JP7469290B2 - エプスタイン-バールウイルスの核酸を検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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-
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
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Description
本出願は、2018年8月1日に出願された、米国仮特許出願第62/713,330号の利益を主張する。先行出願の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の態様では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
試料中のエプスタイン-バールウイルス(EBV)の存在または不在を決定するための反応混合物であって、前記反応混合物が、
EBV核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、
前記検出プローブオリゴマーが、最大30個のヌクレオチドの長さであり、配列番号22の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーと、
増幅オリゴマー対であって、
前記対の第1の増幅オリゴマーが、配列番号3の18~25個の連続する塩基を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にし、
前記対の第2の増幅オリゴマーが、配列番号4の18~25個の連続する塩基を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、増幅オリゴマー対と、を含む、反応混合物。
(項目2)
前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、項目1に記載の反応混合物。
(項目3)
前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、項目2に記載の反応混合物。
(項目4)
前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、項目1~3のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目5)
前記検出プローブオリゴマーの前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、項目4に記載の反応混合物。
(項目6)
前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列を含む、項目1~5のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目7)
前記第1および第2の増幅オリゴマーの各々が、最大25個のヌクレオチドの長さである、項目1~6のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目8)
前記第1の増幅オリゴマーが、20個のヌクレオチドの長さであり、前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号3の20個の連続する塩基からなる、項目1~7のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目9)
前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号5である、項目1~8のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目10)
前記第2の増幅オリゴマーが、20個のヌクレオチドの長さであり、前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号4の20個の連続する塩基からなる、項目1~9のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目11)
前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号7である、項目1~10のいずれか一項に記載の反応混合物。
(項目12)
前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号5または配列番号6のいずれかであり、前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号7または配列番号8のいずれかである、項目7に記載の反応混合物。
(項目13)
前記第1の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号5である、項目12に記載の反応混合物。
(項目14)
前記第2の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号7である、項目12に記載の反応混合物。
(項目15)
前記第2の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号7である、項目13に記載の反応混合物。
(項目16)
試料中のエプスタイン-バールウイルス(EBV)の存在または不在を決定する方法であって、前記方法が、
(a)EBVの存在について試験される試料を、
配列番号3の18~25個の連続する塩基を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、第1の増幅オリゴマー、
配列番号4の18~25個の連続する塩基を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、第2の増幅オリゴマー、ならびに
配列番号22の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、最大30個のヌクレオチドの長さの検出プローブオリゴマーを含む、オリゴマーの組み合わせと接触させるステップと、
(b)前記オリゴマーの組み合わせを使用してインビトロ核酸増幅反応を行うステップであって、任意のEBV標的核酸が、前記試料中に存在する場合、増幅産物を生成するためのテンプレートである、ステップと、
(c)前記検出プローブオリゴマーで、前記増幅産物の存在または不在を検出し、それによって前記試料中のEBVの存在または不在を決定するステップと、を含む、方法。
(項目17)
前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記検出プローブオリゴマーの前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、項目16~18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列を含む、項目16~20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記試料が、ヒト血液、ヒト血漿、またはヒト血清のいずれかから単離された核酸を含む、項目16~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記インビトロ核酸増幅反応が、Taq DNAポリメラーゼを含む、項目16~22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
ステップ(b)および(c)が、同時に行われ、前記インビトロ核酸増幅反応が、リアルタイム核酸増幅反応である、項目16~23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
ステップ(b)における前記インビトロ核酸増幅反応が、前記試料中に存在し得るEBVの任意の核酸に加えて、前記試料中に存在し得るサイトメガロウイルス(CMV)の任意の核酸を増幅および検出するマルチプレックスインビトロ核酸増幅反応である、項目16~24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
