例包含侵入性探针和初级探针。“侵入性探针”是指在初级探针和靶核酸之间的杂交区域附近的位置与靶核酸杂交的低聚核苷酸，其中所述侵入性探针低聚核苷酸包括与所述初级探针低聚核苷酸和靶核酸之间的杂交区域重叠的部分(例如，化学部分或核苷酸，无论是否与所述靶互补)。用于侵入性切割试验的“初级探针”包含与靶核酸杂交的靶特异性区域，并且进一步包含与靶核酸不互补的“5'皮瓣”区域。通常，检测可以是直接的(即，探针直接与靶杂交)或间接的(即，涉及将可检测的标记或可检测标记的分子(例如，FRET盒)连接到靶的中间结构)。探针靶序列通常是指探针特异性杂交的较大序列内的特定序列。检测低聚物可以包含靶特异性序列和非靶互补序列。这种非靶互补序列可以包含将赋予所期望的二级或三级结构的序列，如可以用于促进检测和/或扩增的皮瓣或发夹结构(例如，美国专利号5,118,801、5,312,728、6,835,542、6,849,412、5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,913,881、6,090,543和7,482,127；WO 97/27214；WO 98/42873；Lyamichev等人,《自然生物技术(Nat.Biotech.)》,17:292(1999)；和Hall等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,美国,97:8272(2000))。限定序列的探针可以通过本领域普通技术人员已知的技术产生，如通过化学合成，以及通过重组核酸分子的体外或体内表达。
“探针系统”意指用于检测靶序列的多种检测低聚物或探针。在一些实施例中，探针系统包括至少初级和二级探针。在一些实施例中，初级探针包括靶杂交序列和非靶互补序列。在一些实施例中，在适当的核酸酶(例如，结构特异性核酸酶，例如切割酶或5'-核酸酶)存在的情况下，当与靶序列杂交时，初级探针经历核溶解(例如切割，如5'-切割或核酸内切裂解)。在一些实施例中，这种核溶解导致从与二级探针相互作用的初级探针中释放出“皮瓣”或切割片段。在一些实施例中，二级探针包括至少一个标记。在一些实施例中，二级探针包括至少一对标记，如相互作用的一对标记，例如FRET对或荧光团和淬灭剂。在一些实施例中，二级探针与初级探针的释放皮瓣的相互作用导致二级探针的发射特性中的可检测变化，例如，如下面关于
试验、FRET和/或淬灭所讨论的。在一些实施例中，探针系统包括初级探针和二级探针，所述二级探针被配置成与初级探针的释放皮瓣相互作用，例如，初级探针可以被切割以给出与二级探针或其片段充分互补的释放皮瓣，从而形成复合物。
“杂交(hybridization或hybridize)”意指两条完全或部分互补的核酸链在特定的杂交试验条件下以平行或反平行的方向结合在一起，从而形成具有双链区的稳定结构的能力。这种双链结构的两条组成链(有时被称为混合链)通过氢键结合在一起。尽管这些氢键最常见形成于单个核酸链上含有碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)或胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)的核苷酸之间，但碱基配对还可以在不是这些“经典”对的成员的碱基之间形成。非经典碱基配对在本领域中是众所周知的。(参见，例如，R.L.P.Adams等人,《核酸的生物化学(The Biochemistry of the Nucleic Acids)》)(第11版,1992))。
如本文所使用的，“特定的”意指仅与一个(或仅与一个特别指示的基团)相关，如仅对一个(或仅对一个特别指定的基团)具有特定效果，或以特定方式仅影响一个(或仅一个特别指示的基团)。例如，对FRET盒特异的切割的5'皮瓣将能够与所述FRET盒杂交，形成侵入性切割结构并促进切割反应，但将不能够与不同的FRET盒(例如，具有不同的5'皮瓣杂交序列的FRET盒)杂交以促进切割反应。此外，可以使用与低聚核苷酸组合相关的特异性，例如一组扩增和检测低聚核苷酸(例如，扩增低聚核苷酸可以非特异性地扩增多个靶序列，但是检测低聚核苷酸将仅检测特定的扩增的序列，从而使组合具有特异性)。
如本文所使用的，术语“特异性杂交”意指在给定的杂交条件下，探针或引物基本上仅与包括一个或多个靶序列的样品中的一个或多个其靶序列可检测地杂交(即，与非靶序列的可检测杂交很少或没有)。值得注意的是，例如在各种MREJ靶序列的情况下，低聚物可以被配置成与一组靶中的任何一个特异性杂交。因此，被描述为与第一MREJ类型特异性杂交的低聚物也可以(但不是必须的)与第二(或第二和第三，等等)MREJ类型特异性杂交。在一些实施例中，扩增或检测探针低聚物可以与其靶核酸杂交以形成稳定的低聚物：靶杂交体，但没有形成足够数量的稳定低聚物：用于扩增或检测的非靶杂交体，视情况而定。与靶核酸特异性杂交的扩增和检测低聚物可用于扩增和检测靶核酸，但不能用于非靶核酸，尤其是系统发育上密切相关的生物体的非靶核酸。因此，低聚物与靶核酸杂交的程度充分大于与非靶核酸杂交的程度，使得本领域普通技术人员能够适当地精确扩增和/或检测来自特定靶(例如，MRSA)的核酸的存在(或不存在)。通常，减小低聚核苷酸序列与其靶序列之间的互补程度将会降低低聚核苷酸与其靶区域的杂交程度或速率。然而，包含一种或多种非互补核苷或核碱基可以促进低聚核苷酸区分非靶核酸序列的能力。
特异性杂交可以使用本领域已知的和本文所描述的技术来测量，如在下面所提供的实例中。在一些实施例中，测试样品中的靶杂交信号与非靶杂交信号之间存在至少10倍的差异、至少100倍的差异或至少1,000倍的差异。在一些实施例中，测试样品中的非靶杂交信号不超过背景信号水平。
“严格杂交条件”或“严格条件”意指允许低聚物优先与靶核酸(例如，MRSA核酸)杂交而不是与衍生自密切相关的非靶生物体的核酸杂交的条件。虽然严格杂交条件的定义没有变化，但可用于严格杂交的实际反应环境可以根据包含低聚物的GC含量和长度、低聚物序列与测试样品中可能存在的靶核酸和非靶核酸序列之间的相似度等因素而变化。杂交条件包含杂交试剂或溶液的温度和组分。当盐浓度(如二价盐(例如MgCl2))处于约5到21mM的范围内时，用于扩增和/或检测衍生自一种或多种具有本公开的低聚物的MRSA菌株的靶核酸的示例性杂交试验条件对应于约63℃到约67℃或约64℃到约66℃的温度。实施例部分中阐述了杂交条件的另外的细节。本领域普通技术人员可以容易地确定其它可接受的严格杂交条件。
“标记”或“可检测的标记”是指与被检测或导致可检测信号的探针直接或间接地连接的部分或化合物。直接连接可以使用共价键或非共价相互作用(例如，氢键、疏水或离子相互作用，以及螯合物或配位复合物的形成)，而间接连接可以使用桥接部分或接头(例如，通过抗体或一种或多种额外的低聚核苷酸)，其扩增了可检测的信号。可以使用任何可检测的部分，例如放射性核素、配体如生物素或抗生物素蛋白、酶、酶底物、活性基团、发色团如染料或颗粒(如乳胶或金属珠)，其赋予可检测的颜色、发光化合物(如生物发光、磷光或化学发光化合物)和荧光化合物(即，荧光团)。荧光团的实施例包含吸收约495到690nm范围内的光(例如，具有峰值吸收波长)并且发射约520到710nm范围内的光(例如，具有峰值发射波长)的那些荧光团，其包含那些已知的FAMTM、TETTM、HEX、CAL FLUORTM(橙色或红色)、CY和QUASARTM化合物。荧光团可以与淬灭剂分子结合使用，所述淬灭剂分子在靠近荧光团时吸收光以减弱背景荧光。这种淬灭剂在本领域中是众所周知的，并且包含例如黑洞淬灭剂TM(或BHQTM)、
(或
)、
或TAMRATM化合物。特定的实施例包含“均相可检测标记”，所述标记在均相系统中是可检测的，其中混合物中结合的标记探针与未结合的标记探针相比显示出可检测的变化，这允许在没有从未杂交的标记探针中物理去除杂交的情况下检测标记(例如，美国专利号5,283,174、5,656,207和5,658,737)。示例性的均相可检测标记包含化学发光化合物，包含吖啶酯(“AE”)化合物，如众所周知的标准AE或AE衍生物(美国专利号5,656,207、5,658,737和5,639,604)。合成标记、将标记附着到核酸上以及检测来自标记的信号的方法都是众所周知的(例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)》,第2版(冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,1989)第10章，并且美国专利号5,658,737、5,656,207、5,547,842、5,283,174和4,581,333，以及欧洲专利申请0 747 706)。将AE化合物与核酸连接的特定方法是已知的(例如，美国专利号5,585,481和美国专利号5,639,604，参见第10栏第6行到第11栏第3行，以及实例8)。特定的AE标记位置是探针的中心区域和A/T碱基对的区域附近，在探针的3'或5'端，或在与已知序列的错配位点处或其附近，与所期望的靶序列相比，探针不应检测到所述错配位点。其它可检测标记的探针包含FRET盒、TaqManTM探针、分子火炬和分子信标。下面详细地讨论了FRET盒。TaqManTM探针包含供体和受体标记，其中在扩增期间，在酶降解探针时检测荧光，以便从淬灭剂的存在中释放荧光团。分子火炬和信标以开放和封闭构型存在，其中所述封闭构型淬灭荧光团，并且所述开放位置将荧光团与淬灭剂分离，以允许可检测荧光信号的变化。与靶杂交以其它方式打开了封闭的探针。
如果序列允许两个核酸序列的稳定杂交，例如探针和靶序列的稳定杂交，则序列是“充分互补的”，但是所述序列不必是完全互补的。也就是说，“充分互补的”的序列，所述序列通过使用标准碱基配对(例如，G:C、A:T或A:U)，在互补核苷酸的子集系列之间通过氢键与另一个序列杂交，但是这两个序列可以含有一个或多个不互补的残基(包含碱基位置),只要整个序列在适当的杂交条件下形成稳定的杂交复合物。在杂交在一起的序列中，充分互补的序列可以是至少约80％、至少约90％或完全互补的。合适的杂交条件对于本领域技术人员来说是众所周知的，可以基于序列组成来预测，或可以通过使用常规测试来凭经验来确定(例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)》,第2版，§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，尤其是§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57)。
“不可延伸的”低聚物在其3'端处或附近包含封闭部分，以防止延伸。在一些实施例中，3'端附近的封闭基团位于3'端的5个残基内，并且大到足以限制聚合酶与低聚物的结合，而其他实施例含有共价连接到3'端的封闭基团。许多不同的化学基团可用于封闭3'端，例如烷基、非核苷酸接头、链烷二醇双脱氧核苷酸残基(例如，3'-己二醇残基)和虫草素。封闭部分的其它实例包含3'-脱氧核苷酸(例如，2',3'-双脱氧核苷酸)；3'-磷酸化核苷酸；荧光团、淬灭剂或干扰延伸的其它标记；反向核苷酸(例如，通过3'-到-3'磷酸二酯连接到前面的核苷酸，任选地与暴露的5'-OH或磷酸酯连接)；或连接到低聚核苷酸上的蛋白质或肽，以防止新生核酸链通过聚合酶进一步延伸。本公开的不可延伸的低聚核苷酸的长度可以是至少10个碱基，并且长度可达15、20、25、30、35、40、50个或更多个核苷酸。包括可检测标记的不可延伸的低聚核苷酸可用作探针。
除非另有说明，否则特别是在权利要求中，“SEQ ID NO:X的序列”是指相应序列列表条目的碱基序列，并且不需要主链的身份(例如，RNA、2'-O-Me RNA或DNA)或碱基修饰(例如，胞嘧啶残基的甲基化)。此外，除非另有说明，否则T残基应理解为可与U残基互换，并且反之亦然。
除非另有说明，否则“有义”、“正义”或“正链”的MRSA或金黄色葡萄球菌核酸通常是指ORF(开放阅读框)的编码链或非编码核酸，所述编码链或非编码核酸位于与转录物、操纵子、mRNA等的编码链的相同的链上，其中它是最接近的ORF的一部分或以其它部分，而“反义”、“负义”、“负链”MRSA或金黄色葡萄球菌核酸是指“有义”、“正义”或“正链”MRSA核酸的互补。在下面的序列表中的SEQ ID NO:1-18中提供了示例性正义链MRSA或金黄色葡萄球菌序列。除非另有说明，否则“与MRSA(或金黄色葡萄球菌)核酸杂交”包含与其有义或反义链杂交，例如dsDNA MRSA序列的任一链。类似地，如“与包含SEQ ID NO:Y的位置X的位点杂交”和“竞争与SEQ ID NO:Y”杂交的表达通常可以包含与SEQ ID NO:Y的有义或反义链杂交；在杂交的低聚物被配置成产生扩增子的情况下，适当的取向对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
如本文所使用的，术语“侵入性切割结构”(或简称为“切割结构”)是指包括以下的结构：(1)靶核酸；(2)上游核酸(例如，侵入性探针低聚核苷酸)；和(3)下游核酸(例如，初级探针低聚核苷酸)，其中所述上游和下游核酸与靶核酸的连续区域退火，并且其中上游核酸的3'部分和下游核酸与靶核酸之间形成的双链体之间形成重叠。当上游和下游核酸的一个或多个碱基相对于靶核酸碱基占据相同位置时，无论上游核酸的一个或多个重叠碱基是否与靶核酸互补，并且无论这些碱基是天然碱基还是非天然碱基，都会发生重叠。在一些实施例中，与下游双链体重叠的上游核酸的3'部分是非碱基化学部分，如芳环结构，如美国专利号6,090,543中所公开的。在一些实施例中，一种或多种核酸可以相互连接，例如通过共价连接如核酸茎环，或通过非核酸化学连接(例如多碳链)。当切割的5'皮瓣与FRET盒杂交时(即，当“靶核酸”和“下游核酸”以茎环构型共价连接时)，也产生了侵入性切割结构。与切割的5'皮瓣杂交的FRET盒的“靶核酸”序列可以称为“5'皮瓣杂交序列”。
如本文所使用的，“INVADER试验”或“侵入性切割试验”是指用于检测靶核酸序列的试验，其中在靶序列存在的情况下形成并切割侵入性切割结构。在一些实施例中，用于侵入性切割试验的试剂包含：切割剂；和低聚核苷酸(例如，“侵入性探针”、“初级探针”和“FRET盒”)。在一些实施例中，侵入性探针是扩增低聚物或其延伸产物。侵入性切割试验可以在单一反应混合物中串联结合两种侵入性信号扩增反应(即，“初级反应”和“二级反应”)。在一些实施例中，使用切割剂来实现检测侵入性切割结构的存在。初级探针可以是探针系统的一部分。在一些实施例中，初级探针的附加部分包含3'端核苷酸或由其组成，所述核苷酸与靶核酸不互补和/或是不可延伸的。在一些实施例中，初级探针的附加部分被配置成与FRET盒相互作用，例如包括FRET盒相互作用序列，例如其与靶核酸不互补。在一些实施例中，用于INVADER试验的试剂进一步包括核酸酶，例如切割酶，例如FEN酶(例如，Afu、Ave、RAD2或XPG蛋白)或其它酶(例如，具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶，任选地具有失活或降低的合成活性)，其中核酸酶具有当侵入性探针和初级探针均与靶序列杂交时形成的结构的特异性活性(例如，当初级探针和靶的双链体经历侵入性探针的3'端侵入时可以产生的结构，其中侵入性探针的至少3'端和/或中间部分被杂交，初级探针的5'端是游离的，并且初级探针的中间和/或3'端部分被杂交)。在一些实施例中，用于INVADER试验的试剂进一步包括缓冲溶液。在一些实施例中，缓冲溶液包括二价阳离子源(例如，Mn2+和/或Mg2+离子，如镁盐或锰盐，例如MgCl2、MnCl2、乙酸镁、乙酸锰等)。在一些实施例中，用于INVADER试验的试剂进一步包括至少一种第三低聚物，如至少一种扩增低聚物，所述至少一种扩增低聚物与第一低聚物一起被配置成产生扩增子(例如，通过PCR)。在此类实施例中，初级探针可以包括被配置成与扩增子特异性杂交的靶杂交序列。在一些实施例中，用于INVADER试验的试剂进一步包括扩增试剂，如PCR试剂。其中靶序列被扩增的INVADER试验的实施例可以被称为INVADER PLUS试验。在试验中包含扩增可以提供检测的下限。在以下讨论了INVADER试验、切割酶、其它核酸酶、其它可能的INVADER/INVADER
试剂等，例如，美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,913,881、6,090,543、7,482,127和9,096,893；WO 97/27214；WO 98/42873；Lyamichev等人,《自然生物技术(Nat.Biotech.)》,17:292(1999)；Hall等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,美国,97:8272(2000))；和WO 2016/179093。
如本文所使用的，术语“皮瓣核酸内切酶”或“FEN”(例如，“FEN酶”)是指在DNA结构上充当结构特异性核酸内切酶的一类核酸酶，其中双链体在被核酸的另一条链置换的链中的一条链上含有单链5'突出端或皮瓣，使得在单链与双链DNA之间的连接处存在重叠的核苷酸)。FEN酶催化邻近单链DNA和双链DNA的连接的磷酸二酯键3'的水解切割，从而释放突出端或“皮瓣”(参见《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》23:331-336(1998)和《生物化学年鉴(Anna.Rev.Biochem.)》73:589-615(2004))。FEN酶可以是单个酶、多亚基酶，或可以作为另一种酶或蛋白复合物(如DNA聚合酶)的活性而存在。皮瓣核酸内切酶可以是耐热的。可用于本文所公开的方法的FEN酶的实例描述于美国专利号5,614,402；5,795,763；6,090,606；并且描述于由WO 98/23774；WO 02/070755；WO 01/90337；WO 03/073067所鉴定的已公开的PCT申请中，所述专利中的每个专利通过引用以其整体并入本文。可商购的FEN酶的特定实例包含
酶(美国豪洛捷有限公司(Hologic,Inc.))。
当关于INVADER试验和/或侵入性切割试验或反应使用时，如本文所使用的，“盒”是指被配置成响应于INVADER试验中检测低聚物的切割而产生可检测信号的低聚物或低聚物的组合。在一些实施例中，盒与来自检测低聚物(例如，初级探针)的切割的切割产物(例如，“皮瓣”)杂交。在一些实施例中，这种杂交导致荧光的可检测变化。在一些实施例中，这种杂交形成了第二侵入性切割结构，使得随后盒可以被切割。在一些实施例中，盒包括相互作用的一对标记，例如FRET对(在这种情况下，盒是“FRET盒”)。在一些实施例中，在与检测低聚物的切割的切割产物杂交时，FRET盒经历荧光特性的可检测变化。例如，基于与检测低聚物的切割的切割产物杂交时标记之间的平均距离的变化，FRET盒可以增加第一波长的荧光发射和/或减少第二波长的荧光发射。这可能是由于来自供体荧光团的能量转移的减少(例如，荧光团淬灭的减少或从供体荧光团到受体荧光团的能量转移的减少)所导致的。在一些实施例中，FRET盒采用发夹构型，其中所述一对标记的相互作用基本上抑制(例如，淬灭)可检测的能量发射(例如，荧光发射)。在一些实施例中，FRET盒包括包括与初级探针的互补切割5'皮瓣杂交以形成侵入性切割结构的部分，所述侵入性切割结构是切割试剂(例如，FEN酶)的底物。在一些实施例中，通过切割试剂对FRET盒的切割分离了供体和受体部分，其中结果减轻了抑制并允许产生信号。
本文所使用的“金黄色葡萄球菌特异性序列”是指不同于MREJ、orfX、mecA或mecC序列的序列，所述序列可用于将金黄色葡萄球菌与包含CNS的其它葡萄球菌区分开来。金黄色葡萄球菌特异性序列的非限制性实例包含但不限于金黄色葡萄球菌的nuc、rRNA、femB、Sa442、葡萄球菌黄素和GAPDH(例如，SEQ ID NO:15)基因等中的序列，所述金黄色葡萄球菌通常含有其它葡萄球菌属中可区分的不同序列。金黄色葡萄球菌特异性序列检测的讨论可以在以下找到，例如，Schuenck等人,《微生物学研究(Res.Microbiol.)》,(2006),出版中；Shittu等人,(2006),《诊断微生物学与传染病(Diagn Microbiol Infect Dis.)》7月17日；Grisold等人,(2006),《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》345:79-89；Costa et al等人,(2005),《诊断微生物学与传染病(Diagn Microbiol Infect.Dis.)》51:13-17；McDonald等人,(2005),《临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)》43:6147-6149；Zhang等人,(2005),《临床微生物学杂志》43:5026-5033；Hagen等人,(2005),《医学微生物学杂志(JMed Microbiol)》295:77-86；Maes等人,(2002),《临床微生物学杂志》40:1514-1517；Saito等人,(1995),《临床微生物学杂志》33:2498-2500；Ubukata等人,(1992)《临床微生物学杂志》30:1728-1733；Murakami等人,(1991)《临床微生物学杂志》29:2240-2244；Hiramatsu等人,(1992),《微生物学与免疫学(Microbiol.Immunol.)》36:445-453)。
“金黄色葡萄球菌特异性扩增子”是从金黄色葡萄球菌特异性序列产生的扩增子。通常，金黄色葡萄球菌特异性扩增子的产生表明金黄色葡萄球菌核酸的存在。
如本文所使用的，“试剂盒”是经过包装的试剂的组合，包含具有本文所公开的序列或结合特异性的低聚核苷酸。例如，试剂盒可以包含经过包装的一个或多个小瓶、试管或暗盒的组合，所述小瓶、试管或暗盒具有含有用于扩增和检测MRSA细菌的核酸的试剂的多个腔室。试剂可以包含低聚核苷酸引物和探针，如本文所描述的那些，以及核苷酸聚合酶(例如，DNA聚合酶、逆转录酶、RNA聚合酶等)。任选地，试剂盒中还可以包含皮瓣核酸内切酶(FEN)酶。在某些优选实施例中，试剂可以是液态形式、固态形式(例如，冻干物)或半固态形式(例如，玻璃)。在一些实施例中，低聚核苷酸试剂和酶试剂作为单一经冻干的组合物(例如，小球)的组分存在于试剂盒中。在这种情况下，引物、探针和一种或多种酶(例如，DNA聚合酶和/或FEN酶)可以以经冻干的形式置于同一反应室或容器中，所述经冻干的形式可以用含水试剂进行重构，其中含有含水试剂的单独小瓶或试管被包含在同一试剂盒中。试剂盒可以进一步包含许多任选的组分，例如捕获探针(例如，如US 2013/0209992中所描述的poly-(k)捕获探针)。试剂盒中可能存在的其它试剂包含适于进行体外扩增的试剂，如缓冲液、盐溶液和/或合适的核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP；和/或ATP、CTP、GTP和UTP)。试剂盒进一步可以包含用于在样品制备过程中直接或间接固定捕获探针的固相载体材料(例如，可磁性吸引的颗粒，例如，磁珠)。在某些实施例中，试剂盒进一步包含用于实践根据本公开的方法的一组说明，其中所述说明可以与试剂盒或其组分的包装插入物和/或包装相关。
除非另外定义，在此使用的所有科学和技术术语具有如相关领域的那些技术人员通常理解的相同含义。一般定义可以在与分子生物学相关的技术书籍中找到，例如，《微生物学与分子生物学词典第二版(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,2nd ed.)》(Singleton等人,1994,约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons),纽约市,纽约州)或《哈珀·柯林斯生物学词典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)》(Hale&Marham,1991,哈珀·柯林斯出版社(Harper Perennia),纽约市,纽约州)。
