KR950701979A - 단핵 세포로부터 핵산의 조제 방법(Preparation of Nucleic Acid from Mononuclear Cells) - Google Patents

단핵 세포로부터 핵산의 조제 방법(Preparation of Nucleic Acid from Mononuclear Cells)

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KR950701979A
KR950701979A KR1019940704480A KR19940704480A KR950701979A KR 950701979 A KR950701979 A KR 950701979A KR 1019940704480 A KR1019940704480 A KR 1019940704480A KR 19940704480 A KR19940704480 A KR 19940704480A KR 950701979 A KR950701979 A KR 950701979A
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Abstract

본 발명은 증 용 핵산의 조제 방법 및 그를 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 전혈 세포, 특히 단핵 세포 시료를 목적 세포가 비목적 세포로부터 분리되도록 적합한 원심 분리 매질 중에서 원심 분리하여, 이를 수거하고, 용혈시킴으로써 핵산을 조제할 수 있다. 용혈된 세포에 제2철 이온과 착체를 형성할 수 있는 착체 칠성제를 첨가할 수 있다. 용혈된 세포와 관련된 핵산은 증폭될 수 있으며,핵산은 또한 바이러스 핵산 서열 등과 같은 임의의 핵산 서열의 스크리닝에 사용될 수 있다.

Description

단핵 세포로부터 핵산의 조제 방법(Preparation of Nucleic Acid from Mononuclear Cells)
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음

Claims (90)

