KR960002561B1 - 균질보호분석법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

균질보호분석법
진단분석법(diagnostic assays)은 표지된 결합시약을 이용하여 생물학적 물질을 검출하거나 위치를 찾아내거나 정량하는 일반적인 분석기술이다. 이때에 표지된 시약의 존재는 다양한 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있다.
본발명은 제한없이, 직접 결합분석법 및 경쟁분석법 그리고 연속적인 포화 분석법을 포함하는 모든 공지된 진단분석법 형태에 적용될수 있다. 진단분석법의 한 특별한 형태가 핵산혼성화(hybridization) 분석법이다.
혼성화 분석법 시스템은 적절한 환경하에서 단일-스트랜드핵산(DNA 또는 RNA)은 상보의 단일-스트랜드 핵산과 혼성화되거나 재결합된다는 시실에 기초를 둔 것이다. 용이하게 검출가능한 표지를 가지고 상보 프로브핵산을 표지함으로써 단일-스트랜드핵산 서열을 가진 시료에서 표적 폴리뉴클레오티드서열의 존재를 검출 할수있다.
분석법 시스템은 넓게 이질성(heterogeneous) 또는 균질성(homogeneous)으로써 특징지울 수 있다. 분석법시스템에서 "이질성"이라 용어는 검출할 비표지된 물질로부터 표지된 물질의 분리를 요하는 특이적 결합 분석법을 의히만다.
한편, 균일한 분석법시스템은 어떠한 물리적 분리단계를 포함하지 않는다. 균질한 분석법시스템은 최소한의 작업단계를 포함하기 때문에 일반적으로 이질한 분석법시스템보다 사용하기가 더 편리하고 쉽다.
예를들면 전형적인 샌드위치 면역분석법은 고정화된 항체를 시험배지에 배양한다. 배지에 항원이 있으면 항원은 항체와 결합할 것이다. 배양후, 비결합된 항원은 분리단계에서 제거된다. 표지된 항체액과 제2의 또는 동시적인 배양후에 결합된 항원은 고정화된 항체와 표지된 항체 사이에서 샌드위치형태로 된다. 제2의 분리단계후에 표지된 항체의 양은 배지에 있는 항원을 측정함으로써 결정할 수 있다. 이 시스템은 일련의 배양 및 분리단계를 포함하기 때문에 시간이 소모된다.
진단 분석법에서 종래기술의 노력의 촛점은 관심있는 비결합 물질에 반하여 결합물질의 양에서의 미세한 차이를 분별할수 있는 균질한 분석법 및 표지를 개발하는데 있어왔다. 본발명의 목적중의 하나는 표지자체가 비결합형일때에 반하여 결합형일때 예를들면, 화학발광과 같은 검출 가능한 변화를 일으키는 분석법시스템이다. 본발명의 또 다른 목적은 표지가 결합형 또는 비결합형에서 상당히 분해되거나 파괴되어져 관심있는 반응을 확인하고 정량하는데 용이한 수단을 제공하는 분석법시스템이다.
본발명의 목적은 균질한 분석법 형태를 사용하여 분석물을 민감하게 검출하는 개선된 방법을 개시하는데 있다.
또한, 본발명의 목적은 여기에 개시된 균질한 방법을 비특이적 배경을 경감시키기 위해 다른 분리 방법과 연결하여 분리를 포함한 분석법의 민감도를 증가시키는 개선된 방법을 공급하는데 있다. 여기에 개시된 본발명의 원리는 표지의 화학적 또는 생화학적 시약에 대한 차별적 안정성에 기초를 둔다.
임의의 표지가 결합 대상물에 콘주게이트 되었을때, 본발명자는 위의 표지의 안정성은 결합 대상물이 결합물질과 결합되었을때 변경되거나 또는 변경되어질수 있음을 발견하였다.
또한 본발명의 목적은 언급된 차별적인 표지의 안정성이 균질한 진단분석법시스템을 이용하여 분석물을 민감하게 검출하는데 이용할수 있는 방법을 개시하는데 있다.
또한 본발명의 또다른 목적은 상보의 표적 폴리뉴클레오티드서열의 존재를 민감하게 검출하기 위해 상기 균질한 진단분석법에서 화학 발광하는 아크리디늄 에스테르 표지된 DNA 프로브의 사용을 개시하는데 있다.
(종래기술의 설명)
복합성에서 다양한 종래기술에는 여러가지 분석법이 있다. 예를들면 어떤 시스템에서는 표지가 다른 구성성분, 예를들면 효소, 조효소 및 조인자의 존재하에서 화학반응에 참여할수있는 촉매이다.
다른, 그러나 관련된 시스템에서 표지는 화학적 또는 생화학적 반응을 위한 기질이다. 이들 시스템에서는 특이적인 용이하게 검출가능한 물질, 예를들면 포도당, 젖산염 또는 알코올의 생성이 표적반응을 모니터하고 측정하는데 사용된다. 다른 분석시스템에서, 표지는 직접적으로 검출될수 있는 독특한 물리적 성질을 가지고 있다. 표지의 이러한 형태로는 예를들면 금속류, 헤모글로빈 및 염록소가 있다.
또한 다른 균질한 분석시스템은 분석물이 특이적 결합반응에 대한 배위자인 효소-커플링된 특이적 결합반응에 기초를 둔다. 분석물이 존재할때 이것은 특이적 결합 대상물과 표지 물질로 구성된 콘주게이트와 특이적 결합반응을 일으킨다. 동시에 또는 연속적으로 다른 치환체가 표지와 상호 반응을 일으키게 가해진다.
표지의 활동성은 표지가 구성성분인 콘주게이트가 복합형태냐 비복합 형태냐에 따라 다르다.
이러한 시스템은 전형적으로 효소를 비색정량, 형광정량, 또는 화학발광 종말점을 생성하는 표지시약 및 기질로 사용해오고 있다. 균질한 효소면역분석법의 예는 미국특허 제3,654,090호, 제3,817,837호 및 제4,190,496호를 포함한다. 형광발광기/켄처(quencher)쌍을 만드는 발색단의 사용을 포함하는 균질한 분석법의 다른예는 미국특허 제4,199,559호, 제4,174,383호 및 제4,318,707호에서 발견될수 있다. 그러나, 어떤 시스템에서는 표지는 효소외에 다른 물질, 예를들어 비타민류, NAD, FAD 또는 비오틴이고, 그럼에도 불구하고, 이들은 "모니터"반응에 연결되어질수 있다.
이 형태의 예는 미국특허 제4,383,031호이다. 이들 시스템에서 모니터 반응은 표지의 활동성을 변경하는 구조적 변화에 기초를 두고 있다.
다른 균질한 분석법시스템은 편광화 형광의 기술을 포함한다. 여기서, 분석물은 고분자량의 특이적 결합대상물과 결합하기위해 저분자량의 형광콘주게이트와 경쟁한다. 형광의 편광화는 소분자가 대분자의 표면으로부터 제거될때 변화하기 때문에 용액에서 분석물의 양을 결정할수 있다.
이 분석시스템의 예는 미국특허 제4,668,640호이다.
균질한 분석시스템의 또다른 형태는 비방사성에너지 전이를 포함한다. 이들 시스템에서는 두분자가 밀접히 근접했을때 한분자로부터 다른분자로 빛이 흡착되는 것을 모니터 반응으로 사용한다. 일반적으로 이들방법은 두가지로 설명된다. 한방법은 첫째 분자가 화학발광적이고, 여기상태에서 생성된 전자기적 에너지의 일부분이 밀접히 접근되어야 하는 두번째 "흡수제"분자로 전이된다. 만약 에너지가 두번째 분자에 의해 흡수되어져 다른 파장으로 방출되면, 빛의 일부분은 흡수제분자와 밀접히 근접해 있는 화학발광분자의 수에 비례하여 스펙트럼 이동을 보여준다.
비방사성 에너지 분석시스템의 또다른 형태에서, 첫번째 분자는 형광을 내고 외부빛의 "흡수제"로서 작용한다. 두번째 형광분자의 존재에서 에너지의 일부분이 전이되어 빛이 다른 파장으로 방출된다. 방출된 빛은 서로 밀접히 접근한 "흡수제"및 "방출제"분자의 수에 비례하여 스펙트럼 이동을 보여준다.
이중 프로브분석시스템의 다른 형태는 미국 특허 제4,670,379호에 있다. 첫번째 프로브는 촉매로 표지되고 두번째는 아포발광기로 표지된다. 두 프로브는 표적핵산서열위의 인접한 영역을 표적으로 삼는다. 두프로브가 표적과 함께 혼성화되자마자 기질이 가해진다. 촉매는 기질을 변환 라디칼로 전환시키고 서열대로 두번째 프로브 아포발광기를 발광기로 전환시킨다.
이것은 단지 혼성화가 일어났을때 발생한다. 이 원리를 사용하여 동일한 분석물에 동시에 결합하는 2가지 표지된 물질을 근거로 분석법이 개발되었다.
이 형태의 에너지 전이 분석시스템의 특정예는 엘라자르등의 유럽특허 출원 제85105130.0호, 1985년 10월 30일에 발간된 공보 015719호에 있고 이것은 표적 유전물질의 동일한 또는 반대되는 스트랜드에 상보인 2개의 단일-스트랜드 핵산프로브을 사용한다. 각 프로브는 2개의 표지를 함께 가져올때만 신호를 생성할 능력이 있고 성분으로 표지된다.
