JP4969115B2 - マラリア感染赤血球の検出方法並びにこれに使用する検出用試薬及び赤血球膜部分溶解試薬 - Google Patents
マラリア感染赤血球の検出方法並びにこれに使用する検出用試薬及び赤血球膜部分溶解試薬 Download PDFInfo
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Description
本発明は、マラリアに感染した赤血球（以下、「マラリア感染赤血球」又は単に「感染赤血球」という）を検出する方法、並びに当該検出方法に使用する検出用試薬及び赤血球膜部分溶解試薬に関する。
マラリアは熱帯、亜熱帯地方に広く分布する寄生虫感染症である。その病原体は、アピコンプレクサ類に分類されるマラリア原虫であり、ハマダラカを媒介として感染する。
マラリアは、熱帯熱マラリア、３日熱マラリア、４日熱マラリア、及び卵型マラリアの４種類に分類されるが、このうち熱帯熱マラリアが特に悪性で、発症後数時間以内に治療を開始しないと重篤な症状や合併症を併発し、死に至る場合も少なくない。一方、その他のマラリアは症状もそれほど重篤でなく、死に至ることは稀である。
従って、熱帯熱マラリアとその他のマラリアでは治療方法及び使用する薬剤が大きく異なる。熱帯熱マラリアでは急激に症状が悪化するなど緊急性が高く、まず何よりも患者を救命するという観点から、熱帯熱マラリアを疑う場合は診断が確定以前であっても投薬を開始することがある。そのため、誤診とそれに伴う投与薬剤の副作用がつきまとう。その他のマラリアの場合は、そこまで緊急性が高くないため、時間をかけて治療することが可能である。
そこで、臨床診断の段階では、熱帯熱マラリアかそれ以外のマラリアかを正確かつ迅速に鑑別し、それに基づいて適切な治療の方法を決定することがきわめて重要となる。このことから、マラリア、特に熱帯熱マラリアの早期診断は重要である。
熱帯熱マラリアの治療に際しては、現在のところ、医師が感染率（一定体積の血液に含まれる全赤血球数に対するマラリア感染赤血球数の割合）を基に、経験的に、投薬の種類、薬剤の投与量、投与スパンを決定している。従って、熱帯熱マラリアの治療の際は、熱帯熱マラリアか他のマラリアかの判別が必要なだけでなく、患者血液におけるマラリア感染率を知ることも重要である。
マラリアの検出方法としては、従来、所定の対象者から採取した血液の塗抹標本を作製し、これをギムザ染色して顕微鏡観察し、マラリア感染赤血球を検出する方法、さらには特定視野での赤血球及び感染赤血球を計数して、感染率を算出する方法が採られている。
しかしながら、顕微鏡観察による方法では、塗抹標本の作成、固定、染色、乾燥の各工程を必要とし、煩雑である。また、マラリア感染赤血球と非感染赤血球の弁別や感染したマラリア原虫の種類が熱帯熱マラリアかそれ以外のマラリア原虫かの判別などに熟練した技術が必要である。さらに、顕微鏡下で観察するのに多くの時間（通常１患者あたり１５分以上）を要することになる。
自動的にマラリア感染赤血球を検出する方法として、蛍光色素でマラリア感染赤血球を染色し、フローサイトメータを用いてマラリア感染赤血球を検出する方法も開発されている。
しかし、特許文献１の従来技術で説明されているように、核酸蛍光色素を使用する場合、マラリア感染赤血球が染色されるだけでなく、網状赤血球も染色されてしまい、両者を判別することができないという問題がある。特許文献１では、特定の蛍光色素（オーラミンＯ類似体）を、低濃度で使用することにより、マラリア感染赤血球のみを染色することが提案されている。しかし、この方法ではマラリア非感染赤血球と感染赤血球の弁別は十分明確ではない。
これに対し、Ｐ．Ｈ．Ｖｉａｎｅｎらは、非特許文献１で、赤血球を、緩衝剤、ホルムアルデヒド及びジエチレングリコールを含む溶血剤を用いて溶血し、マラリア感染赤血球からマラリア原虫を遊離させた後、色素としてヘキスト３３２５８を使用してマラリア原虫を染色し、フローサイトメータで検出する方法を開示している。この方法では、マラリア非感染赤血球や網状赤血球の影響は無視できるものの、溶血、染色操作が煩雑であり、数十分以上の時間が必要という問題がある。
特許文献２には、溶血処理によりマラリア原虫を遊離させ、核酸染色性色素を用いてマラリア原虫を迅速に特異染色し、遠心分離操作なしにフローサイトメータで検出する方法が開示されている。しかし、熱帯熱マラリアか他のマラリアであるかの弁別はマラリア感染赤血球中のマラリア原虫を観察することにより一般に行なわれているので、赤血球を溶血してしまう特許文献２の方法では、マラリアに感染しているかどうかの判定はできても、熱帯熱マラリアかどうかを決定することまではできない。
特許文献３には、熱帯熱マラリアと他のマラリアでは核酸と結合する色素量に差があることを利用することにより、フローサイトメータを用いてマラリア原虫の種類を判定する方法が提案されている。この方法は、検体中の赤血球を溶血してマラリア原虫を遊離させ、測定試料中のマラリア原虫から蛍光強度を検出し、所定範囲の蛍光強度を有するマラリア原虫の頻度分布に基づき、マラリア原虫の種類を判定する方法である。
しかし、上記特許文献２，３、及び非特許文献１が採用している、赤血球を溶血し、遊離したマラリア原虫を検出する方法では、以下のような理由から正確な感染率を求めることができない。