  1. 단핵 세포 및 원심 분리 매질을 함유하는 혈액 세포 시료를 함유하는 조성물을 원심 분리하는 단계(이때, 상기 원심 분리 매질의 밀도 및 원심 분리력은 상기 조성물 중의 단핵 세포의 대부분이 상기 조성물 중의 분리된 띠에 축적되도록 선택된다), 상기 분리된 띠를 상기 조성물로부터 분리하는 단계,. 상기 분리된 띠를, 이 분리된 띠 중의 상기 단핵 세포를 용혈시키는 용혈제와 접촉시켜서 상기 단핵 세포와 관련된 핵산을 증폭에 이용될 수 있도록 만드는 단계, 및 이어서 상기 핵산을 증폭 시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭용 핵산의 조제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 접촉및/또는 증폭 단계가 상기 분리된 띠 및 상기 용혈제를 함유하는 용액 중에서 제2철 이온과 착체를 형성할 수 있는 제1착체 형성제의 존재하에 수행되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1착체 형성제가 킬레이특제인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 킬레이트제가 제2철 이온과는 착체를 형성하지만, 아연, 망간 또는 마그네슘 이온과는 착체를 형성하지 않는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 킬레이트제가 데페록사민 또는 철 결합 시데라민, 시데라마이신 또는 페리마이신인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 증폭 및/또는 접촉 단계가 상기 용액 중에서 칼슘 이온과 착체를 형성할 수 있는 제2착체 형성제의 존재하에 수행되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제2착체 형성제가 제1착체 형성제와 다른것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 제2착체 형성제가 아연 또는 마그네슘 이온과는 착체를 형성하지 않아서 증폭에 미치는 1들의 영함을 방해하지 않는 것인 방법.
  9. 제3항 또는 제6항에 있어서, 상기 제1또는 제2착체 형성제 중 어느 하나 또는 양자 모두가 바람직한 이온에 우선해서 바람직하지 않은 이온과 착체를 형성하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1또는 제2찾테 형성제 중 어느 하나 또는 양자 모두가 상기 제1또는 제2착체 형성제 및 1종 이상의 바람직한 이온을 함유하는 착체 또느 염으로서 제공되는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 제2착체 형성제가 EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트를 포함하느 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 착체 형성제가 EDTA, 시트레이트 또는 옥살레이트의 Mg, Mn, Zn착체 또는 염을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항, 제2항 또는 제6항에 있어서, 아연 이온이 상기 접촉 또는 증폭 단계중에 제공되는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 이 조성물이 상기 용혈제를 첨가하기 전에 상기 단핵 세포의 20%미만이 용혈되도록 상기 단핵 세포와 등장성인 것인 방법.
  15. 제2항에 있어서, 상기 조싱물은 원심 분리 전에 혼합되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 분리된 띠가 상기 조성물의 매니스커스에 인접하여 위치하는 것인 방법.
  17. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 원심 분리가 등밀도 원심 분리인 방법.
  18. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 분리된 띠가 상기 조성물 중의 단핵 세포의 직어도 30%를 함유하는 것인 방법.
  19. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 분리된 띠가 상기 혼합물 부피의 20%이하인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분리된 띠가 상기 혼합물 부피의 10%이하인 방법.
  21. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 분리된 띠가 혈소판을 함유하는 것인 방법.
  22. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 원심 분리 매질이 상기 단핵 세포에 등장성을 제공하도록 선택된, 슈크로스 솔비톨, 만니톨, 염화나트륨 또는 글루타민산나트륨을 포함하는 삼투제를 함유하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 삼튜제가 상기 혼합물에 이온 농도를 가하지 않는 것인 방법.
  24. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 원심 분리가 약 1600xg의 힘을 가하는 것인 방법.
  25. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 원심 분리 매질이 콜로이드성 실리카 또는 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드성 실리카를 함유하는 것인 방법.
  26. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 원심 분리 매질이 요오드화 벤조산 유도체를 포함하는 화합물로 형성된 것인 방법.
  27. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 혈액 세포가 동물로부터 취한 전혈 또는 혈장인 것인 방법.
  28. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 시료 중의 혈액 세포의 적어도 80%가 상기 분리된 띠의 접촉 이전에 손상되지 않고 그대로 남아있는 것인 방법.
  29. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 핵산 증폭이 폴리머라제 사슬반응방법을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  30. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서 상기 핵산 증폭이 역전사 효소 및 RNA폴리머라제 존재하에 수행되는 것인 방법.
