DE69233599T2 - Unterbrochene 2'-modifizierte Oligonukleotide - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung ist auf die Synthese und Verwendung von Makromolekülen ausgerichtet, um RNase H zur Spaltung eines Stranges in einen entgegenwirkenden Strang zu veranlassen. Die Makromoleküle sind als Therapeutika, Diagnostika und als Forschungs-Reagenzien geeignet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist bekannt, dass viele körperliche Zustände von Säugetieren, Krankheitszustände inbegriffen, von Proteinen beeinflusst werden. Solche Proteine, die entweder direkt oder durch ihre enzymatischen Funktionen wirken, sind im großen Maße an vielen Krankheiten beim Tier und Menschen beteiligt. Klassische Arzneimittel sind im Allgemeinen darauf ausgerichtet, über Interaktionen mit solchen Proteinen ihrer krankmachenden oder krankheitspotenzierenden Wirkung entgegenzuwirken. Kürzlich hat man jedoch Versuche unternommen, um die tatsächliche Produktion solcher Proteine durch Interaktionen mit Messenger RNA (mRNA) oder anderen intrazellulären RNAs, die die Proteinsynthese steuern, zu vermindern. Es ist im Allgemeinen das Ziel dieser therapeutischen Ansätze, mit der Gen-Expression, die zu Synthese unerwünschter Proteinbildung führt, zu interferieren oder diese zu regulieren.
  • Die Antisense-Methodik ist die komplementäre Hybridisierung von relativ kurzen Oligonukleotiden zu Einzelstrang-RNA oder Einzelstrang-DNA, so dass die normalen, essentiellen Funktionen dieser Nukleinsäuren gestört sind. Hybridisierung ist die sequenzspezifische Wasserstoffbindung über Watson-Crick-Basenpaare der heterozyklischen Basen von Oligonukleotiden zu RNA und DNA. Solche Basenpaare sind, wie man sagt, komplementär zueinander.
  • Man nimmt an, dass es von den natürlich vorkommenden Ereignissen, die eine Störung der Nukleinsäure-Funktion verursachen, wie von Cohen in Oligonucleotides; Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc., Boca Raton, FI (1989) diskutiert, zwei Typen gibt. Der erste Typ stellt den Ausfall der Hybridisierung dar. Dies kennzeichnet das Abbruchsereignis, bei dem ein Oligonukleotidhemmer an eine Zielnukleinsäure bindet und so, durch einfache sterische Behinderung, die Bindung von essentiellen Proteinen, meistens Ribosomen, an die Nukleinsäure verhindert. Methyl-Phosphonat-Oligonukleotide (Siehe, z.B., Miller, et al., Anti-Cancer Drug Design 1987, 2, 117) und α-Anomer-Oligonukleotide sind die zwei am intensivsten untersuchten Antisense-Substanzen, bei denen man glaubt, dass sie zur Störung der Nukleinsäurefunktion durch Ausfall der Hybridisierung führen.
  • Durch die Bestimmung des Ausmaßes des Hybridisierungsausfalls eines Oligonukleotides kann die relative Fähigkeit eines Oligonukleotides, an die komplementäre Nukleinsäure zu binden, verglichen werden, indem die Schmelztemperatur eines bestimmten Hybridisierungskomplexes bestimmt wird. Die Schmelztemperatur (Tm), eine charakteristisch physikalische Eigenschaft von Doppelhelices, ist die Temperatur in Grad Celsius, bei der 50% helikale Formen (hybridisiert) gegenüber Knäuelformen (unhybridisiert) vorliegen. Tm wird gemessen, indem das UV-Spektrum zur Bestimmung der Bildung und des Zerfalls (Schmelzen) der Hybridisierung verwendet wird. Die Basenstapelung, die während der Hybridisierung abläuft, wird von einer Reduktion der UV-Absorption (Hypochromizität) begleitet. Folglich zeigt eine Reduktion der UV-Absorption ein höheres Tm an. Je höher das Tm, umso größer ist die Bindungskraft der Stränge. Nicht-Watson-Crick Basenpaarung, d.h. unpassende Basen, hat einen großen Destabilisierungseffekt auf Tm.
  • Der zweite Typ eines Abbruchsereignisses für Antisense-Oligonukleotide involviert die enzymatische Spaltung der Ziel-RNA durch die intrazelluläre RNase H. Der Mechanismus solcher RNase-Spaltung erfordert, dass ein 2'-Desoxyribofuranosyl Oligonukleotid mit einer Ziel-RNA hybridisiert wird. Der resultierende DNA-RNA-Duplex aktiviert das RNase H Enzym; das aktivierte Enzym spaltet den RNA-Strang. Die Spaltung des RNA-Stranges zerstört die normale Funktion der RNA. Phosphorothoat-Oligonukleotide sind ein markantes Beispiel für Antisense-Substanzen, die durch diesen Typus von Abbruchsereignissen wirken. Für ein DNA-Oligonukleotid, welches für die Aktivierung der RNase H verwendbar ist, muss das Oligonukleotid gegenüber Nukleasen besonders stabil sein, um in einer Zelle für einen für die Aktivierung der RNase H ausreichenden Zeitraum überleben zu können.
  • Zahlreiche aktuelle Publikationen von Walder, et al. beschreiben weitergehend die Interaktion von RNase H und Oligonukleotiden. Von besonderen Interesse sind: (1) Dagle, et al., Nucleic Acids Research 1990, 18, 4751; (2) Dagle, et al., Antisense Research And Development 1991, 1, 11; (3) Eder, et al., Biol. Chem. 1991, 266, 6472; and (4) Dagle, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805. In diesen Veröffentlichungen, erwähnt Walder, et al., dass DNA-Oligonukleotide, die sowohl über unmodifizierte Phosphodiester-Internukleosid-Bindungen als auch über modifizierte Phosphorothioat-Internukleosid-Bindungen verfügen, das Substrat für die zelluläre RNase H sind. Da sie Substrate sind, aktivieren sie die Spaltung von Ziel-RNA mittels der RNase H. Weiterhin schreiben die Autoren jedoch, dass in Xenopus-Embryonen sowohl Phosphodiester-Bindungen als auch Phosphorothioat-Bindungen ebenfalls Gegenstand des Exonuklease-induzierten Abbaus sind. Solcher Abbau durch Nuklease ist nachteilig, da er die für die Aktivierung von RNase H zur Verfügung stehenden Oligonukleotide rapide verringert.
  • Wie in den Referenzen (1), (2) und (4) beschrieben, konstruierten Walder et al., um die Oligonukleotide gegen den Nuklease-bedingten Abbau zu stabilisieren, während sie dennoch zur Aktivierung der RNase H zur Verfügung stehen, ein 2'-Desoxy-Oligonukleotid mit einem kurzen Abschnitt von Phosphoester-verknüpften Nukleotiden, die zwischen Abschnitten mit Phosphoramidat, Alkyl-Phosphonat oder Phosphortriester Bindungen positioniert sind. Während die Phosphoramidat enthaltenden Oligonukleotide gegen Exonukleasen stabilisiert waren, wiesen die Autoren in Referenz (4) darauf hin, dass jede Phosphoramidat-Bindung einen Verlust von 1,5° C im gemessenen Tm-Wert der Phosphoramidat enthaltenden Oligonukleotide zur Folge hatte. Solche Abnahme im Tm-Wert ist ein Indikator für eine unerwünschte Abnahme der Hybridisierung zwischen dem Oligonukleotid und dessen Ziel-Strang.
  • Andere Autoren haben beschrieben, welchen Effekt eine derartige Abnahme der Hybridisierung zwischen einem Antisense-Oligonukleotid und dessen Ziel-Strang haben kann. Saison-Behmoaras, et al., EMBO Journal 1991, 10, 1111, beobachteten, dass, obwohl ein Oligonukleotid ein Substrat für RNase H sein konnte, die Spaltungseffizienz der RNase H aufgrund schwacher Hybridisierung mit der mRNA niedrig war, Die Autoren stellten außerdem fest, dass eine Akridin-Substitution am 3'-Ende des Oligonukleotids dieses vor der Exonuklease schützt. Nucleic Acids Research Vol. 9 (1991) Nr. 10, Seiten 2587–2593 beschreibt 13-mere Oligonukleotide, die (S)-9-(3, 4-die Dihydroxybutyl)-Adenin enthalten. Die WO86/05518 offenbart eine polymere Verbindung, die wirksam mit selektiver Bindungsaffinität an ein Einzelstrang-Polynukleotid bindet, welches eine Basen-Zielsequenz enthält. Insbesondere offenbart die WO86/05518 ein 19-meres Carbamat-gebundenes Oligomer in Beispiel 21.
  • Während erkannt worden ist, dass die Spaltung eines Ziel-RNA-Strangs mittels eines Antisense-Oligonukleotids und RNase H nützlich ist, sind die Nuklease-Resistenz des Oligonukleotids und Exaktheit der Hybridisierung ebenfalls von großer Bedeutung. Bisher gab es im Stand der Technik keine Vorschläge hinsichtlich Verfahren oder Materialien, die sowohl die RNase H aktivieren, als auch gleichzeitig die Hybridisierungseigenschaften erhalten oder verbessern und eine Nukleaseresistenz zur Verfügung stellen können, obwohl es einen seit langem bestehenden Bedarf an solchen Verfahren oder Materialien gegeben hat.
  • Aufgaben dieser Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, Makromoleküle zur Verfügung zu stellen, die sowohl RNase H über eine Hybridisierung mit einem Ziel-Strang aktivieren und außerdem gegen den Nuklease-induzierten Abbau resistent sind.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, Makromoleküle zur Verfügung zu stellen, die RNase H aktivieren, den Nuklease-induzierten Abbau zu hemmen und eine verbesserte Bindungsaffinität zwischen dem Makromoleküle und dem Zielstrang zu schaffen.
  • Es ist eine noch weitere Aufgabe, Forschungs- und Diagnostikverfahren und -materialien zur Untersuchung körperlicher Zustände in Tieren, insbesondere bei pathologischen Zuständen, zu liefern.
  • Eine andere Aufgabe ist es, therapeutische und diagnostische Verfahren und Materialien für die Behandlung von Krankheiten durch Beeinflussung der Aktivität der DNA und RNA zur Verfügung zu stellen.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung liefert Makromoleküle, die eine Vielzahl von verknüpften Einheiten besitzen, wobei jede von ihnen aus Nukleosiden und Nukleinbasen ausgewählt worden ist. Die Nukleoside sind aus α-Nukleosiden, β-Nukleosiden, 4'-Thionukleosiden, und carbozyklischen Nukleosiden; und die Nukleinbasen aus Purin-9-yl und Pyrimidin-1-yl heterozyklischen Basen ausgewählt worden. Die Nukleoside und Nukleinbasen der erwähnten Einheiten sind durch Bindungen in einer Sequenz miteinander verbunden, wobei die Sequenz zu einer komplementären Nukleinsäure hybridisierbar ist. Die Sequenz der verknüpften Einheiten ist in mindestens zwei Bereiche unterteilt. Die Bindungen sind aus geladenem Phosphor, neutralem Phosphor oder nicht-phosphorischen Bindungen ausgewählt worden. Ein erster der Bereiche umfasst α-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 3'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, α-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 2'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, α-Nukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind, 4'-Thionukleoside, die durch geladene und neutrale 3'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, 4'-Thionukleoside, die durch geladene und neutrale 2'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, 4'-Thionukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind, carbozyklische Nukleoside, die durch geladene und neutrale Phosphor-Bindungen gebunden sind, carbozyklische Nukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind, β-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 3'-5'-Bindungen gebunden sind, β-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 2'-5'-Bindungen gebunden sind, und β-Nukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind. Ein zweiter der Bereiche umfasst Nukleinbasen, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind und Nukleinbasen, die an Phosphat-Bindungen über eine Nichtzucker bindende Einheit gebunden sind.
