JP2008530526A - 細胞を透過処理して安定化する試薬及びその使用方法 - Google Patents
細胞を透過処理して安定化する試薬及びその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008530526A JP2008530526A JP2007554139A JP2007554139A JP2008530526A JP 2008530526 A JP2008530526 A JP 2008530526A JP 2007554139 A JP2007554139 A JP 2007554139A JP 2007554139 A JP2007554139 A JP 2007554139A JP 2008530526 A JP2008530526 A JP 2008530526A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- reagent
- permeabilization
- cells
- intracellular
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 112
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 title abstract description 64
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 title description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 88
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 15
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N N-methylaminoacetic acid Natural products C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims abstract description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 58
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims description 16
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 14
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical group CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 11
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 claims description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 claims description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- TYTUELFFKLZOTE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;dodecyl hydrogen sulfate Chemical group OCC(N)(CO)CO.CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O TYTUELFFKLZOTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 claims description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005890 Spectrin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010019965 Spectrin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 abstract description 46
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 12
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract description 12
- 230000035515 penetration Effects 0.000 abstract description 5
- 150000008051 alkyl sulfates Chemical class 0.000 abstract description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 26
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 26
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 20
- 239000000306 component Substances 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 14
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010044495 Fetal Hemoglobin Proteins 0.000 description 8
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- -1 aliphatic aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 3
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- RJYOKYDKKOFLBT-UHFFFAOYSA-N 2-[methyl(octadecanoyl)amino]acetic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O RJYOKYDKKOFLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGOZDSMNMIRDFP-UHFFFAOYSA-N 2-[methyl(tetradecanoyl)amino]acetic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O NGOZDSMNMIRDFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIOYAVUHUXAUPX-ZHACJKMWSA-N 2-[methyl-[(e)-octadec-9-enoyl]amino]acetic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O DIOYAVUHUXAUPX-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010061191 Haemorrhage foetal Diseases 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000001206 effect on leukocytes Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000008040 ionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002433 mononuclear leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