여기에 기재된 본발명과는 달리, 엘라자르등은 이혼혼성체 또는 다중혼성체의 형성 및 검출을 포함하고 있다. 유사하게는 헬러등은 유럽특허출원 제82303699.1호, 공보 제0070685호(1983년 1월 26일 공개)에서 그리고 모리슨등은 유럽특허출원 제82303700.7호, 공보 제0070688호(위와같은 날)에서 2개의 발광기 프로브를 사용한 균질한 분석시스템을 개시하였다. 2개의 프로브가 표적에 혼성화되어질때 에너지 전이가 2개의 표지사이에서 일어나도록 광표지의 적어도 하나는 흡수제/방출제형태이다. 이것은 흡수제/방출제를 다른 파장에서 재 방출하게 한다. 두번째 방출은 혼성화를 검출한다. 이형태의 항원 분석법은 모리슨 등(상기 출원번호, 공개번호)에서 개시되었다.
대부분의 생물학적 물질은 어떤 알맞은 수준의 민감도에서 직접적으로 용이하게 검출될 수 없고 어떤 형태의 결합반응을 필요로 한다.
상기의 논술로부터 명백한것처럼, 이전의 방법은 결합표지 및 비결합 표지사이에 미세한 감쇠의 검출에 기초를 둔다.
종래기술 시스템은 결합 및 비결합 표지사이를 의미있게 구별할수 없다. 이러한 분석법은 단지 고농도로 존재하는 분석물을 검출하는데, 예를들면 혈액 및 뇨에서 여러가지 약물의 모니터에 유용하다.
표지의 안정성을 변경시키는 2개의 결합 대상물의 능력, 예를들면 결합 또는 비결합형태에서 표지의 선택적인 제거 또는 파괴를 일으키는데에 기초를 둔 직접 검출 균질한 분석법은 임상 진단학 분야에서 필요하다. 히르쉬필드는 J.Histochemistry and Cytochemistry, 27/1, 96-101(1979)에 개시한 전표백에 의한 형광배경구분에서 표지분자, 또는 최소한 그들의 형광을 파괴할 수 있는 광화학 수반하는 다소 유사한 전자공학 기술을 개시하였다.
여기에 개시된 본발명은 진단분석법에서 표지의 선택적 제거 또는 파괴를 위한 광화학 표백 또는 어떤 다른 기술을 나타내거나 제안하지 않는다. 본발명은 종래기술보다 더 민감한 크기의 오다이므로 진단 분석법에서의 현존하는 필요성을 충족시킨다. 종래기술의 민감도 범위는 10-13몰 범위보다 더 크지 않으나 본발명은 10-16몰 범위에서 민감하다.
(발명의 개요)
간단하게는 본발명은 진단분석법 및 진단방법을 포함한다. 방법은 특이적 결합쌍의 부분인 분석물을 배지에서 검출하는데 사용되어질수 있다. 분석물을 포함한다고 가정되어지는 배지가 결합 대상물과 연결될때, 결합대상물에 부착된 표지물질은 분석물이 특이적 결합 대상물에 결합될때마다 안정성 또는 차별적인 분해에서 검출가능한 변화를 일으킬 수 있다.
특정 구체예에서, 단일 스트랜드 핵산프로브는 실질적으로 어떤 원하는 위치 또는 프로브상의 위치에서 표지를 함유하게 변경되어진다. 프로브 표지는 핵산 서열이 프로브와 혼성화되어지는 여부에 좌우되어 다른 안전성의 것들이거나 프로브와 다른분해를 당하는 것이다.
명백하게는 본발명은 결합 프로브상의 표지가 비결합 프로브에 비하여 안정화되는 분석법시스템을 포함한다.
이 안정화 삽입(intercalation)에 의해 도움을 받을 수 있다.
아크리디늄 에스테르를 포함하는 DNA 삽입 화합물은, 특히 그러나 유일한 것은 아니나, 본발명 분석시스템에 적합하다. DNA 삽입제는 공지하는 바와같이 이중 DNA에 비공유적으로 결합되어 DNA의 이중나선의 염기쌍 사이에 삽입될수 있는 특징적인 평평한 분자이다. 본발명자는 아크리디늄 에스테르는 아데닌 및 티미딘 염기쌍이 풍부한 영역에 삽입되는 것이 바람직한 증거를 얻었다.
아래에서 본발명은 아크리디늄 에스테르-표지된 프로브에 대해 특별한 참고자료를 가지고 설명되어지는 한편, 본발명은 표지가 구성성분인 콘주게이트가 결합될때 차별적인 분해 또는 안정성에서의 변화에 민감하게되는 동일한 표지 및 분석법 형태의 사용을 기대한다.
여기에서 더 상세히 설명되어질 것처럼, 다른 적합한 표지화합물은 핵산에 존재하는 아민류, 특히는 비혼성화된 프로브상의 표지와 근접해 있는 아민류에 의해 탈안정화되는 물질을 포함한다. 더우기, 예를들면 염기쌍 사이에 삽입됨으로써 소수성환경과 상호작용할 수 있는 표지물질은 또한 사용될수 있다.
본발명은 결합 및 비결합 콘주게이트형을 비교했을때 표지의 선택적인 실질적인 분해를 포함하는 어떤 시스템에 일반적으로 적용된다. 더 나아가서, 어떤 분리 또는 세척단계를 포함하지 않는 분석시스템의 상대적인 간편성 때문에, 본발명은 종래의 시스템보다 더 빨리 그리고 더 저렴하다. 본발명은 표지의 결합 콘주게이트된 형태사이의 안정성에서 큰 차이가 있는 경우에 모든 잔기 또는 비결합 표지 콘주게이트가 파괴되고 그러므로 해서 검출되지 않기 때문에 종래 시스템보다 더 민감하다.
마지막으로 본 시스템은 매우 다양하고 혼자서 또는 다른 분리방법과 연결하여 매우 낮은 배경 잡음을 달성하는데 사용되어 질수 있다.
본발명은 감염 및 유전병 및 바이러스 질환 검출 그리고 암진단을 포함하는 프로브진단학에 유용하다.
(바람직한 구체예의 최선의 형태 및 상세한 설명)
다음의 정의는 본설명에서 사용되어 진다.
1. 아크리디늄 에스테르 : 4차 질소중심을 소유하고 9위치에 불안정 페닐에스테르기를 생성하도록 유도된 아크리딘 유도체, 특히, 4-(2-숙신이미딜옥시카르보닐에틸) 페닐-10-메틸아크리디아이늄-9-카르복실레이트 플루오로술폰산염
Figure kpo00001
2. 아크리디늄 에스테르 : 다음 일반식의 성분
Figure kpo00002
R1=알킬, 알케닐, 아릴, 치환된 알킬 치환된 알케닐, 치환된 아릴, 알콕시 아릴옥시, 또는 X가 할로겐일때는 없다.
R2=X=N일 경우에만, 수소, 알킬, 알케닐, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 아릴, 알콕시, 아릴옥시
R3=수소, 아미노, 하이드록시, 티올, 할로겐, 니트로, 아미노, 아미도, 아세틸, 알킬, 알케닐, 아릴, 치환된 아세틸, 치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 아릴, 알콕시, 아릴옥시
R4=알킬, 알케닐, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 아릴
X=산소, 질소, 황, 할로겐, 치환된 인, 치환된 황, 치환된 붕소, 치환된 비소
Y=산소, 황, 또는 NH
R1및/또는 R2및/또는 R3및/또는 R4는 화학적 콘주게이트를 허용하는 반응성 부위를 가지고 있다.
3. 분석물-제한없이 항원 및 그 항체 ; 헵텐 및 항체 ; 호르몬, 약물, 대사물질, 비타민류, 조효소 및 수용체를 포함하는 그들의 결합대상물; 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 그리고 폴리뉴클레오티드, 또는 올리고클레오티드의 혼합물 및 항체 그리고 그의 결합 물질; 폴리뉴클레오티드 또는 올리고 뉴클레오티드염 및 혼성화할수있는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 올리고 뉴클레오티드금속류 및 그의 킬레이트제를 포함하는 하나 또는 그이상의 특이적 결합 대상물과 결합반응을 일으킬수 있는 어떤물질
4. 결합 대상물-분석물과 특이적 결합반응을 일으킬수 있는 어떤분자 또는 물질
5. 이중구조-2개의 상보인 단일-스트랜드핵산분자의 어니일링시 형성된 이중-스트랜드 복합체
6. 혼성화-2개의 상보인 단일-스트랜드 DNA 또는 RNA 분자 사이에서 또는 DNA 및 상보인 RNA분자 사이에서의 안정한 이중구조의 형성은 상보인 염기쌍에 대해 특이적 이고 그에 의해 혼성화된 특이적 유전자의 유전적 암호를 복사한다.
7. 결합된-결합 상호반응이 한분자와 그의 특이적인 결합 대상물 사이에서 형성되는 조건
8. 안정한-화학적 또는 생화학적 분해, 반응, 분해, 치환 또는 변형에 저항성인
9. 안정성-화학적 또는 생화학적 분해, 반응, 분해, 치환 또는 변형에 대한 물질의 저항성
용액에서 아크리디늄 에스테르는 그들의 해당하는 염기와 평형상태로 존재한다는 것은 공지되어 있다. 높은 pH에서 염기 형성이 용이하다; 4차 질소중은 낮은 pH에서 재형성된다. 화학 발광반응은, 염기, 특히 과산화수소를 포함하는 수산화나트륨수용액을 가하므로 영향을 받을 수 있다는 것은 공지되어 있다. 화학발광은 아크리디늄종에 과산화수소이온이 공격함으로써 전자적으로 여기된 N-메틸아크리돈을 형성한다.
일반적으로 윅스등의 Clin, Chem, 2918, 1474-1479(1983)에 나와있는 면역분석법에서 고특이적 활동성 표지로서의 아크리디늄 에스테를 참고하라.
반응을 아래에 도표에 나타내었다.
Figure kpo00003
본발명은 다음과 같이 실행될수 있다.
첫째로, 결합물질을 포함하는 결합대상물 및 분석법을 수행하기 위해 하나 또는 그 이상의 결합 대상물을 선택한다.
이 쌍들은 항원 및 그의 항체; 합텐 및 그 항체; 호르몬, 약물, 대사물질, 비타민류, 조효소 및 수용체를 포함하는 그들의 결합대상물; 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 그리고 폴리뉴클레오티드 또는 올리고 뉴클레오티드 혼성물 및 항체와 그의 결합물질; 폴리뉴클레오티드 또는 올리고 뉴클레오티드, 및 혼성화 할수있는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 올리고 뉴클레오티드; 금속류 및 그의 킬레이트제일수 있다.
둘째로는, 이용하는 분석법 형태를 선택한다. 이것은 직접 결합분석법, 경쟁분석법, 연속 포화방법 및 샌드위치 분석법을 포함하는 형태에서 선택될수 있다.
셋째로는, 분석법을 수행하기 위해 표지를 선택한다. 이것은 직접 또는 간접적으로 비색계, 형광계, 화학발광계 또는 생발광계에 의해 검출될수 있는 표지일수 있다. 더우기 표지는 검출될수 있게 그것의 능력을 변경하도록 화학적 또는 생화학적으론 분해되어 질수있는 성질을 가져야만 하고, 상기의 분해는 표지된 결합 대상물과 그의 결합물질 그리고 다른 결합대상물과 반응에 참여할수 있는 결합물 사이에서의 결합에 역으로 효과를 주지않는 조건하에서 가능하다. 더 바람직한 표지는 산, 염기 또는 과산화물과 같은 선택적 산화제또는 효소에 노출후 그들이 검출되는 능력에 영향을 받는것들이다.
네째로, 공지된 화학적 방법을 사용하여, 표지를 결합물질에 화학적 또는 생화학적 분해에 대한 표지의 민감성이 표지된 결합 대상물과 그의 특이적 결합물질의 상호작용시 변경되어지는 그러한 부위에 부착한다.
어떤 경우에는 여러가지 다른 부위가 표지부착을 위해 시험될수 있고 가장 잘 차별적분해를 주는 부위가 사용될수 있다.
다섯째로, 화학적이거나 생화학적이거나, 그의 결합 물질의 존재 또는 비존재하에 표지된 결합대상의 가장 좋은 검출 구별을 주도록 분해조건을 최적화한다.
마지막으로, 미리 선택된 분석법 형태를 사용하여, 일반적으로 다음 단계를 이용해서 분석물을 정략적으로 또는 정성적으로 검출하는 분석시스템의 능력을 시험한다 :
a. 배양단계.
b. 선택적으로 분해 단계.
c. 검출단계, 또는
a. 동시에 배양 및 선택적으로 분해단계.
b. 검출단계.
본발명을 사용함으로써 화학 발광인 아크리디늄 에스테르로 표지된 올리고 뉴클레오티드 프로브는 혼성화를 통하여 서열-특이적 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 특히 유용하다. 아놀드등에 의해 "뉴클레오티드 프로브를 위한 비-뉴클레오티드연결시약"이라는 제목으로 1987년 9월 21일 출원된 미국특허 출원일련번호07/099,050에 개시된 것처럼 아크리디늄 에스테르는 DNA 프로브 및/또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 중합체상의 많은 다른 부위에 부착될수 있다.
이것은 올리고뉴클레오티드 염기, 인산염골격, 올리고 인산염의 3'-말단 및 5' 말단 그리고 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 중합체의 비-뉴클레오티드 단량체단위를 표지하는 능력이 있다는 것을 의미한다.
이러한 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브는 이들이 부착된 프로브가 혼성화되어 있을때와 비교하여 용액에 자유로이 있을때 중요한 차별적 화학적인 안정성을 보여줄수 있다.
이 차별적 안정성은 프로브에 있는 아크리디늄 에스테르의 위치, 아크리디늄 에스테르 표지 근처에 있는 뉴클레오티드 잔기 및 표적 뉴클레오티드와 안정한 혼성을 이루는 다른 프로브 분자의 존재에 좌우된다.
아래에 도표로 설명하였다.
Figure kpo00004
DNA 프로브 문자상의 아크리디늄 에스테르의 차별적 안정성에 기여하는 인자를 결정하는 과정에서 비혼성화된 프로브에 염기쌍의 유리아민류(뉴클레오티드 및 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 모두에서)는 아크리디늄 에스테를를 특히 알칼리 조건에서 탈안정화 시킨다는 것을 알수있다.
동시에, 만약 아크리디늄 에스테르가 프로브의 말단에 가까이 있을 경우 이것은 일단 혼성화가 일어나면 표적서열에 의해 기여된 아민류에 의해 알칼리에서 또한 탈안정화될 수 있다. 프로브가 일련의 서열-특이적 폴리뉴클레오티드(결합물질)과 혼성화 했을때 프로브 아민류는 상보의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이루는데 참여하여 아크리디늄 에스테르르 특히 알칼리 조건에서 탈안정화시키는 것이 억제되어 진다. 동시에 아크리디늄 에스테르는 혼성 이중구조로의 삽입에 의해 특히 아데닌/티미딘 염기쌍이 밀집된 영역에서 분해에대해 더욱 안정화 되어진다는 것을 알수있다. 다음장에서 설명되어지는 것처럼 많은 다른 삽입영역은 또한 좋은 차별적 가수분해를 일으킨다.
본발명은 혼성화에 적용될수 있는 여러가지 형태가 있다. 이것은 제한없이 다음을 포함한다 :
1. 아크리디늄 에스테르를 프로브의 중심영역 및 아데닌/티미딘 염기쌍 영역근처에 부착한다.
더 바람직한 방법은 아놀드등에 의해 "뉴클레오티드 프로브를 위한 비-뉴클레오티드 연결시약"이라는 제목으로 1987년 9월 21일 출원된 미국특허출원 일련번호07/099,050에 개시한 대로 아크리디늄 에스테르를 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 매우 인접한 뉴클레오티드와 상보인 뉴클레오티드 단량체 단위에 삽입물로서 부착되어 있는 비-뉴클레오티드 단량체 부위에 부작하는 것이다.
이러한 배치는 아크리디늄 에스테르의 양 부위상의 뉴클레오티드 염기의 아민류를 제한하여 삽입될수 있는 부위를 제공한다.
2. 아크리디늄 에스테르를 프로브가 3' 말단 또는 5'말단에 부착하여 첫번째 프로브에 인접한 혼성화 할수있는 두번째 프로브를 가진 표적폴리뉴클레오티드에 의해 기여된 인접아민의 효과를 억제한다. 이것은 또한 상기 언급한 두번째 프로브가 이중구조 형성상에 A/T 염기쌍의 풍부한 영역을 제공할 경우 바람직할수 있다. 이 이중 프로브 또는 샌드위치 시스템이 단지 하나의 이중구조대신 2개의 이중구조의 형성에 좌우될지라도, 이것은 매우 짧은 프로브, 즉, 약 5-15 뉴클레오티드 길이의 프로브에 의해 분별되어 질수 있는 미세한 염기쌍 변화를 민감하게 검출하는 방법을 제공할수 있다.
3. 아크리디늄 에스테르를 바람직한 표적 뉴클레오티드가 아닌 폴리뉴클레오티드서열을 가진 부적합부위나 또는 근처에 부착한다. 이 방법으로 단지 한 뉴클레오티드에 의해 구별되는 폴리뉴클레오티드 서열사이의 분별을 달성할 수 있다. 왜냐하면 부적합 부위주위의 이중구조영역은 충분히 탈안정성화되어서 아크리디늄 에스테르(만약 이것이 이 부위에 또는 이 부위 가까이 부착되어 있을 경우)를 분해하기 쉽게하기 때문이다.
상기 3가지 형태에 대한 더 바람직한 방법은 혼성화단계와 동일한 온도, 전형적으로는 50-70℃에서 차별적 가수분해를 유도하는 것이다.
또다른 방법은 실온에서 두번째 차별적인 가수분해 단계를 유도하는 것이다. 이것은 pH 10-11 범위의 사용을 허용하고 혼성화된 그리고 비혼성화된 아크리디늄 에스테르-표지된 프로브 사이의 가수분해 비율에서 훨씬 큰 차이를 생성한다.
정상 환경하에서 이러한 짧은 프로브는 적합한 혼성화조건하에서 단일 부적합물을 분별하는 능력을 가지고 있다. 그러나 실제적인 문제로서 그것들은 단일 폴리뉴클레오티드 부분에 충분히 특이적이지 않기 때문에 사용되지 않는다. 즉, 짧은 프로브는 많은 복합체 DNA 또는 RNA 서열내에 포함된 여러가지 특이적 부위와 혼성화할 수 있다. 2개의 다른 프로브가 인접한 폴리뉴클레오티드 영역에 직접적으로 혼성화되어야 하는 부가적 요구에 의해 이러한 영역은 특히 표적화되어져서 확인될 수 있다. 이와같이, 짧은 프로브 분별의 이익은 주프로브에 의해 측정된 영역의 특이성을 유지하는 동안 이용될 수 있다.
(실험방법 및 재료)
다음 실시예는 한정된 방법에 의하지 않고 예시로써 제공된다. 이들 실시예는 현재 이용할수 있는 자료및 현상의 가장 있음직한 설명에 근거를 두고 있다. 다른 인자 및 방법은 더많은 연구를 통해 명백해질수 있다. 비록 본발명은 아크리디늄 에스테르 표지를 사용하여 예시 및 실시예에 의해 상세히 설명되나, 특허청구범위내에서 어떤변화 및 변경이 실행될 수 있고 다른 표지시스템 또한 특허청구범위내에서 사용될수 있다.
제1도는 아크리디늄 에스테르-표지된 프로브의 HPLC 정제의 그래프도
제2도는 실시예 2에서 제시한 결과의 그래프도.
제3-5도는 실시예 3에서 제시한 결과의 그래프도.
제6도는 실시예 4에서 제시한 결과의 그래프도.
제7도는 실시예 5에서 제시한 결과의 그래프도.
제8도는 실시예 6에서 제시한 결과의 그래프도.
본 출원은 1987년 9월 21일자 엘. 제이. 아놀드 쥬니어와 엔. 씨. 넬슨의 미국출원 일련 번호 099,392의 부분 계속출원이다.
(배 경)
본발명은 미세한 양의 유기화합물을 검출하고 정량하는 진단방법 및 기술에 관한 것이다.
특히, 본발명은 표지의 안정성이 비결합형에 반하여 결합형에서 차이가 있음을 이용한 균질한 진단분석법에 관한 것이다. 본발명은 표지가 비복합형 또는 비결합형과 비교하여 복합(Complexed)형 또는 결합(bound)형에서 차별적으로 분해(degrade)되어지는 것을 이용한 진단분석시스템을 위한 환경의 구성에 관한 것이다.
아크리디늄 에스테르-표지된 프로브의 구조
A. 아민 링커-팔 프로브의 합성 및 정제
데옥시 올리고 뉴클레오티드 프로브는 5'-말단, 다인산염사슬을 따라 어떤 미리 선택된 위치, 프로브의 내부부분에 위치하거나 아니면 뉴클레오티드염기의 하나에 부착된 아민 링커-팔(즉, 아크리디늄 에스테르로 표지되기 위해 일차 아민을 말단에 가지고 있는것)을 함유하게 합성된다.
(i)
5'-아민 링커-팔을 프로브에 부착하기 위해, 다음 화합물이 이용된다 :
Figure kpo00005
(1)
지금까지 상기 화합물은 말단 아민 결합기-팔 시약으로 언급되었다. 이 시약은 다음과 같이 합성된다 :
6-아미노 헥산올을 무수에틸 아세테이트중에서 S-에틸트리플루오로티오아세테이트와 반응시킨다. 반응생성물을 석유에테르에 침전시키고 형성된 O-트리플루오로아세틸을 가수분해하기위해 10% 피리딘 수용액으로 10분간 처리하고, 증발시켜 고무형태로 건조시킨다. 이 화합물을 문헌에 있는 표준공정에 따라 아인산염화시켜서 원하는 화합물, 즉, 말단 아민 결합기-팔 시약(1)을 생성한다.
5'-아민 결합기-팔을 포함하는 프로브는 다음과 같이 합성된다. Applied Biosystems, Inc. Model 380 A DNA 합성기를 사용하여, 바람직한 뉴클레오티드 서열의 프로브를 표준 포르포르아미다이트 화학을 사용해서 제조하여 3'말단부터 5'말단의 프로브를 만든다.
원하는 서열을 완성후, 아민 결합기-팔은 또다른 포스포르아미다이트 뉴클레오시드가 연결되어지는 방법과 같은 방법으로 말단기 아민 결합기-팔 시약을 사용하여 프로브의 5'-히드록실기에 자동적으로 연결되어진다. 표준 프로토콜을 사용하여, 프로브를 고체지지체로 부터 쪼개어 탈보호시키고 폴리아크릴 아미드겔 전기영동법 및 이어서 세파덱스 G-25 크로마토그래피법으로 정제한다.
다음 프로브를 본 과정을 사용하여 합성하고 정제한다.
5'-NH2(CH2)6-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3'
여기서 NH2-(CH2)6는 아민 결합기-팔을 나타낸다.
(ii)
아민 결합기-팔을 프로브의 내부부분에 융합시키기위해, 내부 아민결합기-팔 시약을, 형태 1 또는 형태2를 아놀드 등에 의해 1987년 9월 21일에 출원한 "뉴클레오티드 프로브를 위한 비-뉴클레오티드 연결시약"이라는 제목의 미국특허출원 제099,050호에 상술된 바와 같이 사용한다. 다시, 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 프로브를 합성하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 세파덱스 G25 크로마토그래피법을 사용하여 정제한다.
다음 프로브를 이 공정에 의해 합성한다 :
1) E. coli로부터 얻은 rRNA의 16S보조단위에 상보인 30량체에서 서열의 18번 위치의 아데닌 잔기를 내부 아민 결합기-팔, 형태 1, 을 가지고 치환한다 :
Figure kpo00006
2) 클라미디아 트라코마티스로 부터 얻은 rRNA의 16S 보조단위에 상보인 33량체에서 서열의 21번 위치의 아데닌 잔기를 내부아민 결합기-팔, 형태 1, 로 치환하거나
Figure kpo00007
또는 잔기 21과 22사이에 삽입한다.
Figure kpo00008
(iii)
아민 결합기-팔을 함유하는 뉴클레오티드 염기를 다음과같이 프로브에 포함시킨다. 다음 서열을 가진 템플레이트 및 프라이머 올리고뉴클레오티드을 합성한다 :
템블레이트 3'-GCA ATG AGC CTA CGG GTT TAT AGC GG-5'
프라이머 5'-'CGT TAC TCG GAT GCC CAA AT-3'
(프라이머와 연장된 프라이머 서열은 C. trachomatis의 16S 보조단위에 상보이다)
BSA를 10X닉크 번역 완충액에서 뺀것을 제외하고는 Maniatis(참고문헌)에서 서술한 바대로 아민 결합기-팔 변경된 염기 아미노(12) dUTP(Calbiochem, 캘리포니아)을 포함시키기 위해 클레노우 조각을 사용하는 프라이머 연장을 수행한다. 결과적인 올리고머의 서열은 다음과 같다 :
CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA (아미노-12-U)CG CC.
프라이머 연장된 복합체의 경제는 NENSORB-20 카트리지(듀퐁)을 사용하여 제조자가 권하는 과정에 따라 수행된다.(프라이머 연장반응물을 컬럼에 적재하기전에 NENSORB 시약 A 900㎕를 가하여 희석한다. 정제된 올리고머는 50%메탄올로 용리하는데 메탄올을 진공에서 제거하였다.)
B. 아크리디늄 에스테르를 가지고 아민 결합기-팔 프로브를 표지하는법 및 후속 정제법.
25㎚의 아크리디늄 에스테르 원액을 증류된 DMSO에서 제조한다. 원하는 양의 프로브(상기의 A장에 표지된 다른 프로브의 목록을 참조하라)를 1.5㎖ 원추형 폴리프로필렌관에서 증발시켜 건조한다. 다음 혼합액을 적혀진 서열대로 가하여 제조한다 :
3㎕ H2O
1㎕ 1M HEPES(pH 8.0)
4㎕ DMSO(증류된)
2㎕ 25mM(증류된) DMSO중의 아크리디늄에스테르
혼합액을 섞어서 미세원심분리기에서 2초간 돌리고(내용물이 관의 밑으로 이동한다) 37℃에서 20분간 배양한다.
다음 성분을 반응혼합액에 적힌 서열대로 가한다.
3.0㎕ 25mM(증류된) DMSO중의 아크리디늄에스테르
1.5㎕ 물
0.5㎕ 1M HEPES(pH 8.0)
다시 혼합액을 섞어서, 돌리고 37℃에서 20분간 배양한다. 반응되지 않은 표지는 0.1M HEPES(pH 8.0)중의 0.125M 리신액 5㎕, 50% DMSO를 가함으로해서 5배 과도한 리신액을 사용하여 켄칭시키고 실온에서 5분간 배양한다.
아크리디늄 에스테르-표지된 올리고머를 다음 방법으로 정제한다. 켄칭된 반응혼합액 20㎕에 30㎕ 3M NaOAc(pH 5.0), 245㎕ 물 및 5㎕ 글리코겐을 담체로서 가한다.(글리코겐을 전처리하여 뉴클레아제활동성을 제거한다)
시료를 간단히 섞고 640㎕의 무수 EtOH를 가하였다. 샘플을 간단히 섞고 얼음 위에서 5-10분 배양하고 5분간 15,000rpm으로 미세 원심분리기에서 원신분리한다. 상징액을 주의깊게 제거하고 과립을 20㎕ 0.1M NaOAc(pH 5.0), 0.1% SDS에 재용해시킨다. 시료를 고성능액체 크로마토그래피법(HPLC)에 의해 아래 서술한대로 정제한다.
(i)
5' 및 내부 아민 결합기-팔을 함유한 AE-표지된 프로브를 다음과 같이 정제한다 : 20㎕의 재용해된 펠릿을 IBM
Figure kpo00009
9533 HPLC 시스템에 장치된 뉴클레오겐-DEAE 60-7 이온-교환 HPLC 컬럼에 주사한다.
모든 완충액은 HPLC 용 물, 아세토니트릴(CH3CN) 및 초산 나트륨(NaOAc)(Fisher Scientific), 그리고 시약용 빙초산(HOAc) 및 LiCl로 제조된다. 모든 완충액은 사용전에 0.45㎛ 구멍크기의 나일론-66 필터를 통하여 여과된다.