  • Bevorzugte Nukleinbasen der Erfindung umfassen Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkyladenine, 2-Propyl- und andere Alkyladenine, 5-Halouracil, 5-Halocytosin, 6-Azauracil, 6-Azacytosin und 6-Azathymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Haloadenin, 8-Aminoadenin, 8-Thioadenin, 8-Thioalkyladenine, 8-Hydroxyladenin und andere 8-substituierte Adenine und 8-Haloguanine, 8-Aminoguanin, 8-Thioguanin, 8-Thioalkylguanine, 8-Hydroxylguanin und andere 8-Substituierte Guanine, andere Aza- und Deazauracile, andere Aza- und Deazathymidine, andere Aza- und Deazacytosine, Aza- und Deazaadenine, Aza- und Deazaguanine, oder 5-Trifluoromethyluracil und 5-Trifluorocytosin.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Diese Erfindung ist besser im Zusammenhang mit den Zeichnungen verständlich, wobei:
  • 1 eine Dosis-Antwort-Aktivität von Oligonukleotiden der Erfindung und einer Referenzverbindung als Grafik zeigt; und
  • 2 eine Dosis-Antwort-Aktivität von Oligonukleotiden der Erfindung und Referenzverbindungen als Säulendiagramm zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In Übereinstimmung mit den Aufgaben dieser Erfindung werden neuartige Makromoleküle zur Verfügung gestellt, die zum einen eine erhöhte Nukleaseresistenz haben, eine erhöhte Bindungsaffinität an Komplementärsträngen und die Substrate für RNase H sind. Die Makromoleküle der Erfindung sind aus einer Vielzahl von Nukleotiden, Nukleosiden oder Nukleinbasenuntereinheiten aufgebaut. Jedes Makromolekül der Erfindung umfasst mindestens ein Nukleotid, ein Nukleosid, oder eine Nukleinbaseneinheit, welche/s zur Erhöhung der Nukleaseresistenz der Oligonukleotide funktionalisiert worden ist. Weiterhin tragen in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung mindestens einige der Nukleotid- oder Nukleosideinheiten eine Substituentengruppe, die die Bindungsaffinität des Makromoleküls zu einem Komplementärstrang von Nukleinsäure erhöht. Zusätzlich enthalten mindestens einige der Nukleotideinheiten eine 2'-Desoxy-Pentofuranosyl-Gruppe als deren Zuckergruppe.
  • In Verbindung mit den oben genannten Richtlinien, kann jede Nukleotideinheit, alternativ auch als Untereinheit bezeichnet, eine „natürliche" oder ein „synthetische" Einheit sein. Daher bezieht sich der Begriff „Oligonukleotid" im Zusammenhang mit dieser Erfindung in erster Linie auf ein Polynukleotid, bestehend aus einer Vielzahl von miteinander verknüpften Nukleotideinheiten. Die Nukleotide sind miteinander durch native Internukleoside, Phosphodiesterbindungen verknüpft. Die Nukleotideinheiten sind aus natürlich vorkommenden Basen und Pentofuranosyl-Zuckergruppen zusammengesetzt. Der Begriff „Oligonukleotid" beinhaltet daher gewissermaßen natürlich vorkommende Formen oder synthetische Formen, die aus natürlich vorkommenden Nukleotideinheiten aufgebaut sind.
  • Die Erfindung kann außerdem modifizierte Untereinheiten beinhalten. Die Modifizierung kann an dem Basenteil eines Nukleotids, an dem Zuckerteil eines Nukleotids oder an der Bindung, die ein Nukleotid mit dem anderen verknüpft, vorkommen. Zusätzlich können Nukleosideinheiten durch Verbindungsgruppen verknüpft sein, welche die Internukleosid-Phosphatbindungen ersetzen. Makromoleküle dieser Sorte sind als Oligonukleoside identifiziert worden. In solchen Oligonukleosiden umfassen die Bindungen sowohl eine -O-CH2-CH2-O-Bindung (d.h. eine Ethylenglykol-Bindung) als auch andere neuartige Bindungen, die in den folgenden US-Patentanmeldungen offenbart sind: Seriennummer 566,836, angemeldet am 13. August 1990, betitelt mit „Neuartige Nukleosid-Analoga"; Seriennummer 703,619, angemeldet am 21. Mai 1991, betitelt mit „Hauptstruktur modifizierte Oligonukleotid-Analoga"; und Seriennummer 903,160, angemeldet am 24. Juni 1992, betitelt mit „Heteroatomische Oligonukleotid-Bindung". Andere Modifikationen können am Zucker, an der Base, oder an der Phosphat-Gruppe des Nukleotids durchgeführt worden sein. Beispielhafte Modifikationen sind in den folgenden US-Patentanmeldungen offenbart: Seriennummer 463,358, angemeldet am 11. Januar 1990, betitelt mit „Zusammensetzung und Verfahren zum Nachweis und Beeinflussung von RNA-Aktivität"; Seriennummer 566,977, angemeldet am 13. August 1990, betitelt mit „Zucker-modifizierte Oligonukleotide, welche Gen-Expression nachweisen und beeinflussen"; Seriennummer 558,663, angemeldet am 27. Juli 1990, betitelt mit „ Neuartige Polyaminkonjugierte Oligonukleotide", Seriennummer 558,806, angemeldet am 27. Juli 1991, betitelt mit „Nukleaseresistente pyrimidinmodifizierte Oligonukleotide, welche Gen-Expression nachweisen und beeinflussen"; und Seriennummer PCT/US91/00243, angemeldet am 11. Januar 1991, betitelt mit „Zusammensetzung und Verfahren für Nachweis und Beeinflussung von RNA-Aktivität", alle wurden übertragen auf den Rechtsnachfolger dieser Erfindung. Die Offenbarung jeder dieser o.g. Patentanmeldungen ist hierbei im Literaturverzeichnis aufgeführt.
  • Somit wird bei den Makromoleküle beabsichtigt, dass diese natürlich vorkommende Strukturen, eben so wie nicht-natürlich vorkommende oder „modifizierte" Strukturen – inklusive modifizierter Zuckergruppen, modifizierter Basengruppen oder modifizierter Zucker-Verbindungsgruppen –, die sich ähnlich wie natürliche Basen, natürliche Zucker und natürliche Phosphodiester-Bindungen verhalten, umfassen. Folglich können Makromoleküle modifizierte Basengruppen, modifizierte Zuckergruppen oder modifizierte Inter-Zucker-Bindungen besitzen. Beispielhaft unter ihnen sind Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Methyl-Phosphonat, Phosphotiester, Phosphoramidat, Phosphoroselenat und Phosphorodiselenat Inter-Nukleosid-Bindungen, die an Stelle von Phosphodiester Inter-Nukleosid-Bindungen verwendet werden; Deaza- oder Azapurine und -pyrimidine, die an Stelle vom natürlichen Purin- und Pyrimidinbasen verwendet werden; Pyrimidinbasen, welche Substituentengruppen an der 5. oder 6. Position besitzen; Purinbasen, welche geänderte oder ausgetauschte Substituentengruppen an der 2., 6. oder B. Positionen besitzen; oder Zucker, welche Substituentenguppen an ihrer 2'-Position, Substitutionen für ein oder mehr Wasserstoffatome des Zuckers, oder carbozyklische oder azyklische Zucker-Analoga besitzen. Sie können auch andere mit dem Zweck dieser Erfindung konsistente Modifizierungen aufweisen. Solche Makromoleküle werden am besten so beschrieben, dass sie durch natürliche Oligonukleotide (oder naturgetreu synthetisch hergestellte Oligonukleotide) funktionell austauschbar sind, aber einen oder mehrere Unterschiede zur natürlichen Struktur aufweisen. Durch diese Erfindung werden alle solchen Oligonukleotide soweit umfasst, als sie in wirksamer Weise in die Struktur eines gewünschten RNA- oder DNA-Stranges imitieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Nukleaseresistenz durch Verwendung von Phosphorothioat-Internukleosid-Bindungen erzielt. Im Gegensatz zu den Berichten von Walder et al. wie oben erwähnt, habe ich herausgefunden, dass in Systemen, wie fetalem Kälberserum, das eine Auswahl an 3'-Exonukleasen enthält, eine Modifikation der Internukleosid-Bindung von einer Phosphodiester-Bindung zu einer Phosphorothioat-Bindung zur Nukleaseresistenz führt.
  • Brill. et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 3972, berichtete kürzlich, dass auch Phosphorodithioat-Oligonukleotide Nukleaseresistenz zeigen. Diese Autoren berichteten außerdem, dass Phosphorodithioat-Oligonukleotide an komplementäre Desoxyoligonkleotiden binden, RNase H stimulieren und die Bindung des lac- und cro-Repressors stimulieren. Im Hinblick auf diese Eigenschaften können Phosphorodithioate-Bindungen auch zur Erhöhung der Nukleaseresistenz von Oligonukleotiden dieser Erfindung verwendbar sein.
  • Die Nukleaseresistenz kann ferner durch Platzierung einer Gruppe am 3'-Terminus des Oligonukleotids unter Verwendung der Verfahren von Saison-Behmoraras, et al., wie oben genannt, erreichbar sein, wobei eine Dodecanol-Gruppe an den 3'-Terminus des Oligonukleotids gebunden ist. Andere geeignete Gruppen zur Erzielung einer erhöhten Nukleaseresistenz können Steroidmoleküle und andere Lipide, Reportermoleküle, Konjugate und nicht-aromatische lipophile Moleküle einschließlich alizyklischer Kohlenhydrate, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, Wachse, Terpene und polyalizyklische Kohlenhydrate einschließlich Adamantane und Buckminsterfullerene einschließen. Besonders nützlich als Steroidmoleküle sind zu diesem Zweck die Gallensäuren, einschließlich Cholsäure, Desoxycholsäure und Dehydrocholsäure. Andere Steroide schließen Kortison, Digoxigenin, Testosteron und Cholesterin und sogar kationische Steroide wie Kortison, welches eine Trimethylaminomethyl-Hydrazid-Gruppe über eine Doppelbindung an der 3. Position des Kortisonringes besitzt, ein. Besonders nützliche Reportermoleküle sind Biotin und Fluorescein-Farbstoffe. Solche Gruppen können entweder direkt an der 2'-Hydroxyl-Gruppe oder 3'-Hydroxyl-Gruppe des 3'-terminalen Nukleotids gebunden sein oder unter Verwendung eines geeigneten Verbindungsgliedes, wie dieses beschrieben ist in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 782,374, angemeldet am 24. Oktober 1991, betitelt mit „Derivatized Oligonucleotides Having Improved Uptake and Other Properties", übertragen auf den Rechtsnachfolger dieser Anmeldung, wobei der gesamte Inhalt davon hier aufgenommen wurde.
  • Die Bindung funktioneller Gruppen an den 5'-Terminus von Verbindungen der Erfindung kann ebenfalls zur Nukleaseresistenz beitragen. Solche Gruppen schließen Akridingruppen (welche auch als Interkalator dienen) oder andere Gruppen, die vorteilhafte pharmakokinetische oder pharmakodynamische Eigenschaften aufweisen, ein. Gruppen, die im Zusammenhang mit dieser Erfindung pharmakodynamische Eigenschaften besitzen, schließen Gruppen ein, die die Oligonukleotidaufnahme verbessern, die Oligonukleotidresistenz gegen Abbau erhöhen, und/oder die Sequenz-spezifische Hybridisierung mit RNA verstärken. Gruppen, die im Zusammenhang mit dieser Erfindung pharmakokinetische Eigenschaften besitzen, schließen Gruppen ein, die die Aufnahme, Verteilung, den Stoffwechsel oder die Ausscheidung von Oligonukleotiden verbessern.
