JP5865009B2 - 活性化好中球の検出方法 - Google Patents
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Description
生体試料中の赤血球が溶血され、白血球の核酸が核酸染色性の蛍光色素によって染色された測定試料を調製する工程と、
調製された測定試料に光を照射し、該試料中の粒子から生じる散乱光強度および蛍光強度を測定する工程と、
取得した散乱光強度および蛍光強度に基づいて、前記生体試料中の白血球を少なくとも好中球を含む集団と好酸球を含む集団とに分類する工程と、
好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間に存在する粒子を、活性化好中球として検出する工程と
を含む、活性化好中球の検出方法を提供する。
本発明の実施形態においては、活性化好中球として、例えば、活性酸素種(ROS)を産生している好中球が挙げられる。当該技術において、活性化好中球により産生されるROSとしては、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素などが知られている。
また、異物を貪食した活性化好中球においては、異物は貪食空胞に入り、そして、この空胞に分解酵素およびROSを含んだ顆粒が融合してファゴリソソームが形成されることが知られており、形態学的観察において、活性化好中球の細胞質には空胞変性が認められる。よって、本発明の実施形態においては、細胞質において空胞変性が生じている好中球も活性化好中球に含まれる。
以下に、本発明の活性化好中球の検出方法(以下、単に「検出方法」ともいう)について説明する。
本発明の検出方法では、まず、生体試料中の赤血球が溶血され、白血球の核酸が核酸染色性の蛍光色素によって染色された測定試料を調製する(調製工程)。具体的には、生体試料と、核酸を染色するための蛍光色素と、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に前記蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための界面活性剤を含有する溶血剤とを混合して、測定試料を調製する。
この調製工程では、上記の溶血剤の作用によって生体試料に含まれる赤血球が速やかに溶血され、且つ白血球の細胞膜に蛍光色素が透過できる程度の損傷が与えられる。そして、上記の蛍光色素が、損傷を受けた白血球の細胞膜から入り込むことによって、白血球の核酸が染色される。生体試料中に活性化好中球が存在する場合は、活性化好中球の核酸も染色される。
本発明の検出方法に用いられる蛍光色素は、核酸を染色可能な蛍光色素であれば特に限定されず、光源から照射される光の波長に応じて適宜選択することができる。そのような蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−1、エチジウムホモダイマー−2、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス[[3‐[[4‐[[(3‐メチルベンゾチアゾール‐3‐イウム)‐2‐イル]メチレン]‐1,4‐ジヒドロキノリン]‐1‐イル]プロピル]ジメチルアミニウム]・テトラヨージド(TOTO−1)、4‐[(3‐メチルベンゾチアゾール‐2(3H)‐イリデン)メチル]‐1‐[3‐(トリメチルアミニオ)プロピル]キノリニウム・ジヨージド(TO−PRO−1)、N,N,N',N'‐テトラメチル‐N,N'‐ビス[3‐[4‐[3‐[(3‐メチルベンゾチアゾール‐3‐イウム)‐2‐イル]‐2‐プロペニリデン]‐1,4‐ジヒドロキノリン‐1‐イル]プロピル]‐1,3‐プロパンジアミニウム・テトラヨージド(TOTO−3)、または2‐[3‐[[1‐[3‐(トリメチルアミニオ)プロピル]‐1,4‐ジヒドロキノリン]‐4‐イリデン]‐1‐プロペニル]‐3‐メチルベンゾチアゾール‐3‐イウム・ジヨージド(TO−PRO−3)および以下の式(I)で表される蛍光色素が挙げられる。それらの中でも、式(I)で表される蛍光色素が好ましい。
調製工程において、蛍光色素の溶液を用いる場合、蛍光色素の濃度は適宜設定できるが、通常0.01〜100μg/L、好ましくは0.1〜10μg/Lである。例えば、蛍光色素として上記の式(I)で表される蛍光色素を用いる場合、その溶液における蛍光色素の濃度は、好ましくは0.2〜0.6μg/Lであり、より好ましくは0.3〜0.5μg/Lである。
本発明の検出方法に用いられる溶血剤は、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に上記の蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための界面活性剤を含む。そのような界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤およびノニオン性界面活性剤が挙げられる。
本発明の実施形態において、溶血剤に含まれる界面活性剤は1種類であってもよいし、2種類以上であってもよい。2種類以上の界面活性剤が含まれる場合、その組合せは、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤との組合せであってもよいし、カチオン性界面活性剤どうしの組合せであってもよいし、アニオン性界面活性剤どうしの組合せであってもよい。