- A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
- A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
1つの態様において、本発明は、細胞の透過処理と安定化のための試薬であって、以下の分子構造:R1−CO−N(CH3)CH2COOX1(ここで、R1は、8〜18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレンであり、そしてX1はH、Na+、又はK+である)によって表されるN−アシルサルコシン又はその塩;前記試薬のpHを7未満に調節するpH調節剤;及び水性媒体を含んで成る試薬に関する。当該試薬は、9.0mS/cm未満の導電率によって定義される低イオン強度を有している。好ましくは、N−アシルサルコシンはN−ラウリルサルコシン又はその塩であり、前記試薬のpHは約4〜6の範囲内であり、そして導電率は1.2mS/cm未満である。
1つの態様において、本発明はフローサイトメトリー解析のために細胞を準備するための細胞透過処理安定化試薬を提供する。当該細胞透過処理安定化試薬は:
(a)以下の分子構造:
R1−CO−N(CH3)CH2COOX1
(ここで、R1は8〜18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレンであり、そしてX1はH、Na+、又はK+である)によって表されるN−アシルサルコシン又はその塩;
(b)前記試薬のpHを7未満に調節するpH調節剤;及び
(c)水性媒体、
を含んで成る。
R2−O−SO3X2
(ここで、R2は8〜18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレン基であり;そしてX2はNa+、K+、NH4 +又はNH2C(CH2OH)3である)によって表される陰イオン性界面活性剤(すなわち、トリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン)を更に含んで成ることがある。
図4A、4B及び4C:カルシウム不在下でのマーキング。
図4D、4E及び4F:1mMのカルシウムの存在下でのマーキング。
図4A及び4D:血液構成要素の散乱図。血小板及び残骸は閾値を設けることで散乱図から除外した。
0.7mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を抗凝固剤として用いて処理した大量の血液を使用することで血清を調製した。別の大量のEDAT処理済みの血液をリン酸緩衝液(PBS)で洗浄し、9倍量の水で希釈して細胞可溶化物を取得した。細胞可溶化物を200gの遠心に15分間かけて、可溶性の細胞画分と膜画分とを分離した。ペレット含有膜画分を、可溶性細胞画分を体積当たり5%含むように大量の水と混合した。
1.修飾試薬1:界面活性剤(トリスラウリル硫酸塩及びN−ラウリルサルコシン)無添加で、pH7.0の実施例1の組成物C。
2.修飾試薬2:界面活性剤(トリスラウリル硫酸塩及びN−ラウリルサルコシン)無添加で、pH5.0の実施例1の組成物C。
3.修飾試薬3:pH7.0の実施例1の組成物C。
4.透過処理試薬4:上述の(pH5.0の)実施例1の組成物C。
−0.01mlの血清(A)、
−0.01mlの15%重量/体積のウシアルブミン調製物(B)、
−0.1mlの膜画分(D)。
0.01mlの全血を100μlの生理食塩水と混合し、続いて2mlの実施例2に記載の各透過処理試薬の変形版と混合した。5分間インキュベーションした後、50μlの各混合物を、0.2%(w/v)のウシ血清アルブミン及び、FITCと接合した、アルファチューブリンに対するモノクローナル抗体(Beckman Coulter Inc.米国マイアミ)を含む50μlのPBS溶液に添加した。アルファチューブリンは、専ら細胞の内側で発現する分子である。15分間のインキュベーション後、混合物は、0.5%ホルムアルデヒドを含む1mlのPBSと混合することで反応を停止させ、そして細胞を固定し、これにより解析用の試料混合物を形成させた。
図2A及び2B:血液と修飾試薬1とのプレインキュベーション。
図2C及び2D:血液と修飾試薬2とのプレインキュベーション。
図2E及び2F:血液と修飾試薬3とのプレインキュベーション。
図2G及び2H:血液と透過処理試薬4とのプレインキュベーション。
単核白血球は、EDTAの存在下、フィコールを用い、A. Boyem (1968, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21 Suppl. 97)の方法に従い抹消血から調製した。1000万の細胞を100μlの生理食塩水と混合し、続いて2mlの実施例2に記載の各透過処理試薬の変形版と混合した。細胞のインキュベーションと抗チューブリンFITC抗体による細胞内マーキングを実施例3に記載のように実施した。結果を図3Aから3Jに示す。更に具体的には、個々の散乱図は以下の通りである:
図3A、3B:細胞と修飾試薬1とのプレインキュベーション。
図3C、3D:細胞と修飾試薬2とのプレインキュベーション。
図3E、3F:細胞と修飾試薬3とのプレインキュベーション。
図3G、3H:細胞と透過処理試薬4とのプレインキュベーション。
図3I、3J:細胞と透過処理試薬4とのプレインキュベーション、FITCと接合したイソ型コントロール抗体との反応。
99%(v/v)の正常な血液及び1%(v/v)の臍帯血の混合物を胎児赤血球の検出に使用した。100μlの生理食塩水、続いて1mlの組成物Cを5μlの血液混合物に添加した。10分間のインキュベーション後、50μlの試料混合物を、以下のものを含む2つのチューブに添加した:
−チューブAには、0.2%(w/v)のウシ血清アルブミンと以下の抗体混合物:
−FITCと接合した抗胎児ヘモグロビン(HbF)モノクローナル抗体(フランス国特許第98 09006号);
−フィコエリトリンと接合した抗胎児血液群iモノクローナル抗体(フランス国特許第98 09006号);及び
−抗CD45−PC5モノクローナル抗体(Beckman Coulter Inc.フランス国マルセーユ)、
を含む50μlのPBS溶液を含めた。
0.01mlの全血を100μlの生理食塩水、続いて2mlの実施例1の組成物Bと混合した。5分間のインキュベーション後、50μlの混合物を、FITCと接合した、アルファチューブリンに対するモノクローナル抗体(Beckman Coulter Inc.米国マイアミ)を含むか、あるいはHbA1Cに対する、FITCと接合したモノクローナル抗体(抗HbA1c−FITC抗体)であって、米国特許第4,727,036号に記載のKnowles et alの方法に従い調製したものを含む50μlのPBS溶液に添加した。15分間のインキュベーション後、混合物は、0.5%ホルムアルデヒドを含む1mlのPBSと混合することで反応を停止させ、そして細胞を固定し、これにより解析用の試料混合物を形成させた。
図5A及び5B:抗チューブリン−FITC抗体との反応。
図5B及び5D:抗HbA1c−FITC抗体との反応。
図5E及び5F:FITCと接合したイソ型コントロール抗体との反応。
Claims (18)
- 細胞を透過処理して安定化する試薬であって:
(a)以下の分子構造:
R1−CO−N(CH3)CH2COOX1
(ここで、R1は8〜18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレンであり、そしてX1はH、Na+、又はK+である)によって表されるN−アシルサルコシン又はその塩;
(b)前記試薬のpHを7未満に調節するpH調節剤;及び
(c)水性媒体、
を含んで成り、
9.0mS/cm未満の導電率によって定義される低イオン強度を有している、試薬。 - 以下の分子構造:R2−O−SO3X2
(ここで、R2は8〜18個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレン基であり;そしてX2はNa+、K+、NH4 +又はNH2C(CH2OH)3である)