  • Weiterhin ist Nukleaseresistenz bei Verwendung von Bindungen, wie die oben beschriebene -O-CH2-CH2-O-Bindung, und ähnlichen Bindungen zu erwarten, wie in den oben genannten US-Patent-Anmeldungen mit der Seriennummer 566,836, Seriennummer 703,619, und Seriennummer 903,160 beschrieben ist, da diese Arten von Bindungen die natürlichen Phosphat-Ester-enthaltenden Gerüste nicht verwenden, die die natürlichen Substrate für Nukleasen sind. Wenn die Nukleaseresistenz durch ein Oligonukleotid dieser Erfindung durch Verwendung eines Phosphorothioates oder anderer Nuklease-resistenten Internukleotid-Bindungen erreicht wird, werden sich solche Bindungen an jeder Internukleotidstelle befinden. In anderen Ausführungsformen, werden weniger als alle der Internukleotid-Bindungen zu Phosphorothioat oder anderen Internukleotiden-Bindungen modifiziert.
  • Ich fand heraus, dass die Bindungsaffinität durch Platzierung der Substituentengruppen an Nukleotidenuntereinheiten der Oligonukleotide dieser Erfindung erhöht werden kann. Bevorzugte Substituentengruppen sind 2'-Substituentengruppen, d.h., Substituentengruppen, die an der 2'-Position vom Zuckerteil der Nukleotidenuntereinheiten der Oligonukleotide dieser Erfindung platziert sind. Derzeit bevorzugte Substituentengruppen umfassen – werden jedoch nicht dadurch limitiert – die 2'-Fluoro, 2'-Alkoxy, 2'-Aminoalkoxy, 2'-Allyloxy, 2'-Imidazol-Alkoxy und 2'-Poly(ethylenoxid) Gruppen. Alkoxy- und Aminoalkoxy Gruppen umfassen im Allgemeinen niedere Alkylgruppen, insbesondere C1-C9-Alkyl. Poly(ethylenglykole) haben die Struktur (O-CH2-CH2)n-O-Alkyl. Besonders bevorzugte Substituentengruppen sind 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy-, 2'-Ethoxy-, 2'-Propoxy-, 2'-Aminopropoxy-, 2'-Imidazolpropoxy-, 2'-Imidazolbutoxy- und 2'-Allyloxy-Gruppen.
  • Die Bindungsaffinität kann ebenfalls durch Verwendung bestimmter modifizierter Basen in den Nukleotideinheiten erhöht werden, die die Oligonukleotide dieser Erfindung ausmachen. Solche modifizierte Basen können 6-Azapyrimidine und N-2, N-6 und O-6 substituierte Purine einschließlich 2-Aminopropyladenin beinhalten. Bei anderen modifizierten Pyrimidin- und Purin-Basen wird erwartet, dass sie die Bindungsaffinität von den Oligonukleotiden zu einem Komplementärstrang aus Nukleinsäuren erhöhen.
  • Die Verwendung von 2'-Substituentengruppen erhöht die Bindungsaffinität der substituierten Oligonukleotide dieser Erfindung. In einer veröffentlichten Sudie, Kawasaki und Cook, et al., Synthesis and Biophysical Studies of 2'-dRIBO-F Modified Oligonukleotides, Conference On Nucleic Acid Therapeutics, Clearwater, FL, 13. Januar 1991, berichtete der Erfinder, dass sich die Bindungsaffinität um 1,5°C pro substituierter Nukleotideinheit des Oligonukleotides erhöht. Dies ist mit einem unsubstituierten Oligonukleotid, einem 15-mer Phosphodiester-Oligonukleotid, das 2'-Desoxy-2'-Fluoro-Gruppen als Substitutionsgruppe an fünf der Nukleotide des Oligonukleotids besitzt, verglichen worden. Wenn 11 der Nukleotide des Oligonukleotids solche 2'-Desoxy-2'-Fluoro-Substitutionsgruppen tragen, erhöht sich die Bindungsaffinität um 1,8°C pro substituierte Nukleotideinheit.
  • In derselben Studie war das 15-mer Phosphodiester-Oligonukleotid zu dem entsprechenden Phosphorothioat-Analogon derivatisiert. War das 15-mer Phosphodiester-Oligonukleotid mit seinem Phosphorothioat-Analogon verglichen worden, so besaß das Phosphorothioat-Analogon eine Bindungsaffinität von nur etwa 66% des 15-mer Phosphodiester-Oligonukleotids. Anders ausgedrückt, ging die Bindungsaffinität durch die Derivatisierung des Oligonukleotids zu seinem Phosphorothioat-Analogon verloren. Wenn jedoch 2'-Desoxy-2'-Fluoro-Substituenten an 11 der Nukleotide des 15-mer Phosphodiester-Oligonukleotids lokalisiert waren, übertraf die Bindungsaffinität der 2'-Substituentengruppen die erwähnte Abnahme durch die Derivatisierung des 15-mer Oligonukleotids zu seinem Phosphorothioat-Analogon. In dieser Verbindung, d.h. einem 15-mer Phosphorothioat-Oligonukleotid mit 11 Nukleotiden, die mit 2'-Fluoro-Gruppen substituiert sind, war die Bindungsaffinität um 2,5°C pro Substituentengruppe erhöht. In dieser Studie war kein Versuch unternommen worden, um eine passende, aufeinander folgende Sequenz von Nukleotiden einzuführen, die 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Zucker besitzt, welche eine RNase H-Enzym-Spaltung einer Ziel-RNA, welche komplementär zu dem Oligonukleotid dieser Studie war, bewirken würden.
  • Um eine RNase H-Enzym-Spaltung einer Ziel-RNA zu bewirken, muss das erfindungsgemäße Makromolekül ein Segment oder eine Subsequenz umfassen, das ein DNA-Typ-Segment ist. Anders ausgedrückt, müssen mindestens einige der Nukleotid-Untereinheiten 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Zuckergruppen besitzen. Ich fand heraus, dass eine Subsequenz, welche mehr als drei aufeinander folgende, verknüpfte 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-haltige Nukleotid-Untereinheiten aufweist, wahrscheinlich notwendig ist, um eine RNase H-Aktivität über eine Hybridisierung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids mit einer Ziel-RNA auszulösen. Derzeit wird eine Subsequenz von 5 oder mehr aufeinander laufenden 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-haltigen Nukleotid-Untereinheiten in einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid bevorzugt. Die Verwendung von mindestens 7 aufeinander folgenden 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-haltigen Nukleotid-Untereinheiten wird besonders bevorzugt.
  • Der Mechanismus der Wirkung von RNase H ist die Erkennung von einem DNA-RNA-Duplex, gefolgt von der Spaltung des RNA-Strangs dieses Duplex. Wie im Abschnitt „Hintergrund" oben erwähnt, haben Andere nach dem Stand der Technik modifizierte DNA-Stränge verwendet, um ihnen eine Nukleasestabilität zu verleihen. Um dies zu tun, verwendeten sie modifizierte Phosphat-Bindungen, welche eine erhöhte Nukleasestabilität vermitteln, jedoch losgelöst von den Hybridisierungseigenschaften. Obwohl ich es vermeiden möchte, an eine Theorie gebunden zu sein, habe ich bestimmte Nukleoside oder Nukleosid-Analoga identifiziert, die einem Oligonukleotid, einem Oligonukleosid oder einem anderen Makromolekül Nukleasestabilität verleihen, und unter bestimmten Umständen auch die Bindung zu einem Komplementärstrang erhöhen. Diese umfassen α-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 3'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, α-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 2'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, α-Nukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind, 4'-Thionukleoside, die durch geladene und neutrale 3'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, 4'-Thionukleoside, die durch geladene und neutrale 2'-5'-Phosphor-Bindungen gebunden sind, 4'-Thionukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind, carbozyklische Nukleoside, die durch geladene und neutrale Phosphor-Bindungen gebunden sind, carbozyklische Nukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind, β-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 3'-5'-Bindungen gebunden sind, β-Nukleoside, die durch geladene und neutrale 2'-5'-Bindungen gebunden sind, und β-Nukleoside, die durch nicht-phosphorische Bindungen gebunden sind. Sie umfassen weiterhin Nukleinbasen, die mit Phosphat-Bindungen über Nichtzucker bindende Gruppen oder an Nicht-Phosphat-Bindungen verknüpft sind.
  • Nochmals gesagt, obwohl ich es vermeiden möchte, an eine Theorie gebunden zu sein, fand ich bestimmte Kriterien, die für RNase H erfüllt sein müssen, um den RNA- Strang zu erkennen und eine Spaltung auszulösen. Das erste Kriterium ist, dass der RNA-Strang an der Spaltungsseite seine Nukleotide über eine negativ geladene Phosphat-Bindung gebunden haben muss. Zusätzlich muss der Zucker der Nukleoside an der Spaltungsseite ein β-Pentofuranosyl-Zucker sein und außerdem in einer 2'-endo Konformation sein. Die einzigen Nukleoside (Nukleotide), die diese Kriterien erfüllen, sind Phosphodiester, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoroselenat und Phosphorodiselenat Nukleotide von 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl β-Nukleosiden.
  • Im Hinblick auf die obigen Kriterien, lösen selbst bestimmte Nukleoside, von denen nachgewiesen worden ist, dass sie in einer 2'-endo-Konformation (z.B. Zyklopentyl-Nukleoside) vorliegen, keine RNase H-Aktivität aus, da sie keinen Pentofuranosyl-Zucker haben. Modelle haben gezeigt, dass auch das Oligonukleotid 4'-Thionukleosid die RNase H-Aktivität nicht auslösen kann, da solche Nukleoside zwar in einer Briefumschlag-Konformation, nicht jedoch in einer 2'-endo-Konformation vorliegen. Hinzu kommt, dass, da die α-Nukleoside die entgegengesetzte Konfiguration der β-Pentofuranosyl-Zucker haben, sie auch keine RNase H-Aktivität auslösen können.
  • Die Nukleinbasen, die mit Phosphat-Bindungen über Nichtzucker bindende Gruppen oder über Nicht-Phosphat-Bindungen verknüpft sind, erfüllen ebenfalls die Kriterien eines β-Pentofuranosyl-Zuckers in einer 2'-endo-Konformation nicht. Folglich lösen sie wahrscheinlich eine RNase H-Aktivität aus.
  • Wie hier benutzt, umfassen α- und β-Nukleoside Ribifuranosyl-, Desoxyribofuranosyl- (2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-) und Arabinofuranosyl-Nukleoside. 4'-Thionukleoside sind Nukleoside, wobei das 4'-Ring-Sauerstoffatom des Pentofuranosyl-Ringes durch ein Schwefelatom substituiert ist. Carbozyklische Nukleoside sind Nukleoside, bei denen das Ring-Sauerstoffatom durch einen Kohlenstoffatom substituiert ist. Carbozyklische Nukleoside umfassen Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- und Cyclohexyl-Ringe (C3-C6-Carbozyklisch), an die eine passende Nukleinbase gebunden ist. Die oben genannten α- und β-Nukleoside, 4'-Thionukleoside und carbozyklischen Nukleoside können zusätzliche funktionelle Gruppen an ihrer heterozyklischen Baseneinheit und zusätzliche funktionelle Gruppen an jenen Kohlenstoffatomen des Zuckers oder der carbozyklischen Gruppen besitzen, die durch die Bindung des Nukleosids mit dem erfindungsgemäßen Makromolekül nicht besetzt sind. Zum Beispiel können Substituentengruppen an der 1-, 2-, 3-, 6-, 7- oder 8-Position der Purin-Heterozyklen, oder auf der 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-Position der Pyrimidin-Heterozyklen lokalisiert sein. Deaza- und Aza-Analoge der Purin- und Pyrimidin-Heterozyklen oder 2'-substituierte Zucker-Derivate können ausgewählt werden. Alle diese Substitutionstypen sind nach dem Stand der Nukleosid-Technik bekannt.