示例性组合物、试剂盒、方法和用途
本发明提供了用于从样品中扩增和检测MRSA核酸的低聚物、组合物和试剂盒。
在一些实施例中，提供了低聚物，例如在试剂盒或组合物中。低聚物通常包括靶杂交区，例如，被配置成与MRSA核酸特异性杂交。虽然不同长度和碱基组成的低聚物可用于扩增MRSA核酸，但在一些实施例中，本公开中的低聚物的靶杂交区的长度为约10到60个碱基、约12到50个碱基、约12到40个碱基、约12到35个碱基或约12到30个碱基。在一些实施例中，除了靶杂交区之外，低聚物还包括第二序列区，其可以位于靶杂交区的5'。在一些实施例中，低聚物不包括第二序列区。在一些实施例中，第二序列区是启动子。在一些实施例中，第二序列区被配置成与FRET盒相互作用。
在一些实施例中，提供了一对低聚物，其中一个低聚物被配置成与MRSA核酸的有义链杂交，并且另一个低聚物被配置成与MRSA核酸的反义链杂交。这种低聚物包含用于PCR或其它形式扩增的引物对。
在一些实施例中，一种或多种低聚物，如引物组(定义为至少两种被配置为从靶序列产生扩增子的引物)或引物组和任选地不可延伸和/或标记的附加低聚物(例如，检测低聚物)(例如，用作初级探针或探针系统的一部分，如与FRET盒一起)，被配置成与MREJ杂交。在一些实施例中，所述引物组包括至少一个被配置成与orfX特异性杂交的正向引物和至少一个被配置成与SCCmec序列特异性杂交并产生具有至少一个正向引物的扩增子的反向引物。当存在时，附加低聚物(例如，检测低聚物)可以被配置成与引物组产生的扩增子特异性杂交。
在一些实施例中，提供了多种低聚物，如多种引物组或多种引物组和任选地不可延伸和/或标记的附加低聚物(例如，检测低聚物)(例如，用作初级探针，任选地作为探针系统的一部分，例如与FRET盒一起)，所述低聚物共同与MREJ和以下中至少一种杂交：mecA和mecC；MREJ、mecA和mecC；MREJ和金黄色葡萄球菌特异性序列；MREJ、mecA和mecC的至少一个和金黄色葡萄球菌特异性序列；或MREJ、mecA、mecC和金黄色葡萄球菌特异性序列。在一些实施例中，金黄色葡萄球菌特异性序列是金黄色葡萄球菌的nuc、rRNA、femB、Sa442、葡萄球菌黄素或GAPDH基因中的序列。在一些实施例中，金黄色葡萄球菌特异性序列是金黄色葡萄球菌的GAPDH基因中的序列。在一些实施例中，提供了多种低聚物，如多种引物组或多种引物组和任选地不可延伸和/或标记的附加低聚物(例如，检测低聚物)(例如，用作初级探针，任选地作为探针系统的一部分，例如与FRET盒一起)，所述低聚物共同与MREJ和指示金黄色葡萄球菌的序列；MREJ、mecA和mecC的至少一个和指示金黄色葡萄球菌的序列；或MREJ、mecA、mecC和指示金黄色葡萄球菌的序列(有时称为金黄色葡萄球菌指示性序列)。在一些实施例中，指示金黄色葡萄球菌的序列是金黄色葡萄球菌的nuc、rRNA、femB、Sa442、葡萄球菌黄素或GAPDH基因中的序列。在一些实施例中，指示金黄色葡萄球菌的序列是金黄色葡萄球菌的GAPDH基因中的序列。在一些实施例中，指示金黄色葡萄球菌的序列的扩增或检测将金黄色葡萄球菌的存在与许多其它葡萄球菌区分开来，例如，阿尔莱葡萄球菌(Staphylococcus arlettae)；耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)；头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)；山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)；产色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)；科氏葡萄球菌亚种解脲支原体(Staphylococcus cohnii subsp.Urealyticum)；海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)；表皮葡萄球菌(MRSE)(Staphylococcus epidermidis)；马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)；猫属葡萄球菌(Staphylococcus felis)；鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)；溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)；人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)；中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)；克氏葡萄球菌(Staphylococcus kloosii)；缓慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)；巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)；普化葡萄球菌(Staphylococcus pulvereri)；腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)；松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)；模仿葡萄球菌(taphylococcus simulans)；沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)；和/或木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。在一些实施例中，指示金黄色葡萄球菌的序列的扩增或检测将金黄色葡萄球菌的存在与CNS区分开来。任选地，指示金黄色葡萄球菌的序列的扩增或检测可以对金黄色葡萄球菌具有高度特异性，从而检测不到来自其它已知生物体的核酸。
在一些实施例中，提供了一种或多种(例如，至少两种)mecA/mecC扩增低聚物。当存在mecA序列时，mecA/mecC扩增低聚物可以参与mecA的扩增反应，并且当存在mecC序列时，可以参与mecC的扩增反应。mecA/mecC扩增低聚物被认为是mecA扩增低聚物和mecC扩增低聚物两者。
在下面的序列表中提供了示例性MREJ序列。提供了附加的示例性MREJ序列，例如，在美国专利申请公开号2008/0227087和2013/0266942中。美国专利申请公开号2008/0227087和2013/0266942中所公开的MREJ序列、引物和探针出于所有目的通过引用结合在此。
在一些实施例中，根据本公开的试剂盒或组合物进一步包括用于扩增MREJ i到xxi序列中至少一个的至少一个引物或引物对，例如美国专利申请公开号2008/0227087或2013/0266942中所描述的引物或引物对。在一些实施例中，根据本公开的试剂盒或组合物进一步包括用于扩增MREJ x、xi、xvi、xvii、xviii、xix或xx序列中至少一个的至少一个引物或引物对，例如美国专利申请公开号2008/0227087或2013/0266942中所描述的引物或引物对。
在一些实施例中，一组中的一种或多种低聚物、试剂盒、组合物或反应混合物包括甲基化胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。在一些实施例中，低聚物中至少约一半胞嘧啶被甲基化。在一些实施例中，低聚物中的所有或基本上所有(例如，除一个或两个以外的所有)胞嘧啶被甲基化，例如，对在3'端处或在3'端的2、3、4或5个碱基内的一个或多个胞嘧啶进行未甲基化。
下表阐述了示例性的低聚物组(引物对和检测低聚物，例如被标记或用作初级检测低聚物)和探针系统(初级和次级检测低聚物)。应当理解，表A中的检测低聚物，当用作初级检测低聚物时(例如，与结构特异性核酸酶一起，如在侵入性切割试验中，例如INVADER或INVADER PLUS试验中)，可以与表B中与初级检测低聚物相关的任何二级检测低聚物结合。
表A.示例性低聚物组.低聚物通过其SEQ ID No(见下面的序列表)来表示。通过表A中用于靶向orfX/SCCmec连接的示例性低聚物靶向的一种或多种MREJ类型在括号中表示。通过与用于靶向mecA和mecC的低聚物相关的示例性检测低聚物靶向的mec基因在括号中表示。
*：用作侵入性低聚物以与指定的检测低聚物一起形成结构特异性核酸酶的底物
表B.示例性探针系统.低聚物通过其SEQ ID No(见下面的序列表)来表示。
在一些实施例中，提供了多个orfX/SCCmec连接(MREJ)扩增低聚物，其包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个低聚物，所述低聚物在严格条件下与表A中至少一种MREJ类型的低聚物竞争与MREJ序列的杂交。
在一些实施例中，在用于从mecA序列中扩增扩增子的试剂盒、组合物或方法中提供了包括SEQ ID NO:36或37的序列的第一扩增低聚物和包括SEQ ID NO:31、35或38的序列的第二扩增低聚物。
在一些实施例中，提供了包括标记和/或不可延伸的低聚物。这种低聚物可用作探针或作为探针系统的一部分(例如，作为与靶结合检测低聚物结合的FRET盒)。在一些实施例中，标记的低聚物具有对应于表A的检测低聚物栏中所列出的SEQ ID No的序列。在一些实施例中，标记是非核苷酸标记。合适的标记包含发射可检测光信号的化合物，例如可以在均质混合物中检测的荧光团或发光(例如，化学发光)化合物。特定探针上可以存在多于一个标记以及多于一种类型的标记，或可以依赖于使用探针的混合物来进行检测，在所述混合物中，每个探针均标记有产生可检测信号的化合物(例如，美国专利号6,180,340和6,350,579)。标记可以通过各种方式附着在探针上，包含共价键、螯合作用和离子相互作用。在一些实施例中，标记是共价附着。例如，在一些实施例中，检测探针具有附着的化学发光标记，如吖啶酯(AE)化合物(参见，例如，美国专利号5,185,439；5,639,604；5,585,481；和5,656,744)。标记(如荧光或化学发光标记)可以通过非核苷酸接头附着到探针上(参见，例如，美国专利号5,585,481；5,656,744；和5,639,604)。在一些实施例中，提供了低聚物，所述低聚物是不可延伸的并且与MRSA核酸中的位点杂交，所述位点与试剂盒或组合物中的附加低聚物如扩增低聚物的杂交位点重叠。这种低聚物的杂交可以形成结构特异性核酸酶的底物，例如，作为INVADER或INVADER PLUS试验中检测机制的一部分。
在一些实施例中，标记的低聚物(例如，包含荧光标记)进一步包括与第一标记相互作用的第二标记。例如，第二标记可以是淬灭剂。可以使用这样的探针(例如，在TaqManTM试验中)，其中探针与靶或扩增子的杂交，随后通过包括5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶进行核溶解，导致释放荧光标记，并且从而增加荧光，或荧光与第二标记的相互作用无关。还可以使用这种探针(例如，在INVADER或INVADER PLUS试验中(例如，作为FRET盒))。在一些实施例中，标记的低聚物具有表B的二级检测低聚物栏中所列出的SEQ ID NO。
在某些应用中，一种或多种表现出至少某种程度的自互补性的探针用于促进探针的检测：在无需在检测前首先去除未杂交探针的情况下，测试样品中的靶双链体。这种检测探针的具体实施例包含，例如，形成分子内杂交所保持的构型的探针，如通常称为发夹的构型。合适的发夹探针包含“分子火炬”(参见，例如，美国专利号6,849,412；6,835,542；6,534,274；和6,361,945)和“分子信标”(参见，例如，美国专利号5,118,801和美国专利号5,312,728)。分子火炬包含不同的自互补性区(称为“靶结合域”和“靶封闭域”)，所述自互补性区通过连接区(例如-(CH2CH2O)3-接头)连接并且在预定的杂交试验条件下彼此杂交。当暴露于合适的靶或变性条件下时，分子火炬的两个互补区(可以完全或部分互补)熔化，当预定的杂交试验条件恢复时，留下可用于与靶序列杂交的靶结合域。分子火炬被设计成使得靶结合域比靶封闭域更有利于与靶序列杂交。分子火炬的靶结合域和靶封闭域包含相互作用的标记(例如，荧光/淬灭剂)，其定位使得当分子火炬自杂交时产生不同的信号，这与当分子火炬与靶核酸杂交时截然相反，从而允许检测探针：在具有与其相关的活性标记的未杂交探针存在的情况下，测试样品中的靶双链体。
可用于与本公开结合的的相互作用供体/受体标记对的实例包含荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/DABCYL、香豆素/DABCYL、荧光素/荧光素、
荧光素/DABCYL、荧光黄/DABCYL、
/DABCYL、伊红/DABCYL、赤藓红/DABCYL、四甲基罗丹明/DABCYL、德克萨斯红/DABCYL、
和荧光素/
染料。本领域普通技术人员将理解，当供体和受体染料不同时，能量转移可以通过受体的敏化荧光的出现或供体荧光的淬灭进行检测。非荧光受体如DABCYL和QSY7染料有利地消除了由直接(即，非敏化的)受体激发引起的背景荧光的潜在问题。可用作供体-受体对的一个成员的示例性荧光团部分包含荧光素、HEX、ROX和CY染料(如CY5)。可用作供体-受体对的另一个成员的示例性淬灭剂部分包含可从Berry和Associates(德克斯特，密歇根州)获得的DABCYL黑莓淬灭剂，以及可从Biosearch Technologies公司(诺瓦托，加利福尼亚州)获得的黑洞淬灭剂部分。本领域普通技术人员将能够使用供体和受体标记的适当配对以用于各种检测格式(例如，FRET、TaqManTM、INVADER等)。
在一些实施例中，检测低聚物(例如，探针、初级探针或标记的探针)是不可延伸的。例如，可以通过3'-加合物(例如，3'-磷酸化或3'-链烷二醇)使标记的低聚物不可延伸，所述加合物具有3'-端3'-脱氧核苷酸(例如，端2',3'-双脱氧核苷酸)、具有3'-端反向核苷酸(例如，其中最后一个核苷酸被反向，使得其通过3'到3'磷酸二酯键或其类似物如硫代磷酸酯，与倒数第二个核苷酸连接)或具有附着的荧光团、淬灭剂或其它干扰延伸的标记(可能但不一定通过端核苷酸的3'位置附着)。在一些实施例中，3'-端核苷酸未被甲基化。在一些实施例中，检测低聚物包括3'-端加合物，如3'-链烷二醇(例如，己二醇)。
在一些实施例中，如检测低聚物的低聚物被配置成与MRSA扩增子特异性杂交(例如，低聚物包括与用于特异性杂交的扩增子充分互补的靶杂交序列或由其组成)。靶杂交序列可以包含低聚物中存在的任何SEQ ID No或其变体序列之外的额外核苷酸。包括多于一个SEQ ID NO的序列的低聚物可以以重叠的方式包括那些序列，某种程度上SEQ ID NO含有共同的片段；例如，SEQ ID NO:85和97相对于SEQ ID NO:85的最后6个核苷酸和SEQ ID NO:97的前6个核苷酸重叠。
本公开还提供了用于确定样品中是否存在MRSA靶核酸的反应混合物。根据本公开的反应混合物包括以下中的至少一种或多种：低聚物组合，如本文所描述的用于扩增MRSA靶核酸的低聚物组合；并且检测探针低聚物，如本文所描述的用于确定MRSA扩增产物存在与否的检测探针低聚物。反应混合物可以进一步包含许多任选的组分，例如捕获探针(例如，如US 2013/0209992中所描述的poly-(k)捕获探针，所述美国专利申请通过引用并入本文)。对于扩增反应混合物，所述反应混合物通常包含适于进行体外扩增的其它试剂，如缓冲液、盐溶液、合适的核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP中的一个或两个；和/或ATP、CTP、GTP和UTP)和/或酶(例如，耐热DNA聚合酶，和/或逆转录酶和/或RNA聚合酶和/或FEN酶)，并且通常包含测试样品组分，其中MRSA靶核酸可以存在或不存在。反应混合物可以包含用于MRSA基因组的至少一个靶区的扩增低聚物，如，所述反应混合物可以包含用于多个MRSA靶区的扩增低聚物，如orfX/SCCmec连接(例如，包含如上所述的多种类型)、mecA和/或mecC，以及金黄色葡萄球菌特异性序列例如GAPDH。反应混合物可以包含用于MRSA基因组的至少一个靶区的扩增低聚物，如，所述反应混合物可以包含用于多个MRSA靶区的扩增低聚物，如orfX/SCCmec连接(例如，包含如上所述的多种类型)、mecA和/或mecC，以及指示金黄色葡萄球菌核酸序列存在的序列，如GAPDH。此外，对于包含检测探针和扩增低聚物组合的反应混合物，所述反应混合物的扩增低聚物和检测探针低聚物的选择由共同的靶区连接(即，反应混合物将包含结合到可由反应混合物的扩增低聚物组合扩增的序列上的探针)。
本公开还提供了用于实践本文所描述的方法的试剂盒。根据本公开的试剂盒包括以下中的至少一种或多种：扩增低聚物组合，如本文所描述的用于扩增MRSA靶核酸的扩增低聚物组合；并且至少一个检测探针低聚物，如本文所描述的用于确定MRSA扩增产物存在与否的至少一个检测探针低聚物。在一些实施例中，试剂盒中存在本文所描述的任何低聚物组合。试剂盒可以进一步包含许多任选的组分，例如捕获探针(例如，如US 2013/0209992中所描述的poly-(k)捕获探针)。
试剂盒中可能存在的其它试剂包含适于进行体外扩增的试剂，如缓冲液、盐溶液、合适的核苷酸三磷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP中的一个或两个；和/或ATP、CTP、GTP和UTP)和/或酶(例如，耐热DNA聚合酶，和/或逆转录酶和/或RNA聚合酶和/或FEN酶)，并且通常包含测试样品组分，其中MRSA靶核酸可以存在或不存在。试剂盒可以包含用于MRSA基因组的至少一个靶区的扩增低聚物或用于多个MRSA靶区的扩增低聚物，如orfX/SCCmec连接(例如，包含如上所述的多种类型)、mecA和/或mecC，以及金黄色葡萄球菌特异性序列或指示金黄色葡萄球菌的序列，如GAPDH。此外，对于包含检测探针和扩增低聚物组合的是试剂盒，反应混合物的扩增低聚物和检测探针低聚物的选择由共同的靶区连接(即，反应混合物将包含结合到可由反应混合物的扩增低聚物组合扩增的序列上的探针)。在某些实施例中，试剂盒进一步包含用于实践根据本公开的方法的一组说明，其中所述说明可以与试剂盒或其组分的包装插入物和/或包装相关。
本文所公开的任何方法也应理解为针对所述方法的目的，公开了所述方法中所涉及的材料的相应用途。包括MRSA序列的任何低聚物和包括这种低聚物的任何组合(例如，试剂盒和组合物，包含但不限于反应混合物)应理解为也公开了用于检测或量化MRSA，以及用于制备检测MRSA的组合物。
广义地说，方法可以包括以下组分中的一个或多个：靶捕获，其中MRSA核酸(例如，来自样品，如临床样品)退火到捕获低聚物(例如，特异性或非特异性捕获低聚物)；分离(例如，洗涤，以去除与捕获低聚物无关的物质)；扩增；和扩增子检测，例如可以通过扩增实时进行。某些实施例涉及前述步骤中的每一个。某些实施例涉及指数扩增，任选地具有前述的线性扩增步骤。某些实施例涉及指数扩增和扩增子检测。某些实施例涉及上面所列出的任何两种组分。某些实施例涉及上面邻近地所列出的任何两种组分(例如，洗涤和扩增，或扩增和检测)。
在一些实施例中，扩增包括(1)使样品与至少两种低聚物接触以用于扩增对应于MRSA靶核酸的MRSA靶核酸靶区，其中所述低聚物包含至少两种如上所述的扩增低聚物(例如，一种或多种取向于有义方向，并且一种或多种取向于反义方向，用于指数扩增)；(2)进行体外核酸扩增反应，其中样品中存在的任何MRSA靶核酸被用作产生扩增产物的模板；并且(3)检测扩增产物存在与否，从而确定样品中MRSA核酸序列存在与否。
根据本公开的检测方法可以进一步包含获得有待经受所述方法的后续步骤的样品的步骤。在某些实施例中，“获得”要使用的样品包含例如在执行所述方法的一个或多个步骤的测试设施或其它位置接收样本，和/或从执行所述方法的一个或多个步骤的设施内的位置(例如，从存储或其他存放处)取回样品。
在某些实施例中，所述方法包含在扩增(例如，捕获步骤)之前从样品中的其它组分(例如，非核酸组分)中纯化MRSA靶核酸。这种纯化可以包含从其它样品组分中分离和/或浓缩样品中含有的生物体，或去除或降解非核酸样品组分(例如，蛋白质、碳水化合物、盐、脂质等)的方法。在一些实施例中，样品中的RNA被降解(例如，用RNase和/或热)，并且任选地RNase被去除或失活和/或经降解的RNA被去除。
在特定的实施例中，纯化靶核酸包含捕获靶核酸以特异性或非特异性地将靶核酸与其它样品组分分离。非特异性靶捕获方法可以涉及从基本上含水的混合物中选择性沉淀核酸，将核酸粘附到被洗涤以去除其它非核酸样品成分的载体上，或从含有MRSA核酸和其它样品成分的混合物中物理分离核酸的其它方法。
靶捕获可以在含有一种或多种捕获探针低聚物的溶液相混合物中发生，所述捕获探针低聚物在杂交条件下与MRSA靶序列杂交。对于包括捕获探针尾部的实施例，MRSA靶：通过应用杂交条件来捕获捕获探针复合物，使得所述捕获探针尾部与经过固定的探针杂交。某些实施例使用颗粒固体载体，如顺磁性珠。
分离可以在捕获之后进行，其中固体载体上的复合物与其它样品组分分离。分离可以通过任何合适的技术来实现(例如，洗涤与MRSA靶序列相关的载体一次或多次(例如，2次或3次)，以去除其它样品组分和/或未结合的低聚物)。在使用颗粒固体载体如顺磁性珠的实施例中，与MRSA靶相关的颗粒可以悬浮在洗涤溶液中并且从洗涤溶液中回收，在一些实施例中通过使用磁引力。为了限制处理步骤的数量，可以通过简单地将载体上的复合物中的MRSA靶序列与扩增低聚物混合并且进行扩增步骤来扩增MRSA靶核酸。
以指数方式扩增MRSA靶序列利用体外扩增反应，所述体外扩增反应使用至少两种有待扩增的靶区的侧翼的扩增低聚物。在一些实施例中，提供了至少两种如上所述的扩增低聚物。在一些实施例中，提供了多对扩增低聚物，其中所述多对扩增低聚物包括被配置成与MRSA MREJ序列中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13种或更多种类型的MREJ序列杂交的低聚物对。在一些实施例中，MRSA MREJ序列的这些类型包含MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个。扩增反应可以是循环的或等温的。合适的扩增方法包含例如复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)以及转录介导的扩增(TMA)。
可以使用多种已知技术中的任何一种来执行检测步骤，以检测与扩增的靶序列特异性相关的信号，如通过将扩增产物与标记的检测探针杂交并检测由标记的探针产生的信号(在一些实施例中包含来自杂交后从探针中所释放的标记)。在一些实施例中，标记的探针包括第二部分，如淬灭剂或与第一标记相互作用的其它部分，如上所述。检测步骤还可以提供关于扩增序列的附加信息，如其核酸序列的全部或部分。检测可以在扩增反应完成后进行，或可以与扩增靶区域同时进行(例如，实时)。在一个实施例中，检测步骤允许均相检测(例如，检测杂交的探针而没有从混合物中去除未杂交的探针(参见，例如美国专利号5,639,604和5,283,174号))。在一些实施例中，核酸与导致物理变化的表面相关，如可检测的电变化。扩增的核酸可以通过将其浓缩在基质中或基质上并检测核酸或与其相关的染料(例如，嵌入剂如溴化乙锭或荧光染料)或检测溶液相中与核酸相关的染料的增加来检测。其它检测方法可以使用核酸检测探针，所述检测探针被配置成与扩增产物中的序列特异性杂交并检测探针的存在：产物复合物，或通过使用探针复合物，所述探针可以扩增与扩增的产物相关的可检测信号(例如，美国专利号5,424,413；5,451,503；和5,849,481；所述美国专利中的每个专利通过引用并入本文)。与扩增的产物特异性缔合的直接或间接标记的探针提供了可检测的信号，所述信号指示样品中靶核酸的存在。具体地，扩增产物将在MRSA染色体的序列中含有靶序列或互补序列，并且探针将直接或间接结合到扩增产物中含有的序列上，以指示测试样品中MRSA核酸的存在。