調製工程において、界面活性剤の溶液を用いる場合、その濃度は界面活性剤の種類に応じて適宜設定できるが、カチオン性界面活性剤の場合は通常10〜10000 ppm、好ましくは100〜1000 ppmであり、ノニオン性界面活性剤の場合は通常10〜100000 ppm、好ましくは100〜10000 ppm、より好ましくは1000〜5000 ppmである。
上記の調製工程において、生体試料と、蛍光色素と、溶血剤とを混合する順序は特に限定されない。例えば、蛍光色素と溶血剤とを先に混合し、この混合液と生体試料とを混合してもよい。また、溶血剤と生体試料とを先に混合し、この混合液と蛍光色素とを混合してもよい。本発明の実施形態においては、いずれの順序で混合しても同等の結果を得ることができる。
本発明の方法では、上記の工程で調製された測定試料に光を照射して、該試料中の粒子から生じる散乱光強度および蛍光強度を測定する(測定工程)。
本発明の実施形態において、測定工程はフローサイトメータにより行われることが好ましい。フローサイトメータによる測定では、測定試料がフローサイトメータのフローセルを通過するときに光を照射されることにより、該試料中の粒子、例えば染色された白血球などから発せられるシグナルについて散乱光強度および蛍光強度を得ることができる。
当該技術においては、側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映することが知られている。本発明の実施形態においては、散乱光強度として側方散乱光強度を測定することが好ましい。
本発明の方法では、取得した散乱光強度および蛍光強度に基づいて、上記の生体試料中の白血球を少なくとも好中球を含む集団と好酸球を含む集団とに分類するとともに(分類工程)、活性化好中球を検出する(検出工程)。
分類工程では、測定された粒子が正常な白血球である場合、該粒子は、散乱光強度および蛍光強度に基づいて、リンパ球、単球、好酸球、および好酸球以外の顆粒球の4種類の集団(クラスター)に分類される。ここで、好酸球以外の顆粒球とは、好中球及び好塩基球を表す。好中球及び好塩基球の集団に含まれる好塩基球はごく僅かであるので、好中球及び好塩基球の集団は、好中球の集団とみなすことができる。そして、検出工程において、測定された粒子のうち、好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間に存在する粒子が、活性化好中球として検出される。好ましくは、測定された粒子のうち、蛍光強度が好中球を含む集団以下であり、且つ散乱光強度が好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間である粒子が、活性化好中球として検出される。
なお、本発明の実施形態においては、正常な白血球は、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球の5種類の集団に分類されてもよい。
本発明の別の実施形態においては、活性化好中球の検出は次のようにして行ってもよい。まず、測定結果に基づいて、好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間に存在する粒子、好ましくは、蛍光強度が好中球を含む集団以下であり、且つ散乱光強度が好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間である粒子を検出し、計数する。次に、該粒子の計数値が所定の値よりも大きい場合に、該粒子を活性化好中球として検出する。なお、所定の値は、活性化好中球を含む生体試料の測定から蓄積されたデータに基づいて、適宜設定することができる。
本発明の測定装置は、生体試料中の白血球を分類するとともに、活性化好中球を検出するための装置である。
本発明の測定装置について、その一実施形態の外観を図2に示す。本実施形態の測定装置1は、多項目自動血球分析装置として構成されており、測定部2とデータ処理部3とを有する。測定部2は、生体試料と上記の蛍光色素および溶血剤とを混合して測定試料を調製する装置と、得られた測定試料について散乱光強度および蛍光強度を測定する装置とを有する。データ処理部3は、測定部2から出力された測定結果を分析して、白血球の分類と活性化好中球の検出を行う装置を有する。
なお、図2では、測定部2とデータ処理部3とは別個の装置として構成されているが、両者は一体の装置として構成されていてもよい。
検出部4は、白血球を検出する白血球検出部を備えている。また、検出部4は、白血球検出部の他、赤血球数および血小板数を測定するRBC/PLT検出部、血液中の血色素量を測定するHGB検出部、幼若球を検出するIMI検出部も備えている。なお、検出部4は、光学式検出部、より具体的にはフローサイトメトリー法による検出部として構成されている。
なお、演算部62は、インタフェース部63およびバス68を介して制御部64と接続されている。また、制御部64は、インタフェース部66、67およびバス68を介して検出部4および装置機構部8と接続され、インタフェース部65およびバス69を介してデータ処理部3と接続されている。
図5において、試料容器11内の生体試料は、吸引ピペット(図示省略)からサンプリングバルブ12へと吸引される。サンプリングバルブ12で定量された生体試料は、所定量の溶血剤と混合され、得られた混合物が反応チャンバ13に運ばれる。反応チャンバ13には、所定量の蛍光色素が供給され、上記の混合物と混合される。生体試料と蛍光色素および溶血剤との混合物を反応チャンバ13にて所定の時間反応させることにより、生体試料中の赤血球が溶血され、白血球が染色された測定試料が得られる。