AE-프로브를 60%완충액 A/40% 완충액 B로 부터 30%완충액 A/70% 완충액 B까지 근성의 선형구배를 이용하여 1㎖/분의 유속으로 30분간 컬럼에서 용출시켰다(완충액 A=20mM 초산 나트륨, 20% CH3,CN, pH 5.5, 및 완충액 B=완충액 A중의 1M LiCl). 제1도는 전형적인 샘플의 용출 프로필을 나타낸다(이 경우 프로브는 상기 섹션 A.(i)에 기재된 26량체를 포함하는 5'-아민 링커 팔이다).
장치를 돌린 즉시, 5㎕의 10% SDS를 각 관에 가하고, 각 관을 섞는다(이것은 아크리디늄에스테르-표지된 프로브가 관의 벽에 부착되지 않게하기 위해 수행된다). - 0.5㎕의 부분표본을 분획 21-42로 부터 취하여, 12x75㎜ 관에들어 있는 200㎕물에 가한다(각 부분표본을 취하는데 묻어나는 문제점을 피하기 위해 별도의 피펫 팁이 사용된다.)
각 부분표본의 화학발광은 버톨드 클리니루마트에서 다음의 자동주사를 사용하여 결정한다. 200㎕의 0.25N HNO3, 0.1% H2O2주사; 1초 지연; 200㎕의 1N NaOH 주사; 10초 동안 화학발광된 출력을 읽는다.
분획 29-33은 다음과 같이 EtOH 침전된다 ; 각 분획에 5㎕의 글리코겐을 가하고 섞어서, 1㎖에탄올을 다시 가하고 섞은후 얼음위에서 5-10분간 배양하고 미세원심분리기에서 15,000rpm으로 5분간 원심분리한다. 각 상징액을 주의하여 제거하고, 펠릿을 20㎕의 0.1M NaOAc, pH 5, 0.1% SDS에 재용해하여 분획을 모은다.
본 방법으로, 고순도 아크리디늄 에스테르-표지된 프로브가 획득된다. 이러한 프로브의 비(比) 활동도는 일반적으로 올리고의 피코몰(pmol)당 5-10x107화학발광 계산치(Berthold Clinilumat)이다.
(ii)
아민 결합기-팔 변경된 염기(아미노-12-U)를 함유한 AE-표지된 프로브는 다음 설명을 제외하고는 일반적으로 상기 서술한 대로 정제된다 ; 바닥 C4역상 컬럼이 사용된다 ; 완충액 A는 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트(Applied Biosystems, Inc., Foster City, California)이고 완충액 B는 CH3CN이다; 표지된 프로브는 1㎖/분의 유속으로 25분간 10-15% 용매 B의 선형 구배를 사용하여 혼성물로서 용출된다. 중요한 화학발광 피이크는 상기 서술한 대로 확인되고 완성된다.
이전의 논술은 일반적으로 어떻게 프로브를 아크리디늄 에스테르로 표지하느냐 하는 방법을 서술하였다.
구체적 실시예에서, 프로브는 말단 및 내부에 표지되고 뉴클레오티드 염기에서 표지된다.
[실시예 2]
아크리디늄 에스테르로 내부적으로 표지된 혼성화 대 비혼성화 프로브의 pH6에서의 안정성 클라미디아 트라코마티스에 특이적인 내부적으로 표지된 33량체 프로브를 이전에 서술한대로(아데닌 치환, 형태 1 결합기-팔) 제조하였다. 프로브는 다음과정에 따라 그의 표적 rRNA(이경우에 클라미디아 트리코마티스)와 혼성화되었다 :
혼성화 혼합물
2㎕ AE-프로브(0.5pmol)
0.3㎕ 4%(중량 : 용적) SDS
5.8㎕ 1M 인산염 완충액(PB), pH5
4.4㎕ C. trachomatis rRNA(2㎍) 또는 대조를 위해서 4.4㎕몰.
혼성화 및 대조 혼합물을 60℃에서 40분간 배양하고 각 혼합물을 다음과 같이 하이드록시아페타이트 (HAP)를 사용하여 백분율 혼성화로 분석화한다. 혼성물 또는 대조혼합물의 0.1㎕ 부분표본을 2% HAP를 함유하는 0.14M PB, pH6.8의 200㎕에 가한다. 각각의 결과 혼합물을 5초간 섞고서, 60℃에서 5분 배양하고, 20초 섞은후, 15,000rpm에서 30초간 미세원심분리기에서 원심분리한다.
상징액을 제거하여 보관하고, 200㎕의 0.14M PB, pH 6.8을 HAP 펠릿에 가한후, 10초간 섞고, 15,000rpm에서 30초간 미세원심분리기에서 원심분리한다. 상징액을 제거하여 보관하고 펠릿을 200㎕의 0.14M PB, pH 6.8에 재현탁시킨다.
현탁화된 HAP중 50㎕ 부분표본 및 2개의 상징액을 각각 아래에 서술한 바대로 화학발광에 대해 분석하고 백분율 혼성화 프로브, 즉 HAP와 연관된 백분율 화학발광신호를 계산한다.
혼성화된 프로브대 비혼성화된 프로브(즉, 대조물)의 안정성을 다음 공정에 따라 pH6에서 시험한다 :
안정성 시험 혼합액
12.3㎕ 상기의 혼성물 또는 대조물
50㎕ 1M PB, pH6
2.5㎕ 4%, SDS
65㎕ 물
이들 혼합액을 간단히 섞어서 5㎕부분표본을 즉시 취하고 (to) 아래 서술한 대로 화학발광을 위해 분석한다. 혼합액의 나머지는 60℃에서 배양하고 5㎕의 부분표본을 여러시점에서 취하여(아래를 보라)즉시 화학발광에 대해 분석한다.
각 시료의 화학발광은 시료 부분표본을 12×75mm 관에 있는 200㎕물에 가하여 클리니루매트(200㎕ 0.25N HNO3, 0.1% H2O2의 자동 주사, 1초 지연후에 계속해서 200㎕ 2M 칼륨 PB,pH 13.2을 자동주사하고 10초동안 화학발광을 읽는다)에서 화학발광을 측정함으로써 측정된다.
결과 :
1 : 백분율 혼성화(HAP 분석)
혼성물-96%
대조물-1.3%(비특이적 결합)
2 : 시간진행에 따른 안정성
도면 제2도를 보라
이 결과는 혼성화된 프로브가 파괴 및 화학발광의 손실(화학발광의 손실에 대한 반감기는 3370분이다)에 대해 잘 보호되어있다는 것을 의미하며, 한편 비혼성화된 프로브는 파괴 및 화학발광의 손실에 대해 매우 민감하다(반감기는 29.2분으로 혼성화와 비혼성화된 프로브 사이의 차이는 115배이다). 이 자료는 여기 서술한 균질한 분석법의 능력을 즉, 혼성화와 비 혼성화된 프로브 사이의 분별적 안정성을 부여하고 측정함으로써 표적 DNA 서열을 찾아낼수 있는 능력을 보여준다.
[실시예 3]
아크리디늄 에스테르로 내부적으로 표지된 혼성화된 프로브 대 비혼성화된 프로브의 pH9에서의 안정성.
내부적으로 표지된 프로브(실시예 1에서 서술한 모두 3개의 내부적으로 표지된 33량체 프로브를 시헌함다)을 그의표적 rRNA(이 경우에 클라미디아 트리코마티스)와혼성화시켜 실시예 2에서 서술한 바대로 백분율 혼성화에 대해 분석한다.
혼성화 대 비혼성화 프로브(즉, 대조물)의 안정성이 다음 공정에 따라 pH 9에서 시험된다 :
안정성 시험 혼합액
5㎕ 상기의 혼성물 또는 대조물
45㎕ 0.2M 붕산나트륨, pH 9
혼합물을 배양하고 시료로 만들어 실시예 2에서 서술한 대로 혼합발광에 대해 분석한다.
결과 :
1. 백분율 혼성화(HAP 분석)
a. 아데닌 치환, 형태 1 결합기-팔
혼성물-95%
대조물-0.5%(비특이적 결합)
b. 삽입, 형태 1 결합기-팔
혼성물-98%
대조물-0.3%
c. 삽입, 형태 2 결합기-팔
혼성물-98%
대조물-0.2%
2. 시간에 따른 안정성
제3도 내지 제5도를 보라. 제3도는 아데닌 치환, 형태 1 결합기-팔에 관한 도면이고; 제4도는 삽입, 결합기-팔에 관한 도면이고; 제5도는 삽입, 형태 2 결합기-팔에 관한 도면이다.
실시예 2에서 처럼, 혼성된 프로브는 분해에 대해 방어적이나 빈혼성된 프로브는 그렇지 않다.
이것은 모든 3형태의 내부적 표지된 프로브에 대해서도 사실이다.
이 실시예에서, 붕산 나트륨은 상승된 pH에서 본 공정을 가속화시키는 한편(실시예 2와 비교하여) 혼성화 및 비혼성화된 프로브사이의 차별적 변성특징은 그대로 유지한다.
[실시예 4]
인접한 프로브를 가진 혼성물 대 비-혼성물로서 아크리디늄 에스테르로 말단-표지된 프로브의 pH 6에서의 안정성,
본 실시예는 서열이 5'-CCG GAC CGC TGG CAA CAA AGG ATA AGG GTT GC-3'인(표준 포스포르아미다이트 화학을 사용함으로써 제조된다) 프로브를 사용하고, 이것은 본 실시예에서 사용된 AE-표지된 프로브(아래를 보라)의 5'-말단에 매우 인접한 E. coli rRNA 혼성화되고, 그것에 의해 아크리디늄 에스테르 표지 근처에 있는 표적 rRNA의 모든 아민류의 캡핑업(capping off)을 가져온다.