在扩增步骤接近或结束时检测扩增产物的实施例中，线性检测探针可用于提供信号以指示探针与扩增产物的杂交。这种检测的一个实例是使用与靶核酸杂交的发光标记的探针。随后从未杂交的探针中水解发光标记。使用发光计通过化学发光进行检测(参见，例如，国际专利申请公开号WO 89/002476)。在使用实时检测的其它实施例中，检测探针可以是发夹探针，如分子信标、分子火炬或杂交开关探针，所述探针用报告部分标记，当探针结合扩增产物时检测到所述报告部分。这种探针可以包括靶杂交序列和非靶杂交序列。这种探针的各种形式描述于例如，美国专利号5,118,801；5,312,728；5,925,517；6,150,097；6,849,412；6,835,542；6,534,274；和6,361,945；以及美国专利申请公开号2006/0068417A1和2006/0194240A1。
在一些实施例中，通过侵入性切割试验来检测扩增产物，所述侵入性切割试验提供了用于形成需要靶核酸的存在的侵入性切割结构的方法。所述试验进一步涉及切割侵入性切割结构以释放独特的切割产物。例如，切割剂(如FEN酶)用于切割靶依赖性侵入性切割结构，从而产生指示样品中存在特定靶核酸序列的切割产物。当两种低聚核苷酸与靶核酸链杂交使得形成重叠侵入性切割结构时，如上面所定义的，侵入性切割可以发生。通过切割试剂(例如，FEN酶)和上游低聚核苷酸(即，侵入性探针)的相互作用，可以使切割试剂在内部位点处切割下游低聚核苷酸(即，初级探针)，从而产生独特的片段。所述片段(有时被称为“释放的皮瓣”或“切割的5'皮瓣”或简称为“皮瓣”)然后其自身可以与二级探针如FRET盒相互作用(例如，通过作为侵入性探针参与产生可检测信号(例如，荧光信号)的后续反应)。此类实施例描述于美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567和6,090,543，WO 97/27214、WO98/42873，《自然生物技术(Nat.Biotech.)》,17:292(1999),《美国国家科学院院刊(PNAS)》,97:8272(2000)，和WO 2016/179093中。更具体地，多种INVADER反应(例如，结合在单一反应混合物中)可用于本文所公开的多个应用，包含各种orfX-SCCmec连接、mecA、mecC、金黄色葡萄球菌特异性基因和/或内部对照的检测。
侵入性切割试验可用于检测未扩增的以及扩增的DNA(例如，一种或多种PCR产物)中的特定靶序列，包含基因组DNA、RNA或其扩增子。初级探针和侵入性探针与靶核酸一起杂交以形成重叠结构。在初级探针的5'端上包含未配对的“皮瓣”。切割剂(例如，FEN酶，如可从美国豪洛捷有限公司(Hologic,Inc.)获得的
酶)识别重叠并切割掉未配对的5'皮瓣。在一些实施例中，在二次反应中，所述切割产物用作FRET盒上的侵入性探针，以再次产生被结构特异性酶识别的结构。当单个FRET盒上的两个标记通过切割分离时，产生高于背景荧光的可检测荧光信号。因此，第二种侵入性切割结构的切割导致荧光的增加，指示靶序列的存在。
在一些实施例中，一种或多种内部扩增对照多核苷酸(“内部对照”；例如，质粒、质粒片段或其它多核苷酸，通常具有与MRSA序列无关的序列，例如与orfX、MREJ、mecA、mecC和金黄色葡萄球菌特异性或金黄色葡萄球菌指示性基因无关)，以及用于扩增和检测内部对照的低聚物被提供作为本文所公开的组合物或试剂盒的组分和/或用于本文公开的方法。当没有检测到靶序列时，从内部对照中检测扩增子可以用于避免由于仪器或试剂故障而导致的假阴性。
下表说明了从根据本公开的方法中获得的各种可能结果的解析。在一些实施例中，根据该表来解析结果。U表示扩增子的检测是预期的，但对调用来说是不必要的。
表C.解析结果
缩写如上面所定义的。
实例
提供以下实例以说明某些公开的实施例，并且以下实例不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
通用试剂和方法.除非另有说明，否则非特异性靶捕获用于分离靶核酸。示例性非特异性靶捕获试剂和程序公开于Becker等人,US2013/0209992A1中。通常使用PantherFusionTM仪器执行靶捕获程序。
除非另有说明，否则扩增是在Panther FusionTM仪器或ABI 7500FastTM仪器上执行的。除非另有说明，否则扩增是用以上所公开的设计用于检测多个orfX/SCCmec连接序列(即，MREJ i、ii、iii、iv、v、vi、vii、ix、xii、xiii、xiv、xv和xxi中的一些或全部)的低聚物的组合来执行的。这些序列是用orfX扩增低聚物来检测，所述低聚物被配置成在如上所述的INVADER PLUS试验中与包括SEQ ID NO:16的位置192的位点和初级检测低聚物以及多个反向扩增低聚物特异性杂交。一些反向扩增低聚物扩增多于一种MREJ类型(例如，MREJ i和MREJ ii；MREJ ii、viii、ix和xiv；或MREJ xiii、ix和xiv)使得反向引物的数量可以少于可以检测的MREJ类型的数量。用于检测各种类型的orfX/SCCmec(MREJ)连接的扩增低聚物可以进一步与用于扩增和检测mecA和mecC中的一个或两个的扩增低聚物复合；金黄色葡萄球菌特异性或金黄色葡萄球菌指示性基因，如GAPDH；以及内部对照。反应中通常还包含内部对照质粒。
在这些实施例中所使用的切割酶是描述于美国专利第9,096,893号中的Afu FEN-1核酸内切酶。
扩增试剂各自是0.2到0.8mM的dNTPs、可商购获得的热启动Taq聚合酶、MgCl2、切割酶、MOPS和Tris缓冲液、非乙酰化BSA以及
Master Mix提供的其它组分。除非另有说明，否则引物的最终浓度为0.2到0.75μM。在各种反应中，PCR退火温度在63℃到67℃之间变化，而不影响阳性率。
如上所述，扩增子的检测使用了INVADER PLUS化学。引物用作侵入性探针。所述反应包含orfX/SCCmec初级探针、mecA和/或mecC初级探针、GAPDH初级探针和内部对照初级探针，其中orfX/SCCmec初级探针对orfX/SCCmeC扩增子的orfX部分具有特异性的靶杂交序列并且，在适用的情况下。对于每个初级探针，均存在相应的FRET盒，所述FRET盒以能量转移关系来标记相互作用的标记对，当标记对的两个成员都附着到FRET盒上时，荧光发射被淬灭(参见实施例1中关于使用一个FRET盒的讨论，所述FRET盒被配置成与来自mecA或mecC初级探针的释放的皮瓣相互作用)。因此，给定靶的阳性信号通常被解释为指示靶序列存在并被相应的引物组扩增；包括引物、扩增子和相应初级探针的侵入性切割结构已经形成并被切割酶切割；由此从初级探针中释放的皮瓣与相应的FRET盒形成侵入性切割结构，然后被切割酶切割，从而允许荧光检测FRET盒的标记切割产物。
所有在实施例部分提到的SEQ ID NO包含胞嘧啶甲基化标记和在下面序列表中指示的其它特征。
实例1.分析配置和MREJ类型xv低聚物兼容性
对低聚物组合检测MRSA菌株的能力进行测试，包含在orfX/SCCmec连接处含有MREJ xv序列的MRSA。含有MREJ xv序列的MRSA菌株包含孟加拉湾克隆(Bengal BayClone)。
低聚物的组合靶向MRSA基因组的三个区域(orfX/SCCmec连接区、mecA/C区和GAPDH区)。也使用基于质粒的内部对照，其通常由青色素5.5亚磷酰胺(Cy5.5)标记的FRET低聚物进行检测。
mec扩增和检测低聚物被设计用于检测可能存在于SCCmec中的两个传递甲氧西林耐药性的基因(即，mecA和mecC)。在一些试验的配置中，两个靶都被相同的低聚物对扩增，但被mecA-或mecC特异性初级检测低聚物检测，每个所述低聚物与相同的FRET盒相互作用，因此如果存在mecA靶或mecC靶，则会在给定的通道(例如，FAM或HEX)中产生信号。GAPDH被靶向用于检测，因为其含有高度保守的序列，所述序列存在于金黄色葡萄球菌中并指示或特异于金黄色葡萄球菌。
在非特异性靶捕获后，经冻干的扩增和检测试剂被重建并与分离的核酸结合。随后使所述合并的反应混合物经受热循环，以扩增和检测靶核酸序列。对每个试验的结果进行分析，评估调用和分析物Ct值(当可用时)。
表D列出了所使用的示例性荧光团和淬灭剂对。Cal Fluor Red 610-BHQ-2标记的FRET盒含有5'内部和3'修饰。5'修饰是荧光团，所述荧光团在可见光谱内的特定波长处发出荧光，内部修饰是非荧光淬灭剂，所述淬灭剂通过荧光共振能量转移(FRET)淬灭荧光团所发射的荧光，并且3'修饰是在PCR扩增过程中防止低聚核苷酸的延伸的己二醇。在靶序列存在的情况下，FRET盒与由INVADER反应所产生的初级探针切割皮瓣相互作用，从而导致来自5'标记的荧光增加，因为荧光团从FRET盒被切割，因此消除了完整的双标记FRET盒中存在的淬灭效应。对于INVADER PLUS反应的更多讨论，参见上面的一般方法章节。对于多重检测，其它FRET盒与标记一起使用，所述标记在侵入性切割后在可见光谱的不同波长处发出荧光。示例性标记如上面所讨论的。
测试了被配置成与多个MREJ xv序列(包括SEQ ID NO:17的位置491和SEQ ID NO:18的位置555)中的位点杂交的MREJ xv扩增低聚物(SEQ ID NO:83和84)的内含物对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、非MREJ-xv MRSA(即，含有MREJ ii序列)或含有MREJ xv序列的MRSA的样品的扩增和检测的任何潜在影响(图1A-1B)。在ABI 7500FastTM上进行扩增。阴性样品指示不含有葡萄球菌DNA的样品。用0、0.25、0.75或7.50μM浓度的MREJ xv引物与每个样品进行反应。
图1A是用Agilent Tape Station产生的假凝胶图像，并且显示了MREJ ii、MREJxv、GAPDH和mecA如所预期的那样均在MREJ xv引物存在的情况下被扩增，即使在所述引物的最高浓度下也是如此。根据每个样品的Ct(orfX/SCCmec阈值周期[Ct])，还测量了orfX/SCCmec连接扩增子的扩增(图1B)。尽管MREJ ii、GAPDH(数据未示出)和mecA(数据未示出)的检测似乎不受反应中所包含的MREJ xv引物浓度的影响，但MREJ xv的信号随着MREJ xv引物浓度的增加而增加，如所预期的那样。
实例2.MREJ xv菌株检测的性能测试
对实施例1中的低聚物的组合进行测试以用于检测各种不同的含有MREJ xv序列的MRSA克隆，并与其它可商购获得的MRSA测试进行比较。对从丹麦(M2885和M4374)、法国(BL74)和澳大利亚(图2中所列出的所有其它克隆)实验室获得的临床分离株进行测序，以在用每个分子测试进行测试之前确认MREJ类型序列的存在。然后将MRSA临床分离株稀释在液体Amies传送培养基中，并制成多个等分试样。将每种临床分离株的匹配等分试样与CepheidTM 
SA鼻腔完整和Becton Dickinson Max Staph SRTM一起进行测试。在2017年5月12日或前后，对Cepheid Xpert MRSA和Becton Dickinson Max Staph SR的版本进行了对比试验。
使用根据本公开的低聚物的测试是用MRSA临床分离株在1,000菌落形成单位(CFU)/毫升下进行的，而Cepheid测试是在10,000CFU/mL或更高的浓度下进行的。
尽管所有列出的含有MREJ xv的分离株都是由根据本公开的低聚物检测的，包含实施例1中所描述的MREJ类型xv低聚物(由阳性orfX/SCCmec值表示)，但Cepheid测试对7/11所测试的分离株产生假阴性(对于SCC，由0.0的Ct值或大于38的Ct值表示)(图2)。在不含MREJ类型xv低聚物的情况下，根据本公开的的低聚物的调配剂也没有在这些临床分离株中的任何一个中检测到orfX/SCCmec(数据未示出)，从而确认了所述低聚物对于检测含有MREJ类型xv序列的MRSA的有效性。
在Cepheid试验中，SCC的值为零(0.0)或值为38或更大表明基于SCC序列的明显缺失，该试验结果将可能被解析为MRSA呈阴性。这些分离株的所有Cepheid结果对于mec和SPA(对金黄色葡萄球菌的蛋白质A进行编码的基因)呈阳性。对于SCC值为零或值大于38的分离株，这些结果将导致假阴性结果，所述结果表明不含有SCC连接序列(即MSSA)的金黄色葡萄球菌的存在，而不是MRSA菌株的正确结果。
在制造商的条件下运行的BD MaxTMStaph SR试验也遗漏了在10,000CFU/mL下测试的4/4菌株(数据未示出)。这些数据表明，BD MaxTMStaph SR试验不被设计成检测MREJ xv。
因此，与所测试的Cepheid和BD试验相比，根据本公开的包含MREJ xv引物的低聚物似乎对检测含有MREJ xv序列的菌株更敏感。
实例3.检测分析的限制
在质粒靶上对9个orfX/SCCmec连接系统的功能进行测试，以评估性能。各种系统的分析灵敏度测试表明LoD介于88与223.6拷贝/毫升之间。所测试的每个质粒的结果如表E中所示。
表E：质粒LoD测试结果
对一组含有MREJ类型ii、xii、xv和xxi的MRSA分离株进行测试，以评估LoD(图3)。测试试验组包含GP1822(MREJ ii，SCCmec II)、GP1826(MREJ xii，SCCmec V)、GP1827(MREJxxi，SCCmec XI)和CI5708(MREJ xv，SCCmec V)。还包含了仅含有内部对照质粒的阴性对照(数据未示出)。
该试验的测量结果是阳性率。这些结果表明，检测到临床分离株中的MRSA核酸稳健地降低到约500CFU/mL或更低。
实例4.混合感染测试
在与过量的耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)混合感染的模型中对MRSA进行测试。在所测试的特定模型中，MRSA(GP1822)以103CFU/mL的浓度存在，或单独存在(MRSA对照)；其中MRSE以106CFU/mL(MRSA_MRSE1e6)存在；或其中MRSE以107CFU/mL成(MRSA_MRSE 1e7)存在(图4)。结果显示在任何条件下检测都没有损失，在所测试的12/12样品中观察到阳性率。因此，在MRSE超过1,000倍和10,000倍的情况下，该试验能够检测出MRSA。
实例5.交叉反应性
如实施例1中所描述的，对MRSA试验的交叉反应性进行测试。
对一系列7个交叉反应性试验组进行测试，所述组共同包含头葡萄球菌、山羊葡萄球菌、表皮葡萄球菌(MSSE)、表皮葡萄球菌(MRSE)、海豚葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、鲁氏葡萄球菌、假中间葡萄球菌、腐生葡萄球菌、施氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌和巴氏葡萄球菌。MRSE存在于第2组和第6组。
仅在阳性对照中发现MRSA的阳性结果，而在其它交叉反应性组中未发现阳性结果(图5)。对于其它标记，第2试验组和第6试验组对于mecA/C呈阳性，这是由于MRSE的mec基因的存在所导致的。GAPDH是一种高度保守的序列，其存在于金黄色葡萄球菌中并且指示或特异性于金黄色葡萄球菌，并且交叉反应性试验组中的GAPDH阳性率的缺乏表明了该试验的特异性。所有反应对于内部对照(IC)均呈阳性。
因此，相对于本文所测试的其它葡萄球菌属，该试验对MRSA具有特异性。
实例6.mecA和mecC的检测
将被配置成与包括SEQ ID NO:13的位置1394和SEQ ID NO:14的位置1285的位点特异性杂交的mecA/mecC扩增低聚物和被配置成与包括SEQ ID NO:13的位置1312和SEQ IDNO:14的位置1203的位点特异性杂交的mecA/mecC扩增低聚物与对mecA和mecC具有特异性的初级检测低聚物和被配置成与通过INVADER PLUS化学产生的任一初级检测低聚物的切割皮瓣相互作用的二级检测低聚物体(FRET盒)一起使用。
用质粒靶来测定分析灵敏度。结果在表F中示出。
表F：mecA和mecC质粒LoD测试结果
mecA和mecC扩增低聚物和检测低聚物存在于实施例1到5中所描述的实验中，并且所述低聚物不会干扰orfX/SCCmec连接检测或不会导致任何非特异性信号的产生。
实例7.金黄色葡萄球菌GAPDH的检测
第一GAPDH扩增低聚物被配置成与包含SEQ ID NO:15的位置212的位点特异性杂交，并且第二GAPDH扩增低聚物被配置成与包含SEQ ID NO:15的位置312的位点特异性杂交，所述第一GAPDH扩增低聚物和所述第二GAPDH扩增低聚物与适当的初级和二级检测低聚物一起用于通过INVADER PLUS化学检测金黄色葡萄球菌GAPDH。用质粒靶来测定分析灵敏度。结果在表G中示出。
表G：GAPDH质粒LoD测试结果
GAPDH扩增低聚物存在于实施例1到6中所描述的实验中，并且不会干扰orfX/SCCmec连接或mecA/C检测或不会导致任何非特异性信号产生，并且不会导致实施例5中的任何SA假阳性(例如，在所列出的非金黄色葡萄球菌属中任一个中不会产生GAPDH信号)。
由于假引发事件(数据未示出)，因此在高水平orfX靶序列(例如，来自MSSA)存在的情况下，第二GAPDH扩增低聚物的早期设计导致假阳性orfX/SCCmec连接信号。对所述低聚物进行重新设计使其与包括SEQ ID NO:15的位置312(例如，SEQ ID NO:15的位置299-325)的位点杂交，消除了假引发问题。
序列表
1mec＝5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶；Hdiol＝己二醇；HEX＝Hexochloro-荧光素；FAM＝荧光素；Cy5.5＝青色素5.5；Cal610＝Cal Fluor Red 610；BBQdT＝黑莓淬灭剂650dT；BHQ-2dT＝黑洞淬灭剂2dT。
序列表
<110> 简·探针公司（Gen-Probe Incorporated）
<120> 用于检测金黄色葡萄球菌的组合物和方法
<130> 01159-0014-00PCT
<150> US 62/544,491
<151> 2017-08-11
<160> 126
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 709
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 1
tacattagaa atacaaggaa agatgctatc ttccgaagga ttggcccaag aattgaacca 60
acgcatgacc caagggcaaa gcgactttgt tttcgtcatt ggcggatcaa acggcctgca 120
caaggacgtc ttacaacgca gtaactacgc actatcattc agcaaaatga cattcccaca 180
tcaaatgatg cgggttgtgt taattgaaca agtgtacaga gcatttaaga ttatgcgagg 240
agaagcttat cataagtaat gaggttcatg atttttgaca tagttagcct ccgcagtctt 300
tcatttcaag taaataatag cgaaatattc tttatactga atacttatag tgaagcaaag 360
ttctagcttt gagaaaattc tttctgcaac taaatatagt aaattacggt aaaatataaa 420
taagtacata ttgaagaaaa tgagacataa tatattttat aataggaggg aatttcaaat 480
gatagacaac tttatgcagg tccttaaatt aattaaagag aaacgtacca ataatgtagt 540
taaaaaatct gattgggata aaggtgatct atataaaact ttagtccatg ataagttacc 600
caagcagtta aaagtgcata taaaagaaga taaatattca gttgtaggga aggttgctac 660
tgggaactat agtaaagttc cttggatttc aatatatgat gagaatata 709
<210> 2
<211> 980
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 2
taaatgtcag gaaaatatca aaaactgcaa aaaatattgg tataataaga gggaacagtg 60
tgaacaagtt aataacttgt ggataactgg aaagttgata acaatttgga ggaccaaacg 120
acatgaaaat caccatttta gctgtaggga aactaaaaga gaaatattgg aagcaagcca 180
tagcagaata tgaaaaacgt ttaggcccat acaccaagat agacatcata gaagttccag 240
acgaaaaagc accagaaaat atgagcgaca aagaaattga gcaagtaaaa gaaaaagaag 300
gccaacgaat actagccaaa attaaaccac aatccacagt cattacatta gaaatacaag 360
gaaagatgct atcttccgaa ggattggccc aagaattgaa ccaacgcatg acccaagggc 420
aaagcgactt tgtattcgtc attggcggat caaacggcct gcacaaggac gtcttacaac 480
gcagtaacta cgcactatca ttcagcaaaa tgacattccc acatcaaatg atgcgggttg 540
tgttaattga gcaagtgtat agagcattta agattatgcg tggagaagca tatcataaat 600
gatgcggttt tttcagccgc ttcataaagg gattttgaat gtatcagaac atatgaggtt 660
tatgtgaatt gctgttatgt ttttaagaag cttatcataa gtaatgaggt tcatgatttt 720
tgacatagtt agcctccgca gtctttcatt tcaagtaaat aatagcgaaa tattctttat 780
actgaatact tatagtgaag caaagttcta gctttgagaa aattctttct gcaactaaat 840
atagtaaatt acggtaaaat ataaataagt acatattgaa gaaaatgaga cataatatat 900
tttataatag gagggaattt caaatgatag acaactttat gcaggtcctt aaattaatta 960
aagagaaacg taccaataat 980
<210> 3
<211> 782
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 3
caatgcccac agagttatcc acaaatacac aggttataca ctaaaaattg ggcatgaatg 60
tcagaaaaat atcaaaaact gcaaagaata ttggtataat aagagggaac agtgtgaaca 120
agttaataac ttgtggataa ctggaaagtt gataacaatt tggaggacca aacgacatga 180
aaatcaccat tttagctgta gggaaactaa aagagaaata ttggaagcaa gccatagcag 240