得られた測定試料は、シース液(例えば、セルパック(II)、シスメックス株式会社製)とともに検出部4に送られ、該検出部4においてフローサイトメトリー法により測定される。
ROM301bは、マスクROM、PROM、EPROM、EEPROMなどによって構成され、CPU301aにより実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
ハードディスク301dには、オペレーティングシステムおよびアプリケーションシステムプログラムなどの、CPU301aに実行させるための種々のコンピュータプログラムおよびコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム305a(活性化好中球の検出用コンピュータプログラム)および活性化好中球の検出に用いられる所定の値もハードディスク301dにインストールされている。
また、ハードディスク301dには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するWindows(登録商標)などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明において、本発明の実施形態に係るアプリケーションプログラム305aは、該オペレーティングシステム上で動作するものとする。
画像出力インタフェース301hは、LCDまたはCRTなどで構成される表示部302に接続されており、CPU301aから与えられる画像データに応じて映像信号を表示部302に出力する。表示部302は、入力された映像信号にしたがって、画像データ(画面)を表示する。
まず、ユーザの操作などにより、データ処理部3から測定部2へ測定開始指示が送信される(ステップS101)。データ処理部3のCPU301aは、測定部2から測定結果を受信するまで待機する(ステップS102にてNO)。
測定部2は、受信した測定開始指示に応答して、測定試料の調製および測定を行ない、測定結果をデータ処理部3に送信する。データ処理部3のCPU301aは、入出力インタフェース301fを介して測定部2から測定結果を受信すると(ステップS102にてYES)、受信した測定結果をRAM301cに記憶させ、測定結果に対して白血球の分類処理を行う(ステップS103)。
本発明の実施形態では、このステップS104において、データ処理部3のCPU301aは、ハードディスク301dに予め記憶させておいた活性化好中球の検出に用いる所定の値に関するデータを読み出し、蛍光強度が好中球よりも低く、且つ散乱光強度が好中球と好酸球との間である粒子の検出数が該所定の値よりも大きい場合に、試料中に活性化好中球が存在すると認識してもよい。
本発明の別の実施形態では、このステップS104において、データ処理部3のCPU301aは、好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間に存在する粒子、好ましくは、蛍光強度が好中球を含む集団以下であり、且つ散乱光強度が好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間である粒子を少なくとも1つ検出した場合に、試料中に活性化好中球が存在すると認識してもよい。
健常人から、血液学検査用のヘパリン採血管を用いて末梢血を採取した。得られた血液を、室温でモノポリ分離溶液(大日本住友製薬)を用いた遠心分離により、純度90%以上の多核球試料を得た。なお、この操作は、メーカー(大日本住友製薬)のインストラクションに従って行った。そして、得られた多核球(2×105個)を、1mLの0.1%ウシ血清アルブミン(リン酸緩衝生理食塩水)に懸濁した。多核球のうち好中球を染色するため、得られた懸濁液に、フィコエリスリン(PE)で蛍光標識したCD16(抗ヒトCD16 FcガンマレセプターIII (clone: DJ130c)・マウスモノクローナル抗体/RPE標識フローサイトメトリー用好中球特異的抗体;ダコ社)(終濃度750μg/L)を添加し、室温で10分間インキュベートした。次に、ROS検出用試薬であるAPF (Aminophenyl Fluorescein;積水メディカル)(終濃度10μM)を添加し、室温で30分間静置した。最後に、好中球を活性化するための刺激物質であるPMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate;シグマアルドリッチ社)(終濃度0.32 nM)またはfMLP(N-Formyl-Met-Leu-Phe;シグマアルドリッチ社)(終濃度50 nM)を添加し、室温で10分間静置して、活性化好中球を含む試料を調製した。
また、コントロール試料として、PMAおよびfMLPのいずれも添加しなかったこと以外は、上記と同様に処理した試料を調製した。
測定試料を汎用フローサイトメータFACSCalibur(ベクトン・ディッキンソン社製)により測定し、「CD16由来蛍光強度(CD16-PE、585 nm)−前方散乱光強度(FSC)」、「ストマトライザー4DS中の核酸染色性蛍光色素由来蛍光強度(4DS、665 nm)−側方散乱光強度(SSC)」および「APF由来蛍光強度(APF、515 nm)−前方散乱光強度(FSC)」のスキャッタグラムを取得した。