ステップ(b)における前記インビトロ核酸増幅反応が、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを含むPCR増幅反応である、項目16~25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
ステップ(a)の前に、核酸を単離する前記ステップがあり、前記ステップの全てが、単一の自動装置を使用して行われる、項目16~26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
1つ以上のバイアルにおいて、
エプスタイン-バールウイルス(EBV)核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、
前記検出プローブオリゴマーが、最大30個のヌクレオチドの長さであり、配列番号22の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーと、
増幅オリゴマー対であって、
前記対の第1の増幅オリゴマーが、配列番号3の18~25個の連続する塩基を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にし、
前記対の第2の増幅オリゴマーが、配列番号4の18~25個の連続する塩基を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、増幅オリゴマー対と、を含む、試薬のキット。
(項目29)
前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、項目28に記載のキット。
(項目30)
前記検出プローブオリゴマーの前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、項目29に記載のキット。
(項目31)
前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、項目28~30のいずれか一項に記載のキット。
(項目32)
前記検出プローブオリゴマーの前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、項目31に記載のキット。
(項目33)
前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列を含む、項目28~32のいずれか一項に記載のキット。
(項目34)
前記第1および第2の増幅オリゴマーの各々が、最大25個のヌクレオチドの長さである、項目28~33のいずれか一項に記載のキット。
(項目35)
前記第1の増幅オリゴマーが、20個のヌクレオチドの長さであり、前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号3の20個の連続する塩基からなる、項目28~34のいずれか一項に記載のキット。
(項目36)
前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号5である、項目28~35のいずれか一項に記載のキット。
(項目37)
前記第2の増幅オリゴマーが、20個のヌクレオチドの長さであり、前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号4の20個の連続する塩基からなる、項目28~36のいずれか一項に記載のキット。
(項目38)
前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号7である、項目28~37のいずれか一項に記載のキット。
(項目39)
前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号5または配列番号6のいずれかであり、前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号7または配列番号8のいずれかである、項目28~35または項目37のいずれか一項に記載のキット。
(項目40)
前記第1の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号5である、項目39に記載のキット。
(項目41)
前記第2の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号7である、項目39に記載のキット。
(項目42)
前記第2の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号7である、項目40に記載のキット。
(項目43)
前記第1および第2の増幅オリゴマーが、1つのバイアルに一緒に包装され、前記プローブオリゴヌクレオチドが、別個のバイアルに包装される、項目28~42のいずれか一項に記載のキット。
(項目44)
エプスタイン-バールウイルス(EBV)核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、前記検出プローブオリゴマーが、最大30個のヌクレオチドの長さであり、配列番号22の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマー。
(項目45)
検出可能な標識をさらに含む、項目44に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目46)
前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、項目45に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目47)
少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、項目44~46のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目48)
前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、項目47に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目49)
前記検出プローブオリゴマーが、最大26個のヌクレオチドの長さであり、配列番号17の配列またはその相補鎖内に完全に含有される塩基配列を含む、項目44~48のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目50)
前記検出プローブオリゴマーが、最大22個のヌクレオチドの長さである、項目44~49のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目51)
前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列またはその相補鎖を含む、項目44~49のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目52)
前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列を含む、項目51に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目53)
少なくとも9つのヌクレオチド類似体をさらに含む、項目52に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目54)
9つの5-メチルシトシンヌクレオチド類似体をさらに含む、項目52に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目55)
前記検出プローブオリゴマーが、配列番号9からなる塩基配列を有する22個のヌクレオチドの長さである、項目44~46のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目56)
複数の5-メチルシトシンヌクレオチド類似体を含む、項目55に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目57)