aatatgaaaa acgtttaggc ccatacacca agatagacat catagaagtt ccagacgaaa 300
aagcaccaga aaatatgagc gacaaagaaa ttgagcaagt aaaagaaaaa gaaggccaac 360
gaatactagc caaaatcaaa ccacaatcaa cagtcattac attagaaata caaggaaaga 420
tgctatcttc cgaaggattg gcccaagaat tgaaccaacg catgacccaa gggcaaagcg 480
actttgtatt cgtcattggc ggatcaaacg gcctgcacaa ggacgtctta caacgcagta 540
actacgcact atcattcagc aaaatgacat tcccacatca aatgatgcgg gttgtgttaa 600
ttgaacaagt gtacagagca tttaagatta tgcgtggaga agcgtatcat aaataaaact 660
aaaaattagg ttgtgtataa tttaaaaatt taatgagatg tggaggaatt acatatatga 720
aatattggat tataccttgc aatatcatac gatgtttata gagtgtttaa taaaccattt 780
tt 782
<210> 4
<211> 2153
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 4
ctgtagggaa actaaaagag aaatactgga agcaagccat agcagaatat gaaaaacgtt 60
taggcccata caccaagata gacatcatag aagttccaga cgaaaaagca ccagaaaata 120
tgagcgacaa agaaatcgag caagtaaaag aaaaagaagg ccaacgaata ctagccaaaa 180
tcaaaccaca atccacagtc attacattag aaatacaagg aaagatgcta tcttccgaag 240
gattggccca agaattgaac caacgcatga cccaagggca aagcgacttt gtattcgtca 300
ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactac gcactatcat 360
tcagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgaa caagtgtaca 420
gagcatttaa gattatgcgt ggagaagcgt accacaaatg atgcggtttt ttatccagtt 480
ttttgtttaa tgaacaaggt aaattacgag ataatatttg aagaaaacaa taaagtagag 540
atggatttcc atatcctctt tagtagcggt ttttatctgt aaggtttatt aataattaaa 600
taaataggcg ggatagttat atatagctta ttaatgaaag aatatgatta ttaatttagt 660
attatatttt aatattaaaa agaagatatg aaataattat tcataccttc caccttacaa 720
taattagttt tcaatcgaat attaagatta ttagtagtct taaaagttaa gacttcctta 780
tattaatgac ctaatttatt atttgcctca tgaattatct ttttatttct ttgatatgtc 840
ccaaaccaca tcgtgatata cactacaata aatattatga tgaaactaat aatattctca 900
aagttcagat ggaaccaacc tgctagaata gcgagtggga agaataggat tatcatcaat 960
ataaagtgaa ctacagtctg ttttgttata ctccaatcgg tatctgtaaa tatcaaatta 1020
ccataagtaa acaaaattcc aatcaatgcc catagtgcta cacatattag cataataacc 1080
gcttcattaa agttttcata ataaatttta cccataaaag aatctggata tagtggtaca 1140
tatttatccc ttgaaaaaaa taagtgaagt aatgacagaa atcataagac cagtgaacgc 1200
acctttttga acagcgtgga ataatttttt catagtgaga tggaccattc catttgtttc 1260
taacttcaag tgatcaatgt aatttagatt gataatttct gattttgaaa tacgcacgaa 1320
tattgaaccg acaagctctt caatttggta aagtcgctga taaagtttta aagctttatt 1380
attcattgtt atcgcatacc tgtttatctt ctactatgaa ctgtgcaatt tgttctagat 1440
caattgggta aacatgatgg ttctgttgca aagtaaaaaa atatagctaa ccactaattt 1500
atcatgtcag tgttcgctta acttgctagc atgatgctaa tttcgtggca tggcgaaaat 1560
ccgtagatct gatgagacct gcggttcttt ttatatagag cgtaaataca ttcaatacct 1620
tttaaagtat tctttgctgt attgatactt tgataccttg tctttcttac tttaatatga 1680
cggtgatctt gctcaatgag gttattcaaa tatttcgatg tacaatgaca gtcaggttta 1740
agtttaaaag ctttaattac tttagccatt gctaccttcg ttgaaggtgc ctgatctgta 1800
attacctttt gaggtttacc aaattgttta atgagacgtt taataaacgc atatgctgaa 1860
tgattatctc gttgcttacg caaccaaata tctaatgtat gtccctctgc atcaatggca 1920
cgatataaat agctccattt tccttttatt ttgatgtacg tctcatcaat acgccatttg 1980
taataagctt ttttatgctt tttcttccaa atttgatata aaattggggc atattcttga 2040
acccaacggt agaccgttga atgatgaacg tttacaccac gtccccttaa tatttcagat 2100
atatcacgat aactcaatgc atatcttaga tagtagccaa cggctacagt gat 2153
<210> 5
<211> 1696
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 5
aaagagaaat attggaagca agccatagca gaatatgaaa aacgtttagg cccatacacc 60
aagatagaca tcatagaagt tccagacgaa aaagcaccag aaaatatgag tgacaaagaa 120
attgagcaag taaaagaaaa agaaggccaa cgaatactag ccaaaatcaa accacaatcc 180
acagtcatta cattagaaat acaaggaaag atgctatctt ccgaaggatt ggcccaagaa 240
ttgaaccaac gcatgaccca agggcaaagc gactttgttt tcgtcattgg cggatcaaac 300
ggcctgcaca aggacgtctt acaacgcagt aactacgcac tatcattcag caaaatgaca 360
ttcccacatc aaatgatgcg ggttgtgtta attgaacaag tgtacagagc atttaagatt 420
atgcgaggag aagcatatca taaatgatgc ggttatttca gccgtaattt tataatataa 480
agcagagttt attaaatttt aatgattact ttttattaag aattaattct agttgatata 540
ttataatgtg aaacacaaaa taataatttg taattgttag tttataggca tctgtatttg 600
gaattttttg tagactattt aaaaaatagt gtatataagt attgagttca tgtattaact 660
gtcttttttc atcgttcatc aagtataagg atgtagagat ttgttggata atttcttcgg 720
atgtttttaa aattatcatt aaattagatg gtatctgatc ttgagttttg tttttagtgt 780
atgtatattt taaaaaattt ttgattgttg ttatttgact ctcttttaat ttgacaccct 840
catcaataaa tgtgttaaat atatcttcat ttgtacttaa atcatcaaaa tttgccaaca 900
aatatttgaa cgtctctaaa tcattatgtt tgagttccgt tttgctattc cataattcca 960
aaccatttgg tagaaagccc aagctgtgat tttgatctcc ccatatagct gaatttaaat 1020
cagtgagttg attaattttt tcaacacaga aatgtaattt tggaatgagg aatcgaagtt 1080
gttcttctac ttgctgtact tttcttttgt tttcaataaa atttctacac catactgtta 1140
tcaaaccgcc aattattgtg cacaatcctc caatgattgt agataaaatt gacaatatat 1200
tacacacctt tcttagaggt ttattaacat ctatttttga atttaaaatt attactttgg 1260
tagcgttata acctatttaa cagattagag aaaaattgaa tgatcgattg aagaatttcc 1320
aaaataccgt cccatatgcg ttgaaggaga tttctatttt cttctgtatt caaatctttg 1380
gctttatcct ttgctttatt caataaatca tctgagtttt tttcaatatt ttttaataca 1440
tctttggcat tttgtttaaa tactttagga tcggaagtta gggcattaga gtttgccaca 1500
ttaatcatat tattattaat catttgaatt tgattatctg ataatatctc tgataaccta 1560
cgctcatcga ggactttatt aacagtgtct tcaacttgtt gttgtgtgat ttgtttatct 1620
tgattttgtt taatatctgc aagttgttct ttaatatctg ctatagaagc atttaaagct 1680
tcatctgaat acccat 1696
<210> 6
<211> 991
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 6
accattttag ctgtagggaa actaaaagag aaatactgga agcaagccat agcagaatat 60
gaaaaacgtt taggcccata caccaagata gacatcatag aagttccaga cgaaaaagca 120
ccagaaaata tgaactacaa agaaattgag caagtaaaag aaaaagaagg ccaacgaata 180
ctagccaaaa tcaaaccaca atcaacagtc attacattag aaatacaagg aaagatgcta 240
tcttccgaag gattggccca agaattgaac caacgcatga cccaagggca aagcgacttt 300
gtattcgtca ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactac 360
gcactatcat tcagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgaa 420
caagtgtaca gagcatttaa gattatgcga ggagaagcgt atcataagtg atggtaaaaa 480
atatgagtaa gtagatgaag agtgaaaatc agattaatta ataataatgt atcaaattta 540
aataaagggg tttttaagta tgaatttaag aggtcatgaa aatagactta aatttcatgc 600
gaaatatgat gtgacaccta tatcacattt aaaattatta gaaggtcaaa agaaagacgg 660
tgaaggcggc atactgacag atagctatta ctgtttttca tacagcttaa aaggtaattc 720
taaaaaagtt ttaggtacgt ttaattgtgg ttatcatatt gctgaagatt tactaaaatt 780
atcaaatcaa gataaattac ctttatttaa cccgtttaaa gtaattaatg aaggtaatca 840
attgcagggc gtaacgaata aaggtaattt aaatattaat aggcaaagaa aacagtataa 900
tgaagtggct ttacagcttt caaatgctat taatttaatc ataatttgtt atgaggataa 960
tattaaagaa ccactttcaa cgataaaata c 991
<210> 7
<211> 1108
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 7
accattttag ctgtagggaa actaaaagag aaatattgga agcaagccat agcagaatat 60
gaaaaacgtt taggcccata caccaagata gacatcatag aagttccaga cgaaaaagca 120
ccagaaaata tgagcgacaa agaaattgag caagtaaaag aaaaagaagg ccaacgaata 180
ctagccaaaa tcaaaccaca atccacagtc attacattag aaatacaagg aaagatgcta 240
tcttccgaag gattggccca agaattgaac caacgcatga cccaagggca aagcgacttt 300
gtattcgtca ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactat 360
gcactatcat ttagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgaa 420
caagtgtata gagcatttaa gattatgcgt ggagaagcgt accacaaata aaactaaaaa 480
atatgagaaa attattaaat tagctcaaat ctttgaagaa taaaaagtga atattaagtt 540
tgataattta ggtacaagta aagattaaga atttccatta tttaatacat ggtgtgtaaa 600
tcgacttctt tttgtattag atgtttgcag taagcgatgt aaagaagatg ctaataaata 660
tgtgaggaat gattacgata ctagataagc ggctaatgaa attttttaaa gtacatatat 720
agacatattt ttcatttagt aaaattttga atttcacttt gctaagacta gtgtctagaa 780
atttataatg atttattaac acctatttga aacttaagta taataaatga ttcggatttt 840
atttttaata aagacaaact tgaacgtagc aaagtagttt ttatgataaa taataagttt 900
taataatgtg acgcttttat ataagcacat tattatgaac aatgtgaatt gagcatctac 960
aattacatta ataaatatat aaatgatgat ttaaattcac atatatttat aatacacata 1020
ctatatgaaa gttttgatta tccgaataaa tgctaaaatt aataaaataa ttaaaggaat 1080
catacttatt atacgtatac gtttagct 1108
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<211> 1256
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 8
gctgtaggga aactaaaaga gaaatattgg aagcaagcca tagcagaata tgaaaaacgt 60
ttaggcccat acaccaagat agacatcata gaagttccag acgaaaaagc accagaaaat 120
atgagcgaca aagaaattga gcaagtaaaa gaaaaagaag gccaacgaat actagccaaa 180
attaaaccac aatccacagt cattacatta gaaatacaag gaaagatgct atcttccgaa 240
ggattggccc aagaattgaa ccaacgcatg acccaagggc aaagcgactt tgtattcgtc 300
attggcggat caaacggcct gcacaaggac gtcttacaac gcagtaacta cgcactatca 360
ttcagcaaaa tgacattccc acatcaaatg atgcgggttg tgttaattga gcaagtgtat 420
agagcattta agattatgcg tggagaagca tatcataaat gatgcggttt tttcagccgc 480
ttcataaagg gattttgaat gtatcagaac atatgaggtt tatgtgaatt gctgttatgt 540
ttttaagaag catatcataa gtgatgcggt ttttattaat tagttgctaa aaaatgaagt 600
atgcaatatt aattattatt aaattttgat atatttaaag aaagattaag tttagggtga 660
atgaatggct tatcaaagtg aatatgcatt agaaaatgaa gtacttcaac aacttgagga 720
attgaactat gaaagagtaa atatacataa tattaaatta gaaattaatg aatatctcaa 780
agaactagga gtgttgaaaa atgaataagc agacaaatac tccagaacta agatttccag 840
agtttgatga ggaatggaaa aaaaggaaat taggtgaagt agtaaattat aaaaatggtg 900
gttcatttga aagtttagtg aaaaaccatg gtgtatataa actcataact cttaaatctg 960
ttaatacaga aggaaagttg tgtaattctg gaaaatatat cgatgataaa tgtgttgaaa 1020
cattgtgtaa tgatacttta gtaatgatac tgagcgagca agcaccagga ctagttggaa 1080
tgactgcaat tatacctaat aataatgagt atgtactaaa tcaacgagta gcagcactag 1140
tgcctaaaca atttatagat agtcaatttc tatctaagtt aattaataga aaccagaaat 1200
atttcagtgt gagatctgct ggaacaaaag tgaaaaatat ttctaaagga catgta 1256
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<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 9
accattttag ctgtagggaa actaaaagag aaatattgga agcaagccat agcagaatat 60
gaaaaacgtt taggcccata caccaagata gacatcatag aagttccaga cgaaaaagca 120
ccagaaaata tgagcgacaa agaaattgag caagtaaaag aaaaagaagg ccaacgaata 180
ctagccaaaa tcaaaccaca atccacagtc attacattag aaatacaagg aaagatgcta 240
tcttccgaag gattggccca agaattgaac caacgcatga cccaagggca aagcgacttt 300
gtattcgtca ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactat 360
gcactatcat ttagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgaa 420
caagtgtata gagcatttaa gattatgcgt ggagaggcgt atcataaata aaactaaaaa 480
acggattgtg tataatatat tttaaatata aaaaggattg attttatgtt aaataaatta 540
gaaaatgtta gttataaatc attcgataat tacactagtg aagatgattt gactaaagta 600
aatatatttt ttggaagaaa tgggagtgga aaaagctcat taagtgaatg gttaagaaga 660
ctagataatg aaaaaagtgt tatctttaat actggttact taaaaaataa tattgaagaa 720