  • α-Nukleoside sind in Oligonukleoside eingefügt worden, wie von Gagnor et al., in „Nucleic Acids Research" 1987, 15, 10419 berichtet; sie unterstützen den RNase H-Abbau nicht. Carbozyklisch modifizierte Oligonukleotide wurden von einer Anzahl von Forschern hergestellt, wie von Perbost, et al., „Biochemical and Biophysical Research Communications" 1989, 165, 742; Sagi, et al., „Nucleic Acids Research" 1990, 18, 2133; and Szemzo, et al., „Tetrahedron Letters" 1990, 31, 1463. Die 4'-Thionukleoside sind schon seit mindestens 25 Jahren bekannt. Eine verbesserte Herstellung über 4'-Thioribofuranose ist kürzlich bekannt geworden durch Secrist, et al., Tenth International Roundtable: „Nukleosides, Nukleotides and Their Biological Evaluation" September 16–20, 1992, Abstracts of Papers, Abstract 21 und im veröffenflichten Patentantrag PCT/US91/02732.
  • Um α- und β-Nukleoside, 4'-Thionukleoside und carbozyklische Nukleoside in die Oligonukleotide oder Oligonukleotid-Surrogate einzufügen, müssen sie der 5'-Position (oder bei carbozyklischen Nukleosiden an dem Äquivalent zur 5'-Position) durch eine Dimethoxytrityl-Gruppe blockiert sein, gefolgt von einer Phosphitylierung an der 3'-Position, gemäß den in „Oligonukleotides and Analogs, A Practical Approach"; Eckstein, F., Ed.; „The Practical Approach Series", IRL Press, New York, 1991 genannten Tritylierungs- und Phosphitylierungsverfahren. Dieser Einbau in die Oligonukleotide kann durch Gebrauch eines DNA-Synthesizers erfolgen, wie ein ABI 380 B-Model-Synthesizer unter Verwendung geeigneter Chemie zur Bildung von Phosphodiester, Phosphorothioat, Phosphorodithioat oder Methylphosphonaten, wie in den Syntheseprotokollen bei Eckstein (in der Arbeit zitiert) beschrieben.
  • Die Boranophosphat gebundenen Oligonukleotide sind nach dem Verfahren hergestellt, wie in der veröffentlichten Patentanmeldung PCT/US/06949 beschrieben. Die an Phosphoroselenate und Phosphorodiselenate gebundenen Oligonukleotide werden analog zu ihren Schwefel-Entsprechungen durch Verwendung des Reagenz 3H-1,2-Benzothia-Seleno-3-Ol zur Einführung der Selen-Gruppe hergestellt. Dieses Reagenz ist auch zur Herstellung von Selenothio-Phosphaten aus entsprechendem H-Phosphorothiat-Diester verwendbar, wie von Stawinski, et al. Tenth Infernational Roundtable: "Nukleosides, Nukleotides and Their Biological Evaluation"; September 16–20, 1992, Abstracts of Papers, Abstract 80, berichtet. Hydrogen-Phosphonat gebundene Oligonukleotide – sowie Alkyl- und Aryl-Phosphonat, Alkyl- und Aryl-Phosphotriester und Alkyl- und Aryl-Phosphoroamidat gebundene Oligonukleotide – werden nach der veröffentlichten Patentanmeldung PTC/US88/03842 hergestellt. Dieser Patentanmeldung erörtert außerdem die Herstellung von an Phosphorothioate und Phosphoroselenate gebundene Oligonukleotide.
  • Nicht-Phosphat-Gerüste umfassen Carbonat-, Carbamat-, Silyl-, Sulfid-, Sulfon-, Sulfoxid-, Sulfonat-, Sulfonamid-, Formacetal-, Thioformacetal-, Oxime-, Hydroxylamin-, Hydrazin-, Hydrazid-, Disulfid-, Amid-, Harnstoff- und Peptid-Bindungen. Oligonukleoside, deren Nukleoside über Carbonat-Bindungen verknüpft sind, werden wie von z. B. Merles, et al., J. Med. Chem. 1969, 12, 154 und wie später von anderen beschrieben, hergestellt. Oligonukleoside, deren Nukleoside über Carbamat-Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt, wie zuerst von Gait, et al., J. Chem. Soc. Perkin 1 1974, 1684 und wie später von anderen beschrieben. Oligonukleoside, deren Nukleoside über Silyl-Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt, wie von Ogilvie, et al., Tetrahedron Leiters 1985, 26, 4159 and Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583 beschrieben. Oligonukleoside, deren Nukleoside über Sulfid-Bindungen und die assoziierten Sulfoxid- und Sulfon-Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt, wie von Schneider, et al., Tetrahedron Letters 1990, 31, 335 und in anderen Veröffentlichungen wie in der veröffentlichten Patentanmeldung PCT/US89/02323 beschrieben.
  • Oligonukleoside, deren Nukleoside über Sulfonat-Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt, wie von Musicki, et al., Org. Chem. 1991, 55, 4231 und Tetrahedron Letters 1991, 32, 2385 beschrieben. Oligonukleoside, deren Nukleoside über Sulfonamid-Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt wie von Kirshenbaum, et al., The 5th San Diego Conference: Nucleic Acids: New Frontiers, Poster abstract 28, November 14–16, 1990. Oligonukleoside, deren Nukleoside über Formacetale verknüpft sind, werden hergestellt wie von Matteucci, Tetrahedron Letters 1990, 31, 2385 und Veeneman, et al., Recueil des Trav. Chim. 1990, 109, 449 sowie im Verfahren der veröffentlichten Patentanmeldung PCT/US90/06110 beschrieben.
  • Oligonukleoside, deren Nukleoside über Thioformacetale verknüpft sind, werden hergestellt wie von Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7767; Matteucci, Nucleosides & Nucleotides 1991, 10, 231, and in der oben genannten Patentanmeldung PCT/US90/06110 beschrieben.
  • Oligonukleoside, deren Nukleoside über Oxim-, Hydroxylamin-, Hydrazin- und Amid-Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 703,619 angemeldet am 21. Mai 1991 und in der zugehörigen PCT Anmeldung PTC/US92/04292 und PTC/US92/04305 offenbart sind, sowie durch entsprechende durch mich selbst und Koautoren veröffentlichte Verfahren in Vasseur, et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4006 und Debart, et al., Tetrahedron Letters 1992, 33, 2645. Oligonukleoside, deren Nukleoside durch Morpholin-Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt, wie im US-Patent mit der Nummer 5,034,506 beschrieben.
  • Weiterhin umfassen die Nicht-Phosphat-Bindungen, welche für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, Bindungen, die zwei benachbarte Heteroatome in der Kombination mit einer oder zwei Methylen-Gruppen besitzen. Oligonukleoside, deren Nukleoside über solche Bindungen verknüpft sind, werden hergestellt, wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 903,160, angemeldet am 24. Juni 1992, offenbart, wobei der gesamte Inhalt davon hier aufgenommen wurde.
  • Struktureinheiten, welche Nukleinbasen besitzen, die über Nicht-Phosphat-Bindungen verknüpft sind, wobei die Nicht-Phosphat-Bindungen Peptid-Bindungen sind, werden nach dem Verfahren des Patentantrags PCT/EP/01219 hergestellt. Für den Gebrauch bei der Herstellung solcher struktureller Einheiten werden geeignete Nukleinbasen verwendet, die Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkyl-Derivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alkyl-Derivate von Adenin und Guanin, 5-Halouracil und Cytosin, 6-Azouracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo-, Amino, Thiol, Thiolalkyl, Hydroxyl und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluoromethyl und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und andere Nukleinbasen, die im US-Patent mit der Nummer 3,687,808 offenbart wurden, einschließen.
  • Peptid-Bindungen umfassen 5, 6 und 7 atomlange Gerüste, verbunden durch Amid-Verknüpfungen. Andere ähnliche Nicht-Phosphat-Gerüste, welche über Ester-, Amid- und Hydrazid-Bindungen verfügen, sind nach den veröffentlichten Patentanmeldungen PCT/US86/00544 und PCT/US86/00545 hergestellt.
  • Andere α- und β-Nukleoside, 4'-Thionukleosid und carbozyklische Nukleoside, die über für die Nukleinbasen oben genannte heterozyklische Basen verfügen, können hergestellt und in die jeweiligen α- und β-Nukleoside, 4'-Thionukleosid und carbozyklischen Nukleosiden eingebaut werden.
  • Nichtzucker verknüpfte Gruppen umfassen 3,4-Dihydroxybutyl (siehe Augustyns, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 2587) und Dihydroxyproproxymethyl (siehe Schneider, et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 453) und andere lineare Ketten wie C1-C10 Alkyl, Alkenyl und Alkynyl. Da die 3,4-Dihydroxybutyl und Dihydroxyproproxymethyl Nichtzucker verknüpften Gruppen die azyklischen Fragmente eines β-Pentofuranosyl-Zuckers sind, können sie zum Auslösen von RNase H-Aktivität nicht dienen. Als eine Nichtzucker verknüpfte Gruppe ist die 3,4-Dihydroxybutyl-Gruppe vorzuziehen, da sich bei der Verwendung vom Dihydroxyproproxymethyl in einem Oligonukleotid-Analogon via Hybridisierung eine Senkung der Schmelztemperatur zwischen ihm und einem komplementären Nukleinstrang zeigte.
  • Normale 3'-5'-Phosphodiester-Bindungen von natürlichen Nukleinsäuren besitzen 3 Heteroatome (-O-P-O-) zwischen den entsprechenden Zuckern der benachbarten Nukleoside. Wenn die 5'-Methylen-Gruppe (die 5'-CH2-Gruppe des 3'-Nukleosids der benachbarten Nukleoside) auch eingeschlossen ist, können diese Phosphodiestergebundenen Nukleinsäuren als über vier Atome lange Bindungen verknüpft betrachtet werden.
  • Zwei β-Oligonukleotid-Stränge werden miteinander mit einer antiparallelen Polarität hybridisieren, während ein α-Oligonukleotid-Strang mit einem β-Oligonukleotid-Strang mit einer parallelen Polarität hybridisiert wird. In bestimmten Ausführungsformen besitzen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide eine Region, die von α-Nukleotiden gebildet und eine weitere Region, die von β-Nukleotiden gebildet wird. Diese zwei Regionen sind miteinander über eine bereichsübergreifende Bindung verbunden. Damit solch ein Oligonukleotid an einen entsprechenden komplementären β-Strang einer Nukleinsäure bindet und die parallele Polarität der α-Region und gleichzeitig die antiparallele Polarität der β- Region aufrechterhält, muss entweder eine 3'-3'-Verbindung oder eine 5'-5'-Verbindung zwischen den α- und β-Regionen des erfindungsgemäßen Oligonukleotids zustande kommen. Die 3'-3'-Verbindung (besitzt keine 5'-Methylen-Gruppe) liefert eine 3 Atome lange Bindung, während die 5'-5'-Verbindung (besitzt zwei 5'-Methylen-Gruppen) eine 5 Atome große Bindung liefert.