図１は、ハマダラカの吸血時に体内へ侵入したマラリア原虫が、肝細胞を経由して分裂小体（メロゾイト）として血液中に放出され、赤血球に侵入したことにより開始される、マラリア原虫の赤内型の生活環を示している。赤内型の生活環では輪状体（リングフォーム）、栄養体（トロポゾイト）、分裂体（シゾント）と順に発育し、シゾントが複数のメトゾイトに分裂する際に感染赤血球を破壊し、メロゾイトが赤血球外に放出され、血中に放出されたメロゾイトは新たな赤血球に侵入して、再び赤内型生活環を開始する。マラリア原虫はこのサイクルを繰り返すことにより増殖し、血中の赤血球を破壊し続ける。
リングフォームが侵入した赤血球には、１個の赤血球に１つのリングフォームが入り込んだもの（以下、「リングフォーム（シングル）」という）の他、１個の赤血球に２つ以上のリングフォームが侵入したもの（以下、「リングフォーム（マルチ）」という）がある。しかし、赤血球を溶血し、遊離したマラリア原虫を検出する方法では、リングフォーム（シングル）から遊離したマラリア原虫と、リングフォーム（マルチ）から遊離したマラリア原虫のうちの１つとは、同じ蛍光強度を示すので、これらを区別することができない。この結果、リングフォーム（マルチ）は、複数のリングフォーム（シングル）とみなされてしまう。また、シゾントが分裂直前にある場合にも、１つのシゾントが、溶血作用の影響で分裂してしまう場合、複数の赤血球から遊離したものであるとみなされてしまうことがある。
一方、従来の顕微鏡観察の方法では、複数のリングフォームが存在している場合やシゾントが分裂直前の成熟段階にある場合であっても、いずれの場合も感染赤血球１個とカウントして、感染率を算出していた。このため、赤血球を溶血し、遊離したマラリア原虫を検出して、マラリア原虫のＤＮＡ総量に対応する蛍光強度に基づく検出方法では、従来の顕微鏡観察の方法で算出される感染率に一致する感染率を求めることができない。特に、分裂直前のシゾントが溶血の影響で複数のメトゾイトに分裂してしまう現象や、熱帯熱マラリアの場合には、１つの赤血球に２つ、３つの原虫が感染したマルチ感染赤血球の割合が多い傾向にあることから、赤血球を溶血して得られる遊離原虫の頻度に着目する方法では、感染率を正確に把握できない。このことは、従来の顕微鏡観察に基づいて算出されていた感染率をもとに治療方法を選択決定していた医療現場では、熱帯熱マラリアであることを判別できても、これまでに経験的に確立されている治療方法を選択することが困難になるといった事態を意味する。
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡易、迅速に血液試料中のマラリア原虫を検出できる方法である。しかも熱帯熱マラリアと他のマラリアとを区別できるだけでなく、従来の顕微鏡観察に基づいて算出されていた感染率に匹敵する感染率を算出することができるマラリア感染赤血球の検出方法並びにこれに使用する検出用試薬及び赤血球膜部分溶解試薬を提供することにある。
本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、ｐＨ５〜７であり、浸透圧が２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、マラリア原虫を赤血球内部に保持した状態で蛍光色素が透過できるように、赤血球の細胞膜を部分的に溶解し、前記第一の界面活性剤がステアリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、前記第二の界面活性剤がラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、前記ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度は４０ｐｐｍ〜６００ｐｐｍであり、前記ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度は、５００ｐｐｍ〜１４００ｐｐｍである。
本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、実質的に赤血球の細胞膜を溶解しないノニオン界面活性剤をさらに含むことが好ましい。前記ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル型界面活性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル型界面活性剤、ポリオキシエチレンフィトステロール型界面活性剤、及びひまし油からなる群より選ばれることが好ましく、より好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノイソステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル、ポリオキシエチレン水素化ひまし油、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタノール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンセチルエーテル、およびポリオキシエチレンモノラウリン酸エステルからなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