아크리디늄 에스테르로 말단-표지된 프로브(실시예 1에서 서술된 제법)(이후에는 AE-프로브로 표기한다) 및 상기 서술한 인접한 프로브을 다음 공정에 따라 혼성화한다 :
혼성화 혼합물 대조혼합물
1㎕ AE-프로브(0.25pmol) 1㎕ AE-프로브(0.25pmol)
2㎕ E. coli rRNA(2㎍) 5.4㎕ 물
4.3㎕ 인접한 프로브(12pmol) 5.8㎕ 1M PB, pH 5
0.3㎕ 4% SDS 0.3㎕ 4% SDS
7.5㎕ 1M PB, pH5
혼성화및 대조 혼합물을 60℃에서 40분간 배양한후 실시예 2에서 서술한대로 하이드록시아페타이트를 사용하여 백분율 혼성화에 대해 분석한다.
인접한 프로브를 가진 혼성화된 프로브 대 비혼성화된 프로브(즉, 대조물)의 안정성은 실시예 2에 서술한 대로 정확하게 pH 6에서 시험되었다.
결과 :
1. 백분율 혼성화(HAP 분석)
혼성물-93.5%
대조물-2.7%(비특이적 결합)
2. 시간에 따른 안정성
제6도를 보라.
실시예 2에서 처럼, 또한 인접한 프로브를 가진 경우 혼성화된 AE-프로브는 분해로 부터 보호를 받으나 비혼성화된 프로브는 그렇지 않다. 보호는 실시예 2와 같은데 이것은 하나대신 2개의 혼성화에 좌우되기 때문이다.
[실시예 5]
인접한 프로브를 가진 혼성물 대 비-혼성물로서 아크리디늄에스테르로 말단-표지된 프로브의 pH 9에서의 안정성 혼성화는 실시예 4에 서술한 대로 정확하게 실행된다. 인접한 프로브를 가진 혼성화된 프로브대 비혼성화된 프로브(대조물)의 안정성은 다음과 같은 안정성시험 혼합액의 조성을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2에 서술한 대로 정확하게 pH 9에서는 시험되었다 :
5㎕ 혼성물 또는 대조물
50㎕ 0.2M 붕산나트륨, pH 9.0
인접한 프로브를 가진 혼성화된 AE-프로브는 분해로 부터 보호를 받으나 비혼성화된 프로브는 그렇지 않다. 실시예 3에서 처럼, 상승된 pH에서 붕산나트륨은 공정을 가속화하나 혼성화 및 비혼성화된 프로브사이의 차별적인 분해특징은 여전히 유지한다. 이들 결과의 도면은 제7도를 보라.
[실시예 6]
혼성물 대 비-혼성물로서 아크리디늄 에스테르로 말단-표지된 프로브의 pH 6에서의 안정성 프로브는 다음 공정에 따라 그의 표적 rRNA(이경우 E.coli)로 혼성화된다 :
혼성화 혼합물 대조혼합물
1㎕ AE-프로브(0.25pmol) 1㎕ AE-프로브(0.25pmol)
2㎕ E. coli rRNA(2㎍) 5.4㎕ 물
5.8㎕ 1M PB, pH5 5.8㎕ 1M PB, pH 5
0.3㎕ 4% SDS 0.3㎕ 4% SDS
3.4㎕ 물
혼성화 및 대조 혼합물을 60℃에서 40분간 배양한후 실시예 2에서 서술한대로 하이드록시아페타이트를 사용하여 백분율 혼서와에 대해 분석한다.
혼성화된 프로브 대 비혼성화된 프로브(대조물)의 안정성은 실시예 2에 서술한 대로 정확하게 pH 6에서 시험되었다.
결과 :
1. 백분율 혼성화
혼성물-94%
대조물-2.7%(비특이적 결합)
2. 시간에 따른 안정성
제8를 보라.
분해에 대한 차별이 이전 실시예에서 처럼 크지는 않으나 비 혼성된 프로브는 혼성화된 프로브와 비교하여 더 우선적으로 분해한다. 이것은 단지 아민류의 일부분이 아크리디늄 에스테르표지의 근처에서 캡팽업되기 때문이다.
사실은, 이것은 또한 혼성화된 인접한 프로브의 존재 및 부재에서 혼성화된 말단-표지된 프로브사이를 구별할수 있는 능력을 추가로 증명한다.
[실시예 7]
뉴클레오티드 염기상에서 아크리디늄 에스테르로 표지된 혼성화된 프로브대 비 혼성화된 프로브의 pH 7.6에서의 안정성
뉴클레오티드 염기(아미노-12-U) 상에서 실시예 1에서 서술한 아크리디늄에스테르로 표지된 프로브를 그의 표적 rRNA(이 경우는 C.trachomatis)로 다음공정에 따라 혼성화한다.
혼성화 혼합물
0.1M 숙신산 리튬, pH 5.4
10% 라우릴황산 리튬
2㎍ AE-프로브 1.3pmol
총 용적-30㎕
혼성화 및 대조 혼합액을 80℃에서 5분간 배양하고 60℃에서 60분간 배양한다. 결과 용액을 0.1M 숙신산 리튬(pH 5.4), 10% 라우릴 황산리튬으로 각각 300㎕로 희석하고 실시예 2에서 서술한대로 하이드록시아페타이트를 사용하여 백분율 혼성화에 대해 분석한다.
혼성화 대 비혼성화된 프로브(대조물)의 안정성을 다음 프로토콜에 따라 여러가지 동일하게 제조된 시료를 가지고 pH 7.6에서 시험하였다 :
안정성 시험 혼합액
15㎕ 상기의 혼성물 또는 대조물
100㎕ 0.2m 4붕산나트륨 pH 7.6, 5% 트리톤 X-100
이들 혼합액을 60℃에서 배양하고 시료를 여러시점에서 취하여 화학발광을 200㎕의 0.1M 과산화수소의 자동주사, 1초지연, 200㎕의 1N NaOH의 자동주사 및 5초동안 화학발광의 판독을 이용하여 Gen-Probe leaderTMI 발광계를 사용하여 결정한다. 이들 자료로부터 가수분해율을 회구분석에 의해 결정한다.
결과 :
1. 백분율 혼성화(HAP 분석)
혼성물-53.8%
대조물-0.5%
2. 안정성
에스테르 가수분해의 반감기(분) 반감기율
혼성물 대조물 혼성물/대조물
13.6 1.3 10.5
이전의 실시예에서 처럼, 이들 자료는 프로브의 염기에 부착된 표지의 경우에 혼성화된 프로브는 분해에 대해 보호되나 비혼성화된 프로브는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 이것은 AE부착에 대해 다중부위는 여기서 기술한 균질한 보호분석법에서의 사용에 적합 하다는 원리를 보여준다.
[실시예 8]
rRNA 및 DNA 표적을 사용하여 다양한 서열 이량체부위에서 아크리디늄 에스테르로 내부적으로 표지된 혼성화된 프로브대 비혼성화된 프로브의 pH 7.6에서의 안정성 내부 결합자-팔, 형태 "X"를 함유하고 다양한 서열 이량체부위(아래를 보라)에서 삽입된 프로브를 실시예 1에서 서술한대로 합성하고 AE로 표지하여 정제한다. 이 프로브의 서열 및 연결자-팔 위치는 다음과 같다 :
Figure kpo00010
이 프로브는 80℃에서 배양하는 단계를 제외하고는 실시예 7에 서술한 대로 혼성화하고, 사용된 표적 핵산의 양과 형태는 다음과 같다 :
Figure kpo00011
혼성화 대 비혼성화 프로브의 안정성은 실시예 7에서 서술한대로 pH 7.6에서 시험하였다.
결과 :
Figure kpo00012
이들 자료는 결합자-팔(및 그러므로 AE)은 매우 다양한 형태의 서열 이량체 부위에 삽입될수 있고 혼성화된 형태에서 에스테르가수분해에 대해 여전히 실질적으로 보호될수 있다.
더우기, 본 실시예는 DNA표적은 이 균질한 분석법 형태를 사용할때 혼성화된 AE-프로브를 잘 보호한다는 것을 보여준다.
또한 본 실시예는 여기 사용된(9 원자) 결합자-팔은 본 특허에서 일찌기 인용한 다른 결합자-팔과 본질적으로 동등한 차별적인 가수분해 비율을 생성하여 매우 다양한 결합자-팔 길이가 여기 서술한 HPA 형태에서 사용될수 있다는 것을 보여준다.
[실시예 9]
완벽하게 적합한 표적 대 하나의 부적합을 가진 표적으로 혼성화된 내부적으로 표지된 AE-프로브의 pH 7.6에서의 안정성
E. coli로 부터 얻은 rRNA의 16S 보조단위와 상보의 24량체 프로브를 잔기 6과 7 사이에 내부 아민 결합자-팔, 형태 "X"을 삽입함으로써 합성한다. 프로브는 실시예 1에서 서술한대로 아크리디늄 에스테르로 표지되고 정제된다.
서열은 다음과 같다(#=결합자-팔 위치) :
5'-CAA GCT# TGC CAG TAT CAG ATG CAG-3'
이 프로브는 C. diversious의 16S 보조단위로 위치 6에 (프로브 스트랜드의 5' 말단부터 번호를 붙여서) 단 하나의 T-G 부적합을 가지고 있다.