によって表される陰イオン性界面活性剤を更に含んで成る、請求項1に記載の試薬。 - ウシ血清アルブミンを更に含んで成る、請求項1又は2に記載の試薬。
- グリセロールを更に含んで成る、請求項1〜3のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記pHが約4〜約6の範囲内にある、請求項1〜4のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記導電率が1.2mS/cm未満である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記N−アシルサルコシンがN−ラウロイルサルコシンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記N−アシルサルコシンが約0.1mM〜約10mMの濃度範囲内にある、請求項7に記載の試薬。
- 前記陰イオン性界面活性剤がラウリル硫酸トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の試薬。
- 前記陰イオン性界面活性剤が約0.1mM〜約10mMの濃度範囲内にある、請求項9に記載の試薬。
- フローサイトメトリー解析のために細胞膜を透過処理し、そして細胞構成要素を保存する方法であって:
(a)細胞含有試料と、請求項1〜10のいずれか1項に記載の細胞を透過処理して安定化する試薬とを混合して、試料混合物を形成させるステップ;
(b)細胞膜を透過処理し、細胞膜内で細胞内タンパク質の凝集が生じさせ、そして細胞マーカーと結合するための細胞構成要素を保存するのに十分な時間、前記試料混合物をインキュベートするステップ;及び
(c)前記細胞マーカーを前記試料混合物に添加し、そして、当該細胞マーカーがステップ(b)で保存された細胞構成要素と結合するのに可能な追加の時間、その後のフローサイトメトリーによる解析のために、前記試料混合物をインキュベートするステップ、
を含んで成る方法。 - 前記細胞構成要素が、細胞内抗原部位又は細胞表面抗原部位、DNA、RNA、又は細胞骨格因子である、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞内抗原部位がヘモグロビン又はヘモグロビン変異体の抗原部位である、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞骨格因子がチューブリン及びスペクトリンを含んで成る、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞マーカーが前記細胞内抗原部位と特異的な抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞マーカーが前記DNA又はRNA分子と特異的な核酸プローブである、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞マーカーが前記細胞表面抗原部位と特異的な抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞マーカーが前記試料混合物中の前記細胞構成要素と結合した後に、前記細胞を固定することを更に含んで成る、請求項11に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11/052,269 US7678578B2 (en) | 2005-02-07 | 2005-02-07 | Cell permeabilization and stabilization reagent and method of use |
US11/052,269 | 2005-02-07 | ||
PCT/US2006/002612 WO2006086157A1 (en) | 2005-02-07 | 2006-01-24 | Cell permeabilization and stabilization reagent and method of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008530526A true JP2008530526A (ja) | 2008-08-07 |
JP4869258B2 JP4869258B2 (ja) | 2012-02-08 |
Family
ID=36780675
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007554139A Active JP4869258B2 (ja) | 2005-02-07 | 2006-01-24 | 細胞を透過処理して安定化する試薬及びその使用方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7678578B2 (ja) |
EP (1) | EP1863348B1 (ja) |
JP (1) | JP4869258B2 (ja) |
CN (1) | CN101115388B (ja) |
WO (1) | WO2006086157A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015500999A (ja) * | 2011-12-21 | 2015-01-08 | ベックマン コールター, インコーポレイテッド | 白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7541190B2 (en) * | 2005-02-07 | 2009-06-02 | Beckman Coulter, Inc. | Method of measurement of cellular hemoglobin |
US7625757B2 (en) | 2006-01-27 | 2009-12-01 | Sysmex Corporation | Reagent for immature leukocyte analysis and reagent kit |
US20090035758A1 (en) * | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Beckman Coulter, Inc. | Method of Measurement of Micronucleated Erythrocyte Populations |
US7968279B2 (en) * | 2008-08-13 | 2011-06-28 | Beckman Coulter, Inc. | Reference control for cell by cell analysis |
US20110195872A1 (en) * | 2010-02-10 | 2011-08-11 | Richard Selinfreund | Devices and systems for biomarker detection |
US9295251B1 (en) | 2011-04-08 | 2016-03-29 | Safehands Solutions, LLC | Synergistic antimicrobial compositions of PCMX and carboxylic acid and related methods |
WO2014105837A1 (en) * | 2012-12-28 | 2014-07-03 | Beckman Coulter, Inc. | Compositions for permeabilising fixed blood cells and uses thereof |
CN111504887B (zh) * | 2020-05-09 | 2023-05-09 | 苏州四正柏生物科技有限公司 | 一种溶血素及其制备方法 |
