JPWO2009001868A1 - 幼若白血球の分析用試薬及び分析用試薬キット - Google Patents

Abstract

本発明は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、核酸染色色素とを含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である幼若白血球の分析用試薬を提供する。

Description

本発明は、生体から採取された試料中の白血球を分類し、計数するための試薬及び試薬キットに関する。

血球細胞は骨髄で産生され、未熟な細胞から分化して成熟し、末梢血に移行する。健常人の場合、幼若な白血球（幼若白血球）が末梢血に出現することはない。一方、白血病、癌の骨髄転移、多発性骨髄腫、重症感染症などの患者の末梢血には、幼若白血球が出現することがある。このため、生体試料中の成熟白血球や幼若白血球を分類して測定することは、これらの疾患を診断する上で極めて重要である。

幼若白血球を測定するための試薬として、特開平１０−２０６４２３号（特許文献１）に開示される試薬が知られている。この試薬と生体試料とを混合した測定試料をフローサイトメータに導入し、特定の波長の光を照射して得られる光学的情報に基づいて検体中の成熟白血球と幼若白血球とを分類し、それぞれを計数することができる。また、幼若白血球を、骨髄芽球、幼若顆粒球などに細分類してそれぞれ計数することも可能である。
特開平１０−２０６４２３号公報

従来の試薬を用いる血球分析では、たとえば、フローサイトメータを用いて血球を測定した場合、溶血した赤血球の破片（赤血球ゴースト）のシグナル領域と、骨髄芽球のシグナル領域とが、一部重複することがあった。そのような試薬を用いると、骨髄芽球が含まれない血液試料を分析した場合でも、赤血球の破片のシグナルが骨髄芽球のシグナルとして誤って認識され、正確な血球分析結果を得ることができなかった。例えば、多発性骨髄腫、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、糸球体腎炎、胸膜炎などの特定の疾患に罹患した患者の末梢血には、骨髄芽球が含まれない。しかし、前記従来の試薬を用いてこれらの患者から採取した抹消血の血球分類を行うと、スキャッタグラムにおける骨髄芽球のシグナル検出領域に、シグナルが検出されてしまう場合があった。これは、このような特定の患者からの試料に含まれる赤血球が、健常な人やこれらの疾患以外の疾患の患者の試料中の赤血球とは異なり、うまく溶血されないことが原因ではないかと考えられる。末梢血中に実際よりも多い量の骨髄芽球が検出されると、正しい診断及び治療がなされない恐れがある。なお、本明細書において、「赤血球ゴースト」とは、血液試料と血液分析用試薬との反応の結果、ヘモグロビンを喪失したが、十分収縮しなかった赤血球を意味する。

そこで、このような特定の疾患の患者からの血液試料であっても、より正確な幼若白血球の分類及び計数を行うことができる試薬を提供することを本発明の課題とする。

このような問題を解決するために研究を重ねた結果、本発明者らは、幼若白血球の分析用試薬の浸透圧を、従来考えられていたよりも低くすることにより、上記の課題を解決できることを見出した。

従来の幼若白血球の分析用試薬は、幼若白血球及び成熟白血球が測定時に溶解することを防止するために、これらの血球細胞と同程度の浸透圧を有するものを用いることが好適であると考えられていた。
しかしながら、今回、多発性骨髄腫、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、糸球体腎炎、胸膜炎などの特定の疾患に罹患した患者からの生体試料を分析する場合、従来の技術常識では考えられなかった低浸透圧の分析用試薬を用いると、このような特定の患者からの生体試料の分析の精度がより向上することが見出された。たとえば、低浸透圧の分析用試薬を用いることにより、骨髄芽球と溶血した赤血球とをより明確に弁別できた。また、驚くべきことに、上記の特定の疾患以外の疾患を罹患している患者からの生体試料であっても、本発明の分析用試薬を用いると、浸透圧が高い従来の試薬と同様に、幼若白血球と成熟白血球とを明確に区別することができることがわかった。たとえば、本発明の分析用試薬を用いることにより、赤血球ゴーストの出現を防ぐことができることが分かった。
低浸透圧の分析用試薬を用いた場合でも、検体によっては、骨髄芽球のシグナルと好塩基球のシグナルとが重なって検出される場合がある。そのため、健常人の末梢血中に骨髄芽球が出現していなくても、骨髄芽球が出現しているとされ、正しい検査がなされないおそれがあった。骨髄芽球のシグナルと好塩基球のシグナルとが重複するというさらなる問題に対しては、幼若白血球の分析用試薬の界面活性剤、可溶化剤濃度を、従来考えられていたよりも低くすることにより解決することができた。すなわち、好塩基球を多く含む血液試料であっても、本発明の試薬を用いることにより、好塩基球と骨髄芽球とを、より明確に区別することができた。さらに、界面活性剤、可溶化剤濃度を低くすることにより、低浸透圧下においても成熟白血球を少なくとも３分類することができた。

