JP3787352B2 - ハイブリダイゼーション保護検定 - Google Patents
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Description
背景
本発明は診断方法および微少量の有機化合物を検知し、定量する技術分野のものである。
さらに詳しくは、本発明は、その非結合形と対立するものとしての結合形におけるラベルの安定性に差がある均一診断検定に関する。本発明はラベルがその非複合または非結合形と比べて、複合または結合形では異なって分解する診断検定システム用の環境の構成に関する。
発明の背景
診断検定はラベルされた結合試薬を用いて生物学的物質を検出し、位置を定め、または定量する一般的な分析技術である。ついで、ラベルされた試薬の存在を種々の公知の方法を用いて検出できる。本発明は直接結合検定およびコンペティションアッセイおよび逐次飽和(sequential saturation)を含め、制限なしに全ての公知の診断検定のフォーマットに適用できる。一つの具体的な診断検定は核酸のハイブリッド化検定である。ハイブリッド化検定システムは一本鎖核酸(DNAまたはRNA)が適当な環境の下で相補的一本鎖核酸によりハイブリッド化または組換えされる事実に基づくものである。容易に検出できるラベルで相補的プローブ核酸をラベルすることにより、一本鎖核酸配列を含むテスト試料中の目的とする標的ポリヌクレオチド配列の存在を検出することが可能である。
検定システムは広範には、不均一(heterogeneous)または均一(homogeneous)として特徴づけられる。検定システムに適用される「不均一」なる語は検出すべきラベルされない物質からラベルされた物質の分離を必要とする特異結合検定のシステムを意味する。一方、均一検定システムは何等、物理的分離工程を包含しない。均一検定システムは取扱い工程数が最小なので、一般に、不均一検定システムよりも便利で、使用が容易である。
例えば、典型的なサンドイッチイムノアッセイは固定化抗体をテスト媒体と共にインキュベイションすることを包含する。もし、抗原が媒体中にあれば、抗体と結合する。インキュベイション後、分離工程で非結合抗原を除去する。ラベルされた抗体溶液との第2もしくは同時インキュベイションの後、結合抗原は固定化抗体とラベルされた抗体の間で「サンドイッチ」される。第2の分離工程の後、培地中の抗原の量として、ラベルされた抗体の量を測定できる。このシステムは一連のインキュベイションおよび分離工程を包含するので時間がかかる。
診断検定に於け従来の技術における努力の焦点は均一検定と、非結合の目的物質に対立するものとしての結合した物質の量のわずかな差を区別できるラベルの開発に向けられている。本発明の一つの目的はラベル自体が、例えば、非結合のときに対して化学ルミネセンスの能力に検出できる変化を受ける検定システムである。本発明のもう一つの目的はラベルがその結合もしくは非結合形のいずれかで実質的に分解もしくは破壊され、それにより、目的とする反応を同定し、定量するすぐ使用できる手段を提供する検定システムである。
本発明は均一検定フォーマットを用いる分析物を感度良く検出する改良法を開示することを目的とする。また、本発明は本明細書に開示した均一法と他の分離法を組み合わせて非特異的バックグラウンドを減少させる分離を包含する検定の感度を増加させる改良法の提供も目的とする。本発明の原理はラベルの化学的もしくは生化学的試薬に対する安定性の差に基づく。本発明者は、ある種のラベルは結合相手と結合するときはいつも、該結合相手がそれに対する結合物質と結合するときに該ラベルの安定性が変化する、もしくは、しうることを見出した。また、本発明は該ラベル安定性の差を、均一診断検定システムを用いる分析物の感度良好な検出に採用できる方法を開示することを目的とする。本発明のさらにもう一つの目的は相補的標的ポリヌクレオチド配列の存在の感度良好な検出用の該均一診断検定における化学ルミネセント、アクリジニウエステル−ラベルDNAプローブの使用を開示することである。
従来技術の記載
従来技術には複雑さの異なる種々の均一検定がある。幾つかのシステムでは、例えば、ラベルは、他の成分の存在下に化学反応に関与できる触媒、例えば、酵素、補酵素およびコファクターである。関連するシステムであるが、他においては、ラベルは化学的もしくは生化学的反応の基質である。これらのシステムでは、特異的な容易に検出できる物質、例えば、グルコース、ラクテートまたはアルコールを用いて標的反応をモニターし、測定する。他の検定システムでは、ラベルが独特の物理的性質を有し、直接それを検出可能にしている。これらのラベルの例には、金属、ヘモグロビンおよびクロロフィルが包含される。
また、他の均一検定システムは酵素がカップリングした特異結合反応に基づくもので、分析物は特異結合反応のリガンドとなる。分析物が存在する場合、それは、特異的結合相手およびラベル物質からなる抱合体(conjugate)との特異的結合反応を受ける。同時あるいは続いて、ラベルと相互反応する他の物質を加える。ラベルの活性は、ラベルがその一つの成分である抱合体が複合形と非複合形の場合で異なる。このようなシステムは典型的にはラベル試薬として酵素を、また、比色定量、蛍光定量または化学ルミネセント終点を生ずる基質を用いている。均一エンザイムイムノアッセイの例には、米国特許第3654090号、第3817837号および第4190496号が包含される。蛍光発光物質(fluorescer)/蛍光消光物質ペアを生じる発色団の使用を包含する均一検定の他の例は米国特許第4199559号、第4171384号および第4318707号に見られる。しかし、幾つかのシステムでは、ラベルは酵素以外の物質、例えば、ビタミン、NAD、FADまたはビオチンであり、にもかかわらず、これらは「モニター」反応に連結できる。このタイプの例は米国特許第4383031号である。これらのシステムでは、モニター反応はラベルの活性を変化させる構造的変化に基づく。
他の均一検定システムは偏光蛍光の技術を包含する。ここでは、分析物が低分子量蛍光抱合体と、高分子量の結合相手に対する結合を争う。蛍光の偏光は小さい分子が大きい分子の表面からずれるときに変化するので、溶液中の分析物の量を測定するのが可能である。このタイプの検定システムの例は米国特許第4668640号である。
均一検定システムのさらに他のタイプには非輻射性エネルギー転移を包含する。これらのシステムでは、二つの分子が接近したときの一つの分子からの光の他への吸収をモニター反応として用いる。一般に、これらの方法は二通りに記載されている。一つの方法では、第1の分子が化学ルミネセントで、励起されると、発生した電磁気エネルギーの一部が、接近しているべき第2の「吸収体」分子に転移される。第2の分子がエネルギーを吸収し、異なる波長で発光すると、光の一部が、吸収体分子に接近している化学ルミネセント分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
他のタイプの非輻射性エネルギー検定システムでは、第1の分子が蛍光体で、外部の光の「吸収体」となる。第2の蛍光分子の存在下、エネルギーの一部が転移し、異なる波長で発光する。該発光は互いに接近した「吸収体」および「発光体」分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
ダブル・プローブ検定システムの別のタイプが米国特許第4670379号に見られる。第1のプローブは触媒でラベルされており、第2はアポ発光体(apoluminescer)でラベルされている。両方のプローブとも標的核酸配列の隣合う区域を目標とする。両方のプローブが一旦標的とハイブリッド化したら、基質を加える。触媒は基質を転換ラジカルに変え、これは順次、第2のプローブ上のアポ発光体を発光体(luminescer)に変える。これはハイブリッド化が起こったときだけ生ずる。これらの原理を用いて、共通の分析物に同時に結合する二つのラベルされた物質に基づく検定が開発されている。
このエネルギー転移検定システムのタイプの具体例は1985年10月30日に発行されたイレイザーら(Elazar et al)のヨーロッパ特許出願第85105130.0号(公開番号第0159719号)であり、標的遺伝子物質の同一または対立鎖を相補する二つの一本鎖核酸プローブの使用を開示している。各プローブは二つのラベルが集まったときだけシグナルを発生できる部分でラベルされている。本発明と異なり、イレイザーらダブル・ハイブリッドまたはマルチ・ハイブリッドの形成および検出を包含する。同様に、1983年1月26日に発行されたヘラーら(Heller et al)のヨーロッパ特許出願第82303699.1号(公開番号第0070685号)および同日の関連するモリソンら(Morrison et al)のヨーロッパ特許出願第82303700.7号(公開番号第0070686号)は二つの発光体プローブを用いる均一検定システムを開示している。光ラベルの少なくとも一つが吸収体/発光体タイプのもので、二つのプローブが標的とハイブリッド形成すると、二つラベルの間でエネルギー転移が起こるようになっている。第2の発光がハイブリッド形成を検出する。このタイプの抗原検定は前記モリソンらに開示されている。
大部分の生物学的物質はいずれの合理的な感度レベルでは容易に直接検出できず、あるタイプの結合反応が必要である。前記したところから明らかなように、従来技術は、結合および非結合ラベルの間を有意に区別できない。かかる検定は高濃度で存在する分析物の検出、例えば、血液御呼び尿中種々の薬剤のモニターのみ有用である。
臨床診断の分野においては、二つの結合相手のラベルの安定性を変える能力、例えば、結合または非結合形におけるラベルの選択的除去または破壊に基づく直接検出均一検定を必要としている。ヒルシェフィールド(hirshefield)はフルオレセンス・バックグラウンド・ディスクリミネイション・バイ・プレブリーチング(Fluorescence Background Discrimination by Prebleaching)、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・シトケミストリー(J. Histochemistry and Cytochemistry)、27/1、96−101(1979)はラベル分子または少なくともそれらの蛍光を破壊しうる光化学ブリーチングを包含する幾分関連した電子光学技術を開示しているが、本発明は光化学ブリーチングまたは診断検定におけるラベルの選択的除去または破壊をおこなう他の技術の使用を教示または示唆するものではない。本発明は従来技術よりも感度が数オーダー良好なので診断検定における現在の要求を満たすものである。従来技術の感度範囲は10−13モルの範囲より良くはないが、本発明は10−16モル範囲の感度である。
発明の概略
要約すると、本発明は診断検定御および方法からなる。該方法は媒体中の分析物の検出に使用でき、該分析物は特異的結合ペアの一部である。分析物を含有すると思われる媒体を結合相手と合すると、結合相手に結合しているラベル物質は、分析物が該特異的結合相手と結合するたびに安定性の検出できる変化または相違する分解を受ける。具体例においては、一本鎖核酸プローブがその上の実質的にいずれの所望の部分または場所にラベルを含むように修飾されている。プローブラベルは標的核酸配列がプローブとハイブリッド形成するか否かにより安定性の異なるものまたは相違する分解に感受性のものである。
特に、本発明は結合プローブ上のラベルが非結合プローブに関して安定化されている検出システムからなる。この安定化は挿入(intercalation)によって促進される。アクリジニウムエステルを含め、DNA挿入化合物は特に、しかし、専らではなく、本発明の検定システムに使用するのに適している。DNA挿入物は二本鎖DNAと非共有的に結合することが知られており、DNAの二重螺旋の塩基対間に挿入しうる特徴的な偏平分子である。本発明者らは、アクリジニウムエステル類がアデニンとチミジンの塩基対に富む領域に好んで挿入されるという証拠を持っている。
以下、特にアクリジニウムエステルでラベルされたプローブを参照して本発明を記載するが、本発明はラベルが成分である抱合体に結合する場合に相違する分解または安定性の変化に感受性な均等なラベルおよび検定フォーマットの使用も意図していると理解されるべきである。本明細書にさらに詳しく説明するように、他の適当なラベル化合物には核酸に存在するアミン、特に、非ハイブリッド化プローブ上のラベルの近傍のアミンにより不安定化される物質を包含する。さらに、疎水性環境と相互作用できる。例えば、塩基対の間への挿入によるラベル物質も使用できる。
本発明は一般に、結合形と非結合抱合体形を比較したときに、ラベルの選択的な実質的な分解を包含するいずれのシステムにも適用できる。さらに、いずれの分離または洗浄工程も含まず、検定システムが比較的単純な故に、従来のシステムよりも迅速で、経費が少ない。ラベルの結合および非結合抱合体形間の安定性に大きな差異がある場合、残余または非結合ラベル抱合体は実質的に全て破壊され、そのため、検出されないので、該システムは従来のシステムよりさらに感度が良くなる。最後に、該システムは非常に融通性があり、単独でも、また、他の分離方法と組み合わせても使用でき、非常に低いバックグラウンドノイズを達成できる。本発明は感染症、遺伝的およびウイルス病の検出および癌診断を含むプローブ診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
第1図はアクリジニウムエステル−ラベルプローブのHPLC精製を示すグラフである。
第2図は実施例2の結果を示すグラフである。
第3〜5図は実施例3の結果を示すグラフである。
第6図は実施例4の結果を示すグラフである。
第7図は実施例5の結果を示すグラフである。
第8図は実施例6の結果を示すグラフである。
ベスト・モードおよび好ましい態様の詳細な記載
本記載では以下の定義を用いる。
1.アクリジニウムエステル:第4級窒素中心を有し、その9−位で誘導体化され、不安定なフェニルエステル基を生じるアクリジンの誘導体、具体的には、4−(2−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル)フェニル−10−メチルアクリジアイニウム9−カルボキシレートフルオロサルフェート:
2.アクリジニウムエステル類:次の一般式の部分:
R1=アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシまたはX=ハロゲンの場合はなし。
R2=H、アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、もし、そしてX=Nのときだけ。
R3=H、アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミノ、アミド、アセチル、アルキル、アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ。
R4=アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール。
X=O、N、S、ハロゲン、置換リン、置換硫黄、置換ホウ素または置換ヒ素。
Y=O、SまたはNH。
R1および/またはR2および/またはR3および/またはR4化学的抱合を可能にする反応性部位を有する。
3.分析物−特に制限するものではないが、抗原およびそれに対する抗体、ハプテンおよびそれに対する抗体、ホルモン、医薬、代謝物、ビタミン、補酵素および受容体を含むその結合相手、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッドおよびそれらに対する抗体および結合物質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよびそれらとハイブリッド形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、金属およびそれに対するキレート剤を包含する一つ以上の特異的結合相手と結合反応する能力のあるあらゆる物質、特に、標的核酸含有配列。
4.結合相手−分析物と特異的結合反応することのできるあらゆる分子または物質、特に、核酸プローブ。
5.二本鎖構造:二つの相補一本鎖核酸分子のアニーリングにより形成される二本鎖複合体。
6.ハイブリッド化:二つの相補一本鎖DNAまたはRNA分子間またはDNAと相補RNA分子間の安定な二本鎖構造の形成。二本鎖構造形成は相補的塩基対に特異なものであり、それにより、ハイブリッド化した特定の遺伝子の遺伝コードが再生される。
7.結合:結合相互作用が分子とその特異結合相手の間で生ずる条件。