CN112504793B (zh) * | 2020-10-14 | 2021-10-01 | 核工业总医院 | 用于渗透和固定血细胞的试剂及分析方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10206423A (ja) * | 1996-11-20 | 1998-08-07 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 幼若白血球の分類計数法 |
US20030092187A1 (en) * | 2001-11-13 | 2003-05-15 | Karsten Stahnke | Method of detecting the release of substances from cell organelles by means of flow cytometry |
WO2004085989A2 (en) * | 2003-03-20 | 2004-10-07 | Beckman Coulter, Inc. | Dye compositions which provide enhanced differential fluorescence and light scatter characteristics |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4545979A (en) * | 1982-02-22 | 1985-10-08 | Warner-Lambert Company | Dental hygiene compositions |
US4477438A (en) * | 1982-11-12 | 1984-10-16 | Surgikos, Inc. | Hydrogen peroxide composition |
US4727036A (en) * | 1985-08-08 | 1988-02-23 | Molecular Diagnostics, Inc. | Antibodies for use in determining hemoglobin A1c |
US5714380A (en) * | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
US4810630A (en) * | 1987-03-30 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of polyoxyethylene ethers to improve the performance of immunoassays employing peroxidase conjugates |
JP2935529B2 (ja) | 1990-03-01 | 1999-08-16 | シスメックス株式会社 | 白血球分類方法および試薬 |
US5268292A (en) * | 1988-06-27 | 1993-12-07 | Robertson Betty H | Reproducible generation of high yields of hepatitis A virus by cell culture |
AU666957B2 (en) * | 1992-08-28 | 1996-02-29 | Alcon Laboratories, Inc. | Use of certain anionic surfactants to enhance antimicrobial effectiveness of ophthalmic compositions |
JP3301646B2 (ja) | 1993-03-19 | 2002-07-15 | シスメックス株式会社 | 幼若細胞測定用試薬 |
US5386043A (en) * | 1994-06-07 | 1995-01-31 | Hampshire Chemical Corp. | Non-aqueous neutralization of N-acyl sarcosines |
EP0708334B1 (en) * | 1994-10-20 | 2001-05-23 | Sysmex Corporation | Reagent and method for analyzing solid components in urine |
JP3324050B2 (ja) * | 1994-10-31 | 2002-09-17 | 日本光電工業株式会社 | 白血球分類用試薬および白血球分類方法 |
US7306931B2 (en) * | 2000-05-16 | 2007-12-11 | Bolder Biotechnology, Inc. | Method for refolding proteins containing free cysteine residues |
WO1999050460A1 (en) * | 1998-03-31 | 1999-10-07 | Tularik, Inc. | HIGH THROUGHPUT ASSAY FOR DETECTION OF mRNA IN CELLS |
US6271035B1 (en) * | 1998-10-20 | 2001-08-07 | Coulter International Corp. | Methods and compositions for rapid staining of nucleic acids in whole cells |
US6060322A (en) * | 1998-10-20 | 2000-05-09 | Coulter International Corp. | Method for identification of reticulated cells |
EP1124582B1 (en) * | 1998-10-27 | 2003-12-10 | Alcon Laboratories, Inc. | Preservative system for topically administrable pharmaceutical compositions |
US6228652B1 (en) * | 1999-02-16 | 2001-05-08 | Coulter International Corp. | Method and apparatus for analyzing cells in a whole blood sample |
DE60019458T2 (de) * | 1999-12-14 | 2006-02-23 | Thermo BioStar, Inc., Boulder | Stabilisierendes verdünnungsmittel für polypeptide und antigene |
US6413921B1 (en) * | 2000-08-01 | 2002-07-02 | Allegiance Corporation | Antimicrobial composition containing parachlorometaxylenol (PCMX) |
US6958244B2 (en) * | 2002-04-12 | 2005-10-25 | Bruker Biospin Corp. | Low-conductivity buffers for magnetic resonance measurements |
US20040214243A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-10-28 | Beckman Coulter, Inc. | Differential determination of hemoglobins |
-
2005
- 2005-02-07 US US11/052,269 patent/US7678578B2/en active Active
-
2006
- 2006-01-24 CN CN2006800040905A patent/CN101115388B/zh active Active
- 2006-01-24 JP JP2007554139A patent/JP4869258B2/ja active Active
- 2006-01-24 WO PCT/US2006/002612 patent/WO2006086157A1/en active Application Filing