本発明のマラリア感染赤血球検出用試薬は、マラリア原虫に感染した赤血球を検出するための試薬であって、上記本発明の赤血球膜部分溶解試薬と、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素とを含む。
前記ＤＮＡ選択的蛍光色素は、下式で示される蛍光色素であることが好ましい。
本発明のマラリア感染赤血球の検出方法は、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素を含み且つマラリア原虫を内部に保持した状態で前記蛍光色素が透過できるように赤血球の細胞膜を部分的に溶解することができる試薬と、マラリアに感染した赤血球を含む試料とを混合して、測定試料を調製する工程；前記測定試料に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び 前記散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリアに感染した赤血球を検出する工程を含むマラリア感染赤血球の検出方法であって、前記試薬は、前記赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、ｐＨ５〜７であり、浸透圧が２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、前記第一の界面活性剤がステアリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、前記第二の界面活性剤がラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、前記ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度は４０ｐｐｍ〜６００ｐｐｍであり、前記ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド濃度は５００ｐｐｍ〜１４００ｐｐｍである。
前記取得工程において、前記測定試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、前記フローセル内を流れる前記測定試料に前記蛍光色素の蛍光を励起する励起光を照射し、前記測定試料中の赤血球から散乱光情報及び蛍光情報を取得し、前記検出工程において、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、マラリアに感染した赤血球が含まれるマラリア感染赤血球領域を特定することが好ましい。マラリア感染赤血球領域を特定は、前記散乱光情報及び前記蛍光情報を二軸とする散布図を作成し、前記散布図中にマラリア感染赤血球領域を設定することにより行なえばよく、設定したマラリア感染赤血球領域内のマラリア感染赤血球を検出すればよい。
前記マラリア感染赤血球領域のうち、リングフォーム（シングル）を含む赤血球の領域及びリングフォーム（マルチ）を含む赤血球の領域を特定する工程をさらに含むことが好ましい。
また、本発明の検出方法において、前記マラリア感染赤血球領域に含まれる赤血球数（感染赤血球数Ｍ）を計数し、前記試料におけるマラリア感染赤血球の割合（感染率）を算出することが好ましく、感染率の算出は、（１）〜（３）のいずれかにより行なうことができる。
（１）前記試料の白血球濃度ＷＢＣと赤血球濃度ＲＢＣを求め、前記散布図の白血球領域にある白血球数Ｗを計数する工程をさらに含み、前記感染率（％）を、
Ｋ×（Ｍ×ＷＢＣ）／（Ｗ×ＲＢＣ）×１００（式中、Ｋは補正定数である）
により算出する。
Ｋ×（Ｍ×ＷＢＣ）／（Ｗ×ＲＢＣ）×１００（式中、Ｋは補正定数である）
により算出する。
（２）前記試料の赤血球濃度ＲＢＣ及び前記測定試料に供される前記試料の容積Ｖを測定する工程をさらに含み、前記感染率（％）を、
Ｋ×Ｍ／（ＲＢＣ×Ｖ）×１００（式中、Ｋは補正定数である）
により算出する。
Ｋ×Ｍ／（ＲＢＣ×Ｖ）×１００（式中、Ｋは補正定数である）
により算出する。
（３）前記散布図の正常赤血球領域にある赤血球数Ｇを計数する工程をさらに含み、
前記感染率（％）を、
Ｍ／（Ｇ＋Ｍ）×１００
により算出する。
前記感染率（％）を、
Ｍ／（Ｇ＋Ｍ）×１００
により算出する。
本発明の検出方法で用いられる前記試薬には、赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、前記第一の界面活性剤よりも溶解力の弱い第二の界面活性剤とが含有されていることが好ましい。
本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、赤血球の内部にマラリア原虫を保持したままで、蛍光色素を赤血球内へ透過させることができるので、この赤血球膜部分溶解試薬とＤＮＡ選択的蛍光色素とを含有する本発明の感染赤血球検出用試薬を用いれば、リングフォーム（マルチ）を含む赤血球とリングフォーム（シングル）を含む赤血球のように、ＤＮＡ総量が異なるマラリア感染赤血球を区別して検出することができる。