  • Für Ausführungsformen dieser Erfindung, bei denen eine 4 Atome große Bindung zwischen den benachbarten α- und β-Regionen gewünscht wird, liefert die Verwendung eines symmetrischen Verbindungsnukleosids oder Nukleosid-Surrogats eine 4 Atome große Bindung zwischen jedem benachbarten Nukleosid-Paar. Ein Beispiel für ein solches symmetrisches Verbindungsnukleosid-Surrogat ist ein 3,3-Bis-Hydroxymethyl-Cyclobutyl-Nukleosid, wie in meiner US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 808, 201, angemeldet am 13. Dezember 1991, betitelt mit „Cyclobutyl Oligonucleotide Surrogates" offenbart ist, wobei der gesamte Inhalt davon hier aufgenommen wurde.
  • Andere geeignete Bindungen um einen 4 Atome langen Abstand zu erzielen umfassen alizyklische Verbindungen der Klasse 1-Hydroxyl-2-Hydroxyl-Methyl-Alk-ω-yl-Typ Gruppen, wobei eine Nukleinbase mit der ω (Omega- oder letzten) Position verbunden ist. Beispiele dieser Bindungstypen sind 9-(1-Hydroxyl-2-Methylhydroxyl-Pent-5-yl)Adenin, 9-(1- Hydroxyl-2-Methylhydroxyl-Pent-5-yl)Guanin, 1-(1-Hydroxyl-2-Methylhydroxyl-Pent-5-yl)Uridin, 1-(1-Hydroxyl-2-Methylhydroxyl-Pent-5-yl)Cytosin und die entsprechenden 3, 4 und 7 Atom-Analoga, wobei eine Propyl-, Butyl- oder Hexyl-Alkyl-Gruppe ist anstelle der Pentyl-Gruppe verwendet wird. Ein weiteres Beispiel ist ein Nukleosid, welches über einen Pentofuranosy-Zucker verfügt, der durch eine 4'-Hydroxylmethyl-Gruppe substituiert ist. In diesem Fall sind die Bindungen an das 5'-Nukleosid eine normale Bindung über die normale 5'-Hydroxylmethyl-Gruppe, wohingegen die Bindung an das 3'-Nukleosid nicht durch die normale 3'-Hydroxyl-Gruppe, sondern durch die 4'-Hydroxylmethyl-Einheit erfolgt. So wie mit dem Cyclobutyl-Nukleosid, wird sowohl mit den allzyklischen Gruppen oder den 4'-substituierten Nukleosid-Einheiten eine 4 Atome große Bindung zwischen benachbarten Regionen des erfindungsgemäßen Oligonukleotids realisiert.
  • In einer ähnlich wie oben beschriebenen Weise kann in jenen Ausführungsformen dieser Erfindung, die benachbarte Regionen eines Makromoleküls aufweisen, welches aus unterschiedlichen Typen von Gruppen gebildet wird, eine Zwischenverbindung gewünschter Länge zwischen jeder der zwei benachbarten Regionen des Makromoleküls gebildet werden. Die symmetrische Zwischenverbindung wird durch die Auswahl einer Bindungsgruppe erreicht, die eine kovalente Bindung zu den beiden unterschiedlichen Typen von Gruppen eingehen kann, die die benachbarten Regionen bilden. Die Bindungsgruppe wird so gewählt, dass die resultierende Kette von Atomen zwischen der Bindungsgruppe und den unterschiedlichen Typen von Gruppen dieselbe Länge hat.
  • Die erfindungsgemäßen Makromoleküle umfassen vorzugsweise etwa 10 bis etwa 30 Nukleotide oder Nukleinbasenuntereinheiten. Solche Oligonukleotide und Makromoleküle, die etwa 15 bis etwa 25 Untereinheiten umfassen, werden im höheren Maß bevorzugt. Als geeignet gilt eine Untereinheit als Base- und Zucker-Kombination, die in geeigneter Weise an benachbarte Untereinheiten gebunden ist, und zwar durch Phosphorothioat- oder andere Bindungen oder eine Nukleinbase und eine geeignete Bindung, die in geeigneter Weise an benachbarten Untereinheiten durch phosphorische oder nichtphosphorische Bindungen gebunden ist. Solche Begriffe werden mit dem Begriff „Einheit" austauschbar benutzt. Um wie oben beschrieben eine RNase H-Antwort auszulösen, befindet sich innerhalb der gesamten allumfassenden Sequenzlänge des Oligonukleotids oder Makromoleküls eine Subsequenz von mehr als 3 aber vorzugsweise 5 oder mehr fortlaufenden 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-haltigen Nukleotid-Untereinheiten.
  • Es wird derzeit bevorzugt, die 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-haltige Nukleotid Subsequenz in die Oligonukleotid- oder Makromolekül-Hauptsequenz so einzubauen, dass innerhalb des Oligonukleotids oder des Makromoleküls andere Nukleotid-Untereinheiten des Oligonukleotids oder des Makromoleküls an beiden Seiten der 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotid-Untereinheit lokalisiert sind.
  • Wenn in bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung der Rest der Nukleotid-Untereinheiten jeweils eine 2'-Substituentengruppe für die erhöhte Bindungsaffinität besitzen, dann ist die 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotid-Subsequenz zwischen einer ersten Subsequenz der Nukleotid-Untereinheiten mit 2'-Substituentengruppen und einer zweiten Subsequenz der Nukleotid-Untereinheiten mit 2'-Substituentengruppen lokalisiert. Andere Konstrukte sind ebenfalls möglich, einschließlich der Lokalisierung der 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotid- Subsequenz an entweder dem 3'- oder dem 5'-Terminus des erfindungsgemäßen Oligonukleotids.
  • Komponenten dieser Erfindung können in Diagnostika, Therapeutika, und Forschungsreagenzien und Kits verwendet werden. Sie können in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, durch Zugabe einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Oligonukleotid zu einem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder einer Trägersubstanz. Sie können weiterhin zur Behandlung von Organismen verwendet werden, die eine Erkrankung aufweisen, die durch Produktion eines unerwünschten Proteins charakterisiert ist. Der Organismus kann mit einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid in Berührung gebracht werden, das eine Sequenz besitzt, die im Stande ist, eine spezifische Hybridisierung mit einem Nukleinsäurestrang einzugehen, der das unerwünschte Proteins kodiert.
  • Solche therapeutische Behandlung kann bei einer Vielzahl von Organismen im Bereich von einzelligen Prokaryonten und Eukaryonten bis zu mehrzelligen eukaryotischen Organismen praktiziert werden. Jeder Organismus, der die DNA-RNA Transkription oder RNA-Protein Translation als fundamentalen Teil seiner Vererbung, metabolischen oder zellulären Regulation benutzt, ist für solche therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung empfänglich. Scheinbar unterschiedliche Organismen wie Bakterien, Hefen, Protozoen, Algen, alle Pflanzen und alle höheren tierischen Lebensformen, einschließlich warmblütiger Tiere, können durch diese Therapie behandelt werden. Da weiterhin jede der Zellen von mehrzelligen Eukaryonten sowohl DNA-RNA Transkription als auch RNA-Protein Translation als einen integralen Teil ihrer zellulären Aktivität aufweist, können solche Therapeutika und/oder Diagnostika auch bei solchen zellulären Populationen angewandt werden. Weiterhin weisen viele der Organellen, zum Beispiel Mitochondrien und Chloroplasten, von eukaryotischen Zellen ebenfalls Transkriptions- und Translations-Mechanismen auf. Als solche können einzelne Zellen, zelluläre Populationen oder Organellen ebenso in den Definition von Organismen aufgenommen werden, die mit den erfindungsgemäßen therapeutischen oder diagnostischen Oligonukleotiden behandelt werden können. Therapeutika in der hier benutzten Bedeutung schließen sowohl die Eradikation eines Krankheitszustandes, das töten eines Organismus, zum Beispiel bakteriell, protozoisch oder eine andere Infektion, oder die Kontrolle von unregelmäßigem oder gefährlichem zellulären Wachstum oder Expression ein.
  • Die Komponenten der Erfindung wurden zum Zweck der Veranschaulichung in einem Ras-Luziferase Fusionssystem unter Verwendung der Ras-Luziferase Transaktivierung verwendet. Wie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/715,196, angemeldet am 14. Juni 1991, betitelt mit „Antisense Inhibition of Ras Oncogene" und auf üblicherweise mit dieser Anmeldung übertragen, wobei der gesamte Inhalt davon hier aufgenommen wurde, beschrieben wurde, sind die Ras Onkogene Mitglieder einer Genfamilie, die verwandte Proteine kodieren, die an der inneren Oberfläche der Plasmamembran lokalisiert sind. Man hat gezeigt, dass Ras Proteine auf der Ebene der Aminosäuren hoch konservativ sind, GTP mit hoher Affinität und Spezifität binden und GTPase Aktivität besitzen. Obwohl die zelluläre Funktion der Ras Genprodukte unbekannt ist, legen ihre biochemischen Eigenschaften, zusammen mit ihrer signifikanten Sequenzhomologie mit einer Klasse von signaltransduzierenden Proteinen, die als GTP Bindungsproteine oder G Proteine bekannt sind, nahe, dass Ras Genprodukte eine fundamentale Rolle bei grundlegenden zellulären regulatorischen Funktionen, die mit der Transduktion von extrazellulären Signalen über die Plasmamembranen zusammenhängen, spielen.
  • Drei Ras-Gene, die als H-Ras, K-Ras und N-Ras bezeichnet werden, sind im Säugetiergenom identifiziert worden. Säugetier Ras-Gene besitzen transformationsinduzierende Eigenschaften durch einzelne Punktmutationen innerhalb ihrer kodierenden Sequenzen. Mutationen in natürlich vorkommenden Ras Onkogene sind an den Codons 12, 13 und 61 lokalisiert worden. Die am meisten nachgewiesene aktivierende Ras Mutation, die in menschlichen Tumoren gefunden wurde, befindet sich in Codon 12 des H-Ras Gens, bei dem ein Basenaustausch von GGC nach GTC eine Glycin-zu-Valin Substitution in der GTPase regulatorischen Domain des Ras Proteinprodukts bewirkt. Wie man glaubt, verhindert dieser einzelne Aminosäurenwechsel die normale Kontrolle der Ras Proteinfunktion, wobei ein normal reguliertes Zellprotein in eines umgewandelt wird, dass ständig aktiv ist. Wie man glaubt, ist eine solche Deregulation der normalen Ras Proteinfunktion verantwortlich für die Transformation von normalem zu bösartigem Wachstum.
  • Die folgenden Beispiele und Prozeduren veranschaulichen die vorliegende Erfindung und sollen diese nicht auf jene beschränken.
  • Beispiel 1
  • Oligonukleotid Synthese:
  • Unsubstituierte und substituierte Oligonukleotide wurden mit einem automatisierten DNA Synthesizer (Applied Biosystems Model 380B) unter Verwendung von Standard Phosphoramidat-Chemie durch Oxidation von Jod Synthetisiert. Für Phosphorothioat Oligonukleotide wurde die Standard Oxidationslösung durch eine 0,2 M Lösung aus 3H-1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-Dioxid in Acetonitril für die schrittweise Einführung des Schwefels in die Phosphit-Bindungen. Der Schwefelübertragungsschritt wurde auf 68 Sekunden verlängert und es folgte der Cappingschritt. Nach der Trennung von der CPG Säule und der Deblockierung in konzentriertem Ammoniakwasser bei 55° C (18 Stunden) wurden die Oligonukleotide durch zweimalige Präzipitation in 0,5 M Natriumchlorid-Lösung mit 2,5facher Menge Ethanol aufgereinigt. Eine analytische Gelelektrophorese wurde in 20% Acrylamid, 8 M Harnstoff, 454 mM Tris-Borat Puffer, pH 7,0 durchgeführt. Die Oligonukleotide und Phosphorothioate wurden anhand der Polyacrylamid-Gelelektrophorese beurteilt, die größer als 80% der vollen Länge waren.