本発明の１つの側面は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、
損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、
核酸染色色素と
を含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である幼若白血球の分析用試薬である。

また、本発明の１つの側面は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤とを含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である第１試薬、及び
核酸染色色素を含む第２試薬
を含む幼若白血球の分析用試薬キットである。
本発明のさらなる１つの側面は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、核酸染色色素とを含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である幼若白血球の分析用試薬と、幼若白血球を含み得る生体試料とを混合し、成熟白血球の核酸を染色する工程、及び
前記工程で処理した幼若白血球の少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、その強度差によって幼若白血球を分類する方法である。

本発明の幼若白血球の分析用試薬及び試薬キットを用いることにより、多発性骨髄腫、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、糸球体腎炎、胸膜炎などの特定の疾患に罹患した患者の生体試料であっても、従来の試薬に比べてより正確な幼若白血球及び成熟白血球の分類及び計数を行うことができる。

本発明の試薬又は試薬キットを用いて幼若白血球の分析を行う際に用いることができるフローサイトメータの一例を示す模式図である。 実施例１で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例２で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例３で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例４で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例５で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例６で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例７で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例８で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例９で得られたスキャッタグラムを示す。 実施例１０で得られたスキャッタグラムを示す。

符号の説明

６ ノズル
２１ 光源
２２ コリメートレンズ
２３ フローセル
２４ 集光レンズ
２５ ピンホール板
２６ 前方散乱光検出器
２７ 集光レンズ
２８ ダイクロックミラー
２８’ フィルター
２９ 側方散乱光検出器
３０ ピンホール板
３１ 側方蛍光検出器
３２、３３、３４ アンプ
３５ 解析部

本実施形態の幼若白血球の分析用試薬（以下、「試薬」ともいう）を用いると、生体試料に含まれる白血球を成熟白血球と幼若白血球とに分類し、それぞれを計数することができる。また、成熟白血球をリンパ球、単球、顆粒球、好塩基球などの少なくとも３種以上に分類し、それぞれを計数することができる。さらに、この試薬を用いると、幼若白血球を幼若顆粒球と骨髄芽球とに細分類し、それぞれを精度良く計数することもできる。

本明細書において、「幼若白血球」とは、健常人において末梢血には存在せず骨髄に存在する未成熟な白血球のことを指す。幼若白血球としては、例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などが挙げられる。前骨髄球、骨髄球及び後骨髄球をまとめて「幼若顆粒球」と称することもある。骨髄芽球は、骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＮ）、好中球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＥＯＳ）などの白血球系の造血前駆細胞を含む。

本実施形態の試薬を用いて分析する生体試料としては、白血球を含む試料であれば特に限定されず、血液、尿、骨髄穿刺液、アフェレーシスで採取した試料などを例示することができる。

本実施形態の試薬は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、核酸染色色素とを含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である。
生体試料と試薬とを混合すると、界面活性剤と可溶化剤の作用により試料に含まれる血球の細胞膜が損傷を受ける。界面活性剤は、赤血球や成熟白血球の細胞膜に損傷を与えやすく、幼若白血球の細胞膜は損傷しにくい。赤血球や成熟白血球などの損傷した血球は、可溶化剤の作用により収縮する。一方、幼若白血球の細胞膜はほとんど損傷されないので、赤血球や成熟白血球よりも可溶化剤による細胞の収縮が起こりにくい。
損傷を受けた血球のうち、白血球の核は、核酸染色色素の作用により強く染色されやすい。しかし、損傷を受けていない幼若白血球は染色されにくい。また、赤血球は核を持たないので、上記の核酸染色色素によっては染色されにくい。よって、幼若白血球、成熟白血球、赤血球をそれぞれ弁別できる。

本実施形態の試薬の浸透圧は、１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であり、好ましくは１０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１０〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇである。この浸透圧は、以下に記載する成分を以下に記載する量で混合することによるか、又は緩衝剤の濃度を適宜調節することにより得ることができるが、所望により、糖類、アミノ酸、塩化ナトリウムなどを加えることにより調整してもよい。

糖類としては、特に限定されないが、単糖類（例えばグルコース、フルクトースなど）、多糖類（例えばアラビノースなど）、糖アルコール（例えばキシリトール、ソルビトール、マンニトール、リビトールなど）などが挙げられる。
例えばキシリトールを用いる場合、試薬中に０〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは４〜８ｇ／Ｌ用いてもよい。

上記のアミノ酸としては、バリン、プロリン、グリシン、アラニンなどが挙げられる。グリシン及びアラニンの何れか又は両方を用いることが好ましい。
例えばグリシンを用いる場合、試薬中に０〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは２〜６ｇ／Ｌ用いてもよい。

赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤は、ノニオン界面活性剤が好ましく、より好ましくは、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である。該ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤は、以下の式（Ｉ）：
Ｒ¹−Ｒ²−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈ （Ｉ）
（式中、Ｒ¹は炭素数９〜２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｒ²は−Ｏ−、−ＣＯＯ−又は
であり、ｎは１０〜４０の整数である）
で示されるものがより好ましい。

上記の式（Ｉ）で表される界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルなど挙げられ、１種又は複数種を用いることができる。

試薬中の界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類に応じて適宜選択できる。界面活性剤がポリオキシエチレンオレイルエーテルである場合、界面活性剤の試薬中の濃度は、５００〜１５０００ｐｐｍが好ましく、より好ましくは７５０〜１００００ｐｐｍ、さらに好ましくは１０００〜２５００ｐｐｍである。
本発明のより好ましい実施形態において、界面活性剤の濃度を例えば１０００〜１００００ｐｐｍのように比較的低く設定する。そのような濃度範囲においては、成熟白血球の１種である好塩基球の細胞膜の損傷が、界面活性剤の濃度が比較的高い場合よりも弱められ、好塩基球が損傷されて細胞内成分が細胞外に流出することを防ぐことができる。このことにより、好塩基球は、他の成熟白血球と同様に核酸染色色素の作用により染色されやすくなる。一方、幼若白血球の１種である骨髄芽球の細胞膜は、上記のように損傷を受けていないので染色されにくい。このようにして、好塩基球と骨髄芽球とをよりよく弁別できる。

複数種の界面活性剤を用いる場合、これらの界面活性剤の混合比は、界面活性剤の水酸基価に応じて適宜選択できる。例えば、水酸基価６４．８のポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルと水酸基価５２．４のポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルとを用いる場合、混合比は１：９が好ましい。

上記の可溶化剤としては、例えばサルコシン誘導体、コール酸誘導体、メチルグルカンアミドなどが挙げられる。これらから選択される１種又は複数種を用いることができる。
サルコシン誘導体としては、以下の構造式に示すサルコシン誘導体及びその塩を含む。具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシンなどが挙げられる。コール酸誘導体としては、以下の構造式に示すコール酸及びその塩を含む。具体的には、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）などが挙げられる。メチルグルカンアミドとしては、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）などが挙げられる。

サルコシン誘導体は、次の構造式を有する。
（式中、Ｒ₁はＣ_10-22のアルキル基であり、ｎは１〜５である。）

コール酸誘導体は、次の構造式を有する。
（式中、Ｒ₁は水素原子又は水酸基である。）

メチルグルカンアミドは、次の構造式を有する。
（式中、ｎは５〜７である。）

可溶化剤の試薬中の濃度は、用いる可溶化剤の種類に応じて適宜選択できる。
可溶化剤としてサルコシン誘導体を用いる場合、試薬中の可溶化剤の濃度は５０〜３０００ｐｐｍが好ましく、より好ましくは１００〜４００ｐｐｍである。コール酸誘導体を用いる場合、５０〜１００００ｐｐｍが好ましく、より好ましくは５０〜１３００ｐｐｍである。メチルグルカンアミドを用いる場合、５００〜８０００ｐｐｍが好ましく、より好ましくは５００〜１１００ｐｐｍである。

また、可溶化剤としては、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレート、Ｎ−ホルミルメチルロイシルアラニンなどを用いることもできる。これらを用いる場合、試薬中の濃度は５〜５００００ｐｐｍが好ましく、より好ましくは５〜６６００ｐｐｍである。可溶化剤は単独で用いてもよいし、２種類以上の可溶化剤を併用してもよい。

本発明のより好ましい実施形態において、可溶化剤の濃度を比較的低くすることにより、成熟白血球の１種である好塩基球の細胞膜の損傷が、可溶化剤の濃度が比較的高い場合よりも弱められ、好塩基球が損傷されて細胞内成分が細胞外に流出することを防ぐことができる。このことにより、好塩基球は、他の成熟白血球と同様に核酸染色色素の作用により染色されやすくなる。一方、幼若白血球の１種である骨髄芽球の細胞膜は、上記のように損傷を受けていないので染色されにくい。このようにして、好塩基球と骨髄芽球とをよりよく弁別できる。

上記の核酸染色色素は、核酸を染色できるものであれば特に限定されないが、蛍光色素であることが好ましい。このような色素を用いることにより、核酸を持たない赤血球はほとんど染色されず、核酸を有する白血球は強く染色される。この染色強度の差異に基づいて、赤血球と白血球とを弁別することができる。また、色素が透過できるほどの損傷を受けた細胞膜を有する成熟白血球は、この色素により強く染色されるが、損傷をほとんど受けていない幼若白血球はほとんど染色されない。この染色強度の差異に基づいて、白血球のうち成熟白血球と幼若白血球とを弁別することができる。

核酸染色色素は、分析に用いる照射する光によって適宜選択される。例えば、以下のような構造式を有する色素を用いることが好ましい。
（１）以下の式（ＩＩ）を有する色素
（式中、Ｒ₁及びＲ₂は、低級アルキル基であり；ｎは１又は２であり；Ｘ^-はアニオンであり；Ｚは硫黄原子、酸素原子、又は低級アルキル基で置換された炭素原子である）。

上記の式（ＩＩ）中、Ｒ₁及びＲ₂における低級アルキル基は、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基のことをいう。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられ、これらのうちエチル基が好ましい。
Ｚにおける低級アルキル基は、上記のとおりである。Ｚとしては、硫黄原子が好ましい。
Ｘ^-におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ₄ ^-、ＢＣｌ₄ ^-、ＢＢｒ₄ ^-など）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環ハロゲン或いはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオンなどが挙げられる。これらのうち、ヨウ素イオンが好ましい。

上記式（ＩＩ）の核酸染色色素としては、以下のような色素が好適である。
色素Ａ

（２）以下の式（ＩＩＩ）を有する色素
（式中、Ｒ₁及びＲ₂は、低級アルキル基であり；ｎは１又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）。

上記の式（ＩＩＩ）におけるＲ₁及びＲ₂の低級アルキル基、並びにＸ^-のアニオンについては、上記の式（ＩＩ）で述べたことと同様である。

上記式（ＩＩＩ）の核酸染色色素としては、以下のような色素が好適である。
色素Ｂ

（３）以下の式（ＩＶ）を有する色素
（式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基であり；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基であり；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基であり；Ｒ₅は水素原子又は置換されていてもよい低級アルキル基であり；Ｚは硫黄原子、酸素原子、又は低級アルキル基で置換された炭素原子であり；ｎは１又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）。

上記の式（ＩＶ）におけるＲ₁の低級アルキル基については、上記の式（ＩＩ）で述べたことと同様である。
Ｒ₂及びＲ₃における低級アルキル基は、上記と同様である。低級アルコキシ基は、炭素数１〜６のアルコキシを意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。なお、Ｒ₂及びＲ₃は水素原子であることが好ましい。

上記の式（ＩＶ）において、Ｒ₄におけるアシル基とは、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同様である。
Ｒ₅における低級アルキル基とは上記と同様であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エチル基が好ましい。
Ｚにおける低級アルキル基は上記と同様であり、Ｚとしては硫黄原子であることが好ましい。
Ｘ^-におけるアニオンとしては、臭素イオン又はＢＦ₄ ^-が好ましい。

上記式（ＩＶ）の核酸染色色素としては、以下のような色素が好適である。
色素Ｃ

（４）以下の式（Ｖ）を有する色素。
（式中、Ｘ₁及びＸ₂は、独立してＣｌ又はＩである）

（５）以下の式（ＶＩ）を有する色素（ＮＫ−３９７５）。

（６）以下の式（ＶＩＩ）を有する色素（ＮＫ−１５７０）。

（７）以下の式（ＶＩＩＩ）を有する色素（ＮＫ−１０４９）。

（８）以下の式（ＩＸ）を有する色素（ＮＫ−９８）。

（９）以下の式（Ｘ）を有する色素（ＮＫ−１４１）。

（１０）プロピジウムアイオダイド、又はエチジウムブロマイド。
（１１）エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス［［３‐［［４‐［［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］メチレン］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐１‐イル］プロピル］ジメチルアミニウム］・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−１）、４‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐２（３Ｈ）‐イリデン）メチル］‐１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］キノリニウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐テトラメチル‐Ｎ，Ｎ’‐ビス［３‐［４‐［３‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］‐２‐プロペニリデン］‐１，４‐ジヒドロキノリン‐１‐イル］プロピル］‐１，３‐プロパンジアミニウム・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−３）、又は２‐［３‐［［１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐４‐イリデン］‐１‐プロペニル］‐３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−３）。

上記の色素の試薬中の濃度は、０．０１〜５００ｐｐｍが好ましく、より好ましくは０．１〜２００ｐｐｍである。上記の色素は、単独で用いてもよいし、２種類以上の色素を併用してもよい。

本実施形態の試薬のｐＨは、５．０〜９．０が好ましく、より好ましくは６．５〜７．５、さらに好ましくは６．８〜７．３である。試薬のｐＨは、緩衝剤を添加して調整できる。緩衝剤としては、例えばＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＭＯＰＳＯ（2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid）又はＢＥＳ（2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid）などのグッド緩衝剤、リン酸緩衝剤などを用いることができる。また、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調整剤を用いることができる。

本実施形態の試薬は、上記の界面活性剤、可溶化剤及び核酸染色色素と、所望により任意の成分とを上記の濃度になるように適切な溶媒に溶解することにより得ることができる。上記の適切な溶媒としては、上記の成分を溶解できるものであれば特に限定されないが、水、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、これらの混液などが挙げられる。

上記の界面活性剤、可溶化剤及び核酸染色色素は、上記のように単独の試薬として生体試料と混合して幼若白血球の分析を行うことができる。あるいは、界面活性剤と可溶化剤とを含む第１試薬、及び核酸染色色素を含む第２試薬とを含む試薬キットとして用いて、幼若白血球の分析に用いることもできる。
よって、本発明は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤とを含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である第１試薬、及び核酸染色色素を含む第２試薬を含む幼若白血球の分析用試薬キットも提供する。

上記の第１試薬中の界面活性剤及び可溶化剤の濃度は、第２試薬と混合したときに、上記の幼若白血球の分析用試薬について述べた濃度になるようなものであればよい。また、上記の第１試薬の浸透圧は、界面活性剤及び可溶化剤を上記のような適切な溶媒に溶解し、所望により上記の緩衝剤の量を適宜調節することにより所望の範囲に調整することができる。また、上記の糖、アミノ酸などを用いて調整してもよい。

上記の第２試薬中の核酸染色色素の濃度は、第１試薬と混合したときに、上記の幼若白血球の分析用試薬について述べた濃度になるようなものであればよい。第２試薬は、色素の保存安定性を向上させることができるので、核酸染色色素をエチレングリコールなどの有機溶媒に溶解したものが好ましい。

上記の試薬及び試薬キットは、生体試料と混合して測定用試料を調製し、フローサイトメータに供することにより、幼若白血球の分析を行うことができる。生体試料と該試薬又は試薬キットの第１試薬及び第２試薬の合計との混合比（容量比）は、１：１０〜１：１０００が好ましい。
また、試薬キットにおいて、第１試薬と第２試薬との混合比（容量比）は、１０００：１〜１０：１程度が好ましい。

上記の試薬キットを用いる場合、試薬キットの各試薬と生体試料とを混合する順序としては特に限定されないが、第１試薬及び第２試薬とを混合し、次いで生体試料を混合することが好ましい。

上記の試薬又は試薬キットと生体試料との混合は、試薬により適宜設定できる。例えば、２０〜４０℃の温度、及び３〜３０秒間の反応時間から選択できる。反応温度が高いときは反応時間を短くし、反応温度が低いときは反応時間を長くすることができる。

上記の分析にフローサイトメータを用いる場合、フローセル中を流れる測定試料中の血球に光を照射して散乱光や蛍光などの光学的情報を取得し、これに基づいて血球の種類及び数を測定できる。

具体的には、上記の分析は、図１に示すようなフローサイトメータを用いて行うことができる。以下、図１に基づき、本実施形態の一例として骨髄芽球の測定について詳述する。
ノズル６から吐出された測定用試料は、フローセル２３のオリフィス部を流れる。このとき、試料中の血球は一列になってオリフィス部を通過する。光源２１から射出した光は、コリメートレンズ２２を介してフローセル２３を流れる血球に照射される。血球に光を照射することによって側方散乱光、側方蛍光及び前方散乱光が生じる。側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロックミラー２８とを介して側方散乱光検出器（フォトマルチプラアチューブ）２９に入射する。側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロックミラー２８とフィルター２８’とピンホール板３０とを介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５とを介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。

前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２、アンプ３３及びアンプ３４により増幅され、解析部３５に入力される。

解析部３５は、受信した前方散乱光信号、側方散乱光信号及び側方蛍光信号から、前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を算出する。解析部３５は、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第一の二次元分布図を作成し、この二次元分布図上で試料中の全白血球が出現する領域（全白血球領域）を特定する。さらに、全白血球領域に出現する細胞について側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第二の二次元分布を作成する。この二次元分布図上で、成熟白血球が出現する領域（成熟白血球領域）、リンパ球が出現する領域（リンパ球領域）、単球が出現する領域（単球領域）、顆粒球が出現する領域（顆粒球領域）を設定する。さらに、骨髄芽球が出現する領域（骨髄芽球領域１）及び幼若顆粒球が出現する領域（幼若顆粒球領域）を特定する。

次に、側方散乱光強度及び前方散乱光強度を二軸とする第三の二次元分布を作成し、この二次元分布上で骨髄芽球が出現する領域（骨髄芽球領域２）を特定する。骨髄芽球領域１及び骨髄芽球領域２に出現する細胞数を試料に含まれる骨髄芽球数として計数し、幼若顆粒球領域に出現する細胞数を試料に含まれる幼若顆粒球数として計数する。なお、骨髄芽球は細胞サイズが大きく、単核であるため、前方散乱光強度が強く、側方散乱光強度が弱い。また、上述したようにほとんど染色されないので蛍光強度が弱い。幼若顆粒球は、細胞サイズが大きく、核が分葉しているので、前方散乱光強度及び側方散乱光強度が強い。また、上述したようにほとんど染色されないので蛍光強度が弱い。

本発明は、上記の分析用試薬又は分析用試薬キットを生体試料と混合することを含む幼若白血球の分析方法も提供する。
本発明の方法の好ましい実施形態において、上記の分析用試薬中、又は分析用試薬キットの第１試薬と第２試薬とを混合した試薬中の界面活性剤の濃度は、５００〜１５０００ｐｐｍ、より好ましくは７５０〜１００００ｐｐｍ、さらに好ましくは１０００〜２５００ｐｐｍである。
また、本発明の方法の別の好ましい実施形態において、可溶化剤としてサルコシン酸誘導体又はその塩を用いる場合、上記の分析用試薬中、又は分析用試薬キットの第１試薬と第２試薬とを混合した試薬中の可溶化剤の濃度は、１００〜４００ｐｐｍであり、コール酸誘導体を用いる場合は、５０〜１３００ｐｐｍであり、メチルグルカンアミドを用いる場合は、５００〜１１００ｐｐｍである。
これらの好ましい実施形態により、生体試料中の好塩基球と骨髄芽球との弁別をより明確に行うことができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。

（実施例１）
以下の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。
＜第１試薬＞
ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（日光ケミカルズ）２０００ｐｐｍ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（市販品） １２５ｐｐｍ
ＭＯＰＳＯ（市販品） １０ｍＭ
精製水 １Ｌ
上記の各成分を混合し、さらにＮａＯＨを添加してｐＨを７．０に調整した。第１試薬の浸透圧は２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．７８ｍＳ／ｃｍであった。

＜第２試薬＞
核酸染色色素 ５０ｐｐｍ
エチレングリコール １Ｌ
色素をエチレングリコールに溶解して、第２試薬を調製した。なお、核酸染色色素は、上記の色素Ｃを用いた。

第１試薬９８０μＬ、第２試薬２０μＬ、及び健常な人から採取した血液試料（好塩基球比率２．１％、骨髄芽球は含まない）２０μＬを混合し、３５℃で１９秒間反応させて、測定用試料を得た。得られた測定用試料を用いて、図１に示すフローサイトメータで、側方散乱光強度、前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した。なお、光源は赤半導体レーザーを用いた。

得られた前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第一の二次元分布図（スキャッタグラム）を作成した。この第一の二次元分布図に基づいて、全白血球領域を特定した。特定した全白血球領域に出現する細胞数を、試料に含まれる全白血球数として計数した。得られたスキャッタグラムを図２（１）に示す。特定した全白血球領域に出現した細胞を対象として、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第二の二次元分布図（スキャッタグラム）と側方散乱光強度及び前方散乱光強度を二軸とする第三の二次元分布図（スキャッタグラム）を作成した。第二の二次元分布図上で骨髄芽球領域１を設定し、第三の二次元分布図上で骨髄芽球領域２を設定した。得られたスキャッタグラムを図２（２）及び図２（３）に示す。そして設定した骨髄芽球領域１及び骨髄芽球領域２に出現する細胞数を試料に含まれる骨髄芽球数として計数した。得られたスキャッタグラムを図２（４）に示す。

図２（１）、（２）、（３）、（４）から明らかなように、健常な人からの血液試料には骨髄芽球は含まれないので、スキャッタグラムの骨髄芽球が出現する可能性がある領域にはシグナルが存在せず、また、溶血した赤血球によるシグナルも出現しない。さらに好塩基球も他の成熟白血球と同様に染色されるので、骨髄芽球領域には出現しない。
全白血球数に対する骨髄芽球の比率（骨髄芽球比率＝骨髄芽球／全白血球数×１００）を算出したところ、０％であった。なお、目視により確認した骨髄芽球比率も０％であった。

（実施例２）
以下の組成の第１試薬を調製した。
＜第１試薬＞
ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（日光ケミカルズ）１５００ｐｐｍ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（市販品） ２２５ｐｐｍ
ＭＯＰＳ（市販品） １０ｍＭ
精製水 １Ｌ
上記の各成分を混合し、さらにＮａＯＨを添加してｐＨを７．２５に調整した。第１試薬の浸透圧は２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．７８ｍＳ／ｃｍであった。

実施例１で用いた第１試薬に代えて上記の第１試薬を用いた以外は、実施例１と同様にして、健常な人からの血液試料について分析を行った。
得られたスキャッタグラムを、図３（１）、（２）、（３）、（４）に示す。

図３（１）、（２）、（３）、（４）から明らかなように、健常な人からの血液試料には骨髄芽球は含まれないので、スキャッタグラムの骨髄芽球が出現する可能性がある領域にはシグナルが存在せず、また、溶血した赤血球によるシグナルも出現しない。さらに好塩基球も他の成熟白血球と同様に染色されるため、骨髄芽球領域には出現しない。
全白血球数に対する骨髄芽球の比率（骨髄芽球比率＝骨髄芽球／全白血球数×１００）は、０％であった。なお、目視により確認した骨髄芽球比率も０％であった。

（実施例３）
健常な人から採取した血液試料の代わりに、急性骨髄性白血病の患者から採取した骨髄芽球を含む血液試料を用いた以外は実施例１と同様にして分析を行ない、側方散乱光強度、前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した。
得られたスキャッタグラムを、図４（１）、（２）、（３）、（４）に示す。

図４（１）、（２）、（３）、（４）のスキャッタグラムに基づいて、全白血球数に対する骨髄芽球の比率を求めたところ、１．２％であった。なお、同じ血液試料の骨髄芽球比率を目視により計数したところ、４．０％であった。

（実施例４〜９）
以下の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。

第１試薬９８０μＬ、第２試薬２０μＬ、及び以下のいずれかの血液試料２０μＬを混合し、３５℃で１３秒間（実施例４及び１１は１７．５秒間）反応させて、測定用試料を得、実施例１〜３と同様にしてスキャッタグラムを作製した。
血液試料としては、骨髄芽球を含む白血病患者の血液（以下、「骨髄芽球サンプル」ともいう）、又は骨髄芽球を含まない多発性骨髄腫患者の血液（赤血球が溶血不良を起している）（以下、「溶血不良サンプル」ともいう）を用いた。

得られたスキャッタグラムを図５〜１１に示す。図５〜１１の各図において、（Ａ）は骨髄芽球サンプルを血液試料として用いた場合のスキャッタグラムを表し、（Ｂ）は溶血不良サンプルを血液試料として用いた場合のスキャッタグラムを表す。通常、骨髄芽球は、スキャッタグラムの「BL」領域で検出される。
図５〜１１のスキャッタグラムの横軸は側方散乱光強度、縦軸は蛍光強度を表す。また、「Ly」はリンパ球が出現する区画を、「Mo」は単球が出現する区画を、「Gran」は顆粒球が出現する区画を、「IG」は幼若顆粒球が出現する区画を表す。
これらのスキャッタグラムに基づいて、全白血球数に対する骨髄芽球の比率を算出し、「BL領域」として、図６〜１１中に示す。

図５〜１１の結果から、本発明の分析用試薬を用いて測定を実施すると、骨髄芽球サンプルで骨髄芽球が検出され、溶血不良サンプルでは、骨髄芽球比率が極めて低い値であることがわかる。また、溶血不良サンプルの測定において、従来の試薬を用いた場合に検出される赤血球ゴーストが、ほぼ検出されなかった。したがって、本発明の試薬を用いれば、溶血不良サンプルの場合でも骨髄芽球が誤って検出されることがないため、正確な測定結果を得ることができる。また、赤血球ゴーストが検出された場合でも、骨髄芽球領域と赤血球ゴースト領域が、スキャッタグラム上で重複しなかった（図示せず）。すなわち、本発明の分析用試薬を用いると、多発性骨髄腫のような疾患の患者からの血液であっても、スキャッタグラム上で赤血球ゴーストが骨髄芽球の領域に出現しないので、骨髄芽球を赤血球ゴーストから明確に区別して、幼若白血球を正確に測定できることがわかる。

本出願は、２００７年６月２５日に出願された日本国特許出願特願２００７−１６６６０９号及び２００８年３月２７日に出願された日本国特許出願特願２００８−８４１３７号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。

Claims (13)

1. 赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、
   損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、
   核酸染色色素と
   を含み、
   浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である幼若白血球の分析用試薬。
2. 前記界面活性剤の分析用試薬中の濃度が、５００〜１５０００ｐｐｍである請求項１に記載の分析用試薬。
3. 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である請求項１に記載の分析用試薬。
4. 前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が、以下の式（Ｉ）：
   Ｒ¹−Ｒ²−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n−Ｈ （Ｉ）
   （式中、Ｒ¹は炭素数９〜２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｒ²は−Ｏ−、−ＣＯＯ−又は
   であり、ｎは１０〜４０の整数である）
   で示されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である請求項３に記載の分析用試薬。
5. 前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンオレイルエーテルである請求項３に記載の分析用試薬。
6. 前記ポリオキシエチレンオレイルエーテルが、ｎが１５〜２０の式（Ｉ）を有するポリオキシエチレンオレイルエーテルである請求項５に記載の分析用試薬。
7. 前記可溶化剤が、サルコシン誘導体、コール酸誘導体、及びメチルグルカンアミドからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の分析用試薬。
8. 前記可溶化剤の分析用試薬中の濃度が、可溶化剤がサルコシン誘導体である場合に１００〜４００ｐｐｍであり、コール酸誘導体である場合に５０〜１３００ｐｐｍであり、メチルグルカンアミドである場合に５００〜１１００ｐｐｍである請求項１に記載の分析用試薬。
9. 前記核酸染色色素が、
   （１）以下の式（ＩＩ）：
   （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、低級アルキル基であり；ｎは１又は２であり；Ｘ^-はアニオンであり；Ｚは硫黄原子、酸素原子、又は低級アルキル基で置換された炭素原子である）
   で示される色素；
   （２）以下の式（ＩＩＩ）
   （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、低級アルキル基であり；ｎは１又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）
   で示される色素；
   （３）以下の式（ＩＶ）
   （式中、Ｒ₁は水素原子又は低級アルキル基であり；Ｒ₂及びＲ₃は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基であり；Ｒ₄は水素原子、アシル基又は低級アルキル基であり；Ｒ₅は水素原子又は置換されていてもよい低級アルキル基であり；Ｚは硫黄原子、酸素原子、又は低級アルキル基で置換された炭素原子であり；ｎは１又は２であり；Ｘ^-はアニオンである）
   で示される色素；
   （４）以下の式（Ｖ）
   （式中、Ｘ₁及びＸ₂は、独立してＣｌ又はＩである）
   で示される色素；
   （５）以下の式（ＶＩ）
   で示される色素；
   （６）以下の式（ＶＩＩ）
   で示される色素；
   （７）以下の式（ＶＩＩＩ）
   で示される色素；
   （８）以下の式（ＩＸ）
   で示される色素；
   （９）以下の式（Ｘ）
   で示される色素；
   （１０）プロピジウムアイオダイド、又はエチジウムブロマイド；
   （１１）エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス［［３‐［［４‐［［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］メチレン］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐１‐イル］プロピル］ジメチルアミニウム］・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−１）、４‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐２（３Ｈ）‐イリデン）メチル］‐１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］キノリニウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐テトラメチル‐Ｎ，Ｎ’‐ビス［３‐［４‐［３‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］‐２‐プロペニリデン］‐１，４‐ジヒドロキノリン‐１‐イル］プロピル］‐１，３‐プロパンジアミニウム・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−３）、又は２‐［３‐［［１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐４‐イリデン］‐１‐プロペニル］‐３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−３）
   からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の分析用試薬。
10. ｐＨが５．０〜９．０である請求項１に記載の分析用試薬。
11. 赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤とを含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である第１試薬、及び
    核酸染色色素を含む第２試薬
    を含む幼若白血球の分析用試薬キット。
12. 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である請求項１１に記載の分析用試薬キット。
13. 赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、核酸染色色素とを含み、浸透圧が１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満である幼若白血球の分析用試薬と、幼若白血球を含み得る生体試料とを混合し、成熟白血球の核酸を染色する工程、および
    前記工程で処理した幼若白血球の少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、その強度差によって幼若白血球を分類する方法。