配列番号9の配列中の全てのシトシン塩基が、5-メチルシトシンヌクレオチド類似体である、項目55に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目58)
前記検出プローブオリゴマーが、二重標識加水分解プローブである、項目46~57のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
(項目59)
前記プローブが、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を含むDNAポリメラーゼの存在下で相補的な核酸鎖にハイブリダイズされる、項目44~58のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的な定義は、分子生物学の分野に関連する技術書において見られ得る(例えば、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,2nd ed.,Singleton et al.,1994,John Wiley&Sons,New York,NY、またはThe Harper Collins Dictionary of Biology,Hale&Marham,1991,Harper Perennial,New York,NY)。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」は、一般に、1,000個のヌクレオチド(nt)未満の核酸を指し、約2~5個のヌクレオチドの下限および約500~900個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のものを含む。いくつかの特定の実施形態は、約5~15、16、17、18、19、もしくは20個のヌクレオチドの下限および約50~600個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のオリゴマーであり、他の特定の実施形態は、約10~20個のヌクレオチドの下限および約22~100個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲である。オリゴマーは、天然に存在する供給源から精製されてもよいが、任意の周知の酵素的または化学的方法を使用することによって合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬の任意の特定の機能を示さず、むしろ、本明細書に記載される全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、それは、相補鎖に特異的であり、これにハイブリダイズすることができ、核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、プライマーとして機能し得、RNAポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写を可能にする場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得(例えば、T7プライマー)、標的核酸、またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、検出可能な部分(例えば、アクリジニウム-エステル化合物)をさらに提供する場合、標的核酸を検出するように機能し得る。オリゴマーは、機能名(例えば、捕捉プローブ、プライマー、またはプロモータープライマー)によって呼ばれ得るが、当業者は、そのような用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。
配列は、完全に相補的である必要はないが、2つの核酸配列の安定なハイブリダイゼーション、例えば、プローブおよび標的配列の安定なハイブリッドを可能にする場合、「十分に相補的」である。すなわち、「十分に相補的」な配列は、標準的な塩基対合(例えば、G:C、A:T、またはA:U)を使用することによって相補的なヌクレオチドの一連のサブセット間の水素結合によって別の配列にハイブリダイズするが、2つの配列は、配列全体が適切なハイブリダイゼーション条件で安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する限り、相補的ではない1つ以上の残基(非塩基性位置を含む)を含有し得る。十分に相補的な配列は、一緒にハイブリダイズする配列において少なくとも約80%、少なくとも約90%、または完全に相補的であり得る。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、配列組成に基づいて予測することができるか、または日常的な試験を使用することによって経験的に決定することができる(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51、および11.47-11.57、特に§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47、および11.55-11.57)。
典型的には、本開示による検出プローブオリゴマーは、標識をさらに含む。特に好適な標識は、検出可能な光シグナルを放出する化合物を含む。例となる標識には、均質なアッセイにおいて検出され得るフルオロフォアおよび発光(例えば、化学発光)化合物が含まれる。2つ以上の標識、および2つ以上のタイプの標識が特定のプローブ上に存在してもよく、または検出は、各プローブが、検出可能なシグナルを産生する化合物で標識される、プローブの混合物を使用することに依存し得る(例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第6,180,340号および同第6,350,579号を参照されたい)。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに結合され得る。好ましくは、標識は、共有結合している。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、アクリジニウムエステル(AE)化合物などの結合した化学発光標識を有する(例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第5,185,439号、同第5,639,604号、同第5,585,481号、および同第5,656,744号を参照されたい)。蛍光または化学発光標識などの標識は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させることができる(例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第5,585,481号、同第5,656,744号、および同第5,639,604号、特に第10列、第6行~第11列、第3行、および実施例8を参照されたい)。
検出ステップは、増幅された標的配列に特異的に会合したシグナルを検出するために、様々な既知の技法のいずれかを使用して行われ得る。これは、増幅産物を標識された検出プローブとハイブリダイズさせ、いくつかの実施形態におけるハイブリダイゼーション後にプローブから放出される標識からのものを含む、標識されたプローブから生じるシグナルを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、標識されたプローブは、上述されるように、クエンチャーまたは第1の標識と相互作用する他の部分などの第2の部分を含む。検出ステップはまた、増幅された配列(例えば、その核酸塩基配列の全てまたは一部分)に関する追加の情報を提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施され得るか、または標的領域を(例えば、リアルタイム形式を使用して)増幅することと同時に実施され得る。一実施形態では、検出ステップは、例えば、米国特許第5,639,604号および同第5,283,174号に開示されるように、均質な検出(例えば、混合物からのハイブリダイズされていないプローブの除去なしでのハイブリダイズされたプローブの検出)を可能にする。