gttgaagaaa tagatggtgt gaatttggtt attggagaag aatctataaa tcatagtgac 780
caaattaagc atttaaatag cgctataaat agtttagaaa attttattac tcggaaaaat 840
agtgaactta agcattcaaa agaaagaatt tacaataaaa tgaatatcag actaaatgaa 900
gctagagaaa gatttgaaat aggtagtaat gtggttaagc agaagaggaa tgctgacaaa 960
gatccagtta atgcttttta tagttggaag aaaaatgcta acgatataat tcaagagatg 1020
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<210> 10
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accattttag ctgtagggaa actaaaagag aaatattgga agcaagccat agcagaatat 60
gaaaaacgtt taggcccata caccaagata gacatcatag aagttccaga cgaaaaagca 120
ccagaaaata tgagcgacaa agaaattgag caagtaaaag aaaaagaagg ccaacgaata 180
ctagccaaaa ttaaaccaca atccacagtc attacattag aaatacaagg aaagatgcta 240
tcttccgaag gattggccca agaattgaac caacgcatga cccaagggca aagcgacttt 300
gtattcgtca ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactac 360
gcactatcat tcagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgag 420
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caaatactcc agaactaaga tttccagagt ttgatgagga atggaaaaaa aggaaattag 780
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aatatatcga tgataaatgt gttgaaacat tgtgtaatga tactttagta atgatactga 960
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gtattcgtca ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactac 360
gcactatcat tcagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgag 420
caagtgtata gagcatttaa gattatgcgt ggagaagcat atcataaatg atgcggtttt 480
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ctgttatgtt tttaagaagc atatcataaa tgatgcggtt ttttcagccg cttcataaag 600
ggattttgaa tgtatcagaa catatgaggt ttatgtgaat tgctgttatg tttttaagaa 660
gcatatcata agtgatgcgg tttttattaa ttagttgcta aaaaatgaag tatgcaatat 720
taattattat taaattttga tatatttaaa gaaagattaa gtttagggtg aatgaatggc 780
ttatcaaagt gaatatgcat tagaaaatga agtacttcaa caacttgagg aattgaacta 840
tgaaagagta aatatacata atattaaatt agaaattaat gaatatctca aagaactagg 900
agtgttgaaa aatgaataag cagacaaata ctccagaact aagatttcca gagtttgatg 960
aggaatggaa aaaaaggaaa ttaggtgaag tagtaaatta taaaaatggt ggttcatttg 1020
aaagtttagt gaaaaaccat ggtgtatata aactcataac tcttaaatct gttaatacag 1080
aaggaaagtt gtgtaattct ggaaaatata tcgatgataa atgtgttgaa acattgtgta 1140
atgatacttt agtaatgata ctgagcgagc aagcaccagg actagttgga atgactgcaa 1200
<210> 12
<211> 1017
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 12
aacgtttagg cccatacacc aagatagaca tcatagaagt tccagacgaa aaagcaccag 60
aaaatatgag cgacaaagaa atcgagcaag taaaagaaaa agaaggccaa cgaatactag 120
ccaaaatcaa accacaatcc acagtcatta cattagaaat acaaggaaag atgctatctt 180
ccgaaggatt ggcccaagaa ttgaaccaac gcatgaccca agggcaaagc gactttgtat 240
tcgtcattgg cggatcaaac ggcctgcaca aggacgtctt acaacgcagt aactacgcac 300
tatcattcag caaaatgaca ttcccacatc aaatgatgcg ggttgtgtta attgaagcaa 360
gtgtatagag cgtttaagat tatgcgcgga gaagcgtatc acaaatgatg cggttttttt 420
aacctcttta cgtatgaggt ttatgagaat tgccgttatg ttttgcgaga gttatcaatc 480
tttttgatag taagaaagta catagaaact aaaagagtat ttttatctac aatagcattt 540
ataatttatt ctattattgt atacttattt taattattag tatcattgct gagatgttac 600
ttgatattct atgtctattt tttaggaaat tctatactat taaaattatg gtattttata 660
cgcaataaag gactaatcta ttttatacag attagtcctt tattgtagtc tttaaaaact 720
agttactcat taatattttt tagtacaatt tcagcaacct cacttactat tttgtcatta 780
ggtttaccat cttttctatc tttatttgta aatatcacca gaattatagg tttatcttgt 840
ccatctggat aaacaaagcg aacatcgttt cttgaaccgt atgttagtgc ttgaccgctc 900
ttatccataa ctttaaagtt tgaaggtgca ccatccttaa ttaatgtatc gccactttta 960
tttttgaaca ttagattaag taagaaatct ttgtttgctt tgctaagatc tccatca 1017
<210> 13
<211> 2207
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 13
ccttctacac ctccatatca caaaaattat aacattattt tgacataaat actacatttg 60
taatatacta caaatgtagt cttatataag gaggatattg atgaaaaaga taaaaattgt 120
tccacttatt ttaatagttg tagttgtcgg gtttggtata tatttttatg cttccaaaga 180
taaagaaatt aataatacta ttgatgcaat tgaagataaa aatttcaaac aagtttataa 240
agatagcagt tatatttcta aaagcgataa tggtgaagta gaaatgactg aacgtccgat 300
aaaaatatat aatagtttag gcgttaaaga tataaacatt caggatcgta aaataaaaaa 360
agtatctaaa aataaaaaac gagtagatgc tcaatataaa attaaaacaa actacggtaa 420
cattgatcgc aacgttcaat ttaattttgt taaagaagat ggtatgtgga agttagattg 480
ggatcatagc gtcattattc caggaatgca gaaagaccaa agcatacata ttgaaaattt 540
aaaatcagaa cgtggtaaaa ttttagaccg aaacaatgtg gaattggcca atacaggaac 600
agcatatgag ataggcatcg ttccaaagaa tgtatctaaa aaagattata aagcaatcgc 660
taaagaacta agtatttctg aagactatat caaacaacaa atggatcaaa attgggtaca 720
agatgatacc ttcgttccac ttaaaaccgt taaaaaaatg gatgaatatt taagtgattt 780
cgcaaaaaaa tttcatctta caactaatga aacagaaagt cgtaactatc ctctaggaaa 840
agcgacttca catctattag gttatgttgg tcccattaac tctgaagaat taaaacaaaa 900
agaatataaa ggctataaag atgatgcagt tattggtaaa aagggactcg aaaaacttta 960
cgataaaaag ctccaacatg aagatggcta tcgtgtcaca atcgttgacg ataatagcaa 1020
tacaatcgca catacattaa tagagaaaaa gaaaaaagat ggcaaagata ttcaactaac 1080
tattgatgct aaagttcaaa agagtattta taacaacatg aaaaatgatt atggctcagg 1140
tactgctatc caccctcaaa caggtgaatt attagcactt gtaagcacac cttcatatga 1200
cgtctatcca tttatgtatg gcatgagtaa cgaagaatat aataaattaa ccgaagataa 1260
aaaagaacct ctgctcaaca agttccagat tacaacttca ccaggttcaa ctcaaaaaat 1320
attaacagca atgattgggt taaataacaa aacattagac gataaaacaa gttataaaat 1380
cgatggtaaa ggttggcaaa aagataaatc ttggggtggt tacaacgtta caagatatga 1440
agtggtaaat ggtaatatcg acttaaaaca agcaatagaa tcatcagata acattttctt 1500
tgctagagta gcactcgaat taggcagtaa gaaatttgaa aaaggcatga aaaaactagg 1560
tgttggtgaa gatataccaa gtgattatcc attttataat gctcaaattt caaacaaaaa 1620
tttagataat gaaatattat tagctgattc aggttacgga caaggtgaaa tactgattaa 1680
cccagtacag atcctttcaa tctatagcgc attagaaaat aatggcaata ttaacgcacc 1740
tcacttatta aaagacacga aaaacaaagt ttggaagaaa aatattattt ccaaagaaaa 1800
tatcaatcta ttaactgatg gtatgcaaca agtcgtaaat aaaacacata aagaagatat 1860
ttatagatct tatgcaaact taattggcaa atccggtact gcagaactca aaatgaaaca 1920
aggagaaact ggcagacaaa ttgggtggtt tatatcatat gataaagata atccaaacat 1980
gatgatggct attaatgtta aagatgtaca agataaagga atggctagct acaatgccaa 2040
aatctcaggt aaagtgtatg atgagctata tgagaacggt aataaaaaat acgatataga 2100
tgaataacaa aacagtgaag caatccgtaa cgatggttgc ttcactgttt tattatgaat 2160
tattaataag tgctgttact tctcccttaa atacaatttc ttcattt 2207
<210> 14
<211> 1998
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 14
atgaaaaaaa tttatattag tgtgctagtt cttttactaa ttatgattat aataacttgg 60
ttattcaaag atgacgatat tgagaaaaca attagttcta ttgaaaaagg aaactataac 120
gaagtatata aaaatagttc agaaaaatct aaactggcat atggagaaga agaaattgta 180
gataggaata aaaaaattta caaagattta agtgtcaata acttaaaaat tactaatcat 240
gaaattaaaa aaactggaaa agataaaaag caagttgatg ttaaatataa catatataca 300
aaatatggaa ctatacgacg taatacacaa ttaaacttta tttatgaaga taagcattgg 360
aaattagatt ggagaccaga cgtaatagta cctggtttga aaaatggaca gaaaattaat 420
atagaaacat taaaatcaga gcgaggcaaa ataaaagata gaaatggtat agaattagct 480
aaaactggaa atacatatga aatcggtatt gtccctaaca aaacacccaa agaaaaatat 540
gatgatattg ctcgtgactt acaaattgat acaaaagcta taaccaataa agttaatcaa 600
aaatgggttc agccagattc atttgtacca attaaaaaga taaataaaca agatgaatat 660
atagacaaat taattaaatc atacaattta caaataaaca ctataaaaag ccgtgtttat 720
ccattgaacg aagcaacagt acacctttta ggttatgtgg gtccaattaa ttctgacgag 780
ttaaaaagta agcaatttag aaactatagc aaaaatactg ttattggaaa aaaaggctta 840
gaacgcctct atgataaaca attgcaaaac actgatggtt ttaaggtatc cattgcaaat 900
acttatgaca ataaaccttt agacacatta ttggagaaaa aggctgaaaa cggaaaagat 960
cttcatttaa ctatagatgc tagagtacaa gaaagtattt ataaacatat gaaaaatgac 1020
gatggatctg gtacagcatt acaaccaaaa actggagaaa ttttagcttt ggtaagtacc 1080
ccatcgtacg atgtttatcc attcatgaat ggattaagca ataatgacta ccgtaaatta 1140
actaacaata aaaaagagcc tttgctcaac aaatttcaaa tcactacatc accaggttca 1200
acccaaaaaa tattaacatc tattatagcc ttaaaagaaa ataaactaga caaaaatact 1260
aattttgata tttatggtaa gggttggcaa aaagatgcat catgggggaa ttataatatc 1320
acaagattta aagtagtaga cggcaatatc gatttaaagc aagcaataga atcatcagac 1380
aacatatttt ttgcccgcat tgcattagca ttaggagcca aaaaatttga gcaaggtatg 1440
caagatttgg gaatcggtga aaatatcccg agtgattatc ccttttataa agcacaaatc 1500
tcaaatagta atttaaaaaa tgaaatatta ttagcagatt caggatatgg ccaaggcgag 1560
atactagtaa accctataca aattttatca atatacagtg ctttagaaaa taacggaaat 1620
atacaaaatc ctcatgtttt acgtaaaaca aaatctcaaa tatggaaaaa agatattata 1680
cctaaaaaag acatagatat attaactaat ggtatggaac gtgtagttaa taaaacacat 1740
agggatgata tatacaaaaa ttatgcccga attattggta aatctggcac agcagaatta 1800
aaaatgaatc aaggggaaac tggaagacaa ataggttggt ttgtttcata taataaaaat 1860
aatcctaata tgttaatggc gattaatgtt aaagacgttc aaaataaagg gatggccagc 1920
tataatgcta ctatatctgg aaaagtttat gatgatttgt atgataatgg aaaaactcaa 1980
tttgatatag atcagtaa 1998
<210> 15
<211> 1011
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 15
atggcagtaa aagtagcaat taatggtttt ggtagaattg gtcgtttagc attcagaaga 60
attcaagaag tagaaggtct tgaagttgta gcagtaaacg acttaacaga tgacgacatg 120
ttagcgcatt tattaaaata tgacactatg caaggtcgtt tcacaggtga agtagaggta 180
gttgatggtg gtttccgcgt aaatggtaaa gaagttaaat cattcagtga accagatgca 240
agcaaattac cttggaaaga cttaaatatc gatgtagtat tagaatgtac tggtttctac 300
actgataaag ataaagcaca agctcatatt gaagcaggcg ctaaaaaagt attaatctca 360
gcaccagcta ctggtgactt aaaaacaatc gtattcaaca ctaaccacca agagttagac 420
ggttctgaaa cagttgtttc aggtgcttca tgtactacaa actcattagc accagttgct 480
aaagttttaa acgatgactt tggtttagtt gaaggtttaa tgactacaat tcacgcttac 540
acaggtgatc aaaatacaca agacgcacct cacagaaaag gtgacaaacg tcgtgctcgt 600
gcagcggcag aaaacatcat ccctaactca acaggtgctg ctaaagctat cggtaaagtt 660
attcctgaaa tcgatggtaa attagatggt ggtgcacaac gtgttcctgt agctacaggt 720
tcattaactg aattaacagt agtattagaa aaacaagacg taacagttga acaagttaac 780
gaagctatga aaaatgcttc aaacgaatca ttcggttaca ctgaagacga aatcgtttct 840
tcagacgttg taggtatgac ttacggttca ttattcgacg ctacacaaac tcgtgtaatg 900
tcagttggcg accgtcaatt agttaaagtt gcagcttggt atgataacga aatgtcatat 960
actgcacaat tagttcgtac attagcatac ttagctgaac tttctaaata a 1011
<210> 16
<211> 356
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 16
aacgtttagg cccatacacc aagatagaca tcatagaagt tccagacgaa aaagcaccag 60
aaaatatgag cgacaaagaa atcgagcaag taaaagaaaa agaaggccaa cgaatactag 120
ccaaaatcaa accacaatcc acagtcatta cattagaaat acaaggaaag atgctatctt 180
ccgaaggatt ggcccaagaa ttgaaccaac gcatgaccca agggcaaagc gactttgtat 240
tcgtcattgg cggatcaaac ggcctgcaca aggacgtctt acaacgcagt aactacgcac 300
tatcattcag caaaatgaca ttcccacatc aaatgatgcg ggttgtgtta attgaa 356
<210> 17
<211> 819