  • Beispiel 2
  • Oligonukleotide mit an den zentralen β-Oligonukleotidbereich angrenzenden α-Oligonukleotidbereichen
  • A. α-β-Misch-Oligonukleotide mit nichtsymmetrischen 3'-3' und 5'-5' Bindungen
  • Für die Herstellung eines 15-mers wurde ein erster 4 Nukleotide langer Bereich eines α-Oligonukleotids nach der Methode von Gagnor et al., Nucleic Acids Research 1987, 15, 10419 oder mit einem DNA-Synthesizer unter Verwendung der allgemeinen Protokolle von Beispiel 1 hergestellt. Die Herstellung erfolgt von der 5'-Richtung nach der 3'-Richtung. Die terminalen Hydroxyl-Gruppen sind entschützt. Eine normale β-Region eines 7 Nukleotide langen DNA-Oligonukleotids wird, in 3'- nach 5'-Richtung mit freier 5'-Hydroxyl-Gruppe am Ende, zugefügt. Ein weiterer 4 Nukleotide langer Bereich eines α-Nukleotids wird in 3'- nach 5'-Richtung zugefügt.
  • Das resultierende 15-mere gemischte α-β-α-Oligonukleotid enthält eine 3 Atom 3'-3' Bindung zwischen der ersten α-Region und der β-Region und eine 5 Atom 5'-5' Bindung zwischen der zweiten A-Region und der β-Region.
  • B. α-β-Misch-Oligonukleotide mit nichtsymmetrischen 3'-3' und 5'-5' Bindungen
  • Die Prozedur von Beispiel 2-A wird mit der Ausnahme wiederholt, dass die zwischenliegende β-Region als eine Phosphorothioat-Region durch Substitution eines Schwefelübertragungsschrittes an Stelle eines normalen Oxidationsschrittes zugefügt wird. Die Schwefelübertragung wird unter Verwendung des Beaucage Reagenz durchgeführt, zum Beispiel das 3H-1,2-Benzodithiol-3-one-1,1-dioxid aus Beispiel 1.
  • C. α-β-Misch-Oligonukleotide mit symmetrischen 4 Atom Bindungen
  • Für die Präparation von einem 17-mer wurde ein erster 4 Nukleotide langer Bereich eines α-Oligonukleotids mit einem DNA-Synthesizer nach der Methode von Gagnor et al., Nucleic Acids Research 1987, 15, 10419 hergestellt. Die Herstellung erfolgt von der 5'-Richtung nach der 3'-Richtung. Die terminalen 3'-Hydroxyl-Gruppen sind entschützt. Eine einzelne Nukleosid-Surrogateinheit, 1α-Thymidyl-3β-Hydroxymethyl-3α-Methoxytrityloxymethyl-Cyclobutanamidit (hergestellt wie in der US-Patentanmeldung Seriennummer 808,201, siehe oben) wird an die terminalen 3'-Hydroxyl Gruppe der α-Oligonukleotid-Region in der normalen Art und Weise wie in Beispiel 1 kondensiert. Die Trityl-Hydroxyl-Blockier-Gruppe des Cyclobutyl-Thymidine-Nukleosid-Surrogats wird entblockt. Eine 7 Nukleotide lange Region einer Phosphorothioate 2'-Deoxy β-Nukleotid Sequenz wird mit dem Synthesizer zugegeben. Nach Komplettierung der DNA Region des Makromoleküls wird eine 1α-Thymidyl-2β-Hydroxy-3α-Methoxytrityloxycyclobutan-Einheit, die als normales Phosphoramidit an den 2 Hydroxyl-Gruppen aktiviert wurde, an dem wachsenden Makromolekülen in derselben Art und Weise kondensiert, wie die 1α-Thymidyl-2β-Hydroxy-3α-Methoxytrityloxycyclobutan-gruppe oben. Nach der Deblockierung der Trityl-Hydroxyl-Blockier-Gruppe der Nukleosid-Surrogateinheit wird eine weitere 4 Nukleotide lange Verlängerung eines α-Oligonukleotids zugefügt, um das Makromoleküls zu vervollständigen. Die Deblockierung, die Entfernung vom Hilfsmittel und die Αufreinigung des resultierenden Makromoleküls wird auf normalerweise vollzogen.
  • Beispiel 3
  • Oligonukleotide mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden 2'-substituierten Oligonukleotidbereichen
  • Ein 15-meres RNA Ziel mit der Sequenz 5'GCG TTT TTT TTT TGC G3' wurde auf herkömmliche Weise mit einem DNA Sequenzer unter Verwendung von RNA Protokollen hergestellt. Eine Serie von Phosphorothioat komplementären Oligonukleotiden mit 2'-O-substituierten Nukleotiden in Bereichen, die an die 2'-Deoxy-Region an Grenzen, wurden unter Verwendung eines 2'-O-substituierten Nukleotid-Precursors hergestellt, der nach den aus der Literatur bekannten Präparationen hergestellt wurde, zum Beispiel 2'-O-Methyl, oder nach den Herstellungsvorschriften der PCT-Anmeldung PCT/US91/05720 oder der United States Patentanmeldung 566,977 oder 91 8,362. Die 2'-O-substituierten Nukleotide werden als ihre 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-Phosphoramidite auf übliche Art mit einem DNA Synthesizer zugefügt. Oligonukleotide haben die Sequenz 5' CGC AAA AAA AAA AAA ACG C 3'. Der 2'-O-Substituent war in den CGC und CG Bereichen von diesen Oligonukleotiden lokalisiert. Die folgenden 2'-O-Substituenten wurden verwendet: 2'-Fluoro; 2'-O-Methyl; 2'-O-propyl; 2'-0-Allyl; 2'-O-Aminopropoxy; 2'-0-(Methoxyethoxyethyl), 2'-O-Imidazolebutoxy und 2'-O-Imidazolepropoxy. Zusätzlich wurde dieselbe Sequenz sowohl als Phosphodiester und als Phosphorothioat präpariert. Nach der Synthese wurden die Testsubstanzen und die Zielsubstanzen einer Schmelzanalyse unterzogen, um ihre Tm's und Nuklease-Resistenz nach den Protokollen in der oben genannten PCT-Anmeldung PCT/US91/05720 zu messen. Die Testsequenzen waren keine Substrate für die RNase H, wohingegen es die korrespondierende Zielsequenz ist. Diese Testsequenzen sind nukleasestabil und haben eine erhöhte Bindungsaffinität an das Ziel, verglichen mit dem Phosphodiester-Analogon.
  • Beispiel 4
  • Oligonukleotide mit an den zentralen 2'-Deoxy-3'-5'-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden 2'-5'-Phosphodiester-Oligonukleotidbereichen
  • Für die Präparation eines 20-meren Oligonukleotids wird ein erster Bereich von 6 RNA Nukleotiden mit 2'-5' Bindungen nach der Methode von Kierzek, et. al., Nucleic Acids Research 1992, 20, 1685 mit einem DNA Synthesizer unter Verwendung des allgemeinen Protokolls dieser Referenz hergestellt. Nach der Vervollständigung von dem 2'-5' gebundenen Bereich wird ein 2'-Deoxy-Phosphorothioat Bereich eines 8 Nukleotide langen 3'-5' gebundenen DNA Oligonukleotids zugefügt. Ein weiterer 6 Nukleotide langer Bereich von 2'-5' Bindungen, wird dann zugefügt, um das Oligonukleotid mit gemischten 2'-5' und 3'-5' Bindungen zu vervollständigen.
  • Beispiel 5
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-3'-5'-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Cyclobutyl-Surrogat-Nukleosiden, die durch Phosphodiester-Bindungen gebunden sind
  • Für die Präparation eines 20-meren Oligonukleotids wird ein erster Bereich von 6 Cyclobutyl-Surrogat-Nukleosiden, die durch Phosphodiester-Bindungen gebunden sind, gemäß dem Beispiel 38 der US-Patentanmeldung 808,201 mit einem DNA Synthesizer unter Verwendung des allgemeinen Protokolls dieser Referenz hergestellt. Nach der Vervollständigung von diesem Bereich wird ein 2'-Deoxy-Phosphorothioat Bereich eines 8 Nukleotide langen 3'-5' gebundenen DNA Oligonukleotids zugefügt. Einen weiterer Bereich aus 6 Cyclobutyl-Surrogat-Nukleosiden wird dann hinzugefügt, um das Oligonukleotid zu vervollständigen.
  • Beispiel 6
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden carbozyklischen Surrogat-Nukleosiden, die durch Phosphodiester-Bindungen gebunden sind
  • Carbozyklische Nukleotide werden nach den Referenzen hergestellt, die in dem Review von Borthwick, et al., Tetrahedron 1992, 48, 571 zitiert sind. Die resultierenden carbozyklische Nukleotide werden auf die übliche Weise mit einer Dimethoxytrityl-Blockier-Gruppe blockiert. Die korrespondierenden Phosphoramidite werden gemäß dem Beispiel 38 der US-Patentanmeldung 808,201 durch Substitution der carbozyklischen Nukleotide durch die Cyclobutyl-Nukleosid-Surrogate hergestellt. Für die Präparation eines 18-meren Oligonukleotids wird ein erster Bereich von 4 carbozyklischen Nukleosiden, die durch Phosphodiester-Bindungen gebunden sind, mit einem DNA Synthesizer unter Verwendung des Protokolls von Beispiel 1 hergestellt. Nach der Vervollständigung von diesem Bereich wird ein 2'-Deoxy-Phosphorothioat Bereich eines 8 Nukleotide langen 3'-5' gebundenen DNA Oligonukleotids zugefügt. Ein weiterer Bereich aus 4 carbozyklischen Nukleotiden wird hinzugefügt, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 7
  • Oligonukleotid mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden 4'-Thionukleotidbereichen
  • Nach Beispiel 6 wurde ein Bereich aus 4'-Thionukleotiden gemäß den Verfahren der PCT Patentanmeldung PCT/US91/02732 hergestellt. Danach wurde ein Bereich von üblichen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Nukleotiden zugefügt gefolgt von einem weiteren Bereich aus den 4'-Thionukleotiden.
  • Beispiel 8
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Peptid-Nukleinsäurebereichen
  • Ein erster Bereich der Peptid-Nukleinsäuren wird gemäß der PCT Patentanmeldung PCT/EP/01219 hergestellt. Die Peptid-Nukleinsäuren werden vom C-Terminus zum N-Terminus unter Verwendung von Monomeren mit geschützten Aminogruppen hergestellt. Nach der Vervollständigung des ersten Peptid-Bereiches wird die blockierende terminale Aminogruppe entfernt und das resultierende Amin reagierte mit einem 3'-C-(Formyl)-2',3'-Dideoxy-5'-Trityl-Nukleotid gemäß dem Verfahren von Vasseur, et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 7 74, 4006. Die Kondensation des Amins an die Aldehyd-Gruppe des C-Formyl-Nukleosids wird unter den Bedingungen erreicht, wie von Vasseur ebenda beschrieben, um eine intermediäre Oxim-Bindung zu erreichen. Die Oxim-Bindung wird unter den reduzierenden Alkylierungsbedingungen nach Vasseur, ebenda, mit HCHO/NaBH3CN/AcOH reduziert, um das Nukleosid zu erhalten, was an die Peptid-Nukleinsäure mittels einer methylalkylierten Amin-Bindung gebunden ist. Ein innerer 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Nukleotid-Bereich wird dann von diesem Nukleosid gemäß den Protokollen von Beispiel 1 fortgesetzt. Die Peptidsynthese für den zweiten Peptidbereich wird durch die Reaktion des Carboxylendes der ersten Peptid-Nukleinsäure von diesem zweiten Bereich mit der 5'-Hydroxyl-Gruppe des letzten Nukleotids des DNA-Bereiches eingeleitet, um gefolgt von einer Entfernung der Dimethoxytrityl-Blockier-Gruppe an diesem Nukleotid. Die Kopplung wird mittels DEA in Pyridin erzielt, damit sich eine Esterbindung zwischen dem Peptid und dem Nukleosid bildet. Die Peptidsynthese wird dann gemäß der Patentanmeldung PCT/EP/01219 fortgeführt um den zweiten Peptid-Nukleinsäure-Bereich zu vervollständigen.