8.安定な:化学的または生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対する耐性のある。
9.安定性:化学的または生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対する物質の耐性。
アクリジニウムエステル類は溶液中で対応する塩基と平衡して存在することが知られている。高いpHにおいて、塩基形成が優性であり、第4級窒素種は低いpHで再形成される。化学ルミネセンス反応が塩基、特に、過酸化水素を含む水酸化ナトリウム水溶液の添加により影響されることも知られている。化学ルミネセンスはアクリジニウム種に対するヒドロペルオキサイドイオンによる攻撃を包含し、電子的に励起したN−メチルアクリドンを生成する。総括的に、ウイークス(Weeks)ら、「イムノアッセイにおける高特異的活性ラベルとしてのアクリジニウムエステル類」、クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.)、2918、1474−1479(1983)参照。該反応を以下に図式化する。
アクリジニウムエステル反応図
本発明は以下のように実施することができる。第1に、実施される検定用の結合物質と1以上の結合パートナーとからなる結合パートナーを選択する。これらの対は、抗原とその抗体;ハプテンとその抗体;ホルモン、薬剤、代謝産物、ビタミン、補酵素と受容体を包含するその結合パートナー;ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッドと抗体およびその結合物質;ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとそのハイブリッド化しうるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド;金属とそのキレート化剤である。
第2に、用いられる検定フォーマットを選択する。これらは、直接結合検定、競合検定、配列飽和法(sequential saturation methods)およびサンドイッチ検定からなるフォーマットから選択することができる。
第3に、実施される検定用のラベルを選択する。これは、直接または間接的に比色定量法、蛍光分析法、化学ルミネッセンス法またはバイオルミネッセンス法により検出できるラベルであればよい。加えて、該ラベルはその能力を修正し、検出されるように、化学的または生物学的に減成しうる特性を有し、かかる減成は、ラベル化結合パートナーとその結合物質および反応に関与するかもしれない他の結合パートナーとその結合物質の間の結合に悪影響を及ぼさない条件下にて可能である。好ましいラベルは、酸、塩基またはパーオキジデートまたは酵素のような選択的酸化剤を照射した後、その能力に影響を及ぼし、検出されるものである。
第4に、当業者に公知の化学方法を用い、化学または生物学的減成に対するラベル感受性が、ラベル化結合パートナーとその特異結合物質(類)との相互作用を修正するその部位にて、ラベルを結合物質に付着させる。ある場合には、複数の異なる部位をラベル結合について試験し、最も特異的な減成を与える部位を用いることができる。
第5に、その結合物質と共に、またはなしでラベル化結合パートナーの最適検出識別を付与する化学的または生物学的減成条件を最大限に活用する。
最後に、予め選択した検定フォーマットを用いて検定系の能力を試験し、一般に:
a.インキュベートし、
b.選択的に減成し、
c.検出するか、または
a.インキュベートと選択的減成を同時に行い、
b.検出する
の工程を用い、分析物を定性的にまたは定量的に検出する
本発明を用いる場合、化学ルミネッセンスのアクリジニウムエステルでラベル化したオリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーションを介する特異的ポリヌクレオチド配列の検出用に特に有用である。アクリジニウムエステルを、1987年9月21日出願の米国特許出願(まだ番号が付与されていない)、アーノルドら(Arnold, et al.)による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように、DNAプローブおよび/または混合ヌクレオチド/非ヌクレオチドポリマー上の多くの異なる部位にて付着させてもよい。これは、ヌクレオチド塩基、リン酸結合バックボーン、糖残基、オリゴヌクレオチドの3'末端および5'末端ならびに混合ヌクレオチド/非ヌクレオチドポリマーの非ヌクレオチドモノマー単位をラベル化する能力を包含する。
かかるアクリジニウムエステルラベル化プローブは、それらがハイブリッド化された場合と比較して、それらが付着するプローブが溶液中にてフリーである場合には、有意な異なる化学安定性を示しうる。この異なる安定性は、プローブにおけるアクリジニウムエステル、アクリジニウムエステルラベル付近のヌクレオチド残基の位置およびターゲットポリヌクレオチドと安定したハイブリッド物を形成する他のプローブ分子の存在に依存している。グラフ表示を以下に示す。
DNAプローブ分子におけるアクリジニウムエステルの異なる安定性に寄与する因子を測定する方法において、非ハイブリッド化プローブ(ヌクレオチドおよび混合ヌクレオチド/非ヌクレオチドの両方)の塩基上の遊離アミンが、特にアルカリ性雰囲気下にてアクリジニウムエステルを不安定にすることが判明した。同時に、アクリルジニウムエステルがプローブの末端に隣接している場合、いったんハイブリッド化が起こると、それはターゲット配列により寄与されたアミンによってアルカリに対して不安定となりうる。プローブが特異ポリヌクレオチド(結合物質)配列とハイブリッドを形成する場合、プローブアミンは相補性ヌクレオチドと対をなす塩基と関係し、特にアルカリ性条件下、アクリジニウムエステルを不安定にする能力は制限される。同時に、ハイブリッド・デュプレックス(hybrid duplex)、特に、アデニン/チミジン塩基対密度の部位に挿入することにより、アクリジニウムエステルはさらに減成に対して安定化することが判明した。以下のセクションにおいて説明されているように、多くの他の挿入部位もまた、良好な種々の加水分解を提供することが判明した。
本発明をハイブリダイゼーションに適用することができるいくつかの態様がある。これらは限定するものではない。
1.アクリジニウムエステルをプローブの中心部位およびアデニン/チミジン塩基対の隣接部位に付着させる。好ましい方法は、1987年9月21日出願の米国特許出願(まだ番号が付与されていない)、アーノルドら(Arnold, et al.)による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように、アクリジニウムエステルを非ヌクレオチドモノマー単位に付着させ、すなわち、ターゲットポリヌクレオチド配列のすぐ隣くにあるヌクレオチドに対して相補的であるヌクレオチドモノマー単位に挿入し、付着させることである。かかる配置は、アクリジニウムエステルの両端におけるヌクレオチド塩基のアミンを制限し、挿入用部位を提供するのに役立つ。
2.アクリジニウムエステルをプローブの3'または5'末端のいずれかに付着させ、第2のプローブとのターゲットポリヌクレオチドにより寄与されたアミンの付近の作用を制限し、第1のプローブの付近をハイブリッド化する。該第2プローブが、デュプレックス形成に基づくA/T塩基対に富んだ部位をクリエートする場合、それもまた望ましいことである。たとえこのダブルプローブまたはサンドイッチ系が、1つだけではなく、2つのデュプレックスの形成に依存しているとしても、非常に短いプローブ、すなわち、長さが約5〜15ヌクレオチドのプローブにより識別することができるマイナーな塩基対変化を敏感に検出する方法を提供する。
正常な状況下、かかる短いプローブは、適当なハイブリダイゼーション条件下にて単一のミスマッチを識別する能力を有する。しかしながら、それらは常套手段としては用いられていない。すなわち、該短いプローブは、存在する多数の複合DNAまたはRNA配列内に含まれる複数の特異部位をハイブリッド化するかもしれない。2つの異なるプローブが、すぐ隣のポリヌクレオチド部位をハイブリッド化しなければならないという条件下では、かかる部位は特異的にターゲットとされ、同定することができる。したがって、短プローブ識別の利点は、両方のプローブによりスパンされた部位の特異性を維持しながら利用できることである。
3.アクリジニウムエステルを、所望のターゲットポリヌクレオチドでないポリヌクレオチド配列とのミスマッチ部位にて、または付近にて付着させる。このように、ミスマッチ部位のまわりのデュプレックス域は有意に不安定化され、アクリジニウムエステル(仮にそれがこの部位にて、または付近にて付着している場合)は減成に対して影響されやすくなるため、わずか1つのヌクレオチドだけが異なるポリヌクレオチド配列の間の識別をも達成することができる。
4.プローブがターゲットとするハイブリッドの局所的な安定性をモニターするために、プローブのある部位にアクリジウムエステルを付着させる。
このように、アクリジウムエステルは、全体がハイブリッドデュプレックスを形成するのではなく局所的なハイブリッド部位が部分的に会合する条件下での、局所的なハイブリッドの安定性を着実にモニターするのに役立つ。
上記3つのフォーマットについて1つの好ましい態様は、ハイブリダイゼーション工程と同じ温度、典型的には50〜70℃にて、異なる加水分解工程を行なうことである。
別の態様は、別の異なる加水分解工程を室温にて行なうことである。これは、10〜11の範囲のpHを行い、ハイブリッド化と非ハイブリッド化アクリジニウムエステルラベル化プローブの間の加水分解速度に、より大きな差異をもたらす。
実験法および物質
以下の実施例は、例示であり、限定されるものではない。これらの実施例は、一般に利用可能なデーターおよび最も適当な現象の説明に基づくものである。他の因子および方法が、さらなる研究により明らかになるかもしれない。本発明はアクリジニウムエステルラベルを用いる例示および実施例により詳細に記載されているが、ある変形および修正を請求の範囲内で行なってもよく、他のラベル系もまた請求の範囲内で用いてもよい。
実施例1
アクリジニウムエステル-ラベル化プローブの組立て
A.アミンリンカー-アームプローブの合成および精製
デオキシオリゴヌクレオチドプローブを、プローブ内部の5'-末端、ポリリン酸鎖に沿ったある予め選択した位置のいずれかに位置する、または1つのヌクレオチド塩基に付着するアミンリンカーアーム(すなわち、アクリジニウムエステルでラベル化する第1級アミンにて終止するもの)を有するように合成した。
(i)
5'-アミンリンカー-アームをプローブに付着させるのに、以下の化合物を用いた:
この化合物は、これまで、末端アミンリンカー-アーム試薬と称されている。この試薬を以下のように合成した:無水酢酸エチル中、6-アミノヘキサノールをS-エチルトリフルオロチオアセテートと反応させた。反応精製物が石油エーテル中にて沈澱し、水中10%ピリジン混合物で10分間処理し、形成したO-トリフルオロアセチルを加水分解し、ガム状形に蒸発乾固した。ついで、この化合物を、文献(ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucleic Acids Research), 12(11), 4539(1984)参照)に記載されている標準的プロトコルに従ってホスフィチレート(phosphitylate)し、所望の化合物、すなわち、末端アミンリンカー-アーム試薬(1)を得た。
5'-アミンリンカー-アームを有するプローブを以下のように合成した。アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイション(Applied Biosystems, Inc.)のモデル・380A DNAシンセサイザーを用い、標準的ホスホルアミジト(phosphoramidite)化学に従い、所望のヌクレオチド配列のプローブを得、3'末端から5'末端のプローブを形成した。所望の配列が完了した後、アミンリンカー-アームは、別のホスホルアミジトヌクレオシドがカップリングするのと同じように、末端アミンリンカー-アーム試薬を用いて自動的にプローブの5'-ヒドロキシル基にカップリングした。標準的プロトコルを用い、ついで該プローブを固体担体から切断し、NH4OHを用いて脱保護し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、つづいてセファデックス(Sephadex)G-25クロマトグラフィーにより精製した。
以下のプローブを合成し、この操作に従い精製した:
(NH2-(CH2)6はアミンリンカー-アームを示す)
(ii)
アミンリンカー-アームをプローブの内部に組入るため、内部アミンリンカー-アーム試薬、タイプ1(4原子スペーサ、下記引用特許出願中のL1参照)、タイプ2(2原子スペーサ、下記引用特許出願中のL3参照)またはタイプL7(9原子スペーサ、引用特許出願中のL7参照)を、1987年9月21日出願の米国特許出願番号第099050号(特表平2−503146号)、アーノルドらによる「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように用いた。再度、プローブを標準的ホスホルアミジト化学を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびセファデックスG25クロマトグラフィーを用いて精製した。
以下のプローブはこの操作に従い合成した:
1.)イー・コリー(E.Coli)からの16SサブユニットrRNAに対する30merコンプレメンタリーは、内部アミンリンカー-アーム、タイプ1で、配列中の18位のアデニン残基を置き換える:
2.)クラミディア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)からの16Sサブユニットに対する33merコンプレメンタリーは、内部アミンリンカー-アーム、タイプ1で、配列中の21位のアデニン残基を置き換えるか、
または残基21と22の間に挿入する:
(iii)
アミンリンカー-アームを有するヌクレオチド塩基を、以下のようにプローブに挿入した。以下の配列を有する鋳型およびプリマーオリゴヌクレオチドを合成した:
鋳型3'− GCA ATG AGC CTA CGG GTT TAT AGC GG−5'
プリマー5'−CGT TAC TCG GAT GCC CAA AT−3'
(プリマーおよび伸長プリマーはシィ・トラコマティスの16Sサブユニットに対して相補的である。)
クレノー(Klenow)フラグメントを用いるプリマー伸長は、BSAが10×ニック・トランスレーション・バファーから省略することを除いて、モレキュラー クローニング,ア ラボラトリー マニュアル,ティー・マニアティス,1982,コールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ,パブリッシング(Molecular Cloning, A laboratory Mannual, T. Maniatis, 1982, Cold Spring Harbor Laboratories, Pubs.)に記載されているように行ない、アミンリンカー-アーム修正塩基アミノ(12)dUTP(カルバイオケム、カリフォルニア)(Calbiochem,California)を挿入した。したがって、得られたオリゴマーの配列は:
CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA(アミノ-12-U)CG CCである。
プリマー伸長複合体の精製は、NENSORB-20カートリッジ(デュポン)(DuPont)を用い、製造業者の奨励する方法に従い実施した。(プリマー伸長反応体は、カラムに充填する前に、NEN SORB試薬A900μlを加えて希釈した。該精製オリゴマーを50%メタノールで溶出し、ついでスピード-バク(speed-vac.)にて取り出した)。
B.アクリジニウムエステルを用いるアミノリンカー-アームプローブのラベル化および精製
アクリジニウムエステルの25mMストック溶液を、蒸留DMSO中にて調製した。所望量のプローブ(前記セクションAにおけるラベル化した種々のプローブのリスト参照)を、1.5mlの円錐形ポリプロピレン管にて蒸発乾固した。カクテルは以下の成分を列挙した順序にて加えることにより構成した:
3μl 水
1μl 1M HEPES(pH8.0)
4μl DMSO(蒸留)