いくつかの実施形態では、核酸の表面との会合は、光学的変化または電気的変化として検出することができる物理的変化をもたらす。増幅された核酸は、それらをマトリックス中またはその上で濃縮し、核酸もしくはそれらと会合した色素(例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤)を検出するか、または溶液相中の核酸と会合した色素の増加を検出することによって検出され得る。他の検出方法は、増幅産物中の配列に特異的にハイブリダイズするように構成され、プローブ:産物複合体の存在を検出する核酸検出プローブを使用してもよく、または増幅産物と会合した検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を使用することによるものであってもよい(例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第5,424,413号、同第5,451,503号、および同第5,849,481号)。増幅産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。特に、増幅産物は、EBV EBNA1遺伝子における標的配列またはそれにおける配列に相補的な標的配列を含有し、プローブは、増幅産物に含有される配列に直接的または間接的に結合して、試験された試料中のEBV核酸の存在を示すであろう。
EBV標的核酸配列のための様々な増幅および検出オリゴヌクレオチドが、開示された技法の開発中に調製および評価された。全てのオリゴヌクレオチド設計は、EBVゲノムのEBNA1遺伝子を標的とした。オリゴヌクレオチドのセットは、配列番号1の配列内に含有される標的配列領域を増幅および検出する能力について試験された。
EBNA1をコードする領域におけるEBV核酸の増幅および検出
プライマーの対となるセットは、EBNA1標的領域を含有するクローン化されたプラスミドテンプレートでプライミングされたリアルタイムPCR反応においてプローブと組み合わせた。順方向プライマーは、配列番号5および配列番号6の配列を有した。逆方向プライマーは、配列番号7および配列番号8の配列を有した。全ての反応は、各1つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含んだ。配列番号2の配列内からの単一のプローブは、配列番号9の配列を有した。
EBV標的核酸感度
感度は、3つの濃度(5~500コピー/反応)で検体輸送培地(STM)に配列番号1のEBNA1標的領域を有するEBVプラスミドクローンを試験することによってまず評価した。STMは、3%(重量/体積)のラウリル硫酸リチウムを含むリン酸緩衝(pH6.6~pH6.8)溶液である。存在し得る任意の細胞の溶解を促進することに加えて、STMは、試料中に存在し得るヌクレアーゼ酵素の活性を阻害することによって核酸を保護する。PCR製剤は、配列番号5および配列番号7のEBVプライマー、ならびに配列番号9のプローブを含んだ。感度試験について、30の複製を使用して行った。プラスミドクローンを、示された濃度でSTMにスパイクし、3つのプローブロットで試験した。線形性試験について、増幅反応を、6の複製を使用して行い、プラスミドを、示された濃度でSTMにスパイクし、1つのプローブロットで試験した。全ての検体は、自動装置を使用して処理して、標的捕捉によって核酸を単離し、次いでリアルタイムPCRプロトコルを使用して単離された核酸を増幅した。
ウイルス感度
プールされた血漿、プールされた血清、およびSTM中のEBV参照株B95-8は、配列番号1のテンプレート配列、配列番号5および配列番号7のプライマー、ならびに配列番号9のプローブを含んだPCR製剤との反応性について評価した。簡潔には、EBVウイルス株B95-8を、示された濃度で各マトリックスにスパイクした。血漿および血清中の検体を、3mg/mlのプロテイナーゼK(PK)酵素および50ng/μlの追加の標的捕捉オリゴ(TCO)を含有するPBSで1:0.2に希釈し、標的ヌクレオチド配列から実質的に独立した方法で溶液相から固体支持体ビーズへの核酸の捕捉を可能にした。PKも追加のTCOもSTM試料に添加されなかった。全ての試験は、20の複製で実施した。実施例2と同様に、全ての検体は、自動装置を使用して処理して、標的捕捉によって核酸を単離し、次いでリアルタイムPCRプロトコルを使用して単離された核酸を増幅した。
EBVアッセイは高度に特異的である
ヒト血液中に一般的に見られる生物の収集物は、約1×104~約1×106生物/mlをSTMにスパイクすることによって9つのパネルに調製した。各パネルは、配列番号1のテンプレート配列、配列番号5および配列番号7のプライマー、ならびに配列番号9のプローブを含んだPCR製剤との特異性について評価した。
干渉試験
EBV反応性は、特異性試験からの35個の生物の存在下で、またヒト末梢血単核細胞の存在下で評価した。簡潔には、特異性試験からのパネル2~8をSTM中で1:10に希釈し、EBV(株:B95-8)を27,778コピー/mlで試料にスパイクした。パネル1は、STM中で新たに調製した。5×104細胞/mlの末梢血単核細胞を含有する追加のパネルを試験した。両方のパネルは、27,778コピー/mlでスパイクされたEBVを有した。BKも各パネルにスパイクし、27,778コピー/mlでBK干渉を評価した。各パネルは、配列番号1のテンプレート配列、配列番号5および配列番号7のプライマー、ならびに配列番号9のプローブを含んだPCR製剤で4~5つの一般的に見られる生物の存在下でのEBV性能について評価した。
Claims (42)
- 試料中のエプスタイン-バールウイルス(EBV)の存在または不在を決定するための反応混合物であって、前記反応混合物が、
EBV核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、
前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーと、
増幅オリゴマー対であって、
前記対の第1の増幅オリゴマーが、配列番号5または配列番号6のいずれかの塩基配列を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にし、
前記対の第2の増幅オリゴマーが、配列番号7または配列番号8のいずれかの塩基配列を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、増幅オリゴマー対と、を含む、反応混合物。 - 前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、請求項1に記載の反応混合物。
- 前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項2に記載の反応混合物。
- 前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記検出プローブオリゴマーの前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、請求項4に記載の反応混合物。
- 前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号5である、請求項1~5のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号7である、請求項1~6のいずれか一項に記載の反応混合物。
- 試料中のエプスタイン-バールウイルス(EBV)の存在または不在を決定する方法であって、前記方法が、
(a)EBVの存在について試験される試料を、
配列番号5または配列番号6のいずれかの塩基配列を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、第1の増幅オリゴマー、
配列番号7または配列番号8のいずれかの塩基配列を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、第2の増幅オリゴマー、ならびに
22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーを含む、オリゴマーの組み合わせと接触させるステップと、
(b)前記オリゴマーの組み合わせを使用してインビトロ核酸増幅反応を行うステップであって、任意のEBV標的核酸が、前記試料中に存在する場合、増幅産物を生成するためのテンプレートである、ステップと、
(c)前記検出プローブオリゴマーで、前記増幅産物の存在または不在を検出し、それによって前記試料中のEBVの存在または不在を決定するステップと、を含む、方法。 - 前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記検出プローブオリゴマーの前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項8~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記試料が、ヒト血液、ヒト血漿、またはヒト血清のいずれかから単離された核酸を含む、請求項8~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インビトロ核酸増幅反応が、Taq DNAポリメラーゼを含む、請求項8~13のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)および(c)が、同時に行われ、前記インビトロ核酸増幅反応が、リアルタイム核酸増幅反応である、請求項8~14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)における前記インビトロ核酸増幅反応が、前記試料中に存在し得るEBVの任意の核酸に加えて、前記試料中に存在し得るサイトメガロウイルス(CMV)の任意の核酸を増幅および検出するマルチプレックスインビトロ核酸増幅反応である、請求項8~15のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)における前記インビトロ核酸増幅反応が、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを含むPCR増幅反応である、請求項8~16のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)の前に、核酸を単離する前記ステップがあり、前記ステップの全てが、単一の自動装置を使用して行われる、請求項8~17のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のバイアルにおいて、
エプスタイン-バールウイルス(EBV)核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、
前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーと、
増幅オリゴマー対であって、
前記対の第1の増幅オリゴマーが、配列番号5または配列番号6のいずれかの塩基配列を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にし、
前記対の第2の増幅オリゴマーが、配列番号7または配列番号8のいずれかの塩基配列を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、増幅オリゴマー対と、を含む、試薬のキット。 - 前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、請求項19に記載のキット。
- 前記検出プローブオリゴマーの前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項20に記載のキット。
- 前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項19~21のいずれか一項に記載のキット。
- 前記検出プローブオリゴマーの前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、請求項22に記載のキット。
- 前記第1の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号5である、請求項19~23のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2の増幅オリゴマーが、20個のヌクレオチドの長さであり、前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号4の20個の連続する塩基からなる、請求項19~24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号7である、請求項19~25のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号5である、請求項19~25のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第2の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号7である、請求項19~25のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第1および第2の増幅オリゴマーが、1つのバイアルに一緒に包装され、前記プローブオリゴヌクレオチドが、別個のバイアルに包装される、請求項19~27のいずれか一項に記載のキット。
- エプスタイン-バールウイルス(EBV)核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列またはその相補鎖を含み、RNAおよびDNA等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマー。
- 検出可能な標識をさらに含む、請求項30に記載の検出プローブオリゴマー。
- 前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項31に記載の検出プローブオリゴマー。
- 少なくとも1つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項30~32のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチド類似体が、少なくとも1つの5-メチルシトシン塩基を含む、請求項33に記載の検出プローブオリゴマー。
- 前記検出プローブオリゴマーが、22個のヌクレオチドの長さであり、配列番号9の塩基配列を含む、請求項30~34のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
- 少なくとも9つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項35に記載の検出プローブオリゴマー。
- 9つの5-メチルシトシンヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項35に記載の検出プローブオリゴマー。
- 前記検出プローブオリゴマーが、配列番号9からなる塩基配列を有する22個のヌクレオチドの長さである、請求項30~32のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
- 複数の5-メチルシトシンヌクレオチド類似体を含む、請求項38に記載の検出プローブオリゴマー。
- 配列番号9の配列中の全てのシトシン塩基が、5-メチルシトシンヌクレオチド類似体である、請求項38に記載の検出プローブオリゴマー。
- 前記検出プローブオリゴマーが、二重標識加水分解プローブである、請求項32~40のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
- 前記プローブが、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を含むDNAポリメラーゼの存在下で相補的な核酸鎖にハイブリダイズされる、請求項30~41のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
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