프로브는 실시예 8에 서술한 공정에 따라 그의 표적 rRNA(이경우에 E. coli 또는 C. diversious)와 혼성화된다.
비혼성화된 프로브의 시료뿐만아니라 결과적인 혼성화된 프로브의 안정성이 실시예 7에서 서술된 대로 pH=7.6에서 시험된다.
Figure kpo00013
* HAP 분석(실시예 2에 서술)이 73% 혼성화를 나타내기 때문에, 에스테르가수분해의 낮은 반감기는 낮은 혼성화 정도에 기인하지 않는다.
이 자료는 완전히 적합한 표적과의 혼성물의 경우에, AE-프로브는 에스테르가수분해(이전의 실시예들에서 서술)로 부터 보호되나 단하나의 염기 부적합을 포함하는 표적과의 혼성물에서는 AE-프로브는 보잘것 없이 보호된다는 것을 보여준다. 이것은 완전한 표적과 단하나의 부적합 표적사이에서의 AE-프로브의 가수분해율에서 17배차이를 일으킨다. 그러므로, 여기에 서술한 방법은 단하나의 염기차이를 포함한 핵산표적들 간에 쉽게 분별할 수 있다.
[실시예 10]
아크리디늄 에스테르로 내부적으로 표지된 혼성화된 프로브대 비혼성화된 프로브의 여러조건하, 실온에서의 안정성
내부적으로 표지된 프로브(삽입, 형태 1; 실시예 1을 보라)는 실시예 8에서 서술한 대로 1㎍의 C. trachomatis rRNA와 혼성화 된다. 혼성화된 프로브 대 비혼성화된 프로브의 안정성을 실시예 7에 서술한 공정에 따라 여러가지 시약 및 pH 조건하에(결과를 보라) 실온에서 측정하였다.
결과 :
Figure kpo00014
* 피탄산 시스템에서 가수분해 운동학은 2상이다.
"빠름"이란 가수분해의 초기, 빠른 상을 의미하고, "느낌"이란 가수분해의 후기, 느린상을 의미한다.
이들 자료는 매우 다양한 조건하에서 여러 서술한 균질한 보호분석법은 작용하며 넓은 범위의 분석법 조건에 적응할 수 있다는 것을 보여준다. 더우기, 붕산염 이외의 시스템은 적하한데, 예를들어 피탄산 시스템이 실온에서 높은 반감기 비율을 달성한다.
[실시예 11]
아크리디늄 에스테르로 내부 표지된 프로브를 사용하여 완충액에서 일련의 희석된 클라미디아 rRNA의 검출
내부적으로 표지된 프로브(실시예 2에서 처럼)를 다음 공정에 따라 혼성화하여 그의 표적 rRNA(이경우에는 Chlamydia trachomatis)의 양을 감소시킨다.
혼성화 혼합물
0.5㎕ 프로브(12.5fmol)
1㎕ RNA(10-2, 10-3, 10-4또는 10-5㎍)
2㎕ 20% SDS
1.7㎕ 물
4.8㎕ 1M PB, pH 6.8
대조혼합물은 rRNA 대신 물을 사용하는 것을 제외하고는 혼성화 혼합물과 같고, 시약 공시험(blank)혼합물을 프로브 대신 물을 함유하는 것을 제외하고는 대조혼합물과 같다. 혼합물은 60℃에서 20분간 배양된다.
혼성화후에 90㎕의 0.2M 붕산염, pH 9.0, 이 각 시료에 가해지고 60℃에서 14분간 배양된다. 각 시료는 주사 1이 단지 0.1% H2O2이고, 주사 2가 pH 13.2 대신 pH 13.8이며, 읽는 시간이 10초 대신 7초라는 것을 제외하고는 실시예 2에 서술한 대로 화학발광도가 측정된다.
결과 :
시약공시험-116rlu
대조물-124rlu
마이너스 대조물
10-5㎍ rRNA-126rlu 2rlu
10-4㎍ rRNA-210rlu 86rlu
10-3㎍ rRNA-126rlu 976rlu
10-2㎍ rRNA-126rlu 7685rlu
시약이 다른것은 2자료의 평균이다.
이결과는 여기 서술한 본발명은 순수한 완충계에서 약 10-4㎍의 민감도 제한으로 일련의 선형희석한 표적 rRNA를 검출할 수 있다는것을 보여준다.
[실시예 12]
아크리디늄에스테르로 내부적으로 표지된 프로브를 사용하여 임상배지에서 일련의 희석한 클라미디아 rRNA의 검출
내부적으로 표지된 프로브(실시예 2에서 처럼)는 임상견본(인후면봉)에서 혼성화되어 다음공정으로 따라 그의 표적 rRNA(여기서는 Chlamydia trachomatis)의 양을 감소시킨다 :
혼성화 혼합물
50㎕ 인후면봉
6㎕ 4.8M PB, pH 4.7
2㎕ rRNA(3×10-4, 3×10-3, 3×10-2또는 3×10-1㎍)
2㎕ 프로브(1pmol)
대조혼합물은 rRNA 대신 물을 함유하는 것을 제외하고는 혼성화 혼합물과 동일하고 시약 공시험 혼합액을 프로브 대신 물을 함유하는 것을 제외하고는 대조혼합물과 같다. 혼합물은 60℃에서 60분간 배양된다.
혼성화한후에 각 혼합물의 1/3(20㎕)을 50㎕의 0.2M 붕산염, 최종 pH=9(혼성화 혼합물을 가한후)에 가하고, 60℃에서 40분간 배양한다. 각 시료는 실시예 11에서 서술한 대로 화학발광도에 대해 측정한다.
결과 :
시약공시험-163rlu
대조물-6560rlu
마이너스 대조물
10-3㎍ rRNA-8535rlu 1975
10-2㎍ rRNA-27306rlu 20746
10-1㎍ rRNA-258194rlu 251634
자료는 2개 수치의 평균이다.
이들 자료는 여기에서 서술한 본발명은 임상배지를 함유하는 계에서 약 10-3㎍의 민감도 한계에서 일련의 선형희석한 표적 rRNA를 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
[실시예 13]
아크리디늄에스테르로 내부적으로 표지된 프로브를 사용하여 뇨에서 일련의 희석한 박테리아 rRNA의 검출
E. coli에 대해 특이적인 내부적으로 표지된 30량체 프로브를 이전에 서술한 대로(아데닌치환, 형태 1링커-팔) 제조한다. 프로브는 뇨에서 다음 과정에 따라 감소하는 양의 그의 표적 rRNA(이경우에는 E.coli)에 혼성화시켰다.
혼성화 혼합물
76.6㎕ 뇨
0.4㎕ 0.25M EDTA, 0.25M EGTA
10㎕ 4.8M PB, pH 6.8
5㎕ 20% SDS
5㎕ 프로브(0.125pmol)
1㎕ RNA(10-3, 10+2또는 10-1㎍)
대조혼합물은 rRNA 대신 물을 함유하는 것을 제외하고는 혼성화 혼합물과 동일하고, 시약 공시험 혼합물은 프로브 대신 물을 함유하는 것을 제외하고는 대조혼합물과 동일하다. 혼합물은 60℃에서 30분간 배양된다.
혼성화 후에, 300㎕의 0.2M 붕산염, pH 9가 각 시료에 가해지고 60℃에서 16분간 배양된다. 각 시료는 실시예 11에 서술한 대로 화학발광도에 대해 측정된다.
결과 :
시약공시험-6845rlu
대조물-9250rlu
마이너스 대조물
10-3㎍ rRNA-9358rlu 8rlu
10-2㎍ rRNA-14055rlu 4805rlu
10-1㎍ rRNA-61800rlu 52550rlu
결과는 2중수치의 평균이다. 이 자료는 여기 서술한 본발명은 뇨를 함유한 계에서 약 5×10-3㎍ RNA의 민감도한계로 일련의 선형희석된 표적 rRNA를 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
[실시예 14]
아크리디늄에스테르로 내부적으로 표지된 프로브를 사용하여 임상배지에서 일련의 희석한 클라미디아의 검출을 위해 분리단계와 연결하여 사용된 선택적 분해
내부적으로 표지된 프로브(실시예 2에서 처럼)는 실시예 8에서 서술한 대로 임상견본(인후면봉)에서 혼성화되고, 대조 및 공시험혼합물을 포함한다. 혼성화한후에, 각 혼합물의 1/3이 취해져서 실시예 8에 서술한 대로 정확하게 선택적 분해를 하는 한편 1/3은 간단히 취하여 실온에 방치해둔다(즉, 선택적이 아닌 분해).
두종류의 시료, 즉 선택적 분해가 있고 없는 시료를 실시예 2에 서술한대로 하되 다음과 같이 HAP를 사용하여 비혼성화된 프로브로 부터 혼성화된 프로브를 분리하게 한다.
a. 1㎖ HAP 용액을 사용한다(200㎕ 대신),
b. 1㎖ 세척용액을 사용한다(200㎕ 대신),
c. 3번 세척한다(1번 대신)
d. 최종 HAP펠릿을 세척용액 100㎕에 재현탁화시키고 전체가(실시예 2에서 서술한대로) 화학발광도에 대해 측정된다.
결과 :
Figure kpo00015
결과는 이미 제거된 시약공시험을 가진 2중수치의 평균이다. S : B=부호 : 배경 비율 즉, 특별한 rRNA 농도에서의 화학발광도를 대조물의 화학발광도로 나눈 것이다.