  31. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 용혈제가 알칼리, 효소, 세제 및 초음파 파쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 알칼리가 KOH, NaOH〈 (CH3)4NOH, LiOH 또는 RbOH인 것인 방법.
  33. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서. 상기 혈액은 상기 방법을 사용하기 전에, EDTA,시트레이트, 옥살레이트 또는 헤파린을 포함하는 항응고제와 함께 저장된 것인 방법.
  34. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 원심 분리 매질은 밀도가 1.105 내지 1.115g/m1인 것인 방법.
  35. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 분리된 띠의 축적 효율 및 뷴리 용이성을 증대시키는 장치가 상기 분리된 띠에 인접하여 위치하는 것이 방법.
  36. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 원심 분리가 상기 혼합물의 잔여 부로부터 상기 분리된 띠의 분리를 촉진하도록 형성된 튜브 중에서 수행되는 것인 방법.
  37. 제1항, 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 접촉 및 (또는)상기 증폭이 상기 증폭을 촉진시키기 위하여 유효량의 다가 양이온성 중합체 존재하에 수행되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 다가 양이온성 중합체가 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민 또는 헥사디메트린 브로마이드인 것인 방법.
  39. 제2항에 있어서, 상기 접촉 단계 후 및 상기 증폭 단계 전에 착체 형성제가 분리된 띠에 첨가되는 것인 방법.
  40. 제1항에 있어서, 필수적으로 제1항의 단계들로 이루어진 것인 방법.
  41. 제2항에 있어서, 필수적으로 제2항의 단계들로 이루어진 것인 방법.
  42. 제1항, 제2항, 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 혈액 세포가 인체 혈액으로부터 유래된것으로서 인체 면역 결핍 바이러스 또는 B형 간염 바이러스를 잠재적으로 함유하며, 상기 증폭에 의해 상기 인체 면역 결핍 바이러스 또는 B헝 간염 바이러스 유래의 바이러스성 핵산 부분을 증폭시키는 것인 방법.
  43. 제2철 이온을 함유하는 증폭 혼합물 중에서 충분한 제2철 이온과 착체를 행성할 수 있는 제1착체 형성제 를 제공하여 제1착체 형성제를 첨가하지 않은 경우보다 증폭률을 증가시키는 것을 포함하는, 제2철 이온을 함유하는 증폭 혼합물 중에서 핵산을 증폭시키는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 착체 형성제가 킬레이트제인 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 킬레이트제가 아연 또는 마그네슘 이은과는 착체를 형성하지 않는 것인 방법.
  46. 제41항에 있어서, 킬레이트제가 데페록사민 또는 철 결합 시데라민, 시데로마이신 또는 페리마이신인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 증폭 혼합물이 추가로 칼슘 이온을 함유하고, 이 칼슘 이온과 착체를 형성할 수 있는 제2착체 형성제를, 이 제2착체 형성제가 없는 경우보다 증폭률을 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 제2착체 형성제가 제1착체 형성제과 다른 것인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 제2착체 형성제가 아연 또는 마그제슘 이온과는 착체를 형성하지 않는 것인 방법.
  50. 제43항 또는 제47항에 있어서, 제1착체 형성제 또는 제2착체 형성제 중 어느 하나 또는 양자 모두가 바람직한 이온에 우선해서 바람직하지 않은 이온과 착체를 형성하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 제1착체 형성제 또는 제2착체 형성제 중 어느 하나 또는 양자 모두가 상기 제1착체 형성제 또는 제2착체 형성체와 1종 이상의 바람직한 이온을 함유하는 착체 또는 염의 형태로 제공되는 것인 방법.
  52. 제43항 또는 제47항에 있어서, 제1착체 형성제 또는 제2착체 형성제 중 어느 하나 또는 양자 모두가 시트레이트, 옥살레이트 또는 EDTA르 포함하는 것인 방법.
  53. 제43항 또는 제47항에 있어서, 아연 이온이 상기 증폭을 수행하기 전 또는 증폭을 수행하는 동안 제공되는 것인 방법.
  54. 핵산을 함유하는 전(全)세포 시료를 증폭시키기 전에, 이 전세포를 용혈시켜서 상기 핵산을 방출시키고, 이 핵산을 변성시키기에 충분한 양으로 제공된 알칼리와 접촉시키고, 이어서 상기 시료 중의 상기 전세포의 잔류물을 제거하지 않고 상기 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는, 전세포로부터 유래된 핵산의 증폭 방법.
  55. 제54항에 있어서, 제2철 이온과 착체를 형성할 수 있는 착체 형성제가 상기 알칼리 및 상기 전세포 시료에 첨가되는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 착체 형성제가 데페록사민인 방법.
  57. 제54항 또는 제55항에 있어서, 전세포가 혈액 세포를 함유하는 것인 방법.
  58. 제54항 또는 제55항에 있어서, 전세포가 단핵 세포를 함유하는 것인 방법.
  59. 제54항 또는 제55항에 있어서, 알칼리가 KOH, (CH3)4NOH, NaOH 또는 LiOH인 것인 방법.
  60. 단핵 세포 및 원심 분리 매질을 함유하는 조성물을 윈심 분리하는 단계(이때, 상기 원심 분리 매질의 밀도 및 원심 분리력은 상기 조성물 중의 단핵 세포의 30%이상이 분리된 띠에 축적되도록 선택된다). 상기 분리된 띠를 원심분리 후에 상기 조성물의 잔여부로부터 분리하는 단계, 상기 분리된 띠를, 이 분리된 띠로부터 상기 단핵 세포를 용혈시키는 용혈제와 접촉시키는 단계, 및 상기 분리된 띠에 제2철 이온과 착체를 형성할 수 있는 착체 형성체를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단핵 세포로부터 핵산을 조제하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 조성물이 상기 잔여부로부터 상기 분리된 띠의 제거용이성 또는 분리 효율을 증대시키도록 형성된 튜브 내에 배치되는 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 분리된 띠의 분리 용이성 또는 축적 효율을 중대시키는 장치가 상기 분리된 띠에 인접하여 배치되는 것인 방법.
  63. 제60항에 있어서, 분리된 띠가 상기 시료 중에 존재하는 단핵세포의 50%를 함유하는 것인 방법.
  64. 제60항에 있어서, 상기 접촉이 유효량의 다가 양이온성 중합체 존재하에 수행되는 것인 방법
  65. 제64항에 있어서, 상기 다가 양이온성 중합체가 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민 또는 헥사디메트린 브로마이드인 것인 방법.
  66. 제60항에 있어서, 상기 시료가 전혈을 함유하는 것인 방법.
  67. 제60항 또는 제66에 있어서,상기 시료가 인체 헐액을 함유하는 것인 방법
  68. 제60항에 있어서, 필수적으로 제60항에 기재된 단계들로 이루어진 것인 방법.
  69. 제60항에 있어서, 상기 조성물이 원심 분리하기 전에 혼합되는 것인 방법.
  70. 제60항에 있어서, 상기 단핵 세포로부터 얻은 핵산이 특정 핵산 서열에 대해 스크리닝되는 것인 방법.
  71. 제60항에 있어서, 상기 단핵 세포와 관련된 핵산이 상기 용혈 및 상기 착체 형성제의 제공 후에 증폭되는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 핵산이 특정 핵산 서열에 대해 스크리닝되는 것인 방법.
  73. 혈액 및 원심 분리 매질을 함유하는 혼합물을 원심 분리하는 단계(이때, 상기 원심 분리 매질의 밀도 및 원심 분리력은 상기 혼합물 중의 단핵 세포의 30%이상이 상기 원심 분리 후에 상기 혼합물의 메니스커스에 인접한 상층부에 축적되도록 선택된다). 상기 혼합물의 상층부를 원심 분리 후에, 상기 단핵 세포를 용혈시키 는 용혈제 및 제2철 이온과 킬레이트를 형성하는 킬레이트제, 그리고 상기 핵산을 증폭시키는 다가 양이온성 중합cp효량과 접촉시키는 단계, 및 상기 핵산으 특정 바이러스에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 단핵 세포와 관련된 바이러스의 존재를 스크리닝하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 원심 분리가 등밀도 원심 분리인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 상층부가 상기 혼합물 부피의 20%이하를 포함하는 것인 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 용혈이 KOH를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  77. 제73항에 있어서 , 킬레이트제가 데페록사민 또는 철 결합 시데라민, 시데로마이신 또는 페리마이신인 방법.
  78. 제73항에 있어서, 증폭이 역전사 효소 및 RNA폴리머라제를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  79. 제73항에 있어서, 바이러스가 인체 면역 결핍 바이러스인 것인 방법.
  80. a.원심 분리 매질을 함유하는 조성물 중에서 원하는 세포의 30%이상을 원심 분리에 의해 분리된 띠에 축적시킬 수 있도록 선택된 밀도를 갖는 원심 분리 매질을 함유하는 제1용기, b.증폭용 핵산을 함유하는 세포를 용혈시킬 수 있는 용혈제를 함유하는 제2용기, 및 c.상기 분리된 띠 중에 존재하는 제2철 이온과 착체를 형성할 수 있는 착체 형성제를 함유하는 제3용기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 증폭용 핵산조제용 키트.
  81. 제80항에 있어서, 증폭 재료를 함유하는 제4용기를 더 포함하는 것인 키트.
  82. 제80항에 있어서, 포유류로부터 전혈을 수집 및 저장하기 위한 장치를 더 포함하는 것인 키트.
  83. 제80항에 있어서, 상기 혼합물이 전혈과 실질적으로 등장성이 되도록 하기에 충분한 삼투제의 공급을 더 포함하는 것인 키트.
  84. 제81항에 있어서, 증폭 재료가 폴리머라제 사슬 반응 과정의 수행에 필요한 재료를 함유하는 것인 키트.
  85. 제80항에 있어서, 증폭 재료가 역전사 효소 및 RNA 폴리머라제를 함유하는 것인 키트.
  86. 제80항에 있어서, 다가 양이온성 중합체를 함유하는 제4용기를 더 포함하는 것인 키트.
  87. 제80항에 있어서, 상기 단핵 세포로부터 얻은 핵산을 특정 바이러스에 대해 스크리닝하기 위한 프로브를 함유하는 제4용기를 더 포함하는 것인 키트.
  88. 제87항에 있어서, 프로브가 인체 면역 결핍 바이러스에 대해 스크리닝하는것인 키트.
  89. a.인체로부터 헐액을 수집 및 저장하기 위한 제1장치, b.전혈 시료 중에 존재하는 단핵 세포의 20%이상을 원심 분리 후에 분리된 띠에 축적시킬 수 있도록 선택된 밀도를 갖고, 또한 상기 전혈 시료와 효과적으로 등장성이 되도록 삼투제를 함유하는 원심 분리 매질을 함유하기에 적합한 제1용기, c.상기 분리된 띠률 분리하기 위한 제2장치, d.상기 전혈 시료로부터 얻은 단핵 세포를 용혈시킬 수 있는 알칼리를 함유하는 제2용기, e.제2철 이온과 킬레이트를 형성할 수 있는 킬레이트제을 함유하는 제3용기, f.다가 양이온성 중합체를 함유하는 제4용기, g.핵산 증폭에 필요한 재료를 함유하는 제5용기, 및 h.특정 바이러스에 대해 스크리닝할 수 있는 프로브를 함유하는 제6용기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 전혈 시료를 특정 바이러스에 대해 스크리닝하기 위한 키트.
  90. 제89항에 있어서, 바이러스가 인체 면역 결핍 바이러스인 키트.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
KR1019940704480A 1992-06-08 1993-06-07 단핵 세포로부터 핵산의 조제 방법(Preparation of Nucleic Acid from Mononuclear Cells) KR950701979A (ko)

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