このような通常の好中球出現領域の右下側に出現する好中球について、APF−FSCにより、活性化好中球の指標であるROS産生を確認した。図10(B)を参照して、APF−FSCにおいて点線で囲まれた粒子は、4DS−SSCにおいて通常の好中球出現領域の右下側に出現する好中球である。APF−FSCより、点線で囲まれた好中球は、通常の好中球に比べてROS産生が高いことが分かった。
以上のことから、4DS−SSCのスキャッタにおいて、好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間に存在する好中球、すなわち、蛍光強度が好中球を含む集団以下であり、且つ散乱光強度が好中球を含む集団と好酸球を含む集団との間である好中球は、刺激により活性化してROS産生能が亢進している好中球であることが分かった。
上記の実施例1の結果を検証するため、刺激により活性化された好中球が、顕微鏡観察においてもROS産生能の亢進を示すか否かを検討した。
実施例1と同様にして、健常人の末梢血から活性化好中球を含む試料を調製した。ただし、好中球の刺激物質としてはPMAのみを用いた。また、コントロール試料としてAPFおよび刺激物質で処理しなかった試料(−APF)、および刺激物質で処理しなかった試料(+APF)を調製した。
調製した各試料を、ポリ-L-リジンでコートしたガラスボトムディッシュに移し、該試料中の細胞を共焦点レーザ顕微鏡(IX81(オリンパス社製)、CSU-X1(横河電機製)、ImagEM(浜松フォトニクス製))で好中球を観察した。
活性化好中球は、その特徴として、脱顆粒および空胞変性という形態の変化を示すことが知られている。上記の実施例1において作製した試料に、活性化好中球に特徴的な変化を示す細胞が存在するか否かを検討した。
実施例1と同様にして、健常人の末梢血から活性化好中球を含む試料を調製した。また、コントロール試料として刺激物質で処理しなかった試料を調製した。
この試料を2.5%グルタールアルデヒドで固定し、発明者らの文献(Mari Kono et al. (2009), ' Morphological definition of CD71 positive reticulocytes by various staining techniques and electron microscopy compared to reticulocytes detected by an automated hematology analyzer', Clinica Chimica Acta , Vol.404, p105-110.)に記載の方法に従って、電子顕微鏡試料を作製した。得られた試料を、透過型電子顕微鏡(日立 H-7500)を用いて解析した。
観察の結果を、図12に示す。図12より、PMAまたはfMLPを添加した試料では、細胞質において脱顆粒と空胞が生じた好中球が多く見られた。
全血を生体試料とした測定においても、実施例1と同様に活性化好中球を検出できるか否かを検討した。
健常人から、血液学検査用のEDTA-2K入り採血管を用いて末梢血を採取した。得られた血液に、PMA(シグマアルドリッチ社製)(終濃度0.32 nM)を添加し、室温10分間静置した。コントロール試料として、PMAを添加しない全血を用いた。
調製した試料を自動血液分析装置XE-2100(シスメックス株式会社製)に供して測定を行ない、4DS−SSCのDIFFスキャッタグラムを取得した。なお、自動血液分析装置XE-2100は、ストマトライザー4DLおよびストマトライザー4DS(シスメックス社製)を用いて、上記のようにして調製した試料を自動的に処理し、測定試料を調製する。
2 測定部
3 データ処理部
Claims (9)
- 生体試料中の赤血球が溶血され、白血球の核酸が核酸染色性の蛍光色素によって染色された測定試料を調製する工程と、
調製された測定試料に光を照射し、該試料中の粒子から生じる散乱光強度および蛍光強度を測定する工程と、
取得した散乱光強度および蛍光強度に基づいて、前記生体試料中の白血球を少なくとも好中球を含む集団と好酸球を含む集団とに分類する工程と、
蛍光強度が前記好中球を含む集団以下であり、且つ散乱光強度が前記好中球を含む集団と前記好酸球を含む集団との間である粒子を、活性化好中球として検出する工程と
を含む、活性化好中球の検出方法。 - 前記好中球を含む集団が、さらに好塩基球を含む請求項1に記載の方法。
- 前記活性化好中球が、細胞質において空胞変性が生じている請求項1または2に記載の方法。
- 前記活性化好中球が、ROS産生能が亢進している請求項1または2に記載の方法。
- 前記検出工程において、前記好中球を含む集団と前記好酸球を含む集団との間に存在する粒子を計数する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出工程において、前記計数した値が所定の値よりも大きい場合に、前記粒子を活性化好中球として検出する請求項5に記載の方法。
- 前記測定試料中の赤血球が、界面活性剤により溶血されている請求項1〜6に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、ノニオン性界面活性剤およびカチオン性界面活性剤から選択される少なくとも1つである請求項7に記載の方法。
- 前記散乱光強度が、側方散乱光強度である請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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