본결과는 분리하기 전에 선택적인 분해의 첨가는 낮은 배경을 주어서 높은 부호 : 배경비율을 일으켜서 민감하게 개선한다는 것을 보여준다.
[실시예 15]
차별적인 가수분해를 이용한 개선된 엄격성
다음 프로브는 내부 링커-팔, 형태 "X"(아래에서 #으로 표시한 삽입위치)를 함유하게 제조되고 아크리디늄 에스테르로 표지하고 실시예 1에서 서술한대로 정제된다.
ATT CCG CAC A#TG TCA AAA CCA G
본 프로브는 정확하게 Neisseria gonorrhoeae의 16S 보조단위에 상보성이다. 그러나 N. meningitidis와도 밀접한 관계가 있어서 교차반응 이 실시예 2와 8에서 인용한 혼성화 엄격한 조건하에서 전형적으로 관찰된다. 이 프로브는 실시예 8에서 서술한대로(200㎕를 제외하고는)0.5㎍ N. meningitidis와 혼성화한 다음, 1㎖의 0.2M 4붕산나트륨, pH 7.6 5% 트리톤 X-100에서 60℃ 온도로 10분 배양하여 차별적 가수분해(+D.H.)를 수행하거나 아니면 차별적 가수분해 조건(-D.H.)을 받게하지 않았다. 결과적인 혼성물은 자기적 미소구상에서 분리되어 아래 서술한대로 화학발광도에 대해 측정된다.
자기적 아민미소구(BioMag M4100, Advanced magnetic, Inc., Cambridge, Mass.) 150㎍을 함유하는 1㎖의 0.4M PB, pH 6.0을 가한다. 10초간 섞는다. 60℃에서 5분 배양한다. 10초간 섞는다. 자기적으로 용액으로부터 미소구를 페이스-메이트TM자기분리기(Gen-Probe, Inc., 샌디아고, CA)를 사용하여 분리한다. 용액을 따라 버린다.
미소구를 1㎖의 0.3M PB, pH 6.0을 가하고 10초 섞어서 자기적으로 분리하고 용액을 따라 버림으로해서 세척한다. 총 3번 반복한다. 혼성물을 300㎕의 0.2M PB, pH 6.0, 50% 포름아미드를 가하고 10초 섞어서 60℃에서 5분 배양하고 10초 섞어서 자기적으로 용액으로부터 미소구를 분리한다. 용액을 클리니루메트관에 이동해서 실시예 7에서 서술한대로 화학발광도를 측정한다.
결과 :
조 건 화학발광도*
-D.H. 178,034
+D.H. 748
* 혼성물신호-대조물(즉, rRNA가 없다) 신호, 상대적 광 단위(rlu)로 표시한다.
이 형태에서 정확한 표적(즉, N. gonorrhoeae)로부터의 신호는 전형적으로 7-10×10rlu이다.
결론적으로, 여기 서술한 차별적 가수분해기술의 증가되는 엄격성 분별단계로서의 적용은 바람직하지 않은 교차반응하는 서열의 신호를 아주 감소시킨다. 이 실시예에서 N. gonorrhoeae 프로브와 N.menigitidis의 교차반응은 200배보다 더 크게 감소되었다. 차별적 가수분해단계는 비혼성화된 프로브와 평형상태에 있는 불안정한 혼성물에 대한 민감도를 비혼성화된 형태에 있을때 프로브의 화학발광도(가수분해에 의해)를 계속 감소시키므로해서 증가시키고 교차반응에 기인한 화학발광도를 낮춘다.
[실시예 16]
아크리디늄에스테르로 내부적으로 표지된 프로브를 사용하여 만공골수성 백혈병과 연결된 개체변이의 표적서열의 검출
지시에 따라 삽입된 내부 링커-팔, 형태 "X"을 가진 24량체 프로브(아래 주어진 서열)를 합성하고 AE로 표지하여 실시예 1에서 서술된 대로 정제하였다. 이 프로브는 만성 골수성 백혈병(C㎖)과 연결된 개체 변이의 mRNA 전사(공통적인 손상)에 대해 상보이고 bcr/abl 프로브라고 불린다.
이 개체변이의 mRNA는 bcr유전자를 함유하는 또다른 염색체의 영역으로 abl유전자의 영역을 전위시키므로해서 형성된 개체변이 유전자의 생성물이다. bcr/abl 개체변이표적의 파괴점연결영역 및 동일영역에서 정상 bcr/abl표적을 보이는 합성 DNA 60량체 표적은 실시예 1에 서술한대로 합성된다(아래 주어진 서열).
또한 mRNA 표적은 파괴점 주위에 중심을 이루는 개체변이 bcr/abl 유전자의 450뉴클레오티드 조각을 포함한 pGEM 클론의 전사에 의해 생성된다. 프로브 감각에서 동일한 450뉴클레오티드 조각의 mRNA 전자는 네가티브 대조물로서 또한 생성된다.
BCR/ABL 프로브 서열
5'-CCGCTGAAGGGCTTTT*GAACTCTGC-3'
합성된 표적의 서열
BCR/ABL 표적
5'ACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACT-3'
ABL 표적
5'-ACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAATCTGTACTGCACCCTGGAGGTGGATTCCT-3'
위에 삽입한 별표는 아크리디늄에스테르 부착한 위한 링커-팔 삽입부위를 의미하고 밑줄은 abl서열을 나타낸다.
bcr/abl 프로브는 실시예 8에 서술한 바대로 위에서 열겨된 표적의 대략 1 pmol과 혼성화되고 이 혼성물과 비혼성화 된 프로브의 안정성은 실시예 7에서 서술한 대로 pH 7.6에서 시험된다.
결과 :
반감기(분) 비율*
표 적 : bcr/abl mRNA 27.7 39.6
bcr/abl DNA 15.0 21.4
대조물 : 프로브 감각 mRNA 0.7 1
abl DNA 0.7 1
bcr DNA 0.7 1
비혼성화된 프로브 0.7 -
* 표적 또는 대조물 반감기를 비혼성화된 프로브 반감기로 나눈것.
이 자료는 C㎖와 연결된 개체변이 bcr/abl mRNA 전사의 파괴점 연결영역을 연결하도록 지정된 AE-표지된 프로브는 여기 기술된 HPA기술을 사용하여 개체변이 목표와 정상적인 서열(및 비혼성화된 프로브)간에 구별할 수 있다는 것을 보여준다. 이것은 본 발명의 방법은 정성적이고 비-개체변이적인 구성성분 핵산의 존재하에 개체 변이 표적(전형적으로는 유전적인 장해와 관련된)를 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있다는 것일 보여준다.
더우기 본 실시예는 rRNA를 제외환 표적은 -mRNA 및 DNA의 경우에 -AG-표지된 프로브로 혼성화될 때 AE 가수분해에 대해 보호를 제공한다는 것을 보여준다.

Claims (9)

  1. 배지에서 제1핵산의 존재 또는 양을 측정하기 위한 균질분석법에 있어서, 유리의 제2핵산을 상기 배지와 접촉시켜 혼성화혼합물을 형성시키는 단계, 여기서 상기 유리의 제2핵산은 혼성화 조건하에 상기 제1핵산과 혼성화하여 결합쌍을 형성시킬 수 있으며, 또 상기 제2핵산은 산, 염기, 및 산화제로 구성되는 군으로 부터 선택된 화학 약품에 의한 화학적 분해에 선택적으로 민감한 N-아크리디늄에스테르에 화학적으로 결합되어 상기 제2핵산이 상기 결합쌍이 없는지 상기 결합쌍의 부분을 형성하는 지에 따라 변경된 N-아크리디늄 에스테르를 형성하며, 상기 혼성화 혼합물을 상기 화학약품으로 처리하여 유리의 제2핵산에 화학적으로 결합 된 N-아크리디늄에스테르는 분해되어 변경된 N-아크리디늄에스테르를 형성하고 결합쌍으로 존재하는 N-아크리디늄에스테르는 변성되지 않도록 하는 단계, 그리고 상기 결합쌍으로 부터 어떤 상기 유리의 제2핵산을 물리적으로 분리하는 일이 없이, 상기 제1핵산의 존재 또는 양의 척도로서 상기 처리 단계후 남아있는 분해되지 않은 N-아크리디늄에스테르의 양을 측정하는 단계들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분해되지 않은 N-아크리디늄에스테르의 양을 측정하는 단계는 H2O2의 첨가로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학약품은 산인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학약품은 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화학약품은 산화제인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 산은 HNO3인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 염기는 NaOH인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1핵산의 10-16몰의 검출을 허용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 N-아크리디늄에스테르는 다음 화학식으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure kpo00016
    상기식에서 X는 O,N,S, 할로겐, 인, 붕소 및 비소로 구성되는 군으로 부터 선택되며, Y는 O,S 또는 NH로 구성되는 군으로 부터 선택되며, R1은 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 구성되는 군으로부터 선택되거나, 또는 X가 할로겐일때는 R1은 없으며, R2는 X가 N일때 H, 알킬, 알케닐, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 구성되는 군으로 부터 선택되며, X가 N이 아닐때는 R2는 없으며, R3는 H, 아미노, 히드록시, 티올, 할로겐, 니트로, 아미도, 아세틸, 알킬, 아릴, 알케닐, 알콕시, 및 알릴옥시로 구성되는 군으로부터 선택되며, R4는 알킬, 알케닐 및 아릴로 구성되는 군으로 부터 선택되며, 여기서, R1,R2,R3및 R4중 적어도 하나는 화학적 콘주게이트를 허용하는 반응성 부위를 함유한다.
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