2μl DMSO(蒸留)中、25mMアクリジニウムエステル混合物を撹拌し、マイクロ遠心分離機において2秒間スピンに付し(内容物を管の底に集中させる)、37℃にて20分間インキュベーションした。ついで、以下の成分を、列挙した順序にて反応カクテルに加えた:
3.0μl DMSO(蒸留)中、25mMアクリジニウムエステル
1.5μl 水
0.5μl 1M HEPES(pH8.0)
カクテルを再度撹拌し、スピンし、37℃にてさらに20分間インキュベーションした。未反応ラベルは、5倍過剰のリシンを用い、0.1M HEPES(pH8.0)、50%DMSO中、0.125Mリシンを加えることによりクエンチし、室温にて5分間インキュベートした。
ついで、アクリジニウムエステル-ラベル化オリゴマーを、以下の方法を用いて精製した。クエンチした反応混合物20μlに、担体として3M NaOAc(pH5.0)30μl、水20μlおよびグリコゲン5μl加えた(グリコゲンは予め処理し、いずれのヌクレアーゼ活性も除去した)。試料を簡単に撹拌し、無水エタノール640μlを加えた。該試料を簡単に撹拌し、氷上にて5〜10分間インキュベートし、ついでマイクロ遠心分離機において15000rpmにて5分間遠心分離に付した。上澄液を注意して除去し、ペレットを0.1M NaOAc(pH5.0)20μl、0.1%SDSに再度溶かした。ついで、試料を以下に記載のように高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製した。
(i)
5'および内部アミンリンカー-アームを有するAE-ラベル化プローブを以下のように精製した:再度溶解したペレットを、IBMR9533HPLC系に取り付けたヌクレオゲン-DEAE60−7イオン交換HPLCカラムに注入した。すべてのバファーは、フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)からのHPLCグレード水、アセトニトリル(CH3CN)および酢酸ナトリウム(NaOAc)、試薬グレードの氷酢酸(HOAc)およびLiClで調製した。すべてのバファーは、使用前に0.45μm孔径のナイロン-66フィルターを介して濾過した。試料を、第1図の記載(この場合、プローブは前記セクションAにおいて記載された26merを含有する5'-アミンリンカー-アームであった)のように溶出した。実験の直後、10%SDS5μlを各試験管に加え、つづいて各試験管を撹拌した(これにより、アクリジニウムエステルラベル化プローブを、試験管壁にこびりつけないようにした)。フラクション21〜42から0.5μl部を取り出し、12×75mm試験管の水200μlに加えた(各部において分離ピペットチップを用い、キャリーオーバーの問題を回避した)。ついで、各部の化学ルミネッセンスを、次の自動注入および読み配列を用いるバートホルド・クリニルマット(Berthold Clinilumat)において測定した:0.25N HNO3200μl、0.1%H2O2の注入;1秒後;1N NaOH200μlの注入;10秒間化学ルミネッセンス出力の読み。
ついで、フラクション29〜33を以下のようにEtOH沈澱させた:各フラクションにグリコゲン5μlを加え、撹拌し、EtOHlmlを加え、撹拌し、氷上にて5〜10分間インキュベーションし、マイクロ遠心分離機中、15000rpmにて5分間遠心分離に付した。各上澄液を注意して除去し、ペレットを0.1M NaOAc20μl、pH5、0.1%SDSに再度溶かし、フラクションをプールした。
このようにして、高純度のアクリジニウムエステルラベル化プローブを得た。かかるプローブの特異活性は、典型的には、オリゴマー1ピコモル当たり、5〜10×107化学ルミネッセンス光数(バートホルド・クリニルマット)であった。
(ii)
アミンリンカー-アーム修正塩基(アミノ-12-U)を有するAE-ラベル化プローブを、一般に、以下のことを除いて、前記のように精製した:バイダック(Vydac)C4逆相カラムをもちいた;緩衝液Aは0.1M酢酸トリエチルアンモニウム(アプライド・バイオシステムズ、インコーポレイション、カリフォルニア州、ホスター・シティー(Foster City))、緩衝液BはCH3CNであった;ラベル化プローブは、1ml/分の流速にて25分間において10〜15%溶媒Bの直線勾配を用い、ハイブリッドとして溶出した。ついで、主な化学ルミネッセンスピークを同定し、前記のように後処理した。
一般に、前記ディスカッションは、アクリジニウムエステルでプローブを合成し、ラベル化する方法を記載している。個々の実施例において、プローブは、末端および内部ラベル化、ならびにヌクレオチド塩基にてラベル化されている。
実施例2
アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのpH6における安定性
クラミジア・トラコーマティス(Chlamydia trachomatis)に対して特異的な内部標識化33merプローブを前記したごとく調製した(アデニン置換、タイプ1リンカー−アーム)。以下の手法に従い該プローブをそのターゲットrRNA(この場合はクラミジア・トラコーマティス)でハイブリッド化した。
ハイブリダイゼーション混合物
2μl AE−プローブ(0.5ピコモル)
0.3μl 4%(重量:容量)SDS
5.8μl 1M PB、pH5
4.4μl シイ・トラコーマティス rRNA(2μg)、または対照については4.4μl水
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を60℃にて40分間インキュベートし、その時点で、以下のごとくに、ヒドロキシアパタイト(HAP)を用い、各混合物を、パーゼントハイブリダイゼーションについて分析した。ハイブリッドまたは対照混合物の0.1μl分を、2%HAPを含有する0.14M PB、pH6.8、200μlに添加した。得られた各混合物を5秒間攪拌し、60℃にて5分間インキュベートし、20秒間攪拌し、次いで15000rpmにてミクロ遠心機で30秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、0.14M PB、pH6.8、200μlをHAPペレットに添加し、混合物を10秒間攪拌し、次いで15000rpmにてミクロ遠心機で30秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、ペレットを0.14M PB、pH6.8、200μlに再懸濁した。再懸濁HAPの50μlおよび2の上澄みの各々を以下に記載するごとく化学ルミネッセンスについて分析し、パーセントハイブリッド化プローブ、すなわちHAPに伴うパーセント化学ルミネッセンス信号を計算した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を以下の手順に従ってpH6にて試験した。
安定性試験混合物
12.3μl 前記からのハイブリッドまたは対照
50μl 1M PB、pH6
2.5μl 4% SDS
65μl 水
これらの混合物を軽く攪拌し、直ちに5μl分を取り出し(t0)、以下に記載するごとく化学ルミネッセンスについて分析した。混合物の残りを60℃でインキュベートし、各時間(後記参照)において5μl分を取り出し、直ちに化学ルミネッセンスについて分析した。
各試料の化学ルミネッセンスは、試料の一部を12x75mm試験管中の水200μlに添加し、クリニルマート(Clinilumat)(0.25N HNO3 200μl、0.1%H2O2を自動注入、1秒遅れて2M PBカリウム200μl、pH13.2を自動注入、10秒間の化学ルミネッセンスの読み取り)にて化学ルミネッセンスを測定することによって測定した。
結果:
1.パーゼントハイブリダイゼーション(HAP分析)
ハイブリッド−96%
対照−1.3%(非特異的結合)
2.安定性時間経緯
第2図参照
これらの結果は、ハイブリッド化プローブは分解および続いての化学ルミネッセンスの喪失に対してよく保護されているが(化学ルミネッセンスの喪失の半減期は3370分に等しい)、非ハイブリッド化プローブは分解および化学ルミネッセンスの喪失に対して非常に敏感である(半減期は29.2分に等しく、従って、ハイブリッド化および非ハイブリッド化の差は115倍に等しい)ことを示す。これらのデータは、本明細書中に記載する均一検定が、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ間に異なる安定性を付与し、それを測定することによって、ターゲットDNA配列の位置を決める能力を証明するものである。
実施例3
アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのpH9における安定性
内部標識化プローブ(実施例1に記載したすべての3つの内部標識化33merプローブを試験した)をそのターゲットrRNA(この場合はクラミジア・トラコーマティス)でハイブリッド化し、実施例2に記載したごとくにパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を以下のプロトコルに従ってpH9にて試験した。
安定性試験混合物
5μl 前記からのハイブリッドまたは対照
45μl 0.2ホウ酸ナトリウム、pH9
次いで、混合物をシンキュベートし、サンプリングし、実施例2に記載したごとくに化学ルミネッセンスについて分析した。
結果:
1.パーゼントハイブリダイゼーション(HAP分析)
a.アデニン置換、タイプ1リンカー−アーム
ハイブリッド−95%
対照−0.5%(非特異的結合)
b.挿入、タイプ1リンカー−アーム
ハイブリッド−98%
対照−0.3%
c.挿入、タイプ2リンカー−アーム
ハイブリッド−98%
対照−0.2%
2.安定性時間経緯
第3〜第5図参照。第3図はアデニン置換、タイプ1リンカー−アームについてのグラフであり;第4図は挿入、タイプ1リンカー−アームについてのグラフであり;第5図は挿入、タイプ2リンカー−アームについてのグラフである。
実施例2におけるごとく、ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド化プローブは保護されない。これは、内部標識化プローブのすべての3つのタイプについて当てはまる。本実施例においては、高いpHにおけるホウ酸ナトリウムが、ハイブリッド化プローブと非ハイブリッド化プローブとの間にまだ異なる分解特性を保持しつつ、(実施例2と比較して)この過程を加速することが示される。
実施例4
隣接プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのpH6における安定性
本実施例は、本実施例で用いるAE−標識プローブ(後記参照)の5’末端にすぐ隣接するイー・コリ(E. coli)rRNAにハイブリダイズし、それによってアクリジニウムエステル標識に近接するターゲットrRNA中のすべてのアミンの「キャップ除去」に導く(標準的なホスホルアミデイト化学を用いて調製した)配列5’−CCG GAC CGC TGG CAA CAA AGG ATA AGG GTT GC−3’のプローブの使用を含む。
アクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端(実施例1に記載した調製)(以下、AE−プローブという)および前記した隣接プローブを以下の手順に従ってハイブリダイズした。
7.5μl 1M、pH5
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を60℃にて40分間インキュベートし、次いで、実施例2に記載したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
隣接プローブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を実施例2に記載したごとくにpH6にて正確に試験した。
結果:
1.パーセントハイブリダイゼーション(HAP分析)
ハイブリッド−93.5%
対照−2.7%(非特異的結合)
2.安定性時間経緯
第6図参照
実施例2におけるごとく、ハイブリッド化AE−プローブ(この場合はやはりハイブリッド化した隣接プローブをもつ)は分解から保護されたが、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。該保護は実施例2と同じ程度良好であった。何故なら、1つの代わりに2つのハイブリダイゼーションに依存するからである。
実施例5
「隣接」プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのpH9における安定性
実施例4に記載したごとくにハイブリダイゼーションを正確に行った。以下に示す安定性試験混合物の組成以外は、実施例2に記載したごとくに、隣接プローブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性をpH9において正確に行った。
5μlハイブリッドまたは対照
50μl 0.2M ホウ酸ナトリウム、pH9.0
(やはりハイブリッド化された)隣接プローブをもつハイブリッド化AE−プローブは再び分解から保護されたが、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。実施例3におけるごとく、高いpHでのホウ酸ナトリウムは、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ間に異なる分解特性をなお保持しつつ、過程を加速した。これらの結果をグラフで示したものは第7図を参照されたい。
実施例6
ハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのpH6における安定性
以下の手順に従ってプローブをそのターゲットrRNA(この場合はコー・コリ)にハイブリダイズした。
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を60℃にて40分間インキュベートし、次いで、実施例2に記載したごとくヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を実施例2に記載したごとくにpH6にて正確に試験した。
結果:
1.パーセントハイブリダイゼーション
ハイブリッド−94%
対照−2.7%(非特異的結合)
2.安定性時間経緯
第8図参照。
非ハイブリダイズ化プローブは、これまでの実施例におけるほど分解の差は大きくなかったが、再び、ハイブリッド化プローブと比較してかなり分解した。これは、アミンの一部のみがアクリジニウムエステル標識の近接で「キャップ除去」されたからである。事実、これは、さらに、ハイブリッド化隣接プローブの存在下におけると非存在下におけるハイブリッド化末端−標識化プローブ間とを区別する能力を証明する。
実施例7
アクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基に標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのpH7.6における安定性
実施例1に記載したアクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基(アミノ−12−U)に標識化したプローブを、以下の手順に従って、そのターゲットrRNA(この場合はシィ・トラコーマティス)にハイブリダイスした。
ハイブリダイゼーション混合物
0.1Mコハク酸リチウム、pH5.4
10%ラウリル硫酸リチウム
2μg (0.1ピコモル AEプローブ)シィ・トラコーマティスrRNAまたは対照用水
合計容量−30μl
ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を80℃にて5分間、続いて60℃にて60分間インキュベートした。得られた溶液を、0.1Mコハク酸リチウム、pH5.4、10%ラウリル硫酸リチウムで各々300μlまで希釈し、実施例2に記載したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーゼントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を、以下のプロトコルに従い、いくつかの同一に調製した試料とともにpH7.6で試験した。
安定性試験混合物
15μl 前記からのハイブリッドまたは対照
100μl 0.2%テトラホウ酸ナトリウム、pH7.6、5%トリトン(Triton)X−100