本発明のマラリア感染赤血球の検出方法は、赤血球の内部にマラリア原虫を保持したままで、蛍光色素を赤血球内へ透過させることができる試薬を用いてフローサイトメータに導入するので、リングフォーム（マルチ）を含む赤血球とリングフォーム（シングル）を含む赤血球とを区別して、マラリア原虫を検出することができる。
本発明のマラリア感染赤血球の検出方法は、ＤＮＡ総量が異なるマラリア感染赤血球を区別できるとともに、リングフォーム（マルチ）を１個の感染赤血球として検出することができるので、従来の顕微鏡観察の場合に求める感染率と同程度以上の精度で、感染率を求めることができる。
〔赤血球膜部分溶解試薬〕
はじめに、本発明のマラリア感染赤血球の検出方法に好適に用いられる、本発明の赤血球膜部分溶解試薬について説明する。
はじめに、本発明のマラリア感染赤血球の検出方法に好適に用いられる、本発明の赤血球膜部分溶解試薬について説明する。
本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、ｐＨ５〜７であり、浸透圧が２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏである。
前記第１の界面活性剤及び第２の界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤のいずれを用いることができるが、カチオン界面活性剤が好ましく用いられる。
カチオン界面活性剤としては、具体的には、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＯＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド（ＬＴＡＣ）、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＭＴＡＢ）、セチルピリジニウムクロライド（ＣＰＣ）、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド（ＳＴＡＣ）などを用いることができる。
界面活性剤の赤血球膜に対する溶解力は、主として、界面活性剤に含まれる炭素数に依存する。具体的には炭素数が大きくなる程、第４級アンモニウム塩の場合には直鎖アルキル基部分の炭素鎖が長くなる程に溶解力が強くなるが、常温で固形化しやすくなる。そこで、炭素数が小さい界面活性剤を赤血球膜部分溶解試薬に用いることにより、溶媒に対する赤血球膜部分溶解試薬の溶解度を高め、また赤血球膜への影響力を調整することができる。
従って、前記第一の界面活性剤及び前記第二の界面活性剤が長鎖アルキル基を有する四級アンモニウム塩の場合には、前記第二の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数を、前記第一の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数より少なくすることが好ましい。
従って、前記第一の界面活性剤及び前記第二の界面活性剤が長鎖アルキル基を有する四級アンモニウム塩の場合には、前記第二の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数を、前記第一の界面活性剤の長鎖アルキル基の炭素数より少なくすることが好ましい。
具体的には、前記第一の界面活性剤が、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド（ＳＴＡＣ）であり、前記第二の界面活性剤が、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド（ＬＴＡＣ）である組合わせが好ましく用いられる。
第１界面活性剤と第２界面活性剤の組み合わせ及び試薬におけるこれらの界面活性剤の各濃度は、具体的に組み合わせて、蛍光色素が赤血球内に透過でき且つ赤血球の形状を維持できる程度に赤血球膜が溶解されているように選択する。例えば、炭素数２１（最も長いアルキル基が１８炭素鎖）のＳＴＡＣと炭素数１５（最も長いアルキル基が１２炭素鎖）のＬＴＡＣの組み合わせの場合には、ＳＴＡＣ４０〜６００ｐｐｍとＬＴＡＣ５００〜１４００ｐｐｍの範囲で混合した条件が好ましく用いられる。
本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、ｐＨを５〜７に保つために緩衝剤を含有することができる。このようなｐＨ範囲を保つことにより、マラリア原虫を赤血球内部に保持した状態で蛍光色素が透過できるように、赤血球の細胞膜を部分的に溶解することができる。
前記緩衝剤としては、クエン酸、リン酸、コハク酸、トリシンなどを用いることができる。ｐＨを調節するために、塩酸や水酸化ナトリウム等をｐＨ調節剤として添加してもよい。