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 17
aacgtttagg cccatacacc aagatagaca tcatagaagt tccagacgaa aaagcaccag 60
aaaatatgag cgacaaagaa atcgagcaag taaaagaaaa agaaggccaa cgaatactag 120
ccaaaatcaa accacaatcc acagtcatta cattagaaat acaaggaaag atgctatctt 180
ccgaaggatt ggcccaagaa ttgaaccaac gcatgaccca agggcaaagc gactttgtat 240
tcgtcattgg cggatcaaac ggcctgcaca aggacgtctt acaacgcagt aactacgcac 300
tatcattcag caaaatgaca ttcccacatc aaatgatgcg ggttgtgtta attgaacaag 360
tgtatagagc atttaagatt atgcgaggag aagcgtatca caaataaaac taaaaaatag 420
attgtgtata atataaaagg aagggattta tattaaaatt ttgaattcaa aaattattga 480
aagggaagct accttagaaa ttgaatctat ggccactaat acattgaaaa taaacccaga 540
cattaattct tactatacag aaatgtcttt cgatggagaa ttggaagtgt atgatcctga 600
aaatttgaat aaaaaatttc gttggaaaaa tacaagttca agttaaagga aaagaagtag 660
ctaaaagagg aggtaagatt attcgtcgaa gtaatgggtt ctgttgcaaa gtaaaaaaat 720
atagctaacc actaatttat catgtcagtg ttcgcttaac gatataaata gctccatttt 780
ccttttattt tgatgtacgt ctcatcaata cgccatttg 819
<210> 18
<211> 868
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 18
accattttag ctgtagggaa actaaaagag aaatattgga agcaagccat agcagaatat 60
gaaaaacgtt taggcccata caccaagata gacatcatag aagttccaga cgaaaaagca 120
ccagaaaata tgagtgacaa agaaattgag caagtaaaag aaaaagaagg ccaacgaata 180
ctagccaaaa tcaaaccaca atccacagtc attacattag aaatacaagg aaagatgcta 240
tcttccgaag gattggccca agaattgaac caacgcatga cccaagggca aagcgacttt 300
gttttcgtca ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactac 360
gcactatcat tcagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgaa 420
caagtgtaca gagcatttaa gattatgcga ggagaagcgt atcacaaata aaactaaaaa 480
atagattgtg tataatataa aaggagcgga tttatattaa aactttgaat tcaaaaatta 540
ttgaaaggga agctacctta gaaattgaat ctatggcaac taatacattg aaaataaacc 600
cggatattaa ttcaaacgat acaaaaatgt ctttcgatgg agaattggaa gtgtatgatt 660
ctgaaaattt gagtaaaaaa aatttcgttg gaaaaataca agttcaagtt aaaggaaagg 720
aagtagctaa aagaggaggt aaggttattc atcgaagtaa tgtcaaaatg aatgatttaa 780
aggcatacca acgagaaggt ggtgtgtatt actttgtcgt gtatttaatc gttgagaata 840
aaaaagttgt tgagaagcag gtttatgg 868
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH FRET盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Cal Fluor Red 610标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 黑洞淬灭剂2-dT
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> 3'-端己二醇
<400> 19
tcttagccgg ttttccggct gagactccgc gtccgt 36
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向扩增低聚物
<400> 20
cgtttcacag gtgaagtaga ggta 24
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向扩增低聚物
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(29)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 21
cnagtanatt ntaatantan atngatatt 29
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> 3'-端己二醇
<400> 22
acggacgcgg agagttgatg gtggtttccg 30
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH正向扩增低聚物
<400> 23
cgcgtaaatg gtaaagaagt taaatcattc ag 32
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向扩增低聚物
<400> 24
gagcttgtgc tttatcttta tcagtgt 27
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> 3'-端己二醇
<400> 25
acggacgcgg aggtgaacca gatgcaagca 30
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH反向扩增低聚物
<400> 26
ctgtttcaga accgtctaac tcttgg 26
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C FRET盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Hexochloro-荧光素标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 黑莓淬灭剂650 dT
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> 3'-端己二醇
<400> 27
tctagccggt tttccggctg agacgtccgt ggcct 35
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'-端己二醇
<400> 28
acggacgcgg agcatctatt atagccttaa aagaaaataa act 43
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> 3'-端己二醇
<400> 29
acggacgcgg agtcgatttt ataacttgtt ttatcgtc 38
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C正向扩增低聚物
<400> 30
ttatcttttt gccaaccttt accat 25
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C反向扩增低聚物
<400> 31
tcaccaggtt caactcaaaa aatattaac 29
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物
<220>
<221> misc-feature
<222> (43)..(43)
<223> 3'-端己二醇
<400> 32
aggccacgga cgcatctatt atagccttaa aagaaaataa act 43
<210> 33
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> 3'-端己二醇
<400> 33
aggccacgga cgtcgatttt ataacttgtt ttatcgtc 38
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C正向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(23)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 34
atntttttgn naanntttan nat 23
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(29)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 35
tnannaggtt naantnaaaa aatattaac 29
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C正向扩增低聚物
<400> 36
gcaaagaaaa tgttgtctga tgattctatt gcttg 35
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C正向扩增低聚物
<400> 37
gaaaatgttg tctgatgatt ctattgcttg 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA反向扩增低聚物
<400> 38
cttggggtgg ttacaacgtt acaagatatg 30
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA/C正向扩增低聚物
<400> 39
cctgaatctg ctaataatat ttcatt 26
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA正向扩增低聚物
<400> 40
gtgtctttta ataagtgagg tg 22
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 3'-端己二醇
<400> 41
aggccacgga cgcgtaacct gaatcagct 29
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA侵入物
<400> 42
gggttaatca gtatttcacc ttgtca 26
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3'-端己二醇
<400> 43
aggccacgga cgcaccttgt ccgtaacc 28
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA 449-465 (+) 侵入物
<400> 44
ggatctgtac tgggttaatc agtattta 28
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA反向扩增低聚物
<400> 45
ggtgttggtg aagatatacc 20
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC侵入物
<400> 46
atcactcggg atattttcac cgac 24
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物
<400> 47
acggacgcgg agttcccaaa tcttgcatac 30
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC反向扩增低聚物
<400> 48
ttaaagcaag caatagaatc atcaga 26
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC反向扩增低聚物
<400> 49
atggtaaggg ttggcaaaaa g 21
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ i反向扩增低聚物
<400> 50
gaaagactgc ggaggctaac 20
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ i反向扩增低聚物
<400> 51
gctaactatg tcaaaaatca tg 22
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ i反向扩增低聚物
<400> 52
gactgcggag gctaactatg tc 22
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ ii、viii、ix、 xiv反向扩增低聚物
<400> 53
aagcggctga aataaccgc 19
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ ii、viii、ix、 xiv反向扩增低聚物
<400> 54
aagcggctga aaaaaccgc 19
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ ii反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(18)
<223> n = = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 55
cnntttatga agnggntg 18
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ v反向扩增低聚物
<400> 56
ttacggctga aataaccgc 19
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xxi反向扩增低聚物
<400> 57
ctctcgcaaa acataacggc 20
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接FRET盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 荧光素标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 黑莓淬灭剂650 dT标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> 3'-端己二醇
<400> 58
tctagccggt tttccggctg agacctcggc gcg 33
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX正向扩增低聚物
<400> 59
cttccgaagg attggc 16
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX正向扩增低聚物
<400> 60
ccgaaggatt ggcccaagaa ttg 23
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> I
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 3'-端己二醇
<400> 61
cgcgccgagg cncaagaatt gaaccaacg 29
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> 3'-端己二醇
<400> 62
cgcgccgagg gaaccaacgc atgacc 26
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ iv反向扩增低聚物
<400> 63
ggatatggaa atccatctct ac 22
<210> 64
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ iv反向扩增低聚物
<400> 64
cgctactaaa gaggatatgg aaatccatct ctac 34
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ iv反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(2)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 65
anngntanta aagaggatat gg 22
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ v反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(19)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 66
ttanggntga aataacngc 19
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ vi反向扩增低聚物
<400> 67
ctgattttca ctcttcatct acttactc 28
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ vi反向扩增低聚物
<400> 68
gatataggtg tcacatcata tttcgc 26
<210> 69
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xiii反向扩增低聚物
<400> 69
ctctttcata gttcaattcc tcaagttgtt ga 32
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xiii反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(25)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 70
gttgaagtan ttnattttnt aatgc 25
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xiii反向扩增低聚物
<400> 71
gccattcatt caccctaaac ttaatctttc 30
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xiii反向扩增低聚物
<400> 72
ccattcattc accctaaac 19
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ iii反向扩增低聚物
<400> 73
atacacaacc taatttttag 20
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ iii反向扩增低聚物
<400> 74
gtatgatatt gcaaggtata atcc 24
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ iii反向扩增低聚物
<400> 75
cactctataa acatcgtatg atattgcaag 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ vii反向扩增低聚物
<400> 76
taatggaaat tcttaatctt tacttgtacc 30
<210> 77
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ vii反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(26)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 77
ggaaattntt aatntttant tgtanc 26
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ vii反向扩增低聚物
<400> 78
caaaaagaag tcgatttaca caccatg 27
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ vii反向扩增低聚物
<400> 79
ctttacatcg cttactgcaa acatctaata c 31
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xii反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(25)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(20)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 80
aatgagnttt ttnnantnnn atttc 25
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xii反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(18)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 81
tnnantnnna tttnttnc 18
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xii反向扩增低聚物