次いで、これらの混合物を60℃にてインキュベートし、試料を種々の時点で取り出し、0.1M H2O2 200μlの自動注入、1秒遅れての1N NaOH 200μlの自動注入、および5秒間の化学ルミネッセンスの読み取りを使用するGen-Probe LeaderTM Iルミノメーター(Luminometer)を用いて化学ルミネッセンスを測定した。これらのデータより、加水分解速度を回帰分析によって決定した。
結果:
1.パーセントハイブリダイゼーション(HAP分析)
ハイブリッド−53.8%
対照−0.5%
2.安定性
これまでの実施例におけるごとく、これらのデータは、ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド化プローブ(この場合はプローブの塩基に付着した標識をもつ)は保護されないことを示す。これはAE付着についての本明細書中にて記載する均一保護検定で使用できる原理を示す。
実施例8
rRNAおよびDNAターゲットをともに用い各種配列ダイマー部位にてアクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブのpH7.6における安定性
種々の配列ダイマー部位(以下、参照)に挿入した内部リンカー−アーム、タイプ「L7」を含有するプローブを合成し、AEで標識化し、実施例1に記載したごとくに精製した。これらのプローブの配列およびリンカー−アームの位置は以下のとおりである。
80℃インキュベーション工程を省略し、かつ用いるターゲット核酸が以下のものである以外は実施例7に記載したごとくにこれらのプローブをハイブリダイズした。
実施例7に記載したごとく、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブの安定性をpH7.6にて試験した。
結果:
これらのデータは、リンカー−アーム(および、従って該AE)が広範囲の配列ダイマー部位に挿入でき、ハイブリッド化形態においてもエステル加水分解からなお実質的に保護されることを示す。さらに、本実施例は、これらの均一検定フォーマットで用いた場合、DNAターゲットがハイブリッド化AE−プローブの良好な保護を提供することを示す。また、本実施例は、ここで用いた長い(9原子)リンカー−アームが、広範囲のリンカー−アーム長が本明細書中に記載するHPAフォーマットで用いることができることを確立したこの特許で前で引用した他のリンカー−アームと実質的に同等の微分加水分解比を生じることも示す。
実施例9
完全に対合するターゲットでハイブリッド化したおよび単一のミス対合のターゲットでハイブリッド化した内部標識化AE−プローブのpH7.6における安定性
残基6および7の間に挿入された内部アミンリンカー−アーム、タイプL7を有するイー・コリからのrRNAの16Sサブユニットに相補的な24merプローブを合成した。次いで、実施例1に記載したごとくに該プローブをアクリジニウムエステルで標識化し、精製した。その配列は以下のとおりである(#=リンカー−アーム位置)。
このプローブはシイ・ディベルシウム(C.diversius)の16Sサブユニットとともに、位置6(プローブストランドの5’末端からの番号)に単一のT−Gミス対合を有する。
実施例8に記載した手順に従って、該プローブをターゲットrRNA(この場合はコー・コリまたはシイ・ディベルシウスいずれか)でハイブリダイズした。得られたハイブリッド化プローブならびに非ハイブリッド化プローブの試料の安定性を実施例7に記載したごとくにpH7.6にて試験した。
これらのデータは、完全に対合するターゲットでのハイブリッドの場合においても該AE−プローブは(これまでの実施例に記載したごとく)エステル加水分解から保護されるが、単一の塩基のミス対合を含むターゲットでのハイブリッドはほとんど保護されないことを示す。これは完全なターゲットと単一部位ミス対合ターゲットの間でAE−プローブの加水分解速度に17倍の差を生じさせる。従って、本明細書中にて記載する方法は単一の塩基の差を含む核酸ターゲット間を容易に識別区別できる。
実施例10
種々の条件下、室温におけるアクリジニウムエステルで内部ラベル化されたハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの安定性
内部ラベル化されたプローブ(挿入、タイプ1、実施例1参照)を実施例8に記載のシー・トラコーマティス(C.trachomatis)rRNA 1μgでハイブリッド化した。実施例7に記載の方法により、種々の試薬およびpH条件(「結果」参照)下、室温でハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの安定性を測定した。
結果:
これらのデータにより、広範囲の検定条件に適合できれば、ここに記載の均一保護検定が機能する種々の条件が存在することが示される。さらに、ホウ酸塩以外のフィチン酸塩系も可能であり、例えば、非常に高い半減期比が得られる室温でのフィチン酸系が挙げられる。
実施例11
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた緩衝液中のクラミジア(chlamydia)rRNAの希釈系列の検出
以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ(実施例2と同様の)をハイブリッド化し、その標的rRNA(この場合、クラミジア・トラコーマティス)の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
0.5μlプローブ(12.5fmol)
1μl RNA(10-2、10-3、10-4または10-5μg)
2μl 20% SDS
1.7μl H2O
4.8μl 1M PB、pH6.8
対照混合物はrRNAの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は60℃で20分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、pH9の0.2Mボレート90μlを各サンプルに添加し、60℃で14分間インキュベートした。ついで、インジェクション1が0.1%H2O2のみであり、インジェクション2のpHが13.2の代わりに13.8であり、読み取り時間が10秒の代わりに7秒である以外は実施例2に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果:
試薬ブランクおよび対照は3回平均を表し、その他はすべて2回平均を表す。
これらの結果により、ここに記載の発明は純粋の緩衝液系において約10-4μgの感度限界まで標的rRNAの線希釈系列を検出できた。
実施例12
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた臨床培地中のクラミジアrRNAの希釈系列の検出
以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ(実施例2のような)を臨床試料中でハイブリッド化し、その標的rRNA(この場合、クラミジア・トラコマチス)の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
50μlスロート・スワブ(throat swab)
6μl 4.8M PB、pH4.7
2μl rRNA(3×10-4、3×10-3、3×10-2または3×10-1μg)
2μlプローブ(1pmol)
対照混合物はrRNAの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は60℃で20分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、各混合物の1/3(20μl)を最終pH9の0.2Mボレート50μlに添加し(ハイブリッド化混合物した混合物の添加後)、60℃で40分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例11に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果:
データは2回測定値の平均を表す。
これらのデータにより、ここに記載の発明は臨床培地を含有する系において約10-3μgの感度限界まで標的rRNAの線希釈系列を検出できた。
実施例13
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた尿中の細菌rRNAの希釈系列の検出
内部ラベル化されたイー・コリ(E.coli)に対して特異的な30merプローブ(実施例2と同様の)を前記のように調製した(アデニン置換、タイプ1のリンカー・アーム)。以下の方法により、該プローブを尿中でハイブリッド化し、その標的rRNA(この場合、イー・コリ)の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
79.6μl尿
0.4μl 0.25M EDTA、0.25M EGTA
10μl、4.8PB、pH6.8
5μl 20% SDS
5μlプローブ(0.125pmol)
1μl RNA(10-3、10-2または10-1μg)
対照混合物はrRNAの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は60℃で30分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、各サンプルにpH9の0.2Mホウ酸塩300μlを添加し、60℃で16分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例11に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果:
結果は2回測定値の平均を表す。
これらの結果により、ここに記載の発明は尿を含有する系において約5×10-3μgの感度限界まで標的rRNAの線希釈系列を検出できた。
実施例14
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた臨床培地中のクラミジアrRMAの希釈系列の検出のための分離工程と組み合わせて用いる選択的分解
内部ラベル化されたプローブ(実施例2のような)を、対照およびブランク混合物を含む実施例8に記載するような臨床試料(スロート・スラブ)中でハイブリッド化した。ハイブリッド化後、各サンプルの1/3を取り除き、実施例8に記載のように正確に選択的分解に付し、一方、1/3を単純に取り除き、室温で保持した(すなわち、選択的分解を行わなかった)。すなわち、選択的分解を行ったサンプルと、行わなかったサンプルの両方を、以下の点で異なる以外は実施例2に記載のようにHAPを用いて非ハイブリッド化プローブから分離した:
a.1mlのHAP溶液を用いた(200μlの代わりに)、
b.1mlの洗浄液を用いた(200μlの代わりに)、
c.3回洗浄した(1回の代わりに)、
d.最終のHAPペレットを洗浄液100μl中で再懸濁させ、その全体について、ケミルミネッセンスを測定した(実施例2に記載のように)。
結果:
結果はすでに差し引いた試薬ブランクでを用いての2回測定値の平均を表す。S:Bはシグナルとバックグラウンドの比であり、すなわち、対象のケミルミネッセンスにより分割された特定のrRNA濃度でのケミルミネッセンスである。
これらのデータにより、分離前の選択的デグラデーションの付加によって高いシグナル−バックグラウンド比をもたらす低バックグラウンドとなるため、感受性を改良する。
実施例15
示差加水分解を用いる改良されたストリンジェンシー
以下のプローブをタイプL7(以下の記号#によって示される挿入位置)の内部リンカー・アームを含有するように構成させ、実施例1に記載のようにアクリジニウムエステルでラベル化し、そして精製した:
このプローブはナイセリア・ゴノルホエーエ(Neisseria gonorrhoeae)の16Sサブユニットに正確に相補的である。しかしながら、それはエヌ・メニンギチディス(N.meningitidis)と密接に関係し、実施例2および8で引用したハイブリッド化ストリンジェンシー条件下で交叉反応が典型的に観察される。実施例8に記載のように(200μlフォーマット中である以外は)、エヌ・メニンギティデイス0.5μgを用いてこのプローブをハイブリッド化し、pH7.6の0.2M四ホウ酸塩ナトリウム、5%トリトンX−100 1ml中、60℃で10分間インキュベートして示差加水分解(+D.H.)を行うか、またはこれらの示差加水分解条件(−D.H.)に付さなかった。得られたハイブリッドを磁気マイクロスフェア上で分離し、以下に記載のようにケミルミネッセンスを測定した。
磁気アミンマイクロスフェア(米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのアドバンスド・マグネチックス社製バイオマグM4100(BioMag M1400, Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, Mass.))150μgを含有するpH6.0の0.4M PB1mlを添加する。10秒間撹拌する。60℃で5分間インキュベートする。10秒間撹拌する。ペース・メート(Pace-Mte)(登録商標)磁気分離ラック(米国カリフォルニア州、サンディエゴのゲン・プローブ社(Gen-Probe, Tnc., San Diego, CA)を用いて溶液から球体を磁気的に分離する。液体を廃棄する。pH6.0の0.3M PB 1mlを添加し、10秒間撹拌し、磁気的に分離し、液体を廃棄することにより該球体を洗浄する。合計3回、洗浄を繰り返す。pH6.0の0.2M PB 300μlおよび50%ホルムアミドを添加し、10秒間撹拌し、60℃で5分間インキュベートし、10秒間撹拌し、ついで溶液から球体を磁気的に分離することによりハイブリッドを溶離する。該溶液をクリニルマット・チューブ(Clinilumat tube)に移し、実施例7に記載のようにケミルミネッセンスを測定する。
結果:
結論として、ここに記載の付加的なストリンジェンシー識別工程としての示差加水分解技術の適用により、所望でない交叉反応配列からのシグナルを非常に減少する。本実施例においては、エヌ・ゴルノホエーエ・プローブとエヌ・メニンギティディスの交叉反応は200フォルド(fold)以上に低下した。示差加水分解工程は、非ハイブリッド化形態にある場合にプローブのケミルミネッセンスを絶えず減少させ(加水分解により)ることにより、非ハイブリッド化されたプローブと平衡にある不安定なハイブリッドに対する感受性を増大させ、したがって、交叉反応によるケミルミネッセンスを低下させる。
実施例16
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた慢性骨髄性白血病と合したキメラ標的配列の検出
以下のように挿入したタイプL7の内部リンカー・アームを含有する24merのプローブ(以上に示す配列)を、実施例1に記載のようにAEでラベル化し、精製した:
このプローブは慢性骨髄性白血病(CML)と合したキメラmRNA転写(コモン・ブレーク)に相補的であり、bcr/ablプローブと呼ばれている。このキメラmRNAは、abl遺伝子の部位をbcr遺伝子を含有する他の染色体の部位に転座することにより形成されるキメラ遺伝子の産物である。
bcr/abl標的の切断個所接合部位を表す合成DNA 60mer標的および同じ部位中の正常bcrおよびabl標的は、実施例1に記載のように合成された(以下の配列)。また、mRNA標的は、切断個所の中央付近に位置するキメラbcr/abl遺伝子の450ヌクレオチド断片を含有するpGEMクローンの転写によって生成させる。プローブ・センス(probe sense)中の同様の450ヌクレオチド断片のmRNA転写を陰性対照として生成した。
前記のように挿入された星印(*)はアクリジニウムエステル付加のためのリンカー・アーム挿入位置を示し、下線部分はabl配列を示す。
実施例8に記載のように、前記の各標的約1pmolでbcr/ablプローブをハイブリッド化し、実施例7に記載のようにpH7.6でこれらのハイブリッドおよび非ハイブリッド化されたプローブの安定性を試験した。
結果:
これらのデータにより、CMLと合したキメラbcr/abl mRNA転写の切断個所接合部位をつなぐために設計されたAEラベル化プルーブが、ここに記載のHPA技術によってキメラ標的と正常の配列(および非ハイブリッド化プローブ)を識別することが示された。これは、正常な非キメラ核酸の存在下、特にキメラ標的(典型的には遺伝子疾患と合した)を検出するのに使用できる証拠である。
さらに本実施例により、rRNA以外の標的(この場合、mRNAおよびDNA)は、AEラベル化プローブにハイブリッド化された場合、AE加水分解に対する保護を与えることが示された。
