JPH10206423A

JPH10206423A - 幼若白血球の分類計数法

Info

Publication number: JPH10206423A
Application number: JP9289619A
Authority: JP
Inventors: Takashi Sakata; 孝坂田; Toshihiro Mizukami; 利洋水上; Kayo Hatanaka; 加代畑中
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1996-11-20
Filing date: 1997-10-22
Publication date: 1998-08-07
Anticipated expiration: 2017-10-22
Also published as: JP4042925B2; US5958776A; EP0844481A1

Abstract

(57)【要約】【課題】高精度で幼若白血球を測定すると同時に、正
常白血球の分類並びに白血球計数を行うことができる方
法を提供する。【解決手段】以下の工程からなる幼若白血球の分類計
数法：（１）幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血
球に損傷を与える溶血剤で血液学的試料を処理する；（２）損傷を与えた前記白血球を、損傷を受けた細胞を
染色できる蛍光色素で染色する；そして（３）上記の工程で処理した血球の少なくとも１つの散
乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、その強度差
によって白血球を分類計数する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フローサイトメト
リによる白血球の分類計数法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野において、白血球の分類
計数を行うことは、疾患の診断を行う上で極めて有用な
情報を得ることができる。通常、正常な末梢血液中の白
血球には、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、好中球
の５つが存在するのみである。しかしながら、例えば種
々の血液疾患では、骨髄球、骨髄芽球等の幼若白血球が
出現してくる。これらの幼若白血球の出現を検出するこ
とは、疾患を診断する上で極めて重要である。

【０００３】従来、この目的には、血液の塗抹標本を作
製し適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類
計数することが一般的であった。一方、近年、フローサ
イトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計
数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置
は正常な白血球を高精度に分類計数することができる
が、上述の幼若白血球を確実に検出し分類することはで
きなかった。

【０００４】近年、ＲＦ／ＤＣ測定原理を用いて幼若白
血球の出現を高精度で検出する試薬及び方法が提供され
ている（特開平６−２７３４１３号）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前記公報の方法は、特
定の条件下では、正常白血球よりも幼若白血球の方が破
壊されにくいという性質を利用して電気的に測定を行う
ものである。また、散乱光情報によって測定できること
も示唆されている。しかし、この方法は、幼若白血球の
検出のみを目的としており、幼若白血球の検出において
優れた性能を有するが、幼若白血球の測定と同時に正常
な白血球を分類計数することはできない。正常な白血球
を分類計数するには、別途他の方法で行う必要がある。

【０００６】特開平６−２０７９２号には、白血球に標
識物質が通過するだけの損傷を与えて血液を分析する方
法が開示されているが、この方法は正常白血球にも幼若
白血球にも同様の損傷を与えて分析する方法であり、幼
若白血球と正常白血球の分離が必ずしも良くない。ま
た、この方法で処理された幼若白血球は、標識物質とし
て使用される色素に対して透過性であり、幼若白血球に
損傷を与えない方法を開示してはいない。

【０００７】本発明は、高精度で幼若白血球を測定する
と同時に、正常白血球の分類並びに白血球計数を行うこ
とができる方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の工程：（１）幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血
球に損傷を与える溶血剤で血液学的試料を処理する；（２）損傷を与えた前記白血球を、損傷を受けた細胞を
染色できる蛍光色素で染色する；そして（３）上記の工程で処理した血球の少なくとも１つの散
乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、その強度差に
よって白血球を分類計数する、からなる幼若白血球の分
類計数法を提供する。

【０００９】本発明でいう白血球の損傷とは、通常、生
きた白血球の細胞膜を通過しない色素の細胞膜透過を可
能とする操作である。本発明では、正常白血球は損傷
し、色素の透過を可能とし、一方幼若白血球は損傷せず
に、つまり色素透過性のない状態にする。

【００１０】通常の白血球細胞は、細胞内に不要の物質
（例えば色素）を排除する物質排除機能を有している。

【００１１】一方、特定の組成の溶血剤を細胞に作用さ
せた場合、作用機序は明確ではないが、特定の細胞（例
えば、正常白血球）の細胞膜脂質構成成分の一部を抽出
（引き抜く）することにより、細胞膜に特定の物質が通
過できるだけの細孔をあける。この結果、特定の細胞内
に色素分子が入り込み染色することができる。一方、幼
若白血球は、色素の透過を可能にするだけの細孔があけ
られないために（この状態を本発明中では生きた状態と
いう）、色素で染色されない。なお、本発明でいう幼若
白血球とは、通常骨髄に存在し、末梢血液に存在しない
未成熟な細胞を指す。例えば、芽球、前骨髄球、骨髄
球、後骨髄球をさす。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球につ
いては、まとめて幼若顆粒球とすることもある。さらに
は、芽球以前の分化段階の細胞である、骨髄系幹細胞
（CFU-GEMN）、好中球・マクロファージコロニー形成細
胞（CFU-GM）、好酸球コロニー形成細胞（CFU-EOS）等
の白血球系の造血前駆細胞も本発明の幼若白血球の範囲
に含む。幼若白血球が染色されず、その他の白血球が染
色されるようにするには下記の溶血剤と血液学的試料を
混合することによって得られる。本発明でいう血液学的
試料とは、主に末梢血液をさすが、この他にも、骨髄
液、アフェレーシス等によって回収された血液成分を含
む試料、又は腹腔液、尿試料等の白血球成分を含む生体
試料も好適な試料である。

【００１２】本発明で使用できる溶血剤としては、界面
活性剤を含む水溶液が用いられ、さらには以下の構造式
を有するポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤を
含むものが好適に用いられる。特開平６−２７３４１３
号に記載の溶血剤が好適である。前記公報に記載の溶血
剤は、（１）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化す
るためのポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤；
（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶
化剤；（３）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化す
るためのアミノ酸；および（４）液のｐＨを5.0〜9.0、
浸透圧を150〜600mOsm/kgにする緩衝液、電気伝導度を
6.0〜9.0 mS/cmにする緩衝液を含む。本発明では、光学
的に測定を行うため、電気伝導度の影響はほとんどな
く、従って電気伝導度については上記の範囲に限定され
ない。

【００１３】前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活
性剤は、以下の構造式を有するものが使用できる：

【化２】

【００１４】特に、ポリオキシエチレン（２０）ラウリ
ルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエー
テル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルが
好適である。

【００１５】ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性
剤の濃度については、使用するものによって異なるが、
前述のポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテルで
は、0.1〜2.0 g/l（好ましくは0.5〜1.5 g/l）、ポリオ
キシエチレン（１５）オレイルエーテルでは、1〜9 g/l
（好ましくは3〜7 g/l）、ポリオキシエチレン（１６）
オレイルエーテルでは、5〜50 g/l（好ましくは15〜35
g/l）の範囲で使用できる。ポリオキシエチレン系ノニ
オン性界面活性剤は、疎水性基の炭素数が同じであれ
ば、ｎの数が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、
ｎが大きくなるほど弱くなる。また、ｎの数が同じであ
れば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を損
傷する力が強くなる。その点を考慮し、上記の値を目安
にして、必要な界面活性剤濃度は実験により簡単に求め
ることができる。

【００１６】また、前記可溶化剤は以下のものから選ぶ
ことができる：

【化３】

【００１７】可溶化剤の好ましい濃度は、サルコシン酸
誘導体あるいはその塩では、0.2〜2.0 g/l、コール酸誘
導体では、0.1〜0.5 g/l、メチルグルカンアミドでは、
1.0〜8.0 g/lである。具体的には、Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナ
トリウム、ラウロイルサルコシン、ＣＨＡＰＳ（３−
［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］
−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−
［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］
−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、ＭＥ
ＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥ
ＧＡ９（ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧ
Ａ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が好適
に使用できる。その他に、ｎ−オクチルβ−グルコシ
ド、シュークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチ
ルロイシルアラニン等が使用でき、その好ましい濃度
は、0.01〜50.0 g/lである。

【００１８】また、アミノ酸は、タンパク質を構成する
アミノ酸を使用でき、グルタミン酸、バリンや、特にメ
チオニン、シスチン及びシステイン等のような含硫アミ
ノ酸が好適であり、メチオニンが最も好適である。使用
量は、1〜50 g/lの範囲で使用でき、グルタミン酸の場
合は8〜12 g/lが好適であり、メチオニンの場合には、1
6〜24 g/lが好適である。

【００１９】緩衝液は、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液
やリン酸緩衝液等に水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤を
加え、必要があれば、塩化ナトリウムのような浸透圧調
整剤をさらに加え、ｐＨを5.0〜9.0、浸透圧を150〜600
mOsm/kgとするのが好ましい。

【００２０】本発明で使用される色素は、損傷を与えた
細胞又は幼若白血球のうちいずれか一方を染色できれば
よいが、好ましくは損傷を与えた細胞を染色できる色素
である。損傷を与えた細胞を染色するための色素とは、
生細胞に対する透過性が低い色素である。一般に生細胞
は、細胞膜によって細胞外と区別されており、細胞膜は
細胞が必要としない物質を透過させないように、物質選
択的である。例えば、細胞膜透過性の低い色素の例とし
ては、トリパンブルーが挙げられる。これらの色素は一
般的に酸性官能基、例えばカルボキシル基、硫酸基等を
有する酸性色素である。これらの色素は生細胞を染色せ
ずに、細胞膜に損傷を受けた細胞を染色することができ
る。しかしながら、酸性色素は血小板等の白血球以外の
成分を染色する傾向にあるため本発明に使用するには好
適でない。本発明の目的を達成するには、白血球に特異
的に存在する成分を染色する方が好適である。この染色
対象としては、細胞核、特にＤＮＡに対して特異性を有
する色素あるいはＲＮＡに特異性を有する色素が特に好
適である。この目的には、いくつかのカチオン性色素が
好適である。

【００２１】一般的にカチオン性色素は、生きた細胞の
細胞膜を通過し、細胞内構成成分を染色する。しかしな
がら、特定のカチオン性色素（例えば、エチジウムブロ
マイド、プロピジウムアイオダイド等）は、生細胞を透
過せず、損傷細胞のみを染色することがよく知られてい
る。本発明の目的に使用できる色素は特に限定されるも
のではないが、具体例としては、先のエチジウムブロマ
イド、プロピジウムアイオダイド、さらにモレキュラー
プローブ社より販売されているエチジウム−アクリジン
ヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモ
ダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウ
ムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ
ＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３（Handbook of Fluorescen
t Probesand Research Chemicals 5th Edition 1992-19
94: MOLECULAR PROBES, INC. 1992 に記載）等に加え、
さらに、光源としてＨｅ−Ｎｅ、赤色半導体レーザを使
用する場合に好適な色素として、以下の構造式（Ｉ）で
示される色素が使用できることを見いだした：

【化４】（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ₂及びＲ
₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；
Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ₅は水
素原子、置換されていてもよい低級アルキル基；Ｚは硫
黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された炭素
原子；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである）。

【００２２】式（Ｉ）のＲ₁における低級アルキル基と
は、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基を意味
し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソ
ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒ−ブチル、ペンチル、
ヘキシル基が挙げられ、中でもメチル基、エチル基が好
ましい。

【００２３】Ｒ₂及びＲ₃における低級アルキル基は上記
と同様であり、低級アルコキシ基としては、炭素数１〜
６のアルコキシを意味し、例えば、メトキシ、エトキ
シ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エト
キシ基が好ましい。なお，Ｒ₂及びＲ₃は水素原子である
ことがより好ましい。

【００２４】Ｒ₄におけるアシル基とは、脂肪族カルボ
ン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセ
チル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が
好ましい。また、低級アルキル基は上記と同様である。

【００２５】Ｒ₅における低級アルキル基は上記と同様
であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、１
〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又
はヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル基を
意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エ
チル基が好ましい。

【００２６】Ｚにおける低級アルキル基とは上記と同様
であり、Ｚとしては硫黄原子であることが好ましい。

【００２７】Ｘ^-におけるアニオンは、ハロゲンイオン
（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化
ホウ素イオン（ＢＦ₄ ^-、ＢＣｌ₄ ^-、ＢＢｒ₄ ^-等）、リン
化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イ
オン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハ
ロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフ
ェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも、臭
素イオン又はＢＦ₄ ^-が好ましい。

【００２８】上記式（Ｉ）の色素の具体的な例として
は、以下の色素Ａ、色素Ｂおよび色素Ｃが好適である。
これらの色素Ａ、色素Ｂ、色素Ｃについては、特開平９
−１０４６８３号に詳細な合成方法が記載されている。

【化５】

【００２９】合成方法の一例を挙げると、式（Ｉ）にお
いてｎ＝１の化合物は、例えば、式（II）

【化６】で表される化合物と、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジンと
を反応させ、その生成物に式（III）

【化７】で表されるキノリン誘導体を反応させ、次いで、ホウフ
ッ化ナトリウムと処理することにより得ることができ
る。

【００３０】また、式（Ｉ）の化合物のうち、ｎ＝２の
化合物は、上記反応で、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジン
を用いる代わりに、例えば、マロンアルデヒドビス
（フェニルイミン）塩を反応させることによって得るこ
とができる。

【００３１】また、前述のMOLECULAR PROBES, INC.のハ
ンドブックにも幾つかの色素が記載されている。上述の
色素は例示であって、これによって本発明が制限される
ものではない。

【００３２】測定用試料の作製には、上述の溶血剤と色
素を含む溶液と血液試料を混合するだけでよい。あるい
は、色素をエチレングリコール等の水溶性有機溶媒に溶
解しておき、使用時に溶血剤と混合してもよい。このよ
うにすることによって、色素の保存安定性を高めること
ができる。色素濃度は、使用する色素に応じて適宜決定
でき、当業者は容易に実験的に求めることができる。例
えば、エチジウムブロマイドの場合、0.01〜100 ppm、
好ましくは0.1〜30 ppmが使用できる。

【００３３】また、血液試料と、色素を含む溶血剤溶液
との混合比は、１：１０〜１：１０００、反応温度は２
０〜４０℃、反応時間５秒〜５分間で好適に実施でき
る。反応温度が高いときは反応時間を短くすることが望
ましい。

【００３４】作製した試料を測定するには、例えば図１
に示すような構造のフローサイトメータが使用できる。
市販のフローサイトメータ（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ、
ベクトンディッキンソン社）が使用でき、特に改良の必
要はない。光源は、使用する蛍光色素の励起波長に合わ
せて適宜選択することができる。

【００３５】散乱光の検出は、前方散乱光（低角または
高角）でも側方散乱光でも構わない。

【００３６】本発明を以下の実施例によって説明する
が、本発明の範囲はこれに限定されない。

【００３７】

【実施例】

実施例１測定用試薬：ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル 24.0g/l Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム 1.5g/l ＤＬ−メチオニン 20.0g/l ＨＥＰＥＳ 12.0g/l １Ｎ−ＮａＯＨ 0.3g/l ＮａＣｌ 4.0g/l 色素Ａ 3.0mg/l

【００３８】上述の試薬１ｍｌと血液３３μｌを混合
し、１０秒後にフローサイトメータで側方散乱光、赤蛍
光を測定した（光源：赤色半導体レーザー、波長：６３
３ｎｍ）。

【００３９】得られた結果を図２（Ａ〜Ｃ）に示す。Ａ
は正常な血液の測定結果、Ｂは幼若顆粒球の出現してい
る血液、Ｃは幼若顆粒球、芽球の出現している検体の測
定結果を示す。図中、Ｌｙｍｐｈはリンパ球、Ｍｏｎｏ
は単球、Ｇｒａｎは顆粒球、ＩＧは幼若顆粒球、Ｂｌａ
ｓｔは芽球を示す。

【００４０】図２のＡでは、白血球がリンパ球、単球、
顆粒球に３分画されている。Ｂでは、正常の３分画に加
えて、幼若顆粒球が分画される。Ｃでは、正常の３分画
に加えて、幼若顆粒球と芽球が分画される。

【００４１】次に、本発明の測定法による測定結果と従
来法による測定結果を比較して相関分析を求めた。従来
法は多項目自動血球分析装置（ＳＥ−９０００、東亜医
用電子株式会社）で測定した。

【００４２】得られた結果を図３（Ａ〜Ｄ）に示す。リ
ンパ球（Ａ）、単球（Ｂ）および顆粒球（Ｃ）の割合、
ならびに白血球の総数（ＷＢＣ：図３ではＤで示す）の
いずれにおいても従来法と本発明の方法の結果に良好な
相関が得られた。なお、ＳＥ−９０００の顆粒球は、Ｎ
ＥＵＴ（好中球）＋ＥＯ（好酸球）＋ＢＡ（好塩基球）
で求めた。

【００４３】実施例２実施例１と同じ試薬を用いて、Ｇ−ＣＳＦ投与後の造血
前駆細胞の出現した検体をフローサイトメータで側方散
乱光と赤蛍光を測定した。結果を図４に示す。幼若白血
球の領域である蛍光強度の低い領域に細胞集団が認めら
れた。

【００４４】また、造血前駆細胞がＣＤ３４陽性である
性質を利用して、造血前駆細胞を分離して測定を行っ
た。まず、血液成分分析装置により単核球に富む試料を
調製し、次に、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（Becton
Dickinson Immunocytometry System Co., Ltd.社製）
を結合させた磁気ビーズ（Dynabeads^TM; DYNALとして市
販されている）と反応させ、次いで磁気細胞分離器（Is
olex^TM; Baxter Co., Ltd.）を用いてＣＤ３４陽性の造
血前駆細胞を分離した。次に、酵素（キモパパイン）処
理を行ってＣＤ３４陽性細胞を磁気ビーズから分離し
た。

【００４５】このようにして調製した試料を同じ試薬を
用いて、フローサイトメータで側方散乱光と赤蛍光を測
定した。結果を図５に示す。同様に幼若白血球の領域で
ある蛍光強度の低い領域に細胞集団が認められた。

【００４６】

【発明の効果】本発明によれば、溶血剤による処理に加
え、さらに損傷細胞を染色できる色素で染色し、散乱光
と蛍光とを組み合わせて測定することにより、従来法で
は不可能であった正常白血球の分類計数と幼若白血球の
分類計数が同時に可能になり、ならびに白血球数計数が
一つの系で可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法に使用できるフローサイトメータ
の概略図を示す。

【図２】本発明の方法を用いて測定した結果を示す。Ａ
は正常な血液の測定血液、Ｂは幼若顆粒球の出現してい
る血液、Ｃは幼若顆粒球、芽球の出現している検体の測
定結果である。

【図３】本発明の測定法による測定結果と従来法による
測定結果を比較して相関分析結果を示す。

【図４】Ｇ−ＣＳＦ投与後の造血前駆細胞の出現した検
体を本発明の方法を用いて測定した結果を示す。

【図５】ＣＤ３４陽性の造血前駆細胞を分離した後、本
発明の方法を用いて測定した結果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程からなる幼若白血球の分類計
数法：（１）幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血
球に損傷を与える溶血剤で血液学的試料を処理する；（２）損傷を与えた前記白血球を、損傷を受けた細胞を
染色できる蛍光色素で染色する；そして（３）上記の工程で処理した血球の少なくとも１つの散
乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、その強度差
によって白血球を分類計数する。
【請求項２】幼若白血球の分類計数と同時に、正常白
血球も検出し、全白血球数を計数する請求項１記載の方
法。
【請求項３】さらに正常白血球を少なくとも３つに分
類計数する請求項２記載の方法。
【請求項４】溶血剤が以下の成分：（１）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化するため
のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤；（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶
化剤；（３）幼若白血球の細胞質及び細胞膜を固定化するため
のアミノ酸；および（４）液のｐＨを5.0〜9.0、浸透圧を150〜600 mOsm/kg
にする緩衝液、を含む請求項１〜３のいずれかに記載の
方法。
【請求項５】蛍光色素が以下の群から選ばれる請求項
１〜４のいずれかに記載の方法：（１）以下の式（Ｉ）の化合物：【化１】（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ₂及びＲ
₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；
Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基；Ｒ₅は水
素原子、置換されていてもよい低級アルキル基；Ｚは硫
黄原子、酸素原子又は低級アルキル基で置換された炭素
原子；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである）；（２）エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイ
ド；（３）エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジ
ウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウ
ムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ
−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ
−３。