<400> 82
acttaatgag ctttttccac tc 22
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xv反向扩增低聚物
<220>
<221> mod_base
<222> (1)..(25)
<223> n = 5'-甲基-2'脱氧胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 83
caatttntaa ggtagnttnn ntttc 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MREJ xv反向扩增低聚物
<400> 84
caatttctaa ggtagcttcc ctttc 25
<210> 85
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物核心序列
<400> 85
ccgagggaac ca 12
<210> 86
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物核心序列
<220>
<221> mod_base
<222> (8)..(8)
<223> I
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 86
ccgaggcnca ag 12
<210> 87
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物核心序列
<400> 87
cggacgtcga tt 12
<210> 88
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物核心序列
<400> 88
caacctgttt ta 12
<210> 89
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物核心序列
<400> 89
gcggagtcga tt 12
<210> 90
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物核心序列
<400> 90
cggacgcgta ac 12
<210> 91
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物核心序列
<400> 91
cggacgcacc tt 12
<210> 92
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物核心序列
<400> 92
gcggagcatc ta 12
<210> 93
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物核心序列
<400> 93
gcggagttcc ca 12
<210> 94
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物核心序列
<400> 94
cggacgcatc ta 12
<210> 95
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物核心序列
<400> 95
gcggaggtga ac 12
<210> 96
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物核心序列
<400> 96
gcggagagtt ga 12
<210> 97
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物靶杂交序列
<400> 97
gaaccaacgc atgacc 16
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物靶杂交序列
<220>
<221> mod_base
<222> (2)..(2)
<223> I
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n 是 a、c、g或t
<400> 98
cncaagaatt gaaccaacg 19
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物靶杂交序列
<400> 99
tcgattttat aacttgtttt atcgtc 26
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物靶杂交序列
<400> 100
tcgattttat aacttgtttt atcgtc 26
<210> 101
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物靶杂交序列
<400> 101
gttttaagtc gatattacca tttaccac 28
<210> 102
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物靶杂交序列
<400> 102
cgtaacctga atcagct 17
<210> 103
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物靶杂交序列
<400> 103
caccttgtcc gtaacc 16
<210> 104
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物靶杂交序列
<400> 104
catctattat agccttaaaa gaaaataaac t 31
<210> 105
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物靶杂交序列
<400> 105
catctattat agccttaaaa gaaaataaac t 31
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物靶杂交序列
<400> 106
ttcccaaatc ttgcatac 18
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物靶杂交序列
<400> 107
gtgaaccaga tgcaagca 18
<210> 108
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物靶杂交序列
<400> 108
agttgatggt ggtttccg 18
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC正向扩增低聚物
<400> 109
atctttttgc caacccttac cat 23
<210> 110
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC反向扩增低聚物
<400> 110
tcaccaggtt caacccaaaa aatattaac 29
<210> 111
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec 连接检测低聚物
<400> 111
acggacgcgg aggaaccaac gcatgacc 28
<210> 112
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物
<400> 112
cgcgccgagg tcgattttat aacttgtttt atcgtc 36
<210> 113
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物
<400> 113
cgcgccgagg catctattat agccttaaaa gaaaataaac t 41
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物
<400> 114
aggccacgga cggtgaacca gatgcaagca 30
<210> 115
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec 连接检测低聚物
<400> 115
aggccacgga cggaaccaac gcatgacc 28
<210> 116
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物
<400> 116
acggacgcgg agtcgatttt ataacttgtt ttatcgtc 38
<210> 117
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物
<400> 117
acggacgcgg agcatctatt atagccttaa aagaaaataa act 43
<210> 118
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物
<400> 118
cgcgccgagg gtgaaccaga tgcaagca 28
<210> 119
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物核心序列
<400> 119
gcggaggaac ca 12
<210> 120
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物核心序列
<400> 120
ccgaggtcga tt 12
<210> 121
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物核心序列
<400> 121
ccgaggcatc ta 12
<210> 122
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物核心序列
<400> 122
cggacggtga ac 12
<210> 123
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> orfX/SCCmec连接检测低聚物核心序列
<400> 123
cggacggaac ca 12
<210> 124
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecA检测低聚物核心序列
<400> 124
gcggagtcga tt 12
<210> 125
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mecC检测低聚物核心序列
<400> 125
gcggagcatc ta 12
<210> 126
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH检测低聚物核心序列
<400> 126
ccgagggtga ac 12
Claims (136)
1.一种组合物或试剂盒，其包括至少一种orfX扩增低聚物、至少第一SCCmec右端连接(MREJ)扩增低聚物和多种mec扩增低聚物，其中：
所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；
所述MREJ扩增低聚物被配置成与SCCmec序列特异性杂交；
所述orfX扩增低聚物和所述MREJ扩增低聚物被配置成产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的orfX/SCCmec连接扩增子；
所述多种mec扩增低聚物包括第一mecA/mecC扩增低聚物和第二mecA/mecC扩增低聚物；
所述第一mecA/mecC扩增低聚物被配置成与位点特异性杂交，所述位点包括：SEQ IDNO:13的位置1394和SEQ ID NO:14的位置1285，或SEQ ID NO:13的位置1484和SEQ ID NO:14的位置1376；
所述第二mecA/mecC扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:13的位置1312和SEQ IDNO:14的位置1203的位点特异性杂交；并且
所述第一mecA/mecC扩增低聚物和所述第二mecA/mecC扩增低聚物被配置成产生mec扩增子。
2.一种组合物或试剂盒，其包括至少一种orfX扩增低聚物、至少第一MREJ扩增低聚物以及至少第一GAPDH扩增低聚物和第二GAPDH扩增低聚物，其中：
所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；
所述MREJ扩增低聚物被配置成与SCCmec序列特异性杂交；
所述orfX扩增低聚物和所述MREJ扩增低聚物被配置成产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的orfX/SCCmec连接扩增子；
所述第一GAPDH扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:15的位置169或位置212的位点特异性杂交；
所述第二GAPDH扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:15的位置279、位置312或位置421的位点特异性杂交；并且
所述第一GAPDH扩增低聚物和所述第二GAPDH扩增低聚物被配置成产生GAPDH扩增子。
3.一种检测MRSA核酸的方法，其包括：
制备根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含或怀疑包含MRSA核酸的样品；
使所述组合物经受扩增条件；以及
检测所述orfX/SCCmec连接扩增子以及所述mec扩增子和所述GAPDH扩增子中至少一种存在与否。
4.一种组合物或试剂盒，其包括：
orfX扩增低聚物，所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；
至少一种检测低聚物，所述至少一种检测低聚物包括靶杂交序列，所述靶杂交序列被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置201或位置210的位点特异性杂交；以及
至少第一MREJ扩增低聚物和第二MREJ扩增低聚物，其中：
所述orfX扩增低聚物和所述第一MREJ扩增低聚物被配置成从一种或多种第一MREJ类型的MRSA产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的第一orfX/SCCmec连接扩增子；并且
所述orfX扩增低聚物和所述第二MREJ扩增低聚物被配置成从不同于所述一种或多种第一MREJ类型的一种或多种第二MREJ类型的MRSA产生长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸的第二orfX/SCCmec连接扩增子。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少一种的SCCmec序列特异性杂交。
6.一种组合物或试剂盒，其包括：
orfX扩增低聚物，所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186或位置192中至少一个的位点特异性杂交；以及
至少第一MREJ扩增低聚物，其中所述第一MREJ扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:17的位置491和SEQ ID NO:18的位置555的位点特异性杂交，其中：
所述orfX扩增低聚物和所述第一MREJ扩增低聚物被配置成从MREJ类型xv的MRSA产生第一orfX/SCCmec连接扩增子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括至少第二MREJ扩增低聚物和第三MREJ扩增低聚物，每个扩增低聚物被配置成与彼此不同并且不同于所述第一MREJ扩增低聚物被配置成特异性杂交的一种或多种MREJ类型的MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少一种的至少一个SCCmec序列特异性杂交并产生长度范围为约50个核苷酸到约2000个核苷酸的orfX/SCCmec连接扩增子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括多个MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少一种的至少一个SCCmec序列特异性杂交，其中所述试剂盒或组合物的所述至少一种orfX引物和所述MREJ扩增低聚物共同被配置成从MREJ类型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、xii、xiii、xiv、xv或xxi中至少7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种或14种产生orfX/SCCmec连接扩增子，其中所述orfX/SCCmec连接扩增子的长度范围为约200个核苷酸到约2000个核苷酸。
9.一种检测MRSA核酸的方法，其包括：
制备根据权利要求4到8中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括包含或怀疑包含MRSA核酸的样品；
使所述组合物经受扩增条件；以及
使用所述至少一种检测低聚物来检测至少一种orfX/SCCmec连接扩增子存在与否。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:1的位置277、位置287或位置293中至少一个的位点处与MREJ类型i核酸特异性杂交。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:2的位置613、位置622、位置721、位置731或位置737中至少一个的位点处与MREJ类型ii核酸特异性杂交。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:8的位置473或位置654的位点处与MREJ类型ix核酸特异性杂交。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:11的位置482、位置584或位置765的位点处与MREJ类型xiv核酸特异性杂交。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型i、ii、viii、ix和xiv中至少一种特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:50-55或69-72之一的序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:52、53或55之一的序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:50的序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:51的序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:53或54的序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:69-72的序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:3的位置668、位置738或位置750中至少一个的位点处与MREJ类型iii核酸特异性杂交。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型iii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:73-75之一的序列。
22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:73-75之一的序列。
23.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:4的位置545、位置551或位置559中至少一个的位点处与MREJ类型iv核酸特异性杂交。
24.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型iv核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:63-65之一的序列。
25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:63-65之一的序列。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:5的位置458的位点处与MREJ类型v核酸特异性杂交。
27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型v核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:56的序列。
28.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:56的序列。
29.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:6的位置498或位置611的位点处与MREJ类型vi核酸特异性杂交。
30.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型vi核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:67-68之一的序列。
31.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:67-68之一的序列。
32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:7的位置563、位置565、位置601或位置629中至少一个的位点处与MREJ类型vii核酸特异性杂交。
33.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型vii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:76-79之一的序列。
34.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:76-79之一的序列。
35.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括其中MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:9的位置617、位置624或位置630中至少一个的位点处与MREJ类型xii核酸特异性杂交。
36.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型xii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:80-82之一的序列。
37.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:80-82之一的序列。
38.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括其中MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:10的位置561、位置568、位置605或位置628中至少一个的位点处与MREJ类型xiii核酸特异性杂交。
39.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型xiii核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:69-72之一的序列。
40.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:69-72之一的序列。
41.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成在包括SEQ ID NO:12的位置461的位点处与MREJ类型xxi核酸特异性杂交。
42.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物被配置成与MREJ类型xxi核酸特异性杂交，并且包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:57的序列。
43.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述试剂盒或组合物包括至少一种MREJ扩增低聚物，所述MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:57的序列。
44.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:59组成的序列的低聚物竞争与orfX核酸的杂交。
45.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:60组成的序列的低聚物竞争与orfX核酸的杂交。
46.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置186的位点特异性杂交。
47.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置192的位点特异性杂交。
48.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:59的序列。
49.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括SEQ ID NO:59的序列。
50.根据权利要求1到47中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:60的序列。
51.根据权利要求1到47中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX扩增低聚物包括SEQ ID NO:60的序列。
52.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括至少一种初级orfX/SCCmec连接检测低聚物，所述低聚物被配置成与所述orfX/SCCmec连接扩增子序列特异性杂交。
53.根据权利要求52所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物是不可延伸的。
54.根据权利要求52或53所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括标记。
55.根据权利要求52到54中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物被配置成与包括SEQ ID NO:16的位置201和位置211中至少一个的位点特异性杂交。
56.根据权利要求52到55中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物被配置成与同所述orfX扩增低聚物被配置成特异性杂交的SEQID NO:16中的位点重叠的位点特异性杂交。
57.根据权利要求52到56中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:61或62组成的序列的检测低聚物竞争与SEQ ID NO:16的杂交。
58.根据权利要求52到57中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括SEQ ID NO:85、86、97或98中至少一个的序列。
59.根据权利要求52到58中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:61、62、111或115的序列。
60.根据权利要求52到59中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述orfX/SCCmec连接初级检测低聚物包括SEQ ID NO:61、62、111或115的序列。
61.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物在严格的条件下与具有由包含胞嘧啶甲基化的SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:84组成的序列的低聚物竞争与MREJ类型xv核酸的杂交。
62.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括包含胞嘧啶甲基化的具有多达两个错配的SEQ ID NO:83的序列。
63.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括包含胞嘧啶甲基化的SEQ ID NO:83的序列。
64.根据权利要求1到61中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:84的序列。
65.根据权利要求64所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述第一MREJ扩增低聚物包括SEQ ID NO:84的序列。
66.根据权利要求2到65中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括多个被配置成产生mecA扩增子或mecC扩增子中至少一种的mec扩增低聚物。
67.根据权利要求1或66所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述多种mec扩增低聚物包括在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:30、34、36、37、39或40组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA核酸的mec扩增低聚物。
68.根据权利要求1、66或67所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述多种mec扩增低聚物包括包含具有多达两个错配的SEQ ID NO:30、34、36、37、39或40的序列的mec扩增低聚物。
69.根据权利要求1或66所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述多种mec扩增低聚物包括包含SEQ ID NO:30、34、36、37、39或40的序列的mec扩增低聚物。
70.根据权利要求1或66到69中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:31、35、38、45、48或49组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA或mecC核酸。
71.根据权利要求1或66到70中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物包括所述具有多达两个错配的SEQ ID NO:31、35、38、45、48或49的序列。
72.根据权利要求1或66到69中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物包括所述SEQ ID NO:31、35、38、45、48或49的序列。
73.根据权利要求1或66到72中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:34、36、37或39组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA或mecC核酸。
74.根据权利要求1或66到73中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:34、36、37或39的序列。
75.根据权利要求1或66到72中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物包括所述SEQ ID NO:34、36、37或39的序列。
76.根据权利要求1或66到75中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:35、48或49组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecC核酸。
77.根据权利要求1或66到76中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec扩增低聚物，所述低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:35、48或49的序列。
78.根据权利要求1或66到75中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括包含SEQ ID NO:35、48或49的序列的mec扩增低聚物。
79.根据权利要求1或66到78中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:29、33、41、43、112或116组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecA核酸。
80.根据权利要求1或66到79中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物包括SEQ ID NO:87-91或99-103中至少一个的序列。
81.根据权利要求1或66到80中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:29、33、41、43、112或116的序列。
82.根据权利要求1或66到80中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物包括SEQ ID NO:29、33、41、43、112或116的序列。
83.根据权利要求1或66到82中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:28、32、47、113或117组成的序列的低聚物竞争杂交以结合到mecC核酸。
84.根据权利要求1或66到83中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物包括SEQ ID NO:92-94或104-106中至少一个的序列。
85.根据权利要求1或66到84中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:28、32、47、113或117的序列。
86.根据权利要求1或66到84中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括mec初级检测低聚物，所述低聚物包括SEQ ID NO:28、32、47、113或117的序列。
87.根据权利要求1或3到86中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括至少一对金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物，其被配置成产生金黄色葡萄球菌特异性扩增子或金黄色葡萄球菌指示性扩增子。
88.根据权利要求87所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一对金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物被配置成与金黄色葡萄球菌染色体中的nuc、rRNA、femB、Sa442、葡萄球菌黄素或GAPDH之一特异性杂交。
89.根据权利要求2或87到88中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:20或23组成的序列的低聚物竞争结合到金黄色葡萄球菌GAPDH。
90.根据权利要求2或87到89中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物包括SEQ ID NO:20或23的序列。
91.根据权利要求2或87到90中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:21、24或26组成的序列的低聚物竞争结合到金黄色葡萄球菌GAPDH。
92.根据权利要求2或87到91中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中至少一种金黄色葡萄球菌特异性扩增低聚物或金黄色葡萄球菌指示性扩增低聚物包括SEQ ID NO:21、24或26的序列。
93.根据权利要求2或87到92中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括至少一种金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物。
94.根据权利要求93所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物在严格的条件下与具有由SEQ IDNO:22、25、114或118组成的序列的低聚物竞争结合到金黄色葡萄球菌GAPDH。
95.根据权利要求93或94所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物包括SEQ ID NO:95、96、107或108中至少一个的序列。
96.根据权利要求93到95中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述金黄色葡萄球菌特异性初级检测低聚物或金黄色葡萄球菌指示性初级检测低聚物包括SEQ ID NO:22、25、114或118的序列。
97.根据权利要求4到5或9到96中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒进一步包括一种或多种二级检测低聚物，所述低聚物包括标记并且被配置成与初级检测低聚物的片段相互作用。
98.根据权利要求97所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物是FRET盒。
99.根据权利要求97或98所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物包含包括SEQ ID NO:58的序列的二级检测低聚物。
100.根据权利要求97到99中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物包含包括SEQ ID NO:19的序列的二级检测低聚物。
101.根据权利要求97到100中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述一种或多种二级检测低聚物包含包括SEQ ID NO:27的序列的二级检测低聚物。
102.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括具有针对由3'端侵入形成的三链结构的结构特异性活性的核酸酶。
103.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括切割酶或5'核酸酶。
104.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括FEN1核酸酶。
105.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括聚合酶。
106.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括DNA聚合酶。
107.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括耐热DNA聚合酶。
108.根据权利要求107所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述耐热DNA聚合酶是热启动DNA聚合酶。
109.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括NTP。
110.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒或方法，其中所述组合物或试剂盒包括脱氧核糖核苷三磷酸。
111.一种检测低聚物，其包括SEQ ID NO:85-96或119-126中任一项中所阐述的序列，其中所述检测低聚物进一步包括足够的附加序列以与MRSA扩增子特异性杂交。
112.根据权利要求111所述的检测低聚物，所述检测低聚物被配置成与SEQ ID NO:97-108中任一项中所阐述的序列的反向互补序列特异性杂交。
113.根据权利要求111或112所述的检测低聚物，其包括具有多达两个错配的SEQ IDNO:97-108中任一个中所阐述的序列。
114.根据权利要求111或112所述的检测低聚物，其包括SEQ ID NO:97-108中任一个中所阐述的序列。
115.根据权利要求111到114中任一项所述的检测低聚物，其包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:22、25、28、29、32、33、39、41、43、47、61或62中任一个中所阐述的序列。
116.根据权利要求111至114中任一项所述的检测低聚物，其包括SEQ ID NO:22、25、28、29、32、33、39、41、43、47、61或62中任一个中所阐述的序列。
117.根据权利要求111到116中任一项所述的检测低聚物，其中所述检测低聚物是不可延伸的。
118.根据权利要求111到117中任一项所述的检测低聚物，其中所述检测低聚物包括标记。
119.根据权利要求111到118中任一项所述的检测低聚物，其中所述检测低聚物的长度为约25到约45个核甘酸。
120.一种组合物或试剂盒，其包括根据权利要求111到119中任一项所述的至少一种检测低聚物和至少一种二级检测低聚物，其中所述二级检测低聚物包括至少一个标记并且被配置成与所述检测低聚物的片段相互作用。
121.根据权利要求120所述的组合物或试剂盒，其中所述二级检测低聚物包括至少两个标记。
122.根据权利要求121所述的组合物或试剂盒，其中所述至少两个标记包含FRET对。
123.根据权利要求121或122所述的组合物或试剂盒，其中所述至少两个标记包含淬灭剂。
124.根据权利要求121到123中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述二级检测低聚物是FRET盒。
125.根据权利要求120到124中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述检测低聚物的所述片段是至少约6个核苷酸的5'端皮瓣。
126.根据权利要求125所述的组合物或试剂盒，其中所述检测低聚物的所述5'端皮瓣具有包括如SEQ ID NO:22、25、28、29、32、33、39、41、43、47、61或62中任一个中所阐述的位置1-6的序列。
127.一种检测MRSA核酸的方法，其包括：
制备根据权利要求120到126中任一项所述的组合物或包括根据权利要求111到119中任一项所述的至少一种检测低聚物，并且进一步包括包含或怀疑包含MRSA核酸或至少一种MRSA扩增子的样品；
通过进行杂交试验来检测所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子存在与否；以及确定所述检测低聚物是否与所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子杂交。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述组合物包括根据权利要求120到126中任一项所述的至少一种二级检测低聚物，并且所述方法包括确定与所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子杂交的检测低聚物是否包括将所述检测低聚物暴露于结构特异性核酸酶，并确定由所述结构特异性核酸酶所产生的所述检测低聚物的片段是否与所述二级检测低聚物相互作用。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述检测低聚物的所述片段是5'端皮瓣。
130.根据权利要求128或129所述的方法，其中所述组合物进一步包括至少一种侵入性低聚物，所述侵入性低聚物与所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子中与所述检测低聚物的所述杂交位点重叠的位点杂交，并且在所述检测低聚物和所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子存在的情况下，形成被所述结构特异性核酸酶识别为切割的结构。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述侵入性低聚物在严格的条件下与具有由SEQ ID NO:20、21、23、24、30、31、34-40、45、46、48-57、59、60、63-84、109或110中任一个的序列组成的序列的低聚物竞争与所述MRSA核酸或所述MRSA扩增子的杂交。
132.根据权利要求130或131所述的方法，其中所述侵入性低聚物具有包括具有多达两个错配的SEQ ID NO:20、21、23、24、30、31、34-40、45、46、48-57、59、60、63-84、109或110中任一个的序列的序列。
133.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒、检测低聚物或方法，其中至少一种低聚物包括至少一种甲基化胞嘧啶。
134.根据前述权利要求中任一项所述的组合物、试剂盒、检测低聚物或方法，其中SEQID NO的序列包含如序列表中所指示的胞嘧啶甲基化。
135.根据权利要求1到2、4到8、10到110、120到126或133到134中任一项所述的组合物，或包括根据权利要求111到119中任一项所述的检测低聚物，所述检测低聚物是含水的、冷冻的或冻干的，或其中至少一种低聚物结合到固体基质。
136.一种根据权利要求1到2、4到8、10到110、120到126或133到135中任一项所述的组合物或试剂盒或根据权利要求111到119中任一项所述的检测低聚物的用途，其用于检测样品中的MRSA核酸。
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