本発明は診断方法および微少量の有機化合物を検知し、定量する技術分野のものである。
さらに詳しくは、本発明は、その非結合形と対立するものとしての結合形におけるラベルの安定性に差がある均一診断検定に関する。本発明はラベルがその非複合または非結合形と比べて、複合または結合形では異なって分解する診断検定システム用の環境の構成に関する。
発明の背景
診断検定はラベルされた結合試薬を用いて生物学的物質を検出し、位置を定め、または定量する一般的な分析技術である。ついで、ラベルされた試薬の存在を種々の公知の方法を用いて検出できる。本発明は直接結合検定およびコンペティションアッセイおよび逐次飽和(sequential saturation)を含め、制限なしに全ての公知の診断検定のフォーマットに適用できる。一つの具体的な診断検定は核酸のハイブリッド化検定である。ハイブリッド化検定システムは一本鎖核酸(DNAまたはRNA)が適当な環境の下で相補的一本鎖核酸によりハイブリッド化または組換えされる事実に基づくものである。容易に検出できるラベルで相補的プローブ核酸をラベルすることにより、一本鎖核酸配列を含むテスト試料中の目的とする標的ポリヌクレオチド配列の存在を検出することが可能である。
検定システムは広範には、不均一(heterogeneous)または均一(homogeneous)として特徴づけられる。検定システムに適用される「不均一」なる語は検出すべきラベルされない物質からラベルされた物質の分離を必要とする特異結合検定のシステムを意味する。一方、均一検定システムは何等、物理的分離工程を包含しない。均一検定システムは取扱い工程数が最小なので、一般に、不均一検定システムよりも便利で、使用が容易である。
例えば、典型的なサンドイッチイムノアッセイは固定化抗体をテスト媒体と共にインキュベイションすることを包含する。もし、抗原が媒体中にあれば、抗体と結合する。インキュベイション後、分離工程で非結合抗原を除去する。ラベルされた抗体溶液との第2もしくは同時インキュベイションの後、結合抗原は固定化抗体とラベルされた抗体の間で「サンドイッチ」される。第2の分離工程の後、培地中の抗原の量として、ラベルされた抗体の量を測定できる。このシステムは一連のインキュベイションおよび分離工程を包含するので時間がかかる。
診断検定に於け従来の技術における努力の焦点は均一検定と、非結合の目的物質に対立するものとしての結合した物質の量のわずかな差を区別できるラベルの開発に向けられている。本発明の一つの目的はラベル自体が、例えば、非結合のときに対して化学ルミネセンスの能力に検出できる変化を受ける検定システムである。本発明のもう一つの目的はラベルがその結合もしくは非結合形のいずれかで実質的に分解もしくは破壊され、それにより、目的とする反応を同定し、定量するすぐ使用できる手段を提供する検定システムである。
本発明は均一検定フォーマットを用いる分析物を感度良く検出する改良法を開示することを目的とする。また、本発明は本明細書に開示した均一法と他の分離法を組み合わせて非特異的バックグラウンドを減少させる分離を包含する検定の感度を増加させる改良法の提供も目的とする。本発明の原理はラベルの化学的もしくは生化学的試薬に対する安定性の差に基づく。本発明者は、ある種のラベルは結合相手と結合するときはいつも、該結合相手がそれに対する結合物質と結合するときに該ラベルの安定性が変化する、もしくは、しうることを見出した。また、本発明は該ラベル安定性の差を、均一診断検定システムを用いる分析物の感度良好な検出に採用できる方法を開示することを目的とする。本発明のさらにもう一つの目的は相補的標的ポリヌクレオチド配列の存在の感度良好な検出用の該均一診断検定における化学ルミネセント、アクリジニウエステル−ラベルDNAプローブの使用を開示することである。
従来技術の記載
従来技術には複雑さの異なる種々の均一検定がある。幾つかのシステムでは、例えば、ラベルは、他の成分の存在下に化学反応に関与できる触媒、例えば、酵素、補酵素およびコファクターである。関連するシステムであるが、他においては、ラベルは化学的もしくは生化学的反応の基質である。これらのシステムでは、特異的な容易に検出できる物質、例えば、グルコース、ラクテートまたはアルコールを用いて標的反応をモニターし、測定する。他の検定システムでは、ラベルが独特の物理的性質を有し、直接それを検出可能にしている。これらのラベルの例には、金属、ヘモグロビンおよびクロロフィルが包含される。
また、他の均一検定システムは酵素がカップリングした特異結合反応に基づくもので、分析物は特異結合反応のリガンドとなる。分析物が存在する場合、それは、特異的結合相手およびラベル物質からなる抱合体(conjugate)との特異的結合反応を受ける。同時あるいは続いて、ラベルと相互反応する他の物質を加える。ラベルの活性は、ラベルがその一つの成分である抱合体が複合形と非複合形の場合で異なる。このようなシステムは典型的にはラベル試薬として酵素を、また、比色定量、蛍光定量または化学ルミネセント終点を生ずる基質を用いている。均一エンザイムイムノアッセイの例には、米国特許第3654090号、第3817837号および第4190496号が包含される。蛍光発光物質(fluorescer)/蛍光消光物質ペアを生じる発色団の使用を包含する均一検定の他の例は米国特許第4199559号、第4171384号および第4318707号に見られる。しかし、幾つかのシステムでは、ラベルは酵素以外の物質、例えば、ビタミン、NAD、FADまたはビオチンであり、にもかかわらず、これらは「モニター」反応に連結できる。このタイプの例は米国特許第4383031号である。これらのシステムでは、モニター反応はラベルの活性を変化させる構造的変化に基づく。
他の均一検定システムは偏光蛍光の技術を包含する。ここでは、分析物が低分子量蛍光抱合体と、高分子量の結合相手に対する結合を争う。蛍光の偏光は小さい分子が大きい分子の表面からずれるときに変化するので、溶液中の分析物の量を測定するのが可能である。このタイプの検定システムの例は米国特許第4668640号である。
均一検定システムのさらに他のタイプには非輻射性エネルギー転移を包含する。これらのシステムでは、二つの分子が接近したときの一つの分子からの光の他への吸収をモニター反応として用いる。一般に、これらの方法は二通りに記載されている。一つの方法では、第1の分子が化学ルミネセントで、励起されると、発生した電磁気エネルギーの一部が、接近しているべき第2の「吸収体」分子に転移される。第2の分子がエネルギーを吸収し、異なる波長で発光すると、光の一部が、吸収体分子に接近している化学ルミネセント分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
他のタイプの非輻射性エネルギー検定システムでは、第1の分子が蛍光体で、外部の光の「吸収体」となる。第2の蛍光分子の存在下、エネルギーの一部が転移し、異なる波長で発光する。該発光は互いに接近した「吸収体」および「発光体」分子の数に比例したスペクトルシフトを示す。
ダブル・プローブ検定システムの別のタイプが米国特許第4670379号に見られる。第1のプローブは触媒でラベルされており、第2はアポ発光体(apoluminescer)でラベルされている。両方のプローブとも標的核酸配列の隣合う区域を目標とする。両方のプローブが一旦標的とハイブリッド化したら、基質を加える。触媒は基質を転換ラジカルに変え、これは順次、第2のプローブ上のアポ発光体を発光体(luminescer)に変える。これはハイブリッド化が起こったときだけ生ずる。これらの原理を用いて、共通の分析物に同時に結合する二つのラベルされた物質に基づく検定が開発されている。
このエネルギー転移検定システムのタイプの具体例は1985年10月30日に発行されたイレイザーら(Elazar et al)のヨーロッパ特許出願第85105130.0号(公開番号第0159719号)であり、標的遺伝子物質の同一または対立鎖を相補する二つの一本鎖核酸プローブの使用を開示している。各プローブは二つのラベルが集まったときだけシグナルを発生できる部分でラベルされている。本発明と異なり、イレイザーらダブル・ハイブリッドまたはマルチ・ハイブリッドの形成および検出を包含する。同様に、1983年1月26日に発行されたヘラーら(Heller et al)のヨーロッパ特許出願第82303699.1号(公開番号第0070685号)および同日の関連するモリソンら(Morrison et al)のヨーロッパ特許出願第82303700.7号(公開番号第0070686号)は二つの発光体プローブを用いる均一検定システムを開示している。光ラベルの少なくとも一つが吸収体/発光体タイプのもので、二つのプローブが標的とハイブリッド形成すると、二つラベルの間でエネルギー転移が起こるようになっている。第2の発光がハイブリッド形成を検出する。このタイプの抗原検定は前記モリソンらに開示されている。
大部分の生物学的物質はいずれの合理的な感度レベルでは容易に直接検出できず、あるタイプの結合反応が必要である。前記したところから明らかなように、従来技術は、結合および非結合ラベルの間を有意に区別できない。かかる検定は高濃度で存在する分析物の検出、例えば、血液御呼び尿中種々の薬剤のモニターのみ有用である。
臨床診断の分野においては、二つの結合相手のラベルの安定性を変える能力、例えば、結合または非結合形におけるラベルの選択的除去または破壊に基づく直接検出均一検定を必要としている。ヒルシェフィールド(hirshefield)はフルオレセンス・バックグラウンド・ディスクリミネイション・バイ・プレブリーチング(Fluorescence Background Discrimination by Prebleaching)、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・シトケミストリー(J. Histochemistry and Cytochemistry)、27/1、96−101(1979)はラベル分子または少なくともそれらの蛍光を破壊しうる光化学ブリーチングを包含する幾分関連した電子光学技術を開示しているが、本発明は光化学ブリーチングまたは診断検定におけるラベルの選択的除去または破壊をおこなう他の技術の使用を教示または示唆するものではない。本発明は従来技術よりも感度が数オーダー良好なので診断検定における現在の要求を満たすものである。従来技術の感度範囲は10−13モルの範囲より良くはないが、本発明は10−16モル範囲の感度である。
発明の概略
要約すると、本発明は診断検定御および方法からなる。該方法は媒体中の分析物の検出に使用でき、該分析物は特異的結合ペアの一部である。分析物を含有すると思われる媒体を結合相手と合すると、結合相手に結合しているラベル物質は、分析物が該特異的結合相手と結合するたびに安定性の検出できる変化または相違する分解を受ける。具体例においては、一本鎖核酸プローブがその上の実質的にいずれの所望の部分または場所にラベルを含むように修飾されている。プローブラベルは標的核酸配列がプローブとハイブリッド形成するか否かにより安定性の異なるものまたは相違する分解に感受性のものである。
特に、本発明は結合プローブ上のラベルが非結合プローブに関して安定化されている検出システムからなる。この安定化は挿入(intercalation)によって促進される。アクリジニウムエステルを含め、DNA挿入化合物は特に、しかし、専らではなく、本発明の検定システムに使用するのに適している。DNA挿入物は二本鎖DNAと非共有的に結合することが知られており、DNAの二重螺旋の塩基対間に挿入しうる特徴的な偏平分子である。本発明者らは、アクリジニウムエステル類がアデニンとチミジンの塩基対に富む領域に好んで挿入されるという証拠を持っている。
以下、特にアクリジニウムエステルでラベルされたプローブを参照して本発明を記載するが、本発明はラベルが成分である抱合体に結合する場合に相違する分解または安定性の変化に感受性な均等なラベルおよび検定フォーマットの使用も意図していると理解されるべきである。本明細書にさらに詳しく説明するように、他の適当なラベル化合物には核酸に存在するアミン、特に、非ハイブリッド化プローブ上のラベルの近傍のアミンにより不安定化される物質を包含する。さらに、疎水性環境と相互作用できる。例えば、塩基対の間への挿入によるラベル物質も使用できる。
本発明は一般に、結合形と非結合抱合体形を比較したときに、ラベルの選択的な実質的な分解を包含するいずれのシステムにも適用できる。さらに、いずれの分離または洗浄工程も含まず、検定システムが比較的単純な故に、従来のシステムよりも迅速で、経費が少ない。ラベルの結合および非結合抱合体形間の安定性に大きな差異がある場合、残余または非結合ラベル抱合体は実質的に全て破壊され、そのため、検出されないので、該システムは従来のシステムよりさらに感度が良くなる。最後に、該システムは非常に融通性があり、単独でも、また、他の分離方法と組み合わせても使用でき、非常に低いバックグラウンドノイズを達成できる。本発明は感染症、遺伝的およびウイルス病の検出および癌診断を含むプローブ診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
第1図はアクリジニウムエステル−ラベルプローブのHPLC精製を示すグラフである。
第2図は実施例2の結果を示すグラフである。
第3〜5図は実施例3の結果を示すグラフである。
第6図は実施例4の結果を示すグラフである。
第7図は実施例5の結果を示すグラフである。
第8図は実施例6の結果を示すグラフである。
ベスト・モードおよび好ましい態様の詳細な記載
本記載では以下の定義を用いる。
1.アクリジニウムエステル:第4級窒素中心を有し、その9−位で誘導体化され、不安定なフェニルエステル基を生じるアクリジンの誘導体、具体的には、4−(2−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル)フェニル−10−メチルアクリジアイニウム9−カルボキシレートフルオロサルフェート:
2.アクリジニウムエステル類:次の一般式の部分:
R1=アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシまたはX=ハロゲンの場合はなし。
R2=H、アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ、もし、そしてX=Nのときだけ。
R3=H、アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロゲン、ニトロ、アミノ、アミド、アセチル、アルキル、アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリールオキシ。
R4=アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール。
X=O、N、S、ハロゲン、置換リン、置換硫黄、置換ホウ素または置換ヒ素。
Y=O、SまたはNH。
R1および/またはR2および/またはR3および/またはR4化学的抱合を可能にする反応性部位を有する。
3.分析物−特に制限するものではないが、抗原およびそれに対する抗体、ハプテンおよびそれに対する抗体、ホルモン、医薬、代謝物、ビタミン、補酵素および受容体を含むその結合相手、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッドおよびそれらに対する抗体および結合物質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよびそれらとハイブリッド形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、金属およびそれに対するキレート剤を包含する一つ以上の特異的結合相手と結合反応する能力のあるあらゆる物質、特に、標的核酸含有配列。
4.結合相手−分析物と特異的結合反応することのできるあらゆる分子または物質、特に、核酸プローブ。
5.二本鎖構造:二つの相補一本鎖核酸分子のアニーリングにより形成される二本鎖複合体。
6.ハイブリッド化:二つの相補一本鎖DNAまたはRNA分子間またはDNAと相補RNA分子間の安定な二本鎖構造の形成。二本鎖構造形成は相補的塩基対に特異なものであり、それにより、ハイブリッド化した特定の遺伝子の遺伝コードが再生される。
7.結合:結合相互作用が分子とその特異結合相手の間で生ずる条件。
8.安定な:化学的または生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対する耐性のある。
9.安定性:化学的または生化学的崩壊、反応、分解、置換または修飾に対する物質の耐性。
アクリジニウムエステル類は溶液中で対応する塩基と平衡して存在することが知られている。高いpHにおいて、塩基形成が優性であり、第4級窒素種は低いpHで再形成される。化学ルミネセンス反応が塩基、特に、過酸化水素を含む水酸化ナトリウム水溶液の添加により影響されることも知られている。化学ルミネセンスはアクリジニウム種に対するヒドロペルオキサイドイオンによる攻撃を包含し、電子的に励起したN−メチルアクリドンを生成する。総括的に、ウイークス(Weeks)ら、「イムノアッセイにおける高特異的活性ラベルとしてのアクリジニウムエステル類」、クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.)、2918、1474−1479(1983)参照。該反応を以下に図式化する。
アクリジニウムエステル反応図
本発明は以下のように実施することができる。第1に、実施される検定用の結合物質と1以上の結合パートナーとからなる結合パートナーを選択する。これらの対は、抗原とその抗体;ハプテンとその抗体;ホルモン、薬剤、代謝産物、ビタミン、補酵素と受容体を包含するその結合パートナー;ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッドと抗体およびその結合物質;ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとそのハイブリッド化しうるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド;金属とそのキレート化剤である。
第2に、用いられる検定フォーマットを選択する。これらは、直接結合検定、競合検定、配列飽和法(sequential saturation methods)およびサンドイッチ検定からなるフォーマットから選択することができる。
第3に、実施される検定用のラベルを選択する。これは、直接または間接的に比色定量法、蛍光分析法、化学ルミネッセンス法またはバイオルミネッセンス法により検出できるラベルであればよい。加えて、該ラベルはその能力を修正し、検出されるように、化学的または生物学的に減成しうる特性を有し、かかる減成は、ラベル化結合パートナーとその結合物質および反応に関与するかもしれない他の結合パートナーとその結合物質の間の結合に悪影響を及ぼさない条件下にて可能である。好ましいラベルは、酸、塩基またはパーオキジデートまたは酵素のような選択的酸化剤を照射した後、その能力に影響を及ぼし、検出されるものである。
第4に、当業者に公知の化学方法を用い、化学または生物学的減成に対するラベル感受性が、ラベル化結合パートナーとその特異結合物質(類)との相互作用を修正するその部位にて、ラベルを結合物質に付着させる。ある場合には、複数の異なる部位をラベル結合について試験し、最も特異的な減成を与える部位を用いることができる。
第5に、その結合物質と共に、またはなしでラベル化結合パートナーの最適検出識別を付与する化学的または生物学的減成条件を最大限に活用する。
最後に、予め選択した検定フォーマットを用いて検定系の能力を試験し、一般に:
a.インキュベートし、
b.選択的に減成し、
c.検出するか、または
a.インキュベートと選択的減成を同時に行い、
b.検出する
の工程を用い、分析物を定性的にまたは定量的に検出する
本発明を用いる場合、化学ルミネッセンスのアクリジニウムエステルでラベル化したオリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーションを介する特異的ポリヌクレオチド配列の検出用に特に有用である。アクリジニウムエステルを、1987年9月21日出願の米国特許出願(まだ番号が付与されていない)、アーノルドら(Arnold, et al.)による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように、DNAプローブおよび/または混合ヌクレオチド/非ヌクレオチドポリマー上の多くの異なる部位にて付着させてもよい。これは、ヌクレオチド塩基、リン酸結合バックボーン、糖残基、オリゴヌクレオチドの3'末端および5'末端ならびに混合ヌクレオチド/非ヌクレオチドポリマーの非ヌクレオチドモノマー単位をラベル化する能力を包含する。
かかるアクリジニウムエステルラベル化プローブは、それらがハイブリッド化された場合と比較して、それらが付着するプローブが溶液中にてフリーである場合には、有意な異なる化学安定性を示しうる。この異なる安定性は、プローブにおけるアクリジニウムエステル、アクリジニウムエステルラベル付近のヌクレオチド残基の位置およびターゲットポリヌクレオチドと安定したハイブリッド物を形成する他のプローブ分子の存在に依存している。グラフ表示を以下に示す。
DNAプローブ分子におけるアクリジニウムエステルの異なる安定性に寄与する因子を測定する方法において、非ハイブリッド化プローブ(ヌクレオチドおよび混合ヌクレオチド/非ヌクレオチドの両方)の塩基上の遊離アミンが、特にアルカリ性雰囲気下にてアクリジニウムエステルを不安定にすることが判明した。同時に、アクリルジニウムエステルがプローブの末端に隣接している場合、いったんハイブリッド化が起こると、それはターゲット配列により寄与されたアミンによってアルカリに対して不安定となりうる。プローブが特異ポリヌクレオチド(結合物質)配列とハイブリッドを形成する場合、プローブアミンは相補性ヌクレオチドと対をなす塩基と関係し、特にアルカリ性条件下、アクリジニウムエステルを不安定にする能力は制限される。同時に、ハイブリッド・デュプレックス(hybrid duplex)、特に、アデニン/チミジン塩基対密度の部位に挿入することにより、アクリジニウムエステルはさらに減成に対して安定化することが判明した。以下のセクションにおいて説明されているように、多くの他の挿入部位もまた、良好な種々の加水分解を提供することが判明した。
本発明をハイブリダイゼーションに適用することができるいくつかの態様がある。これらは限定するものではない。
1.アクリジニウムエステルをプローブの中心部位およびアデニン/チミジン塩基対の隣接部位に付着させる。好ましい方法は、1987年9月21日出願の米国特許出願(まだ番号が付与されていない)、アーノルドら(Arnold, et al.)による「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように、アクリジニウムエステルを非ヌクレオチドモノマー単位に付着させ、すなわち、ターゲットポリヌクレオチド配列のすぐ隣くにあるヌクレオチドに対して相補的であるヌクレオチドモノマー単位に挿入し、付着させることである。かかる配置は、アクリジニウムエステルの両端におけるヌクレオチド塩基のアミンを制限し、挿入用部位を提供するのに役立つ。
2.アクリジニウムエステルをプローブの3'または5'末端のいずれかに付着させ、第2のプローブとのターゲットポリヌクレオチドにより寄与されたアミンの付近の作用を制限し、第1のプローブの付近をハイブリッド化する。該第2プローブが、デュプレックス形成に基づくA/T塩基対に富んだ部位をクリエートする場合、それもまた望ましいことである。たとえこのダブルプローブまたはサンドイッチ系が、1つだけではなく、2つのデュプレックスの形成に依存しているとしても、非常に短いプローブ、すなわち、長さが約5〜15ヌクレオチドのプローブにより識別することができるマイナーな塩基対変化を敏感に検出する方法を提供する。
正常な状況下、かかる短いプローブは、適当なハイブリダイゼーション条件下にて単一のミスマッチを識別する能力を有する。しかしながら、それらは常套手段としては用いられていない。すなわち、該短いプローブは、存在する多数の複合DNAまたはRNA配列内に含まれる複数の特異部位をハイブリッド化するかもしれない。2つの異なるプローブが、すぐ隣のポリヌクレオチド部位をハイブリッド化しなければならないという条件下では、かかる部位は特異的にターゲットとされ、同定することができる。したがって、短プローブ識別の利点は、両方のプローブによりスパンされた部位の特異性を維持しながら利用できることである。
3.アクリジニウムエステルを、所望のターゲットポリヌクレオチドでないポリヌクレオチド配列とのミスマッチ部位にて、または付近にて付着させる。このように、ミスマッチ部位のまわりのデュプレックス域は有意に不安定化され、アクリジニウムエステル(仮にそれがこの部位にて、または付近にて付着している場合)は減成に対して影響されやすくなるため、わずか1つのヌクレオチドだけが異なるポリヌクレオチド配列の間の識別をも達成することができる。
4.プローブがターゲットとするハイブリッドの局所的な安定性をモニターするために、プローブのある部位にアクリジウムエステルを付着させる。
このように、アクリジウムエステルは、全体がハイブリッドデュプレックスを形成するのではなく局所的なハイブリッド部位が部分的に会合する条件下での、局所的なハイブリッドの安定性を着実にモニターするのに役立つ。
上記3つのフォーマットについて1つの好ましい態様は、ハイブリダイゼーション工程と同じ温度、典型的には50〜70℃にて、異なる加水分解工程を行なうことである。
別の態様は、別の異なる加水分解工程を室温にて行なうことである。これは、10〜11の範囲のpHを行い、ハイブリッド化と非ハイブリッド化アクリジニウムエステルラベル化プローブの間の加水分解速度に、より大きな差異をもたらす。
実験法および物質
以下の実施例は、例示であり、限定されるものではない。これらの実施例は、一般に利用可能なデーターおよび最も適当な現象の説明に基づくものである。他の因子および方法が、さらなる研究により明らかになるかもしれない。本発明はアクリジニウムエステルラベルを用いる例示および実施例により詳細に記載されているが、ある変形および修正を請求の範囲内で行なってもよく、他のラベル系もまた請求の範囲内で用いてもよい。
実施例1
アクリジニウムエステル-ラベル化プローブの組立て
A.アミンリンカー-アームプローブの合成および精製
デオキシオリゴヌクレオチドプローブを、プローブ内部の5'-末端、ポリリン酸鎖に沿ったある予め選択した位置のいずれかに位置する、または1つのヌクレオチド塩基に付着するアミンリンカーアーム(すなわち、アクリジニウムエステルでラベル化する第1級アミンにて終止するもの)を有するように合成した。
(i)
5'-アミンリンカー-アームをプローブに付着させるのに、以下の化合物を用いた:
この化合物は、これまで、末端アミンリンカー-アーム試薬と称されている。この試薬を以下のように合成した:無水酢酸エチル中、6-アミノヘキサノールをS-エチルトリフルオロチオアセテートと反応させた。反応精製物が石油エーテル中にて沈澱し、水中10%ピリジン混合物で10分間処理し、形成したO-トリフルオロアセチルを加水分解し、ガム状形に蒸発乾固した。ついで、この化合物を、文献(ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucleic Acids Research), 12(11), 4539(1984)参照)に記載されている標準的プロトコルに従ってホスフィチレート(phosphitylate)し、所望の化合物、すなわち、末端アミンリンカー-アーム試薬(1)を得た。
5'-アミンリンカー-アームを有するプローブを以下のように合成した。アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイション(Applied Biosystems, Inc.)のモデル・380A DNAシンセサイザーを用い、標準的ホスホルアミジト(phosphoramidite)化学に従い、所望のヌクレオチド配列のプローブを得、3'末端から5'末端のプローブを形成した。所望の配列が完了した後、アミンリンカー-アームは、別のホスホルアミジトヌクレオシドがカップリングするのと同じように、末端アミンリンカー-アーム試薬を用いて自動的にプローブの5'-ヒドロキシル基にカップリングした。標準的プロトコルを用い、ついで該プローブを固体担体から切断し、NH4OHを用いて脱保護し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、つづいてセファデックス(Sephadex)G-25クロマトグラフィーにより精製した。
以下のプローブを合成し、この操作に従い精製した:
(NH2-(CH2)6はアミンリンカー-アームを示す)
(ii)
アミンリンカー-アームをプローブの内部に組入るため、内部アミンリンカー-アーム試薬、タイプ1(4原子スペーサ、下記引用特許出願中のL1参照)、タイプ2(2原子スペーサ、下記引用特許出願中のL3参照)またはタイプL7(9原子スペーサ、引用特許出願中のL7参照)を、1987年9月21日出願の米国特許出願番号第099050号(特表平2−503146号)、アーノルドらによる「ヌクレオチドプローブ用の非ヌクレオチド結合試薬」に記載されているように用いた。再度、プローブを標準的ホスホルアミジト化学を用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびセファデックスG25クロマトグラフィーを用いて精製した。
以下のプローブはこの操作に従い合成した:
1.)イー・コリー(E.Coli)からの16SサブユニットrRNAに対する30merコンプレメンタリーは、内部アミンリンカー-アーム、タイプ1で、配列中の18位のアデニン残基を置き換える:
2.)クラミディア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)からの16Sサブユニットに対する33merコンプレメンタリーは、内部アミンリンカー-アーム、タイプ1で、配列中の21位のアデニン残基を置き換えるか、
または残基21と22の間に挿入する:
(iii)
アミンリンカー-アームを有するヌクレオチド塩基を、以下のようにプローブに挿入した。以下の配列を有する鋳型およびプリマーオリゴヌクレオチドを合成した:
鋳型3'− GCA ATG AGC CTA CGG GTT TAT AGC GG−5'
プリマー5'−CGT TAC TCG GAT GCC CAA AT−3'
(プリマーおよび伸長プリマーはシィ・トラコマティスの16Sサブユニットに対して相補的である。)
クレノー(Klenow)フラグメントを用いるプリマー伸長は、BSAが10×ニック・トランスレーション・バファーから省略することを除いて、モレキュラー クローニング,ア ラボラトリー マニュアル,ティー・マニアティス,1982,コールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ,パブリッシング(Molecular Cloning, A laboratory Mannual, T. Maniatis, 1982, Cold Spring Harbor Laboratories, Pubs.)に記載されているように行ない、アミンリンカー-アーム修正塩基アミノ(12)dUTP(カルバイオケム、カリフォルニア)(Calbiochem,California)を挿入した。したがって、得られたオリゴマーの配列は:
CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA(アミノ-12-U)CG CCである。
プリマー伸長複合体の精製は、NENSORB-20カートリッジ(デュポン)(DuPont)を用い、製造業者の奨励する方法に従い実施した。(プリマー伸長反応体は、カラムに充填する前に、NEN SORB試薬A900μlを加えて希釈した。該精製オリゴマーを50%メタノールで溶出し、ついでスピード-バク(speed-vac.)にて取り出した)。
B.アクリジニウムエステルを用いるアミノリンカー-アームプローブのラベル化および精製
アクリジニウムエステルの25mMストック溶液を、蒸留DMSO中にて調製した。所望量のプローブ(前記セクションAにおけるラベル化した種々のプローブのリスト参照)を、1.5mlの円錐形ポリプロピレン管にて蒸発乾固した。カクテルは以下の成分を列挙した順序にて加えることにより構成した:
3μl 水
1μl 1M HEPES(pH8.0)
4μl DMSO(蒸留)
2μl DMSO(蒸留)中、25mMアクリジニウムエステル混合物を撹拌し、マイクロ遠心分離機において2秒間スピンに付し(内容物を管の底に集中させる)、37℃にて20分間インキュベーションした。ついで、以下の成分を、列挙した順序にて反応カクテルに加えた:
3.0μl DMSO(蒸留)中、25mMアクリジニウムエステル
1.5μl 水
0.5μl 1M HEPES(pH8.0)
カクテルを再度撹拌し、スピンし、37℃にてさらに20分間インキュベーションした。未反応ラベルは、5倍過剰のリシンを用い、0.1M HEPES(pH8.0)、50%DMSO中、0.125Mリシンを加えることによりクエンチし、室温にて5分間インキュベートした。
ついで、アクリジニウムエステル-ラベル化オリゴマーを、以下の方法を用いて精製した。クエンチした反応混合物20μlに、担体として3M NaOAc(pH5.0)30μl、水20μlおよびグリコゲン5μl加えた(グリコゲンは予め処理し、いずれのヌクレアーゼ活性も除去した)。試料を簡単に撹拌し、無水エタノール640μlを加えた。該試料を簡単に撹拌し、氷上にて5〜10分間インキュベートし、ついでマイクロ遠心分離機において15000rpmにて5分間遠心分離に付した。上澄液を注意して除去し、ペレットを0.1M NaOAc(pH5.0)20μl、0.1%SDSに再度溶かした。ついで、試料を以下に記載のように高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製した。
(i)
5'および内部アミンリンカー-アームを有するAE-ラベル化プローブを以下のように精製した:再度溶解したペレットを、IBMR9533HPLC系に取り付けたヌクレオゲン-DEAE60−7イオン交換HPLCカラムに注入した。すべてのバファーは、フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)からのHPLCグレード水、アセトニトリル(CH3CN)および酢酸ナトリウム(NaOAc)、試薬グレードの氷酢酸(HOAc)およびLiClで調製した。すべてのバファーは、使用前に0.45μm孔径のナイロン-66フィルターを介して濾過した。試料を、第1図の記載(この場合、プローブは前記セクションAにおいて記載された26merを含有する5'-アミンリンカー-アームであった)のように溶出した。実験の直後、10%SDS5μlを各試験管に加え、つづいて各試験管を撹拌した(これにより、アクリジニウムエステルラベル化プローブを、試験管壁にこびりつけないようにした)。フラクション21〜42から0.5μl部を取り出し、12×75mm試験管の水200μlに加えた(各部において分離ピペットチップを用い、キャリーオーバーの問題を回避した)。ついで、各部の化学ルミネッセンスを、次の自動注入および読み配列を用いるバートホルド・クリニルマット(Berthold Clinilumat)において測定した:0.25N HNO3200μl、0.1%H2O2の注入;1秒後;1N NaOH200μlの注入;10秒間化学ルミネッセンス出力の読み。
ついで、フラクション29〜33を以下のようにEtOH沈澱させた:各フラクションにグリコゲン5μlを加え、撹拌し、EtOHlmlを加え、撹拌し、氷上にて5〜10分間インキュベーションし、マイクロ遠心分離機中、15000rpmにて5分間遠心分離に付した。各上澄液を注意して除去し、ペレットを0.1M NaOAc20μl、pH5、0.1%SDSに再度溶かし、フラクションをプールした。
このようにして、高純度のアクリジニウムエステルラベル化プローブを得た。かかるプローブの特異活性は、典型的には、オリゴマー1ピコモル当たり、5〜10×107化学ルミネッセンス光数(バートホルド・クリニルマット)であった。
(ii)
アミンリンカー-アーム修正塩基(アミノ-12-U)を有するAE-ラベル化プローブを、一般に、以下のことを除いて、前記のように精製した:バイダック(Vydac)C4逆相カラムをもちいた;緩衝液Aは0.1M酢酸トリエチルアンモニウム(アプライド・バイオシステムズ、インコーポレイション、カリフォルニア州、ホスター・シティー(Foster City))、緩衝液BはCH3CNであった;ラベル化プローブは、1ml/分の流速にて25分間において10〜15%溶媒Bの直線勾配を用い、ハイブリッドとして溶出した。ついで、主な化学ルミネッセンスピークを同定し、前記のように後処理した。
一般に、前記ディスカッションは、アクリジニウムエステルでプローブを合成し、ラベル化する方法を記載している。個々の実施例において、プローブは、末端および内部ラベル化、ならびにヌクレオチド塩基にてラベル化されている。
実施例2
アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのpH6における安定性
クラミジア・トラコーマティス(Chlamydia trachomatis)に対して特異的な内部標識化33merプローブを前記したごとく調製した(アデニン置換、タイプ1リンカー−アーム)。以下の手法に従い該プローブをそのターゲットrRNA(この場合はクラミジア・トラコーマティス)でハイブリッド化した。
ハイブリダイゼーション混合物
2μl AE−プローブ(0.5ピコモル)
0.3μl 4%(重量:容量)SDS
5.8μl 1M PB、pH5
4.4μl シイ・トラコーマティス rRNA(2μg)、または対照については4.4μl水
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を60℃にて40分間インキュベートし、その時点で、以下のごとくに、ヒドロキシアパタイト(HAP)を用い、各混合物を、パーゼントハイブリダイゼーションについて分析した。ハイブリッドまたは対照混合物の0.1μl分を、2%HAPを含有する0.14M PB、pH6.8、200μlに添加した。得られた各混合物を5秒間攪拌し、60℃にて5分間インキュベートし、20秒間攪拌し、次いで15000rpmにてミクロ遠心機で30秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、0.14M PB、pH6.8、200μlをHAPペレットに添加し、混合物を10秒間攪拌し、次いで15000rpmにてミクロ遠心機で30秒間遠心した。上澄みを除去し、保存し、ペレットを0.14M PB、pH6.8、200μlに再懸濁した。再懸濁HAPの50μlおよび2の上澄みの各々を以下に記載するごとく化学ルミネッセンスについて分析し、パーセントハイブリッド化プローブ、すなわちHAPに伴うパーセント化学ルミネッセンス信号を計算した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を以下の手順に従ってpH6にて試験した。
安定性試験混合物
12.3μl 前記からのハイブリッドまたは対照
50μl 1M PB、pH6
2.5μl 4% SDS
65μl 水
これらの混合物を軽く攪拌し、直ちに5μl分を取り出し(t0)、以下に記載するごとく化学ルミネッセンスについて分析した。混合物の残りを60℃でインキュベートし、各時間(後記参照)において5μl分を取り出し、直ちに化学ルミネッセンスについて分析した。
各試料の化学ルミネッセンスは、試料の一部を12x75mm試験管中の水200μlに添加し、クリニルマート(Clinilumat)(0.25N HNO3 200μl、0.1%H2O2を自動注入、1秒遅れて2M PBカリウム200μl、pH13.2を自動注入、10秒間の化学ルミネッセンスの読み取り)にて化学ルミネッセンスを測定することによって測定した。
結果:
1.パーゼントハイブリダイゼーション(HAP分析)
ハイブリッド−96%
対照−1.3%(非特異的結合)
2.安定性時間経緯
第2図参照
これらの結果は、ハイブリッド化プローブは分解および続いての化学ルミネッセンスの喪失に対してよく保護されているが(化学ルミネッセンスの喪失の半減期は3370分に等しい)、非ハイブリッド化プローブは分解および化学ルミネッセンスの喪失に対して非常に敏感である(半減期は29.2分に等しく、従って、ハイブリッド化および非ハイブリッド化の差は115倍に等しい)ことを示す。これらのデータは、本明細書中に記載する均一検定が、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ間に異なる安定性を付与し、それを測定することによって、ターゲットDNA配列の位置を決める能力を証明するものである。
実施例3
アクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのpH9における安定性
内部標識化プローブ(実施例1に記載したすべての3つの内部標識化33merプローブを試験した)をそのターゲットrRNA(この場合はクラミジア・トラコーマティス)でハイブリッド化し、実施例2に記載したごとくにパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を以下のプロトコルに従ってpH9にて試験した。
安定性試験混合物
5μl 前記からのハイブリッドまたは対照
45μl 0.2ホウ酸ナトリウム、pH9
次いで、混合物をシンキュベートし、サンプリングし、実施例2に記載したごとくに化学ルミネッセンスについて分析した。
結果:
1.パーゼントハイブリダイゼーション(HAP分析)
a.アデニン置換、タイプ1リンカー−アーム
ハイブリッド−95%
対照−0.5%(非特異的結合)
b.挿入、タイプ1リンカー−アーム
ハイブリッド−98%
対照−0.3%
c.挿入、タイプ2リンカー−アーム
ハイブリッド−98%
対照−0.2%
2.安定性時間経緯
第3〜第5図参照。第3図はアデニン置換、タイプ1リンカー−アームについてのグラフであり;第4図は挿入、タイプ1リンカー−アームについてのグラフであり;第5図は挿入、タイプ2リンカー−アームについてのグラフである。
実施例2におけるごとく、ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド化プローブは保護されない。これは、内部標識化プローブのすべての3つのタイプについて当てはまる。本実施例においては、高いpHにおけるホウ酸ナトリウムが、ハイブリッド化プローブと非ハイブリッド化プローブとの間にまだ異なる分解特性を保持しつつ、(実施例2と比較して)この過程を加速することが示される。
実施例4
隣接プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのpH6における安定性
本実施例は、本実施例で用いるAE−標識プローブ(後記参照)の5’末端にすぐ隣接するイー・コリ(E. coli)rRNAにハイブリダイズし、それによってアクリジニウムエステル標識に近接するターゲットrRNA中のすべてのアミンの「キャップ除去」に導く(標準的なホスホルアミデイト化学を用いて調製した)配列5’−CCG GAC CGC TGG CAA CAA AGG ATA AGG GTT GC−3’のプローブの使用を含む。
アクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端(実施例1に記載した調製)(以下、AE−プローブという)および前記した隣接プローブを以下の手順に従ってハイブリダイズした。
7.5μl 1M、pH5
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を60℃にて40分間インキュベートし、次いで、実施例2に記載したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
隣接プローブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を実施例2に記載したごとくにpH6にて正確に試験した。
結果:
1.パーセントハイブリダイゼーション(HAP分析)
ハイブリッド−93.5%
対照−2.7%(非特異的結合)
2.安定性時間経緯
第6図参照
実施例2におけるごとく、ハイブリッド化AE−プローブ(この場合はやはりハイブリッド化した隣接プローブをもつ)は分解から保護されたが、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。該保護は実施例2と同じ程度良好であった。何故なら、1つの代わりに2つのハイブリダイゼーションに依存するからである。
実施例5
「隣接」プローブをもつハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのpH9における安定性
実施例4に記載したごとくにハイブリダイゼーションを正確に行った。以下に示す安定性試験混合物の組成以外は、実施例2に記載したごとくに、隣接プローブをもつハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性をpH9において正確に行った。
5μlハイブリッドまたは対照
50μl 0.2M ホウ酸ナトリウム、pH9.0
(やはりハイブリッド化された)隣接プローブをもつハイブリッド化AE−プローブは再び分解から保護されたが、非ハイブリッド化プローブは保護されなかった。実施例3におけるごとく、高いpHでのホウ酸ナトリウムは、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ間に異なる分解特性をなお保持しつつ、過程を加速した。これらの結果をグラフで示したものは第7図を参照されたい。
実施例6
ハイブリッドとしてのアクリジニウムエステルで標識化したプローブ末端および非ハイブリッドのpH6における安定性
以下の手順に従ってプローブをそのターゲットrRNA(この場合はコー・コリ)にハイブリダイズした。
該ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を60℃にて40分間インキュベートし、次いで、実施例2に記載したごとくヒドロキシアパタイトを用いてパーセントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を実施例2に記載したごとくにpH6にて正確に試験した。
結果:
1.パーセントハイブリダイゼーション
ハイブリッド−94%
対照−2.7%(非特異的結合)
2.安定性時間経緯
第8図参照。
非ハイブリダイズ化プローブは、これまでの実施例におけるほど分解の差は大きくなかったが、再び、ハイブリッド化プローブと比較してかなり分解した。これは、アミンの一部のみがアクリジニウムエステル標識の近接で「キャップ除去」されたからである。事実、これは、さらに、ハイブリッド化隣接プローブの存在下におけると非存在下におけるハイブリッド化末端−標識化プローブ間とを区別する能力を証明する。
実施例7
アクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基に標識化したハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブのpH7.6における安定性
実施例1に記載したアクリジニウムエステルでヌクレオチド塩基(アミノ−12−U)に標識化したプローブを、以下の手順に従って、そのターゲットrRNA(この場合はシィ・トラコーマティス)にハイブリダイスした。
ハイブリダイゼーション混合物
0.1Mコハク酸リチウム、pH5.4
10%ラウリル硫酸リチウム
2μg (0.1ピコモル AEプローブ)シィ・トラコーマティスrRNAまたは対照用水
合計容量−30μl
ハイブリダイゼーションおよび対照混合物を80℃にて5分間、続いて60℃にて60分間インキュベートした。得られた溶液を、0.1Mコハク酸リチウム、pH5.4、10%ラウリル硫酸リチウムで各々300μlまで希釈し、実施例2に記載したごとくにヒドロキシアパタイトを用いてパーゼントハイブリダイゼーションについて分析した。
ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブ(すなわち、対照)の安定性を、以下のプロトコルに従い、いくつかの同一に調製した試料とともにpH7.6で試験した。
安定性試験混合物
15μl 前記からのハイブリッドまたは対照
100μl 0.2%テトラホウ酸ナトリウム、pH7.6、5%トリトン(Triton)X−100
次いで、これらの混合物を60℃にてインキュベートし、試料を種々の時点で取り出し、0.1M H2O2 200μlの自動注入、1秒遅れての1N NaOH 200μlの自動注入、および5秒間の化学ルミネッセンスの読み取りを使用するGen-Probe LeaderTM Iルミノメーター(Luminometer)を用いて化学ルミネッセンスを測定した。これらのデータより、加水分解速度を回帰分析によって決定した。
結果:
1.パーセントハイブリダイゼーション(HAP分析)
ハイブリッド−53.8%
対照−0.5%
2.安定性
これまでの実施例におけるごとく、これらのデータは、ハイブリッド化プローブは分解から保護されるが、非ハイブリッド化プローブ(この場合はプローブの塩基に付着した標識をもつ)は保護されないことを示す。これはAE付着についての本明細書中にて記載する均一保護検定で使用できる原理を示す。
実施例8
rRNAおよびDNAターゲットをともに用い各種配列ダイマー部位にてアクリジニウムエステルで内部標識化したハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブのpH7.6における安定性
種々の配列ダイマー部位(以下、参照)に挿入した内部リンカー−アーム、タイプ「L7」を含有するプローブを合成し、AEで標識化し、実施例1に記載したごとくに精製した。これらのプローブの配列およびリンカー−アームの位置は以下のとおりである。
80℃インキュベーション工程を省略し、かつ用いるターゲット核酸が以下のものである以外は実施例7に記載したごとくにこれらのプローブをハイブリダイズした。
実施例7に記載したごとく、ハイブリッド化プローブおよび非ハイブリッド化プローブの安定性をpH7.6にて試験した。
結果:
これらのデータは、リンカー−アーム(および、従って該AE)が広範囲の配列ダイマー部位に挿入でき、ハイブリッド化形態においてもエステル加水分解からなお実質的に保護されることを示す。さらに、本実施例は、これらの均一検定フォーマットで用いた場合、DNAターゲットがハイブリッド化AE−プローブの良好な保護を提供することを示す。また、本実施例は、ここで用いた長い(9原子)リンカー−アームが、広範囲のリンカー−アーム長が本明細書中に記載するHPAフォーマットで用いることができることを確立したこの特許で前で引用した他のリンカー−アームと実質的に同等の微分加水分解比を生じることも示す。
実施例9
完全に対合するターゲットでハイブリッド化したおよび単一のミス対合のターゲットでハイブリッド化した内部標識化AE−プローブのpH7.6における安定性
残基6および7の間に挿入された内部アミンリンカー−アーム、タイプL7を有するイー・コリからのrRNAの16Sサブユニットに相補的な24merプローブを合成した。次いで、実施例1に記載したごとくに該プローブをアクリジニウムエステルで標識化し、精製した。その配列は以下のとおりである(#=リンカー−アーム位置)。
このプローブはシイ・ディベルシウム(C.diversius)の16Sサブユニットとともに、位置6(プローブストランドの5’末端からの番号)に単一のT−Gミス対合を有する。
実施例8に記載した手順に従って、該プローブをターゲットrRNA(この場合はコー・コリまたはシイ・ディベルシウスいずれか)でハイブリダイズした。得られたハイブリッド化プローブならびに非ハイブリッド化プローブの試料の安定性を実施例7に記載したごとくにpH7.6にて試験した。
これらのデータは、完全に対合するターゲットでのハイブリッドの場合においても該AE−プローブは(これまでの実施例に記載したごとく)エステル加水分解から保護されるが、単一の塩基のミス対合を含むターゲットでのハイブリッドはほとんど保護されないことを示す。これは完全なターゲットと単一部位ミス対合ターゲットの間でAE−プローブの加水分解速度に17倍の差を生じさせる。従って、本明細書中にて記載する方法は単一の塩基の差を含む核酸ターゲット間を容易に識別区別できる。
実施例10
種々の条件下、室温におけるアクリジニウムエステルで内部ラベル化されたハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの安定性
内部ラベル化されたプローブ(挿入、タイプ1、実施例1参照)を実施例8に記載のシー・トラコーマティス(C.trachomatis)rRNA 1μgでハイブリッド化した。実施例7に記載の方法により、種々の試薬およびpH条件(「結果」参照)下、室温でハイブリッド化および非ハイブリッド化プローブの安定性を測定した。
結果:
これらのデータにより、広範囲の検定条件に適合できれば、ここに記載の均一保護検定が機能する種々の条件が存在することが示される。さらに、ホウ酸塩以外のフィチン酸塩系も可能であり、例えば、非常に高い半減期比が得られる室温でのフィチン酸系が挙げられる。
実施例11
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた緩衝液中のクラミジア(chlamydia)rRNAの希釈系列の検出
以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ(実施例2と同様の)をハイブリッド化し、その標的rRNA(この場合、クラミジア・トラコーマティス)の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
0.5μlプローブ(12.5fmol)
1μl RNA(10-2、10-3、10-4または10-5μg)
2μl 20% SDS
1.7μl H2O
4.8μl 1M PB、pH6.8
対照混合物はrRNAの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は60℃で20分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、pH9の0.2Mボレート90μlを各サンプルに添加し、60℃で14分間インキュベートした。ついで、インジェクション1が0.1%H2O2のみであり、インジェクション2のpHが13.2の代わりに13.8であり、読み取り時間が10秒の代わりに7秒である以外は実施例2に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果:
試薬ブランクおよび対照は3回平均を表し、その他はすべて2回平均を表す。
これらの結果により、ここに記載の発明は純粋の緩衝液系において約10-4μgの感度限界まで標的rRNAの線希釈系列を検出できた。
実施例12
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた臨床培地中のクラミジアrRNAの希釈系列の検出
以下の方法により、内部ラベル化されたプローブ(実施例2のような)を臨床試料中でハイブリッド化し、その標的rRNA(この場合、クラミジア・トラコマチス)の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
50μlスロート・スワブ(throat swab)
6μl 4.8M PB、pH4.7
2μl rRNA(3×10-4、3×10-3、3×10-2または3×10-1μg)
2μlプローブ(1pmol)
対照混合物はrRNAの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は60℃で20分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、各混合物の1/3(20μl)を最終pH9の0.2Mボレート50μlに添加し(ハイブリッド化混合物した混合物の添加後)、60℃で40分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例11に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果:
データは2回測定値の平均を表す。
これらのデータにより、ここに記載の発明は臨床培地を含有する系において約10-3μgの感度限界まで標的rRNAの線希釈系列を検出できた。
実施例13
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた尿中の細菌rRNAの希釈系列の検出
内部ラベル化されたイー・コリ(E.coli)に対して特異的な30merプローブ(実施例2と同様の)を前記のように調製した(アデニン置換、タイプ1のリンカー・アーム)。以下の方法により、該プローブを尿中でハイブリッド化し、その標的rRNA(この場合、イー・コリ)の量を減少させた。
ハイブリッド化混合物
79.6μl尿
0.4μl 0.25M EDTA、0.25M EGTA
10μl、4.8PB、pH6.8
5μl 20% SDS
5μlプローブ(0.125pmol)
1μl RNA(10-3、10-2または10-1μg)
対照混合物はrRNAの代わりに水を含有する以外はハイブリッド化混合物と同じであり、試薬ブランク混合物はプローブの代わりに水を含有する以外は対照混合物と同じであった。混合物は60℃で30分間インキュベートした。
ハイブリッド化後、各サンプルにpH9の0.2Mホウ酸塩300μlを添加し、60℃で16分間インキュベートした。ついで、各サンプルについて、実施例11に記載のようにケミルミネッセンスを読み取った。
結果:
結果は2回測定値の平均を表す。
これらの結果により、ここに記載の発明は尿を含有する系において約5×10-3μgの感度限界まで標的rRNAの線希釈系列を検出できた。
実施例14
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた臨床培地中のクラミジアrRMAの希釈系列の検出のための分離工程と組み合わせて用いる選択的分解
内部ラベル化されたプローブ(実施例2のような)を、対照およびブランク混合物を含む実施例8に記載するような臨床試料(スロート・スラブ)中でハイブリッド化した。ハイブリッド化後、各サンプルの1/3を取り除き、実施例8に記載のように正確に選択的分解に付し、一方、1/3を単純に取り除き、室温で保持した(すなわち、選択的分解を行わなかった)。すなわち、選択的分解を行ったサンプルと、行わなかったサンプルの両方を、以下の点で異なる以外は実施例2に記載のようにHAPを用いて非ハイブリッド化プローブから分離した:
a.1mlのHAP溶液を用いた(200μlの代わりに)、
b.1mlの洗浄液を用いた(200μlの代わりに)、
c.3回洗浄した(1回の代わりに)、
d.最終のHAPペレットを洗浄液100μl中で再懸濁させ、その全体について、ケミルミネッセンスを測定した(実施例2に記載のように)。
結果:
結果はすでに差し引いた試薬ブランクでを用いての2回測定値の平均を表す。S:Bはシグナルとバックグラウンドの比であり、すなわち、対象のケミルミネッセンスにより分割された特定のrRNA濃度でのケミルミネッセンスである。
これらのデータにより、分離前の選択的デグラデーションの付加によって高いシグナル−バックグラウンド比をもたらす低バックグラウンドとなるため、感受性を改良する。
実施例15
示差加水分解を用いる改良されたストリンジェンシー
以下のプローブをタイプL7(以下の記号#によって示される挿入位置)の内部リンカー・アームを含有するように構成させ、実施例1に記載のようにアクリジニウムエステルでラベル化し、そして精製した:
このプローブはナイセリア・ゴノルホエーエ(Neisseria gonorrhoeae)の16Sサブユニットに正確に相補的である。しかしながら、それはエヌ・メニンギチディス(N.meningitidis)と密接に関係し、実施例2および8で引用したハイブリッド化ストリンジェンシー条件下で交叉反応が典型的に観察される。実施例8に記載のように(200μlフォーマット中である以外は)、エヌ・メニンギティデイス0.5μgを用いてこのプローブをハイブリッド化し、pH7.6の0.2M四ホウ酸塩ナトリウム、5%トリトンX−100 1ml中、60℃で10分間インキュベートして示差加水分解(+D.H.)を行うか、またはこれらの示差加水分解条件(−D.H.)に付さなかった。得られたハイブリッドを磁気マイクロスフェア上で分離し、以下に記載のようにケミルミネッセンスを測定した。
磁気アミンマイクロスフェア(米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのアドバンスド・マグネチックス社製バイオマグM4100(BioMag M1400, Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, Mass.))150μgを含有するpH6.0の0.4M PB1mlを添加する。10秒間撹拌する。60℃で5分間インキュベートする。10秒間撹拌する。ペース・メート(Pace-Mte)(登録商標)磁気分離ラック(米国カリフォルニア州、サンディエゴのゲン・プローブ社(Gen-Probe, Tnc., San Diego, CA)を用いて溶液から球体を磁気的に分離する。液体を廃棄する。pH6.0の0.3M PB 1mlを添加し、10秒間撹拌し、磁気的に分離し、液体を廃棄することにより該球体を洗浄する。合計3回、洗浄を繰り返す。pH6.0の0.2M PB 300μlおよび50%ホルムアミドを添加し、10秒間撹拌し、60℃で5分間インキュベートし、10秒間撹拌し、ついで溶液から球体を磁気的に分離することによりハイブリッドを溶離する。該溶液をクリニルマット・チューブ(Clinilumat tube)に移し、実施例7に記載のようにケミルミネッセンスを測定する。
結果:
結論として、ここに記載の付加的なストリンジェンシー識別工程としての示差加水分解技術の適用により、所望でない交叉反応配列からのシグナルを非常に減少する。本実施例においては、エヌ・ゴルノホエーエ・プローブとエヌ・メニンギティディスの交叉反応は200フォルド(fold)以上に低下した。示差加水分解工程は、非ハイブリッド化形態にある場合にプローブのケミルミネッセンスを絶えず減少させ(加水分解により)ることにより、非ハイブリッド化されたプローブと平衡にある不安定なハイブリッドに対する感受性を増大させ、したがって、交叉反応によるケミルミネッセンスを低下させる。
実施例16
アクリジニウムエステルで内部ラベル化されたプローブを用いた慢性骨髄性白血病と合したキメラ標的配列の検出
以下のように挿入したタイプL7の内部リンカー・アームを含有する24merのプローブ(以上に示す配列)を、実施例1に記載のようにAEでラベル化し、精製した:
このプローブは慢性骨髄性白血病(CML)と合したキメラmRNA転写(コモン・ブレーク)に相補的であり、bcr/ablプローブと呼ばれている。このキメラmRNAは、abl遺伝子の部位をbcr遺伝子を含有する他の染色体の部位に転座することにより形成されるキメラ遺伝子の産物である。
bcr/abl標的の切断個所接合部位を表す合成DNA 60mer標的および同じ部位中の正常bcrおよびabl標的は、実施例1に記載のように合成された(以下の配列)。また、mRNA標的は、切断個所の中央付近に位置するキメラbcr/abl遺伝子の450ヌクレオチド断片を含有するpGEMクローンの転写によって生成させる。プローブ・センス(probe sense)中の同様の450ヌクレオチド断片のmRNA転写を陰性対照として生成した。
前記のように挿入された星印(*)はアクリジニウムエステル付加のためのリンカー・アーム挿入位置を示し、下線部分はabl配列を示す。
実施例8に記載のように、前記の各標的約1pmolでbcr/ablプローブをハイブリッド化し、実施例7に記載のようにpH7.6でこれらのハイブリッドおよび非ハイブリッド化されたプローブの安定性を試験した。
結果:
これらのデータにより、CMLと合したキメラbcr/abl mRNA転写の切断個所接合部位をつなぐために設計されたAEラベル化プルーブが、ここに記載のHPA技術によってキメラ標的と正常の配列(および非ハイブリッド化プローブ)を識別することが示された。これは、正常な非キメラ核酸の存在下、特にキメラ標的(典型的には遺伝子疾患と合した)を検出するのに使用できる証拠である。
さらに本実施例により、rRNA以外の標的(この場合、mRNAおよびDNA)は、AEラベル化プローブにハイブリッド化された場合、AE加水分解に対する保護を与えることが示された。
Claims (2)
- 媒体中の標的核酸含有配列を検出又は定量する方法であって、次の工程:
a)該媒体をアクリジニウムエステルでラベルした核酸プローブと接触させ、ここに該アクリジニウムエステルは、そのアクリジン環の9位に置換アリールオキシカルボニル基を含むものであり、媒体中に標的核酸含有配列が存在する場合には、該ラベル化核酸プローブ−標的核酸含有配列複合体が形成され、媒体中に標的核酸含有配列が存在しない場合には、該ラベル化核酸プローブは未結合プローブであり、該複合体中に存在する該ラベルの分解に対する安定性が、該複合体中に存在しない該ラベルの安定性とは異なるものであり、
b)pHを調節し、該未結合プローブに結合したラベルを選択的に分解して、該未結合プローブに結合したラベルをもはや検出不可能なものとし、
c)該媒体中の標的核酸含有配列の存在または量を表すものとして、該複合体中の分解されていないラベルの存在または量を検出する
を特徴とする方法。 - 電子的に励起されたアクリドン分子の生成による化学発光によって該ラベルが検出される、請求項1記載の方法。
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