- 2006-01-24 EP EP06719464.7A patent/EP1863348B1/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10206423A (ja) * | 1996-11-20 | 1998-08-07 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 幼若白血球の分類計数法 |
US20030092187A1 (en) * | 2001-11-13 | 2003-05-15 | Karsten Stahnke | Method of detecting the release of substances from cell organelles by means of flow cytometry |
WO2004085989A2 (en) * | 2003-03-20 | 2004-10-07 | Beckman Coulter, Inc. | Dye compositions which provide enhanced differential fluorescence and light scatter characteristics |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015500999A (ja) * | 2011-12-21 | 2015-01-08 | ベックマン コールター, インコーポレイテッド | 白血球の細胞内標的及び細胞外標的の標識方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1863348A1 (en) | 2007-12-12 |
US20060178294A1 (en) | 2006-08-10 |
EP1863348B1 (en) | 2016-10-12 |
US7678578B2 (en) | 2010-03-16 |
JP4869258B2 (ja) | 2012-02-08 |
EP1863348A4 (en) | 2010-05-26 |
CN101115388A (zh) | 2008-01-30 |
WO2006086157A1 (en) | 2006-08-17 |
CN101115388B (zh) | 2011-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4869258B2 (ja) | 細胞を透過処理して安定化する試薬及びその使用方法 | |
US5811099A (en) | Method and composition for preserving antigens and process for utilizing cytological material produced by same | |
US7541190B2 (en) | Method of measurement of cellular hemoglobin | |
US5459073A (en) | Method and composition for preserving antigens and process for utilizing cytological material produced by same | |
EP0305491B1 (en) | System for isolating and identifying leukocytes | |
WO1998002740A1 (en) | Method and composition for preserving antigens and nucleic acids and process for utilizing cytological material produced by same | |
EP2324350B1 (en) | Reference control for cell by cell analysis | |
JP2005536550A (ja) | 血液細胞の安定化のためのホルムアルデヒド−アンモニウム塩複合体 | |
US20080293144A1 (en) | Five-part differential white blood cell control and method for preparation of the same | |
EP0639985B1 (en) | Method and composition for preserving antigens and process for utilizing cytological material produced by same | |
TW201439515A (zh) | 用於高嚴苛度細胞處理及抗原修復之組成物 | |
CA3063144C (en) | Compositions and methods for lysis of red blood cells | |
JP2013518087A (ja) | 生体細胞用固定液 | |
Brown et al. | Specific precipitin reactions with the viruses of foot-and-mouth disease and vesicular stomatitis | |
FI903510A0 (fi) | Litiumsalter som reagens som bryter ned roeda blodkroppar och som denaturerar hemoglobin. | |
Wright et al. | Acute Babesia bovis infection: A study of the vascular lesions in kidney and lung | |
CN112504793B (zh) | 用于渗透和固定血细胞的试剂及分析方法 | |
PT625706E (pt) | Metodo de proteccao das celulas leucocitarias composicao protectora composicao sanguinea protegida e metodo de analise sanguinea | |
JPWO2006109685A1 (ja) | 血漿または血清の採取方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100129 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100129 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20100129 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20101217 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101221 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110316 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110324 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110601 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111107 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111115 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4869258 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141125 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |