JP6903494B2 - 感染症を識別するための粒子分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、感染症を識別するための粒子分析方法、感染症を識別するための粒子分析装置及び感染症を識別するための粒子分析用コンピュータプログラムに関する。
細菌感染に対しては好中球が反応し、ウイルス感染に対してはリンパ球が反応することが知られている。これらの病原体に対する細胞の反応性の違いは、高い発熱を伴う患者において、細菌感染症であるのか、ウイルス感染症であるのかを識別するために利用されている。
例えば、非特許文献１には、活性化リンパ球（AS-LYMP (antibody-synthesizing lymphocytes)及びRE-LYMP (total reactive lymphocytes)）のカウントは、細菌感染よりもウイルス感染で顕著に増加することが記載されている。また、非特許文献１には、活性化状態の好中球（NEUT-RI及びNEUT-GI）が細菌感染の検出に使用可能であることが記載されている。
さらに、特許文献１には、細菌感染などで活性化状態の好中球を、フローサイトメトリを用いて検出する技術が記載されている。
特開２０１３−０９２４３３号公報
White Paper: Novel haematological parameters for rapidly monitoring the immune system response, Sysmex Europe GmbH Release: 13.03.2017
被検者が細菌感染症に罹患しているか、ウイルス感染症に罹患しているかを識別することは、治療方針を決定する上で重要である。しかし、細菌感染症であるか、ウイルス感染症であるかを厳密に識別するためには、細菌感染症であれば一定期間の細菌の培養期間が必要である。また、ウイルス感染症の確定診断には、PCR法等の白血球計数以外の追加の検査が必要であり、診断までに時間と費用を要する。
近年では、抗生物質の多用による多剤耐性細菌の出現が医療機関で問題となっており、多剤耐性細菌の出現をできる限り抑制するため抗生物質の使用は最小限にすべきである。また、抗生物質はウイルスには効かないため、ウイルス感染症患者に抗生物質を投与することは治療とはならない。
発熱を有する患者において、細菌感染症であるのかウイルス感染症であるのかを、適切なタイミングで、特に患者が発熱後初めて医療機関を受診した際に、迅速に、簡便に診断することは、感染症の初期に治療方針を決定できるという大きなメリットを有する。特に、発熱症状を訴える患者に対して、ルーティンとして最初に行われる検査は、白血球数の計数、白血球４分類又は白血球５分類検査であるため、この検査において、被検者が細菌感染症に罹患しているか、ウイルス感染症に罹患しているかを識別できることは、患者自身の身体的及び経済的負担を軽減でき、さらには多剤耐性細菌の出現を最小限にするという公衆の利益をもたらす。
細菌感染症であるのかウイルス感染症であるのかを、迅速に、簡便に診断するため、本発明は、医療機関で通常行われている白血球４分類又は白血球５分類検査において、被検者から採取された被検血液検体が、細菌感染症患者から採取されたものであるか、ウイルス感染症患者から採取されたものであるかを識別することを課題とする。
本発明の課題を解決するための手段である第１の実施形態は、被検者から採取された、粒子を含む被検血液検体と、核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された測定試料に光を照射することによって、前記測定試料に含まれる各粒子から散乱光及び蛍光を取得する工程Ａと、前記散乱光及び蛍光に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定し、特定された粒子についての粒子数情報を取得する工程Ｂと、前記粒子数情報に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する工程Ｃと、を含む、感染症を識別するための粒子分析方法である。
本発明の課題を解決するための手段である第２の実施形態は、被検者から採取された、粒子を含む被検血液検体と、核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された測定試料に、光を照射する光源２０１と、前記照射により生じた前記測定試料に含まれる各粒子からの散乱光及び蛍光を受光する検出部１３と、前記散乱光及び蛍光に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定し、特定された粒子についての粒子数情報を取得し、前記粒子数情報に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する処理部２１と、を備える、感染症を識別するための粒子分析装置５０である。
本発明の課題を解決するための手段である第３の実施形態は、被検者から採取された、粒子を含む被検血液検体と、核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された測定試料に光を照射することによって、前記測定試料に含まれる各粒子から散乱光及び蛍光を取得するステップと、前記散乱光及び蛍光に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定し、特定された粒子についての粒子数情報を取得するステップと、及び前記粒子数情報に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定するステップとを、コンピュータに実行させる、感染症を識別するための粒子分析用コンピュータプログラムである。
本発明の第１から第３の実施形態によれば、通常医療機関で用いられている自動白血球４分類又は自動白血球５分類装置を使用して、細菌感染症患者から採取された検体であるか、ウイルス感染症患者から採取された検体であるかを簡便に識別することができる。
細菌感染症患者から採取された検体であるか、ウイルス感染症患者から採取された検体であるかを簡便に識別することができる。
図１は、本発明の概要、及び第２集団の決定方法の一例を示す図である。 図２は、第２集団の決定方法の別の例を示す図である。 図３は、データ処理ユニットの構成を示す図である。 図４は、測定ユニットの構成を示す図である。 図５は、有核細胞検出部の構成を示す図である。 図６は、試料調製部の構成を示す図である。 図７は、データ処理ユニットの動作の一部を示す図である。 図８は、図７から続くデータ処理ユニットの動作の一部を示す図である。 図９は、01から05までの各感染症群のLS_LEUT_P値の分布を示す図である。 図１０は、01から05までの各感染症群のLEUT_P値の分布を示す図である。
［１．感染症を識別するための粒子分析方法］
［１−1．概要］
本発明の第１の実施形態は、被検者から採取された血液検体（被検血液検体）について、細菌感染症患者から採取された検体であるか、ウイルス感染症患者から採取された検体であるかを決定する、感染症を識別するための粒子分析方法に関する。
第１の実施形態の概要を図１に示す。
具体的には、第１の実施形態は、以下の少なくとも工程Ａ（ステップＳ１）、工程Ｂ（ステップＳ２）及び工程Ｃ（ステップＳ３）を含む。
第１の実施形態の工程Ａ（ステップＳ１）は、被検血液検体と、少なくとも核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された、粒子を含む測定試料に光を照射することによって得られる、散乱光及び蛍光を取得する。
第１の実施形態の工程Ｂ（ステップＳ２）は、前記工程Ａ（ステップＳ１）で取得された散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定する。そして、前記特定された粒子についての粒子数情報を取得する。前記特定された粒子についての粒子数情報は、後述する第２集団の粒子情報に相当する。
第１の実施形態の工程Ｃ（ステップＳ３）は、前記粒子数情報に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する。
第1の実施形態において、細菌は、ヒトに病原性を示す細菌である限り制限されない。好ましくは、細菌からは、編性細胞内寄生性細菌（マイコプラズマ、クラミジア、リケッチア等）、及び抗酸菌群は除かれる。
第１の実施形態において、ウイルスは、ヒトに病原性を示すウイルスである限り制限されない。
［１−２．測定試料の調製］
第1の実施形態において、被検者は、特に制限されないが、発熱等の炎症症状を有する者を挙げることができる。
血液検体は、白血球数の計数及び白血球の分類ができる状態である限り、制限されない。前記血液は、好ましくは末梢血である。例えば、血液は、エチレンジアミン四酢酸塩（ナトリウム塩又はカリウム塩）、ヘパリンナトリウム等の抗凝固剤を使用して採血された末梢血を挙げることができる。末梢血は、動脈から採取されても静脈から採取されてもよい。
第1の実施形態において、粒子は血液検体に由来するものである限り制限されない。粒子として好ましくは細胞であり、より好ましくは有核細胞であり、さらに好ましくは芽球、後骨髄球以前の骨髄球及び巨核球以外の有核細胞である。
測定試料の調製は、血液検体に含まれる粒子が有する核酸を蛍光色素で染色し、血液検体中に含まれる赤血球を溶血剤を用いて溶血できる状態に調製するもので限り制限されない。
核酸を染色する蛍光色素（以下、単に「蛍光色素」と称する場合がある）は、例えば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス［［３‐［［４‐［［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］メチレン］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐１‐イル］プロピル］ジメチルアミニウム］・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−１）、４‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐２（３Ｈ）‐イリデン）メチル］‐１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］キノリニウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'‐テトラメチル‐Ｎ，Ｎ'‐ビス［３‐［４‐［３‐［（３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム）‐２‐イル］‐２‐プロペニリデン］‐１，４‐ジヒドロキノリン‐１‐イル］プロピル］‐１，３‐プロパンジアミニウム・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−３）、又は２‐［３‐［［１‐［３‐（トリメチルアミニオ）プロピル］‐１，４‐ジヒドロキノリン］‐４‐イリデン］‐１‐プロペニル］‐３‐メチルベンゾチアゾール‐３‐イウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−３）、及び以下の一般式（Ｉ）で示される蛍光色素が挙げられる。この中でも、下記一般式（Ｉ）で表される蛍光色素が好ましい。
Figure 0006903494
（式中、Ｒ１及びＲ４は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシ基を有するアルキル基、エーテル基を有するアルキル基、エステル基を有するアルキル基、又は置換基を有しても良いベンジル基であり、；Ｒ２及びＲ３は、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアルコキシ基であり；Ｚは硫黄原子、酸素原子、又はメチル基を有する炭素原子であり；ｎは０，１，２又は３であり；Ｘ−はアニオンである。）
ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ４のいずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基の場合、他方は水素原子又は炭素数６未満のアルキル基であることが好ましい。炭素数が６〜１８のアルキル基としては、炭素数６、８又は１０のアルキル基が好ましい。Ｒ１及びＲ４のベンジル基の置換基としては、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルケニル基、又は炭素数２〜２０のアルキニル基が挙げられ、特にメチル基又はエチル基が好ましい。Ｒ２及びＲ３のアルケニル基としては、炭素数２〜２０のアルケニル基が挙げられる。Ｒ２及びＲ３のアルコキシ基としては、炭素数１〜２０のアルコキシ基が挙げられ、特にメトキシ基又はエトキシ基が好ましい。Ｘ−におけるアニオンとしては、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−のようなハロゲンイオン、ＣＦ３ＳＯ３ −、ＢＦ４ −などが挙げられる。
核酸を染色するための蛍光色素は溶液であってもよい。蛍光色素を溶解するための溶媒は特に限定されないが、例えば、水、有機溶媒及びこれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、例えばアルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。なお、蛍光色素は、保存安定性の観点から有機溶媒に溶解させることが好ましい。
核酸を染色できる蛍光色素は緩衝液等を含む染色試薬の形態で血液検体と混合されることが好ましい。前記血液検体と混合される蛍光色素の終濃度は、蛍光色素の種類により適宜設定することができる。例えば、一般式（Ｉ）で示される蛍光色素の終濃度としては、通常０．０１〜１００μｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１０μｇ／Ｌである。濃度としては、０．２〜０．６ｐｇ／μＬが好ましく、特に０．３〜０．５ｐｇ／μＬが好ましい。蛍光色素は、核酸を染色できる蛍光色素を２種類以上使用してもよい。
また、前記染色試薬としては、市販の白血球分類用の染色試薬を用いることもできる。市販の白血球分類用の染色試薬としては、例えば、シスメックス株式会社製のストマトライザー４ＤＳが挙げられる。ストマトライザー４ＤＳは、上述の一般式（Ｉ）で示される蛍光色素を含む染色試薬である。
溶血剤は、赤血球を溶血するだけでなく、末梢血中の白血球を少なくとも４つのサブクラスに分類することができるものであることが好ましい。
この溶血剤を使用することで、赤血球を溶血させ、有核細胞の細胞膜に損傷を与えることができ、細胞内の核酸が前記蛍光色素により染色されやすくなる。
溶血剤には、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両極性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤が含まれる。溶血剤に含まれる界面活性剤は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。２種類以上の界面活性剤が含まれる場合、その組合せは、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤との組合せであってもよいし、カチオン性界面活性剤どうしの組合せであってもよいし、アニオン性界面活性剤どうしの組合せであってもよい。好ましくは、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤との組合せである。
ここで、カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。より具体的には、一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。
Figure 0006903494
Figure 0006903494
（式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｒ１は炭素数６〜１８のアルキル基又はアルケニル基、Ｒ２及びＲ３は炭素数１〜４のアルキル基又はアルケニル基、Ｒ４は炭素数１〜４のアルキル及びアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原子である。）
Ｒ１としては、炭素数が６、８、１０、１２及び１４のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ１としてはオクチル基、デシル基、及びドデシル基が挙げられる。また、Ｒ２及びＲ３としては、特にメチル基、エチル基、及びプロピル基が好ましい。また、Ｒ４としては、メチル基、エチル基、及びプロピル基が好ましい。
ノニオン性界面活性剤としては、ジエチレングリコール、サポニン、又は以下の一般式（ＩＶ）で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤等が好ましい。
Figure 0006903494
 （式中、Ｒ１は炭素数８〜２５のアルキル、アルケニル又はアルキニル基；Ｒ２はＯ、
Figure 0006903494
 、
又はＣＯＯ；ｎは１０〜５０の整数を表す。）で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤を用いるのが、好ましい。
上記の一般式（ＩＶ）で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルなどが挙げられる。
アニオン性界面活性剤としては、Ｎ−ラウロイルサルコシン塩、グリコール酸塩、デオキシコール酸塩等を挙げることができる。
第１の実施形態において、界面活性剤は溶液の形態にあってもよい。界面活性剤を溶解するための溶媒は特に限定されないが、例えば水、有機溶媒及びそれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、例えばアルコール、エチレングリコール、ＤＭＳＯなどが挙げられる。
界面活性剤の溶液を用いる場合、その濃度は界面活性剤の種類に応じて適宜設定できるが、カチオン性界面活性剤の場合は通常１０〜１０，０００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１０００ｐｐｍであり、ノニオン性界面活性剤の場合は通常１０〜１０，００００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１０，０００ｐｐｍ、より好ましくは１，０００〜５，０００ｐｐｍである。
溶血剤は、上述の界面活性剤以外の成分と組み合わせて溶血試薬として使用することができる。溶血試薬に含むことができる界面活性剤以外の成分としては、例えば、メタノール、エタノール、フェノキシエタノール等のアルコールコール類、ホルムアルデヒド等の固定液、キレート剤、有機酸、緩衝剤等を挙げることができる。
ここで、有機酸としては、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩が好ましい。より具体的には、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びそれらのその塩等が挙げられる。
また、緩衝剤としては、例えば、炭酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ及びリン酸塩等を挙げることができる。なお、緩衝剤としては、溶血試薬のｐＨを、４．５〜１１．０、好ましくは５．０〜９．０の範囲に保つ緩衝剤が赤血球の溶血効率を上げるため好ましい。溶血試薬のｐＨは、クエン酸、炭酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、塩酸などのｐＨ調節剤を添加して調整することができる。
溶血試薬の浸透圧は特に限定されないが、赤血球を効率よく溶血させる観点から、浸透圧は２０〜１５０ ｍＯｓｍ／ｋｇであることが好ましい。また、溶血試薬の浸透圧は、糖、アミノ酸、有機溶媒、塩化ナトリウムなどの浸透圧調節剤を添加して調製することができる。糖としては、例えばグルコース、キシリトール、マンニトール、アラビノース、リビトールなどが挙げられる。アミノ酸としては、アラニン、プロリン、グリシン、バリンなどが挙げられる。有機溶媒としては、エチレングリコール、グリセリンなどが挙げられる。
キレート剤としては、エチレンジアミン四塩酸塩等を挙げることができる。
具体的な、溶血試薬の例としては、塩化アンモニウム溶血剤（ｐＨ７．３、塩化アンモニウム１．６８Ｍ、炭酸水素カリウム１００ｍＭ、ＥＤＴＡ ２Ｋ ０．８２ｍＭ）、細胞固定溶血剤（ｐＨ７．ホルムアルデヒド３、１０％、メタノール３．５％、ジエチレングリコール３０％、クエン酸１００ｍＭ）、細胞膜透過性溶血剤（ｐＨ７．３、フェノキシエタノール１％以下、サポニン１％以下、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム塩１％以下、アジ化ナトリウム１％以下）を挙げることができる。
前記溶血剤、又は溶血試薬を使用することで、有核細胞は、蛍光色素により染色されやすくなり、さらに白血球は、リンパ球、単球、好酸球、好酸球以外の顆粒球の間で大きさ等に差異が生じるようになる。このため、粒子由来の散乱光強度と蛍光強度に基づいて、白血球を少なくとも４つのサブクラスに分類すると共に、状態の異なる好中球を検出することが可能となる。
また、溶血試薬は、市販の白血球分類用の溶血試薬を用いることもできる。市販の白血球分類用の溶血試薬としては、例えば、シスメックス株式会社製のストマトライザー４ＤＬが挙げられる。ストマトライザー４ＤＬは、上述のカチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤と有機酸とを含み、上述のｐＨ範囲内の溶血試薬である。
血液検体と、蛍光色素と、溶血剤とを混合する順序は特に限定されない。例えば、蛍光色素と溶血剤とを先に混合し、この混合液と血液検体とを混合してもよい。また、溶血剤と血液検体とを先に混合し、この混合液と蛍光色素とを混合してもよい。本発明の第１の実施形態においては、いずれの順序で混合しても同等の結果を得ることができる。
血液検体と染色試薬と溶血試薬との混合は、被検血液検体：染色試薬及び溶血試薬の混合物の体積比が１：５〜１：１０００、好ましくは１：１０〜１：１００となるように行うことが好ましい。この場合、該混合物における染色試薬と溶血試薬との比は、１：１〜１：１０００、好ましくは１：１０〜１：１００が好ましい。このような比で血液検体と染色試薬と溶血試薬とを混合することにより、赤血球の溶血が速やかに進行し、白血球の核酸を染色することができる。なお、血液検体の量は５〜５００μＬ程度で測定に十分である。
第１の実施形態においては、血液検体と染色試薬と溶血試薬とを混合した後に、１５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃の温度で５〜１２０秒間、好ましくは５〜３０秒間インキュベーションすることが好ましい。
［１−３．散乱光及び蛍光の取得］
本発明において、散乱光及び蛍光の取得方法は、制限されない。例えば、後述する第２の実施形態に記載する粒子測定装置を用いて、散乱光及び蛍光を取得することができる。具体的には、第２の実施形態に係る粒子分析装置の少なくとも一部を構成するデータ処理ユニット２０が、測定ユニット１０が受光した散乱光及び蛍光の情報（波長、強さ等）から、散乱光の情報及び蛍光の情報を取得する。散乱光の情報及び蛍光の情報は、光のパルス幅、前記パルス幅の積分値又は微分値、光の強度等のいずれであってもよい。以下、光の強度を例として第１の実施形態を説明するが、本実施形態は光の強度に限定して解釈されるものではない。散乱光強度及び蛍光強度は、測定ユニット１０が、受光した各散乱光及び蛍光から算出し、データ処理ユニット２０に前記散乱光強度及び蛍光強度を送信し、データ処理ユニット２０が前記散乱光強度及び蛍光強度を受信することで取得してもよい。あるいは、測定ユニット１０が、受光した散乱光及び蛍光の情報をデータ処理ユニット２０に送信し、データ処理ユニット２０は受信した各光の情報に基づいて散乱光強度及び蛍光強度を算出することで取得してもよい。
第１の実施形態において、散乱光は好ましくは側方散乱光であり、蛍光は側方蛍光である。データ処理ユニット２０及び測定ユニット１０の構成及び動作は、後述する２．及び３．で説明する。
［１−４．粒子の分類及び粒子数情報の取得］
第１の実施形態では、初めに取得した散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、上記の血液検体中の有核細胞を分類する。
具体的には、測定された粒子が正常な白血球である場合、前記粒子は、散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、リンパ球集団、単球集団、好酸球集団、及び好酸球以外の顆粒球集団の４種類の集団（クラスター）に分類される。ここで、好酸球以外の顆粒球とは、好中球及び好塩基球を表す。好中球及び好塩基球の集団に含まれる好塩基球はごく僅かであるので、好中球及び好塩基球の集団は、好中球の集団とみなすことができる。
なお、第１の実施形態においては、正常な白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の５種類の集団に分類されてもよい。
第１の実施形態の一例においては、白血球の分類は、散乱光強度を横軸とし、蛍光強度を縦軸とする二軸のスキャッタグラムを作成し、得られたスキャッタグラムに基づいて行われることが好ましい。当該方法においては、リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の各集団が出現するスキャッタグラム上の領域は、感染症に罹患していない対照者の正常な白血球について蓄積されたデータから予め決定されている。したがって、例えば、横軸に側方散乱光強度を、縦軸に蛍光強度をとったスキャッタグラムを作成することにより、正常な白血球である粒子は、図１に示すようにリンパ球、単球、好中球、好酸球の集団の４集団に分類される。さらに、公知の解析ソフトを用いることにより、スキャッタグラム上で各集団を囲むウィンドウを設けて、その中の粒子数を計数し、各集団の粒子数情報（単位容積あたりの粒子数（濃度）、各粒子の散乱光強度及び蛍光強度等）を取得することができる。
第１の実施形態の別の例として、スキャッタグラムを作成せずに、予めリンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球の各集団の散乱光強度の範囲と蛍光強度の範囲とを設定しておき、被検血液検体中の各粒子の散乱光強度と蛍光強度を前記設定と比較して、各集団を分類してもよい。前記分類は、公知の解析ソフトを使用して行うことができる。
ここで、全好中球集団には様々な状態の好中球が含まれる。例えば全好中球集団には、感染症に罹患していない対照者（好ましくは炎症症状を有していない対照者）の好中球、及び感染症に罹患している患者の好中球等が含まれる。感染症に罹患していない対照者の好中球における散乱光強度の範囲及び蛍光強度の範囲は、予め１又は複数の対照者の血液検体を測定し、設定しておくことができる。また、感染症に罹患している患者の好中球における散乱光強度の範囲及び蛍光強度の範囲も、予め感染症に罹患している１又は複数の患者の血液検体を測定し、設定しておくことができる。さらに、全好中球の散乱光強度の範囲及び蛍光強度の範囲も対照者、感染症に罹患している被検者、他の疾患に罹患している被検者等から採取された様々な血液検体を測定し、設定しておくことができる。
第１の実施形態において、前記感染症に罹患していない対照者の好中球における散乱光強度の範囲及び蛍光強度の範囲に含まれる粒子集団を対照好中球集団と呼ぶ。また、被検血液検体の測定試料に含まれる粒子であって、前記対照好中球集団に相当すると判断される、粒子の集団を好中球集団の第１集団ともいう。
前記対照者は、血液中に含まれる白血球中の桿状核好中球の割合が、桿状核好中球の基準値未満の者であることが好ましい。桿状核好中球の基準値は、末梢血で、１０％である。
次に、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定する。続いて、前記特定された粒子についての粒子数情報を取得する。本明細書において、前記特定された粒子の集団を第２集団ともいう。すなわち、特定された粒子の粒子数情報は、以下に述べる第２集団の粒子数情報でもある。第２集団の粒子数情報は、以下のいずれかの方法により取得することができる。
例えば、第２集団の粒子数情報を取得するための方法の一例は、全好中球集団に含まれ、かつ前記第１集団に含まれない粒子集団の粒子数情報を、第２集団の粒子数情報として取得する方法である。より具体的には、全好中球集団に含まれる粒子数から第１集団に含まれる粒子数を減じた値が、第２集団に含まれる粒子数となる。この場合、上記工程Ａと工程Ｂとの間に、工程Ａで取得された散乱光及び蛍光から、被検血液検体についての全好中球集団の粒子数情報と、前記第１集団の粒子数情報を取得する工程Ａ−１を含むことができる。
また、別の第２集団の粒子数情報を取得方法するための例は、例えば、幼若顆粒球（後骨髄球以前の顆粒球形細胞）の集団である幼若顆粒球集団と上記第１集団の出現位置に基づいて第２集団を決定する方法である。具体的には、粒子から発せられる蛍光を取得した際に、幼若顆粒球集団の出現位置よりも蛍光強度の低い位置に出現し、第１集団よりも蛍光強度の高い位置に出現する粒子を選択する。さらに、前記粒子について、第１集団と実質的に同じ散乱光強度の範囲に出現する粒子を選択することで第２集団を決定することができる。続いて、前記決定された第２集団について粒子数情報を取得する。
より好ましくは、図２において斜線で示す範囲である。すなわち、蛍光強度が、予め決定されている幼若顆粒球集団の蛍光強度の下限値と第１集団の蛍光強度の上限値との間であり、かつ散乱光強度が、第１集団の散乱光強度の範囲に存在する粒子集団の粒子数情報を、第２集団の粒子数情報として取得する方法である。幼若顆粒球集団は、予め芽球、前骨髄球、骨髄球、骨髄球を含む末梢血や、骨髄液を測定することにより、これらの細胞が含まれる散乱光強度の範囲及び蛍光強度の範囲を設定しておくことにより、決定することができる。
［１−５．感染症の識別］
次に、上記１−４で取得された粒子数情報に基づいて、被検血液検体が、細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する。
判定方法は、以下のいずれかの方法により行うことができる。
判定方法の一例は、白血球集団の粒子数情報に含まれる粒子数と、第２集団の粒子数情報に含まれる粒子数との割合に基づいて判定する方法である。好ましくは、白血球集団の粒子数に対する第２集団の粒子数の割合、すなわち第２集団の粒子数の値を白血球数の値で除した値（「第２集団の粒子数」／「白血球数」）に基づいて判定する。
白血球数は常法によって算出することができる。例えば散乱光強度が所定の範囲に入る粒子数を計数することにより白血球の粒子数情報を取得することができる。白血球の粒子数情報の取得は、工程Ｃの前に、行うことができる。
前記割合は、別途設定された閾値と比較される。閾値は、細菌感染症患者から採取された検体であるか否かを判定するための第１閾値と、細菌感染症患者及びウイルス感染症患者から採取された検体でないことを判定するための第２閾値を含む。ここで、第２閾値は第１閾値よりも低い値である。より具体的には、前記割合を第１閾値と比較し、前記割合が第１閾値よりも高い場合には、被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体であると判定することができる。また、前記割合が、第１閾値以下であり、かつ第２閾値よりも高い場合には、被検血液検体がウイルス感染症患者から採取された検体であると判定することができる。さらに、前記割合が第２閾値以下である場合には、被検血液検体が、細菌感染症患者及びウイルス感染症患者から採取された検体ではないと判定することができる。
第１閾値と第２閾値は、統計学的手法により、予め設定することができる。例えば、予め細菌感染症患者から採取した血液検体群（細菌感染症群）と、ウイルス感染症患者から採取した血液検体群（ウイルス感染症群）と、感染症に罹患していない対照者（好ましくは炎症症状を有していない対照者）から採取した血液検体群（対照群）について、それぞれの血液検体について前記割合を算出する。得られた各群の割合の値に基づいて、細菌感染症群とウイルス感染症群を識別できる第１閾値、及びウイルス感染症群と対照群を識別できる第２閾値を算出する。閾値の算出方法は、特に制限されない。例えば、閾値の算出方法は、ＲＯＣ曲線（Receiver Operatorating Characteristic curve、受信者動作特性曲線）等を用いた方法を挙げることができる。また、別の例では、感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率などの観点からウイルス感染症患者群と、細菌感染症患者群と、対照群とを最も精度良く分類できる閾値を設定することができる。例えば、別の閾値の設定方法としては、判別分析法、モード法、Ｋｉｔｔｌｅｒ法、３σ法、ｐ‐ｔｉｌｅ法等を挙げることができる。
判定方法の別の例は、前記白血球数に代えて、全好中球集団の粒子数情報を用い、全好中球集団の粒子数情報に含まれる粒子数と、第２集団の粒子数情報に含まれる粒子数との割合に基づいて判定する方法である。好ましくは、第２集団の粒子数の値を全好中球集団の粒子数で除した値（「第２集団の粒子数」／「全好中球集団の粒子数」）に基づく判定方法である。この場合、被検血液検体が、ウイルス感染症患者から採取された検体であれば、「第２集団の粒子数」／「全好中球集団の粒子数」の値は下がる。また、被検血液検体が、細菌感染症患者から採取された検体であれば、「第２集団の粒子数」／「全好中球集団の粒子数」は１に近づくので、より明確に被検血液検体が、細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを識別できる。
判定方法の別の例は、前記白血球数に代えて、リンパ球集団の粒子数情報を用い、リンパ球集団の粒子数情報に含まれる粒子数と、第２集団の粒子数情報に含まれる粒子数との割合に基づいて判定する方法である。好ましくは、第２集団の粒子数の値をリンパ球集団の粒子数で除した値（「第２集団の粒子数」／「リンパ球集団の粒子数」）に基づく判定方法である。
リンパ球集団の粒子数情報は、例えば、工程Ａと、前記工程Ｃとの間に、工程Ａにおいて取得された散乱光強度及び蛍光強度に基づいて取得することができる。
また、この他にも、白血球数に代えて、単球集団の粒子数情報に含まれる粒子数又は好酸球集団の粒子数情報に含まれる粒子数を用いてもよい。
［２．感染症を識別するための粒子分析装置］
本発明の第２の実施形態は、少なくともデータ処理ユニット２０を備える粒子分析装置５０に関する。また、第２の実施形態において、粒子分析装置５０は、データ処理ユニット２０の他、測定ユニット１０を備えていてもよい。さらに、第２の実施形態は、データ処理ユニット２０と測定ユニット１０がネットワーク等で通信可能に接続される粒子分析システムを包含しうる。第２の実施形態において、上記１．で既に説明されている用語については、説明を省略するが、上記１．における各用語についての説明は、第２の実施形態にも援用される。
［２−１．データ処理ユニットの構成］
図３に、データ処理ユニット２０のハードウェアの構成を示す。データ処理ユニット２０は、入力部３０と、出力部３１と、記憶媒体３２と接続されていてもよい。
データ処理ユニット２０において、ＣＰＵ２１と、主記憶部２２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）２３と、補助記憶部２４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）２５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）２８は、バス２９によって互いにデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ２１は、データ処理ユニット２０の処理部である。ＣＰＵ２１が、補助記憶部２４又はＲＯＭ２３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、データ処理ユニット２０が機能する。
ＲＯＭ２３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、ＣＰＵ２１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。ＣＰＵ２１はＭＰＵ２１としてもよい。ＲＯＭ２３は、データ処理ユニット２０の起動時に、ＣＰＵ２１によって実行されるブートプログラムやデータ処理ユニット２０ハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
主記憶部２２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ ａｃｃｅｓｓ ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部２２は、ＲＯＭ２３及び補助記憶部２４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部２２は、ＣＰＵ２１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
補助記憶部２４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部２４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、ＣＰＵ２１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、後述する感染症を識別するための粒子分析用コンピュータプログラム；リンパ球集団、単球集団、全好中球集団、対照好中球集団、好酸球集団、又は幼若顆粒球集団の粒子数情報を取得するための散乱光強度の範囲及び蛍光強度の範囲；第１閾値及び第２閾値等の設定値を不揮発性に記憶する。
通信Ｉ／Ｆ２５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ２５は、ＣＰＵ２１の制御下で、測定ユニット１０又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じてデータ処理ユニット２０が保存又は生成する情報を、測定ユニット１０又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ２５は、ネットワークを介して測定ユニット１０又は他の外部機器と通信を行ってもよい。
入力Ｉ／Ｆ２６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ２６は、入力部３０文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部２２又は補助記憶部２４に記憶される。
入力部３０は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、データ処理ユニット２０に文字入力又は音声入力を行う。入力部３０は、データ処理ユニット２０の外部から接続されても、データ処理ユニット２０と一体となっていてもよい。
出力Ｉ／Ｆ２７は、例えば入力Ｉ／Ｆ２６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ２７は、ＣＰＵ２１が生成した情報を出力部３１に出力する。出力Ｉ／Ｆ２７は、ＣＰＵ２１が生成し、補助記憶部２４に記憶した情報を、出力部３１に出力する。
出力部３１は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、測定ユニット１０から送信される測定結果及びデータ処理ユニット２０における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。
メディアＩ／Ｆ２８は、記憶媒体３２に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部２２又は補助記憶部２４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ２８は、ＣＰＵ２１が生成した情報を記憶媒体３０７に書き込む。メディアＩ／Ｆ２８は、ＣＰＵ２１が生成し、補助記憶部２４に記憶した情報を、記憶媒体３２に書き込む。
記憶媒体３２は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭとうで構成される。記憶媒体３２は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ２８と接続される。記憶媒体３２には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
ＣＰＵ２１は、データ処理ユニット２０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ２３又は補助記憶部２４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータにデータ処理ユニット２０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ２３又は補助記憶部２４に記憶することも可能である。
また、ＲＯＭ２３又は補助記憶部２４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第２の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、データ処理ユニット２０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。
［２−２．測定ユニットの構成］
図４から６を用いて、測定ユニット１０の構成を説明する。
測定ユニット１０は、上記１−２．に記載の方法に従って調製された測定試料に光を照射して、該試料中の粒子から生じる散乱光及び蛍光を測定する。
第２の実施形態において、測定ユニット１０は、フローサイトメータであることが好ましい。フローサイトメータによる測定では、測定試料に含まれる粒子がフローサイトメータ内に備えられたフローセル（シースフローセル）２０３を通過する際に、光源２０１がフローセル２０３に光を照射し、この光によってフローセル２０３内の粒子から発せられる散乱光及び蛍光を検出する。
第２の実施形態において、散乱光は、一般に流通しているフローサイトメータで測定できる散乱光であれば特に限定されない。例えば、散乱光としては、前方散乱光（例えば、受光角度０〜２０度付近）及び側方散乱光（受光角度９０度付近）を挙げることができる。側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映することが知られている。第２の実施形態においては、散乱光強度として側方散乱光を測定することが好ましい。
蛍光は、測定試料に適当な波長の励起光を照射した際に、蛍光色素によって染色された細胞内の核酸などから発せられる、励起された蛍光を測定して得られる光である。励起光波長及び受光波長は、用いた蛍光色素の種類に応じて適宜選択できる。
図４は、測定ユニット１０のブロック図を示す。この図に示されるように、測定ユニット１０は、血球を検出する検出部１３、検出部１３の出力に対するアナログ処理部１４、測定ユニット制御部１１、表示・操作部１２、及び装置機構部１５を備えている。
検出部１３は、少なくとも白血球等の有核細胞を検出する有核細胞検出部１３１、赤血球数及び血小板数を測定する赤血球／血小板検出部１３２、血液中の血色素量を測定するヘモグロビン検出部１３３を備える。また検出部は任意の構成として幼若顆粒球等の幼若球を検出する幼若球検出部１３４を備えていてもよい。なお、有核細胞検出部１３１は、光学式検出部から構成され、より具体的にはフローサイトメトリ法による検出を行うための構成を備える。
図５は、有核細胞検出部１３１の光学系の構成を示している。この図において、光源２０１であるレーザダイオードから出射された光は、照射レンズ系２０２を介してフローセル２０３内を通過する粒子に照射される。
第２の実施形態において、フローサイトメータの光源２０１は特に限定されず、蛍光色素の励起に好適な波長の光源２０１が選択される。そのような光源２０１としては、例えば赤色半導体レーザ及び青色半導体レーザを含む半導体レーザ、アルゴンレーザ、ヘリウム−ネオンレーザ等の気体レーザ、水銀アークランプなどが使用される。特に半導体レーザは、気体レーザに比べて非常に安価であるので好適である。
図５に示されるように、フローセル２０３を通過する粒子から発せられる前方散乱光は、集光レンズ２０４とピンホール部２０５を介してフォトダイオード（前方散乱光受光素子）２０６によって受光される。側方散乱光は、集光レンズ２０７、ダイクロイックミラー２０８、バンドパスフィルタ２０９、及びピンホール部２１０を介してフォトマルチプライヤ（側方散乱光受光素子）２１１によって受光される。側方蛍光は、集光レンズ２０７及びダイクロイックミラー２０８を介してフォトマルチプライヤ（側方蛍光受光素子）２１２によって受光される。
各受光部２０６、２１１及び２１２から出力された受光信号は、それぞれ、アンプ１４１、１４２及び１４３を有するアナログ処理部１４によって増幅・波形処理などのアナログ処理が施され、測定ユニット制御部１１に送られる。
図４に示されるように、測定ユニット制御部１１は、Ａ／Ｄ変換部１１２と、前記Ａ／Ｄ変換部１１２から出力されたデジタル信号に対して所定の演算処理を行う信号演算部１１３と、プロセッサ１１１ａ及びプロセッサ１１１ａを動作させるためのメモリ１１１ｂからなる測定ユニット情報処理部１１１とを備えている。さらに、測定ユニット制御部１１は、表示・操作部１２との間に介在するインタフェース部１１６と、装置機構部１５との間に介在するインタフェース部１１８とを備えている。
なお、信号演算部１１３は、インタフェース部１１４及びバス１１５を介して測定ユニット情報処理部１１１と接続されている。また、測定ユニット情報処理部１１１は、インタフェース部１１６、１１８及びバス１１５を介して検出部１３及び装置機構部１５と接続され、インタフェース部１１９及びバス１１７を介してデータ処理ユニット２０と接続されている。
Ａ／Ｄ変換部１１２は、アナログ処理部１４から出力された受光信号をデジタル信号に変換して、信号演算部１１３に出力する。信号演算部１１３は、Ａ／Ｄ変換部１１２から出力されたデジタル信号に対して所定の演算処理を行う。そして、信号演算部１１３は、演算結果（測定結果）をインタフェース部１１４及びバス１１５を介して測定ユニット情報処理部１１１に出力する。
測定ユニット情報処理部１１１は、外部インタフェース部１１９を介してデータ処理ユニット２０と接続されており、信号演算部１１３から出力された演算結果をデータ処理ユニット２０へ送信することができる。また、測定ユニット情報処理部１１１は、試料容器を自動供給するサンプラ（図示省略）、試料の調製・測定のための流体系などからなる装置機構部１５の制御及びその他の制御を行う。
測定ユニット１０は、上記１−２．に記載の方法に従って測定試料を調製する試料調製部１６を備えていてもよい。試料調製部１６は、インタフェース１１８及びバス１１５を介して測定ユニット情報処理部１１１によって制御される。図６は、測定ユニット１０内に備えられた試料調製部１６において、血液検体と染色試薬と溶血試薬とを混合して測定試料を調製し、得られた測定試料を有核細胞検出部で測定する様子を示している。
図６において、試料容器００内の血液検体は、吸引ピペット（図示省略）からサンプリングバルブ１６１へと吸引される。サンプリングバルブ１６１で定量された血液検体は、所定量の溶血試薬と混合され、得られた混合物が反応チャンバ１６２に運ばれる。反応チャンバ１６２には、所定量の染色試薬が供給され、上記の混合物と混合される。血液検体と染色試薬及び溶血試薬との混合物を反応チャンバ１６２にて所定の時間反応させることにより、血液検体中の赤血球が溶血され、有核細胞が蛍光色素で染色された測定試料が得られる。
得られた測定試料は、シース液（例えば、セルパック（ＩＩ）、シスメックス株式会社製）とともに有核細胞検出部１３１内のフローセル２０３に送られ、有核細胞検出部１３１においてフローサイトメトリ法により測定される。
［２−４．感染症を識別するための粒子分析装置の動作］
次に図７及び図８を用いて、第２の実施形態における感染症を識別するための粒子分析装置の動作を説明する。粒子分析装置の動作は、後述する感染症を識別するためのコンピュータプログラムにしたがって、データ処理ユニット２０のＣＰＵ２１（処理部２１）が制御する。
初めに、処理部２１は、検査者が入力部３０から行う、データ処理ユニット２０に対する、測定ユニット情報処理部１１１によって生成された各粒子の散乱光強度及び蛍光強度の取得を開始するための入力を受け付ける（ステップＳ０１）。
次に、処理部２１は、測定ユニット情報処理部によって生成された被検血液検体に由来する測定試料に含まれる各粒子の散乱光強度及び蛍光強度を取得する（ステップＳ１）。
続いて、処理部２１は、ステップＳ１で取得された測定試料に含まれる各粒子の散乱光強度及び蛍光強度を、補助記憶部２４に記憶されている、リンパ球、単球、全好中球、及び好酸球の各集団を分類するために予め設定されている散乱光強度の範囲及び蛍光強度の範囲の値と比較する。そして、処理部２１は、各粒子をリンパ球集団、単球集団、全好中球集団、好酸球集団に分類する（ステップＳ１１）。
次に、処理部２１は、散乱光強度と蛍光強度に基づいて各集団について粒子数情報を取得する（ステップＳ１２）。また、処理部２１は、散乱光強度から白血球集団の粒子数情報を取得するステップ（図示せず）を行ってもよい。また、白血球集団の粒子数情報の取得は後述するステップＳ３１の前であればいつ行ってもよい。
続いて処理部２１は、対照好中球集団に対応する第１集団を含まない好中球集団である第２集団の粒子数情報を取得する。第２集団の粒子数情報の取得方法は少なくとも２つのパターンが想定される
第１のパターンとしては、処理部２１は、被検血液検体に由来する全好中球集団に含まれる好中球の散乱光強度と蛍光強度を、記憶部２４に記憶されている対照好中球集団の散乱光強度の範囲と蛍光強度の範囲を比較し（ステップＳ１３）する。続いて処理部２１は、被検血液検体に由来する全好中球集団に含まれる好中球のうち、対照好中球集団の散乱光強度の範囲に含まれ、かつ対照好中球集団の蛍光強度の範囲に含まれる好中球集団を第１集団と決定する（ステップＳ１４）。そして、処理部２１は、全好中球集団に含まれる好中球のうち第１集団を含まない好中球集団を第２集団と決定する（ステップＳ１５）方法である。
第２のパターンとしては、次の方法を挙げることができる。処理部２１は、被検血液検体に由来する全好中球集団に含まれる好中球の散乱光強度と蛍光強度を、対照好中球集団の散乱光強度の範囲と蛍光強度の範囲を比較する（ステップＳ１３）。処理部２１は、比較結果に基づいて、被検血液検体に由来する全好中球集団に含まれる好中球のうち、対照好中球集団の散乱光強度の範囲に含まれ、かつ対照好中球集団の蛍光強度の範囲に含まれる好中球集団を第１集団と決定する（ステップＳ１４）。さらに、処理部２１は、被検血液検体に由来する全好中球集団に含まれる好中球の蛍光強度を記憶部２４に記憶されている幼若顆粒球集団の蛍光強度の下限値と比較する。処理部２１は、幼若顆粒球の集団である幼若顆粒球集団の蛍光強度の下限値と第１集団の蛍光強度の上限値との間であり、かつ散乱光強度が、第１集団の散乱光強度の範囲に存在する粒子集団を、第２集団と決定する（図示せず）。
処理部２１は、前記第１のパターン又は第２のパターンのいずれかで得られた第１集団を含まない第２集団の粒子数情報を取得する（ステップＳ２）。
さらに処理部２１は、図８に示すように、ステップＳ２で取得された第２集団の粒子数情報に基づいて、被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する（ステップＳ３）。
具体的には、処理部２１は、ステップＳ２で取得された第２集団の粒子数情報に含まれる粒子数と、ステップＳ１３で取得された白血球集団の粒子数情報に含まれる粒子数との比（「第２集団の粒子数」／「白血球数」）を求め（ステップＳ３１）、「第２集団の粒子数」／「白血球数」の値を予め設定された第１閾値と比較する（ステップＳ３２）。「第２集団の粒子数」／「白血球数」が第１閾値よりも高い場合には、処理部２１は、被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体であると判定することができる（ステップＳ３３）。また、「第２集団の粒子数」／「白血球数」が第１閾値以下である場合には、さらに、処理部２１は、「第２集団の粒子数」／「白血球数」を第２の域値と比較する（ステップＳ３４）。第２集団の粒子数」／「白血球数」が第１閾値以下であり、かつ第２閾値よりも高い場合には、処理部２１は、被検血液検体がウイルス感染症患者から採取された検体であると判定することができる（ステップＳ３５）。さらに、「第２集団の粒子数」／「白血球数」が第２閾値以下である場合には、処理部２１は、被検血液検体が、細菌感染症患者及びウイルス感染症患者から採取された検体ではないと判定することができる（ステップＳ３６）。
処理部２１は、上記ステップＳ３３、ステップＳ３５又はステップＳ３６で得られた結果を出力部３１から出力するか、記録媒体３２に記録してもよい。また、図示しないが、処理部２１は、ステップＳ２で得られた粒子数情報を出力部３１から出力するか、記録媒体３２に記録してもよい。
第２の実施形態において、「第２集団の粒子数」／「白血球数」は、第１の実施形態と同様に、「第２集団の粒子数」／「全好中球集団の粒子数」又は、「第２集団の粒子数」／「全リンパ球集団の粒子数」に置き換えることができる。
［３．感染症を識別するための粒子分析用コンピュータプログラム］
本発明の第３の実施形態は、感染症を識別するための粒子分析用コンピュータプログラムに関する。具体的には、上記２−４．で述べた感染症を識別するための粒子分析装置の動作を制御するコンピュータプログラムである。
第３の実施形態のコンピュータプログラムが実行する各ステップは、上記２−４．で述べた図７に記載のステップＳ０１、ステップＳ１、ステップＳ１１〜１６、ステップ１６’及びステップ２、並びに図８に記載のステップS３１〜S３５である。上記２−４．に記載の各ステップの説明は、第３の実施形態に援用することができる。上記１．に記載の各用語の説明についても、第３の実施形態に援用することができる。
さらに、第３の実施形態に係るプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶されていてもよい。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
以上、本発明の各実施形態を、添付の図面を参照して詳細に説明したが、本発明における感染症を識別するための粒子分析方法、及び感染症を識別するための粒子分析装置、及び感染症を識別するための粒子分析用コンピュータプログラムは、上記に説明する具体的な実施形態に限定されるものではない。本発明の実施形態は、本明細書の記載と当業者の技術常識に基づいて変形しうる。
以下に、実施例を用いて、本発明を説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。
１．実施例１
以下の01から05の各感染症群に属する被検者から末梢血を採血し、XN−1000（シスメックス株式会社）で、白血球数、全好中球集団、第１集団、リンパ球集団の単位容積あたりの粒子数を計数した。各感染症の確定診断は、PCR検査等の従来行われている感染症検査に基づき医師が行った。
01_デング熱（ウィルス） ｎ＝82
02_チクングニア熱（ウィルス） ｎ＝7
03_腸チフス（細菌） ｎ＝8
04_レプトスピラ（細菌） ｎ＝5
05_菌血症（細菌）：非常に重症 ｎ＝9
第１集団を含まない第２集団の粒子数は、各被検者の末梢血について、全好中球集団の粒子数から第１集団の粒子数を減ずることで求めた。
各末梢血について、「第２集団の粒子数」を「白血球数」で除した値に100を乗じて、LS_LEUT_P値を求めた。各感染症群のLS_LEUT_P値の分布を図９に示す。
細菌感染症患者の血液検体である、03_腸チフス群と、04_レプトスピラ群及び05_菌血症群の３群と01_デング熱群及び02_チクングニア熱群の２群との間で、二群の判別分析法により、LS_LEUT_P値を9.8に閾値を設定することができた。
２．比較例
上記01から05までの各感染症群について、「全好中球集団の粒子数」を「白血球数」で除した値に100を乗じて、LEUT_P値を求めた。各群のLEUT_P値の分布を図10に示す。
LEUT_P値では、03_腸チフス群と、04_レプトスピラ群及び05_菌血症群の３群と01_デング熱群及び02_チクングニア熱群の２群との間に有意差は認められず、閾値を設定することができなかった。
以上の結果から、LS_LEUT_P値は、細菌感染症患者の血液検体とウイルス感染症患者の血液検体を識別できると考えられた。
検出部 １３
処理部 ２１
記憶部 ２４
粒子分析装置５０
光源 ２０１
フローセル ２０３

Claims (22)

  1. 被検者から採取された、粒子を含む被検血液検体と、核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された測定試料に光を照射することによって、前記測定試料に含まれる各粒子から散乱光及び蛍光を取得する工程Ａと、
    前記散乱光及び蛍光に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定し、特定された粒子についての粒子数情報を取得する工程Ｂと、
    前記粒子数情報に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する工程Ｃと、
    を含む、感染症を識別するための粒子分析方法。
  2. 前記工程Ａにおいて、前記散乱光及び蛍光に基づいて、散乱光強度及び蛍光強度が取得され、
    前記工程Ｂにおいて、前記散乱光強度および前記蛍光強度に基づいて、前記粒子の特定を行う、請求項１に記載の方法。
  3. 前記工程Ａと、前記工程Ｂとの間に、前記工程Ａで取得された散乱光及び蛍光から、全好中球集団の粒子数情報と、第１集団の粒子数情報と、を取得する工程Ａ−１を含み、
    前記第１集団は、前記測定試料において、感染症に罹患していない対照者の血液に含まれる好中球集団に相当すると判断される粒子集団であり、
    前記工程Ｂにおいて特定される粒子は、前記全好中球集団に含まれ、かつ前記第１集団に含まれない粒子である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記感染症に罹患していない対照者の血液に含まれる好中球集団と判断される粒子集団が、対照者から採取された対照血液検体を用いてあらかじめ設定された散乱光強度の範囲内及び蛍光強度の範囲内に含まれる粒子集団である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記対照者は、血液中に含まれる白血球中の桿状核好中球の割合が、基準値を超えない者である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記工程Ｂにおいて特定される粒子は、
    幼若顆粒球集団の出現位置よりも蛍光強度の低い位置に出現し、
    第１集団よりも蛍光強度の高い位置に出現し、
    第１集団と実質的に同じ散乱光強度の範囲に出現する、
    請求項３又は４に記載の方法。
  7. 前記工程Ｃが、前記全好中球集団の粒子数情報に含まれる粒子数と、前記工程Ｂで取得された粒子数情報に含まれる粒子数との割合に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する工程である、請求項３、請求項４、又は請求項３若しくは４を引用する請求項５に記載の方法。
  8. 前記工程Ｃの前に、さらに前記測定試料中の白血球集団の粒子数情報を取得する工程を含み、
    前記工程Ｃが、前記白血球集団の粒子数情報に含まれる粒子数と、前記工程Ｂで取得された粒子数情報に含まれる粒子数との割合に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する工程である、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記工程Ｃが、前記白血球集団の粒子数に対する、前記工程Ｂで取得された粒子数との割合を算出し、前記割合を第１閾値と比較し、前記割合が第１閾値より高い場合に、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体であると判定する工程である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記工程Ｃが、前記割合を第１閾値よりも低い値である第２閾値と比較し、前記割合が第１閾値以下であり第２閾値よりも高い場合に、前記被検血液検体がウイルス感染症患者から採取された検体であると判定する工程である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記工程Ｃが、前記割合が第２閾値以下の場合に、前記被検血液検体がウイルス及び細菌の何れにも感染していない被検者から採取された検体であると判定する工程である、請求項１０に記載の方法。
  12. 被検者から採取された、粒子を含む被検血液検体と、核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された測定試料に、光を照射する光源と、
    前記照射により生じた前記測定試料に含まれる各粒子からの散乱光及び蛍光を受光する検出部と、
    前記散乱光及び蛍光に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定し、特定された粒子についての粒子数情報を取得し、前記粒子数情報に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定する処理部と、
    を備える、感染症を識別するための粒子分析装置。
  13. 前記処理部は、
    前記検出部により受光された散乱光及び蛍光から、散乱光強度及び蛍光強度を取得し、 前記散乱光強度および前記蛍光強度に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定する、請求項１２に記載の装置。
  14. 前記処理部は、
    前記散乱光及び蛍光に基づいて、全好中球集団の粒子数情報と、第１集団の粒子数情報と、をさらに取得し、
    前記第１集団は、前記被検血液検体において、感染症に罹患していない対照者の血液に含まれる好中球集団に相当すると判断される粒子集団である、
    請求項１２又は１３に記載の装置。
  15. 前記装置は、
    前記第１集団を決定するための散乱光強度範囲及び蛍光強度範囲の情報と、
    前記全好中球集団を決定するための散乱光強度範囲及び蛍光強度範囲の情報と、
    を記憶した記憶部をさらに備え、
    前記処理部は、
    前記測定試料中の各粒子の散乱光強度及び蛍光強度と、前記記憶部に記憶された散乱光強度範囲及び蛍光強度範囲の情報とをそれぞれ比較し、
    比較結果に基づいて前記測定試料中の第１集団と、全好中球集団とを決定し、
    前記全好中球集団に含まれ、かつ前記第１集団に含まれない粒子を、前記感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子として特定する、
    請求項１４に記載の装置。
  16. 前記処理部は、
    前記処理部は、さらに測定試料中の白血球集団の粒子数情報を取得する、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の装置。
  17. 前記処理部は、
    前記白血球集団の粒子数情報に含まれる粒子数と、前記感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子の粒子数との割合を算出し、前記割合を第１閾値と比較し、前記割合が第１閾値より高い場合に、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体であると判定する、請求項１６に記載の装置。
  18. 前記処理部は、
    さらに前記割合を第１閾値よりも低い値である第２閾値と比較し、前記割合が第１閾値以下であり第２閾値よりも高い場合に、前記被検血液検体がウイルス感染症患者から採取された検体であると判定する、請求項１７に記載の装置。
  19. 前記処理部は、
    前記割合が第２閾値以下の場合に、前記被検血液検体がウイルス及び細菌の何れにも感染していない被検者から採取された検体であると判定する、請求項１８に記載の装置。
  20. さらに、フローセルを備え、前記光がフローセルを通過する粒子に照射される、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の装置。
  21. 被検者から採取された、粒子を含む被検血液検体と、核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された測定試料に、光を照射する光源と、
    前記照射により生じた前記測定試料に含まれる各粒子からの散乱光及び蛍光を受光する検出部と、
    前記散乱光及び蛍光に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定し、特定された粒子についての粒子数情報を取得し、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定するための前記粒子数情報を出力する処理部と、
    を備える、感染症を識別するための粒子分析装置。
  22. 被検者から採取された、粒子を含む被検血液検体と、核酸を染色する蛍光色素と、溶血剤とを混合して調製された測定試料に光を照射することによって、前記測定試料に含まれる各粒子から散乱光及び蛍光を取得するステップと、
    前記散乱光及び蛍光に基づいて、感染症に罹患していない対照者の血液に実質的に含まれず、かつ感染症患者の血液に含まれる好中球と判断される粒子を特定し、特定された粒子についての粒子数情報を取得するステップと、及び
    前記粒子数情報に基づいて、前記被検血液検体が細菌感染症患者から採取された検体か、ウイルス感染症患者から採取された検体かを判定するステップとを、コンピュータに実行させる、感染症を識別するための粒子分析用コンピュータプログラム。
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