  • Beispiel 9
  • Oligonukleotid mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphoroselenat-Oligonukleotidbereich angrenzenden 2'-vielen substituierten Oligonukleotidbereichen
  • Ein Oligonukleotid wird gemäß Beispiel 3 unter Verwendung von 2'-O-Methyl-substituierten Nukleotiden hergestellt, um die angrenzenden Bereiche herzustellen und durch Oxidation mit 3H-1,2-benzothiaseleno-3-ol zum Einbau der Selengruppen in die zentrale Region, gemäß dem veröffentlichten Verfahren von Stawinski, et al., Tenth Intemational Roundtable: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Evaluation, September 16–20, 1992, Abstracts of Papers, Abstract 80.
  • Beispiel 10
  • Oligonukleotid mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorodithioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden 2'-substituierten Oligonukleotidbereichen Ein Oligonukleotid wird gemäß Beispiel 3 unter Verwendung von 2'-O-aminopropoxy-substituierten Nukleotiden hergestellt, um die angrenzenden Bereiche herzustellen und durch die Verfahren von Beaton, et. al., Kapitel 5, Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates, Page 109, Oligonucleotides and Analogs, A Practical Approach, Eckstein, F., Ed.; The Practical Approach Series, IRL Press, New York, 1991, um die innere Phosphorodithioat-Region herzustellen.
  • Beispiel 11
  • Oligonukleotid mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Boranophosphat-gebundenen Oligonukleotidbereichen
  • Ein Oligonukleotid wird gemäß Beispiel 3 unter Verwendung der Verfahren der veröffentlichten Patentanmeldung PCT/US/06949 hergestellt, um die angrenzenden Boranophosphat-Bereiche herzustellen und der Verfahren von Beispiel 1, um die zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Region herzustellen.
  • Beispiel 12
  • Oligonukleotid mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden 2'-substituierten Methylphosphonat-gebundenen Oligonukleotidbereichen
  • 2-Fluoro-Nukleoside werden gemäß Beispiel 3 hergestellt und dann in Nukleotide für die Präparation von angrenzenden Methylphosphonat-Bindungen umgewandelt, gemäß den Methoden von Miller et. al., Kapitel 6, Synthesis of oligo-2'-deoxyribonucleoside methylphosphonates, Seite 137, Oligonucleotides and Analogs, A Practical Approach, Eckstein, F., Ed.; The Practical Approach Series, IRL Press, New York, 1991. Die zentrale innere Phosphorothioat-Region wird gemäß Beispiel 1 hergestellt, gefolgt von der Hinzufügung eines weiteren 2'-O-substituierten Methylphosphanat-Bereiches.
  • Beispiel 13
  • Oligonukleotid mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphodiester-Thymidin-Oligonukleotidbereich angrenzenden 2'-substituierten Methylphosphotriester-gebundenen Oligonukleotidbereichen
  • 2-Fluoro-Nukleoside werden gemäß Beispiel 3 hergestellt und dann in Nukleotide für die Präparation von angrenzenden Bereichen von Methylphosphotriester-Bindungen umgewandelt, gemäß den Methoden von Millen et. al., Biochemistry 1977, 76, 1988. Eine zentrale innere Phosphodiester-Region mit 7 aufeinander folgenden Thymidin-Nukleotidresten wird wie in Beispiel 1 hergestellt, gefolgt von der Hinzufügung eines weiteren 2'-O-substituierten Methylphosphotriester-Bereiches.
  • Beispiel 14
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Hydroxylamin-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die abwechselnd durch Methylhydroxylamin-Bindungen und Phosphodiester-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Vasseur, ebenda, hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 15
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Hydrazin-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Methylhydrazin-Bindungen gebunden ist, wird gemäß den Verfahren in den Beispielen der Patentanmeldung PCT/US92/04294 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 16
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Methylsulfenyl-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Methylsulfenyl-Bindungen gebunden ist, wird gemäß den Verfahren in den Beispielen der Patentanmeldung PCT/US92/04294 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 17
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Ethandiylimino-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch 1,2-Ethandiylimino-Bindungen gebunden ist, wird gemäß den Verfahren in den Beispielen der Patentanmeldung PCT/US92/04294 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy- Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 18
  • Oligonukleotid mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Methylenphosphonat-gebundenen Oligonukleotidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Methylenphosphonat-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren in den Beispielen der Patentanmeldung PCT/US92/04294 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 19
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Nitrilomethylidin-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Nitrilomethylidin-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren in den Beispielen der US-Patentanmeldung 903,160 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 20
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Carbonat-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Carbonat-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Mertes, 13 EP 1 044 987 B1 et al., J. Med. Chem. 1969, 72, 154 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 21
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Carbamat-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Carbamat-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Gait, et. al., J. Chern. SOC. Perkin 7 1974, 1684 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 22
  • Makromolekül mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Silyl-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Silyl-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Ogilvie, et al., Nucleic Acids Res. 1988, 76, 4583 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 23
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Sulfid-, Sulfoxid und Sulfon-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Sulfid-, Sulfoxid und Sulfon-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Schneider, etal., Tetrahedron Letters 1990, 37,335 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 24
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Sulfonat-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Sulfonat-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Musicki, et al., J. Org. Chem. 1991, 55, 4231 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 24
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Sulfonamid-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Sulfonat-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Kirshenbaum, et. al., The 5th San Diego Conference: Nucleic Acids: New Frontiers, Poster abstract 28, November 14-1 6, 1990 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 25
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Formacetal-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Formacetal-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Matteucci, Tetrahedron Letters 1990, 31, 2385 oder Veeneman, et. al., Recueil des Trav. Chim. 1990, 109, 449 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 26
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Thioformacetal-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Thioformacetal-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Matteucci, et. al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7767 oder Matteucci, Nucleosides & Nucleotides 1991, 70,231 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 27
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Morpholin-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Morpholin-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren in dem US-Patent Nummer 5,034,506 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 28
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Amid-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Amid-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 5,034,506, angemeldet am 21. Mai 1991 und der zugehörigen PCT-Patentanmeldung PCT/US92/04305 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 29
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Ethylenoxid-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Ethylenoxid-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren der PCT-Patentanmeldung PCT/US91/05713 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphodiester-Oligonukleotid-Region, die drei Nukleotide lang ist, wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 30
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden 3,4-Dihydroxybutyl-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch 3,4-Dihydroxybutyl-Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Augustyns, et. al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 2587 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Region wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Beispiel 31
  • Makromoleküle mit an den zentralen 2'-Deoxy-Phosphorothioat-Oligonukleotidbereich angrenzenden Dihydroxypropoxymethyl-gebundenen Oligonukleosidbereichen
  • Eine erste angrenzende Region von Nukleosiden, die durch Dihydroxypropoxymethyl -Bindungen gebunden ist, wird gemäß dem Verfahren von Schneider, et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 453 hergestellt. Eine zentrale 2'-Deoxy-Phosphorothioat- Oligonukleotid-Region, die 9 Nukleotide lang ist, wird gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 zugefügt, gefolgt von einer weiteren angrenzenden Region mit denselben Bindungen wie der erste Bereich, um das Makromolekül zu vervollständigen.
  • Prozedur 1
  • Ras-Luziferase Reportergen Zusammenbau
  • Die in dieser Arbeit beschriebenen Ras-Luziferase Reportergene wurden unter Verwendung der PCR Technologie zusammengebaut. Oligonukleotid Primer wurden für die Verwendung als Primer für das PCR Klonen der 5'-Bereiche des Exon 1 von sowohl den mutanten (Codon 12) als auch den nichtmutanten (Wildtyp) humanen H-Ras Genen synthetisiert. H-Ras Gen-Vorlagen wurden von der „American Type Culture Collection" (ATCC Nummern 41000 und 41001) in Bethesda, MD gekauft. Die Oligonukleotid PCR Primer 5'-ACA-TTA-TGC-TAG-CTT-GAG-TAA-ACT-TGT-GGG-GCA-GGA-GAC-CCT-GT-3' (sense), SEQ ID NO: 7, und 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TC-TGG-ATG-GTC-AGC-GC-3' (antisense), SEQ ID NO: 8, wurden in Standard PCR Reaktionen unter Verwendung von mutanten und nichtmutanten H-Ras Gen-Vorlagen verwendet. Von diesen Primern wird erwartet, dass sie ein DNA Produkt aus 145 Basenpaaren entsprechend den Sequenzen –53 bis + 65 (relativ zur Translationsstartstelle) aus normalem und mutanten N-Ras, begrenzt von NheI und HindIII Restriktionsendonuclease Stellen. Das PCR Produkt wurde nach Standardprozeduren gelgereinigt, präzipitiert, gewaschen und in Wasser resuspendiert.
  • PCR Primer für das klonieren von dem P. pyralis (Leuchtkäfer) Luziferase Gen wurden so hergestellt, dass das PCR Produkt das Luziferase Protein für seine volle Länge kodiert, mit der Ausnahme des aminoterminalen Methioninrestes, der durch zwei Aminosäuren ersetzt wurde, und zwar ein aminoterminaler Lysinrest gefolgt von einem Leucinrest. Die für das Klonen des Luziferase Gens verwendeten Oligonukleotid PCR Primer waren 5'-GAG-ATC-TGA-AGC-TTG-AAG-ACG-CCA-AAA-ACA-TAA-AG-3' (sense), SEQ ID NO: 9, und 5'-ACG-CAT-CTG-GCG-CGC-CGA-TAC-CGT-CGA-CCT-CGA-3' (antisense), SEQ ID NO: 10, und wurden in Standard PCR Reaktionen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Plasmids (pT3/T7-Luc) (Clontech), verwendet, welche das Luziferase Reportergen als Vorlage enthielten. Von diesen Primern wurde als Ausbeute ein Produkt von ungefähr 1,9 kb entsprechend dem Luziferase Gen erwartet, begrenzt von NheI und HindIII Restriktionsendonuclease Stellen. Der resultierende Klon ergab die im Rahmen des Leuchtkäfer Luziferase Gens eingefügten H-Ras 5'-Sequenzen (–53 bis +65). Der resultierende Expressionsvektor kodiert ein Ras-Luziferase Fusionsprodukt, dass unter der Kontrolle des steroidinduzierten MMTV-Promotors exprimiert wird.
  • Prozedur 2
  • Transfektion der Zellen mit Plasmid DNA
  • Transfektionen wurden mit den folgenden Modifikationen wie von Greenberg, M.E. in Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, et al., eds.), John Wiley and Sons, NY, durchgeführt. HeLa Zellen wurden auf 60 mm Schalen bei 5 × 105 Zellen/Schale aufgebracht. Zu jeder Schale wurde eine Gesamtmenge von 10 μg DNA zugegeben, von der 9 μg Ras-Luziferase Reporterplasmid und 1 μg ein Vektor war, der Ratten-Glucocorticoid-Rezeptor unter der Kontrolle des konstitutiven Rous Sarkom Virus (RSV) Promotors exprimierte. Kalziumphosphat-DNA Präzipitate wurden nach 16 bis 20 Stunden durch Waschen mit Tris-gepufferter Salzlösung [50 Mm Tris-Cl (pH 7,5) 150 mM NaCl], die 3 mM EGTA enthielt, entfernt. Frisches Medium, das mit 10% fetalem Kälberserum versetzt war, wurde dann zu den Zellen hinzugegeben. Zu dieser Zeit wurden die Zellen mit Antisense-Oligonukleotiden vorbehandelt, und zwar vor einer Aktivierung der Reportergen-Exprimierung mittels Dexamethason.
  • Prozedur 3
  • Oligonukleotid Behandlung der Zellen:
  • Unmittelbar nach der Plasmid Transfektion wurden die bei 37°C vorgewärmten Zellen dreimal mit Opti-MEM (Gibco) gewaschen. 2 ml Opti-MEM, das 10 μg/ml N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N,-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) (Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD) enthielt, wurde zu jeder Schale hinzugegeben und die Oligonukleotide wurden direkt hinzugegeben und für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Opti-MEM wurde dann entfernt und durch das geeignete Zellwachstumsmedium ersetzt, das die Oligonukleotide enthielt. Zu dieser Zeit wurde die Reportergen-Exprimierung durch Behandlung der Zellen mit Dexamethason bis zu einer Endkonzentration von 0,2 μM aktiviert. Die Zellen wurden nach 12–16 Stunden geerntet, gefolgt von einer Steroidbehandlung.
  • Prozedur 4
  • Luziferase Assays
  • Luziferase wurde aus Zellen durch Lysis mit dem Detergenz Triton X-100 extrahiert, wie von Greenberg, M.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, et al., eds.), John Wiley and Sons, NY, beschrieben. Ein Dynatech ML1000 Luminometer wurde verwendet, um den Luminizenz-Peak durch Zugabe von 625 μM Luziferin (Sigma) zu messen. Für jeden Extrakt wurden die Luziferase Assays mehrmals durchgeführt, wobei unterschiedliche Mengen an Extrakt verwendet wurden, um sicherzustellen, dass die Daten im linearen Bereich des Assays gemessen wurden.
  • Prozedur 5
  • Antisense-Oligonukleotid Inhibierung der RAS-Luziferase Genexpression
  • Eine Serie von Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid-Analoga, die auf die Codon-12 Punktmutation der aktivierten H-Ras abzielten, wurden unter Verwendung des Ras-Luziferase Reportergen Systems getestet, wie in den folgenden Beispielen beschrieben. Diese Serie umfasste eine Basissequenz und Analoga dieser Basissequenz. Die Basissequenz hatte eine bekannte Aktivität, wie in der Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/715,196 oben beschrieben wurde. In sowohl der Basissequenz als auch in ihren Analoga wies jede Nukleotideinheit eingefügte Phosphorothioat-Bindungen auf, um eine Nukleaseresistenz herzustellen. In jedes der Analoga waren Nukleotideinheiten eingefügt, die 2'-O-Methyl-Substituenten und 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Zucker enthielten. In den Analoga wurde eine Subsequenz von den 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Zucker enthaltenden Untereinheiten an beiden Enden durch Subsequenzen der 2'-O-Methyl-substituierten Untereinheiten begrenzt. Die Analoga unterschieden sich untereinander im Hinblick auf die Länge der Subsequenz der 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Zucker enthaltenden Nukleotide. Die Länge von diesen Subsequenzen variierte durch zwei Nukleotide zwischen insgesamt 1 und 9 Nukleotiden. Die 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl Subsequenzen wurden an der Punktmutation der Codon-12 Punktmutation von der aktivierten Ras zentriert.
  • Die Basensequenzen, Sequenzreferenznummern und Sequenz ID Nummern von diesen Oligonukleotiden (alle sind Phosphorothioat Analoga) sind in Tabelle 1 gezeigt. In dieser Tabelle enthalten die mit einem "M" bezeichneten Nukleotide eine 2'-O-Methyl-Substituenten Gruppe und der mit einem "d" bezeichnete Rest der Nukleotide sind 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl Nukleotide.
  • Tabelle 1
    Figure 00400001
  • 1 zeigt dosisabhängige Daten, wobei Zellen mit den Phosphorothioat-Oligonukleotiden der Tabelle 1 behandelt wurden. Das Oligonukleotid 2570 zielte auf die Codon-12 Punktmutation der mutanten (aktivierten) H-Ras. Die anderen Nukleotide weisen 2'-O-Methyl-Substituenten Gruppen auf, um die Bindungsaffinität mit Sektionen verschiedener Längen der dazwischenliegenden 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl Nukleotide zu erhöhen. Das Kontroll-Oligonukleotid ist ein zufälliges Phosphorothioat Oligonukleotid Analogon, das 20 Basen lang ist. Die Ergebnisse sind als Prozent der Luziferase Aktivität in transfizierten Zellen, die nicht mit Oligonukleotiden behandelt wurden, ausgedrückt. Wie die Figur zeigt, resultierte die Behandlung von Zellen mit steigenden Konzentrationen von Oligonukleotid 2570 in einer dosisabhängigen Inhibierung der Ras-Luziferase Aktivität in Zellen, die die mutante Form der Ras-Luziferase exprimieren. Das Oligonukleotid 2570 zeigt eine annähernd dreifache Selektivität zu der mutanten Form der Ras-Luziferase verglichen mit der normalen Form.
  • Wie man weiter in 1 sehen kann, zeigt jedes der Oligonukleotide 3980, 3985 und 3984 eine größere Inhibierung der Ras-Luziferase Aktivität als das Oligonukleotid 2570. Die größte Inhibierung wies das Oligonukleotid 3985 auf, das eine Subsequenz mit 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl Nukleotiden hat, die sieben Nukleotide lang ist. Das Oligonukleotid 3980 mit einer fünf Nukleotide langen 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotid Subsequenz wies die nächstgrößte Inhibierung auf, gefolgt von dem Oligonukleotid 3984, dass eine neun Nukleotide lange 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotid Subsequenz hat.
  • 2 zeigt die Ergebnisse ähnlich wie in 1, mit dem Unterschied das sie in Form einer Säulengrafik dargestellt ist. Weiterhin sieht man in 2 die Aktivität des Oligonukleotids 3975 und des Oligonukleotids 3979. Diese Oligonukleotide haben Subsequenzen mit 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotiden, die jeweils ein und drei Nukleotide lang sind. Wie aus 2 ersichtlich ist, zeigte keine der Oligonukleotide, die weder die eine noch die drei 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotid Subsequenzen haben, eine signifikante Aktivität. Es gab eine messbare Aktivität für das drei Nukleotid lange Subsequenz Oligonukleotid 3979 bei der höchsten Konzentrationsdosis.
  • Die erhöhten Aktivitäten der Oligonukleotide 3980, 3985 und 3984, verglichen mit dem Oligonukleotid 2570, werden der erhöhten Bindungsaffinität zugeschrieben, die diesen Komponenten durch die 2'-O-Methyl-Substituenten Gruppen verliehen werden, die an diesen Komponenten lokalisiert sind, und durch die RNase H Aktivierung, die diesen Komponenten durch Einfügen einer Subsequenz von 2'-Desoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nukleotiden in die Hauptsequenz der Nukleotide verliehen werden. Es ist interessant zu erwähnen, dass, im Gegensatz zu den aktiven Komponenten der Erfindung, Sequenzen, die mit den aktiven Oligonukleotiden 2570, 3980,3985 und 3984 identisch sind, aber Phosphodiester-Bindungen anstatt der Phosphorothioat-Bindungen der erfindungsgemäßen aktiven Oligonukleotide besitzen, keine Aktivität zeigten. Dies wird bei diesen Phosphodiester-Komponenten darauf zurückgeführt, dass sie Substrate für Nukleasen sind, die diese Phosphodiester-Komponenten abbauen und so eine mögliche Aktivierung der RNase H verhindern.

Claims (9)

  1. Makromolekül, umfassend 15 bis 25 Einheiten, die über kovalente Bindungen in einer Sequenz verknüpft sind, die hybridisierbar an eine komplementäre Nukleinsäure sind, worin: die Einheiten gewählt sind aus Nukleosiden und Nukleobasen; die Nukleoside gewählt sind aus α-Nukleosiden, β-Nukleosiden, 4'-Thionukleosiden und carbozyklischen Nukleosiden; die Nukleobasen gewählt sind aus Purin-9-yl- und Pyrimidin-1-yl-heterozyklischen Basen; die Bindungen gewählt sind unter geladenen Phosphor-, neutralen Phosphor- oder nicht-Phosphor-Bindungen; und die Sequenz von verknüpften Einheiten in zwei Bereiche unterteilt ist, worin: ein erster der Bereiche die α-Nukleoside, gebunden durch geladene oder neutrale 3'-5'-Phosphorbindungen, umfasst, wobei die α-Nukleoside durch geladene oder neutrale 2'-5' Phosphorbindungen gebunden sind, wobei die α-Nukleoside durch nicht-Phosphorbindungen gebunden sind, wobei die 4'-Thionukleoside durch geladene oder neutrale 3'-5' Phosphorbindungen gebunden sind, wobei die 4'-Thionukleoside durch geladene oder neutrale 2'-5'-Phosphorbindungen gebunden sind, wobei die 4'-Thionukleoside durch nicht-Phosphorbindungen gebunden sind, wobei die carbozyklischen Nukleoside durch geladene oder neutrale Phosphorbindungen gebunden sind, wobei die carbozyklischen Nukleoside durch nicht-Phosphorbindungen gebunden sind, wobei die β-Nukleoside durch geladene oder neutrale 3'-5'-Bindungen gebunden sind, wobei die β-Nukleoside durch geladene oder neutrale 2'-5'-Bindungen gebunden sind oder die β-Nukleoside durch nicht-Phosphorbindungen gebunden sind; und ein zweiter der Bereiche, einschließlich der Nukleobasen durch nicht-Phosphorbindungen oder Nukleobasen verknüpft ist, die an Phosphatbindungen über eine nicht-Zuckerketteneinheit gebunden sind.
  2. Makromolekül nach Anspruch 1, worin der erste Bereich wenigstens zwei Nukleobasen umfasst, verknüpft durch eine nicht-Phosphatbindung, wobei die nicht-Phosphatbindung eine Peptidbindung ist.
  3. Makromolekül nach Anspruch 1, worin die Nukleobasen gewählt sind aus Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und anderem Alkyladenin, 2-Propyl- und anderem Alkyladenin, 5-Halogen-Uracil und Cytosin, 6-Azo-Uracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halogen, Amino, Thiol, Thiolalkyl, Hydroxyl und anderem 8-substituiertem Adenin und Guanin, oder 5-Trifluoremethyluracil und Cytosin.
  4. Makromolekül nach Anspruch 1, worin die nicht-Phosphatbindung eine Peptidbindung ist.
  5. Makromolekül nach Anspruch 1, umfassend eine Vielzahl der zweiten Bereiche.
  6. Verfahren zum Modifizieren in vitro einer sequenzspeziefischen Nukleinsäure, umfassend das Kontaktieren einer Testlösung, die eine RNaseH enthält und der Nucleinsäure mit einer Verbindung nach Anspruch 1.
  7. Makromolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in der Medizin.
  8. Verwendung des Makromoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit, die durch die unerwünschte Erzeugung eines Proteins gekennzeichnet ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, worin die Zusammensetzung gleichzeitig Hybridisierung und RNaseH-Aktivierung verstärkt.
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