さらに、本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、浸透圧を２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの範囲に保つために、浸透圧調節剤が含有されていることが好ましい。浸透圧２００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ未満では、試薬又は血液中の液体成分が赤血球内に取り込まれて、膨張する傾向にあり、赤血球の低張溶解が生じる可能性がある。３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ超ではマラリア原虫検出のための後述の蛍光色素が赤血球内に進入しにくくなり、また赤血球の収縮による構造変化が生じる可能性がある。
浸透圧調節剤としては、塩化ナトリウム等のアルカリ金属ハロゲン化物や塩化マグネシウム等のアルカリ土類ハロゲン化物、プロピオン酸等のカルボン酸金属塩、グルコース、マンノース等の糖類が好ましく用いられる。
さらに、必要に応じて、２−ピリジルチオ−１−オキシドナトリウムやβ−フェネチルアルコール等の防腐剤を含有してもよい。
また、ｐＨ、浸透圧に影響を与えない範囲で、濃度調整のために、精製水、エタノールなどで希釈されていてもよい。
本発明の赤血球膜部分溶解試薬には、さらに、実質的に赤血球の細胞膜を溶解しないノニオン界面活性剤を含むことが好ましい。これにより、マラリア感染赤血球を、マラリア原虫の生育段階に応じてより的確に分類できるようになる。
ノニオン界面活性剤としては、具体的には、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノイソステアリン酸エステル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレイン酸エステル等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレン（３０）水素化ひまし油、ポリオキシエチレン（５０）水素化ひまし油等のひまし油；ポリオキシエチレン（２０）フィトステロール（以下、「ＰＯＥ（２０）フィトステロール」と略記する）、ポリオキシエチレン（２５）フィトスタノール（以下、「ＰＯＥ（２５）フィトスタノール」と略記する）等のポリオキシエチレンフィトステロール類；ポリオキシエチレン（２１）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類；ポリオキシエチレン（２０）・ポリオキシプロピレン（６）デシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（８）セチルエーテル等のポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンアルキルエーテル類；ポリオキシエチレン（１０）モノラウリン酸エステル等のポリオキシエチレン脂肪酸エステルなどが好ましく用いられる。尚、ポリオキシエチレンの（ ）内の数値は、ポリエチレン鎖部分の炭素数を示している。
試薬中のノニオン界面活性剤の濃度は、１００〜５０００ｐｐｍであることが好ましく、５００〜３０００ｐｐｍであることがより好ましい。
〔検出用試薬〕
本発明のマラリア感染赤血球検出用試薬は、上記本発明の赤血球膜部分溶解試薬とＤＮＡ選択的蛍光色素、好ましくはＤＮＡ選択的ビスベンズイミド系蛍光色素を含有する。
ＤＮＡ選択的蛍光色素とは、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色する蛍光色素で、ＤＮＡ選択的ビスベンズイミド系蛍光色素とは骨格がビスイミド系のものである。
本発明のマラリア感染赤血球検出用試薬は、上記本発明の赤血球膜部分溶解試薬とＤＮＡ選択的蛍光色素、好ましくはＤＮＡ選択的ビスベンズイミド系蛍光色素を含有する。
ＤＮＡ選択的蛍光色素とは、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色する蛍光色素で、ＤＮＡ選択的ビスベンズイミド系蛍光色素とは骨格がビスイミド系のものである。
このような色素としては、例えば、下記式のような構造を有する色素（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のヘキスト３４５８０）が好ましく用いられる。
ＤＮＡ選択的ビスベンズイミド系蛍光色素には、上記色素の他、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２が挙げられる。これらの色素は、ヘキスト３４５８０と側鎖が異なるが、青色波長（４０５ｎｍ）で励起可能である。
赤血球には核がないので、ＤＮＡ選択的蛍光色素によって染色されることがない。一方、マラリア感染赤血球は、赤血球内に進入したマラリア原虫のＤＮＡが染色される。従って、感染赤血球は、ＤＮＡ選択的蛍光色素によって染色されるのに対し、非感染赤血球では染色されないので、後述するフローサイトメータで得られるスキャッタグラムにおける蛍光強度の差違に基づいて、両者を判別することができる。
従来用いられていた核酸蛍光色素では、ＲＮＡが残存している網状赤血球も染色されてしまうので、スキャッタグラムでは、感染赤血球が現れる領域に、網状赤血球に相当するドットも現れることになるため、感染赤血球が現れる領域に、網状赤血球が含まれることになる。網状赤血球は、通常、赤血球の１％ぐらい存在する一方、感染率も通常１％程度であることから、網状赤血球を感染赤血球と間違えてしまうおそれがあり、検出感度の低下、感染率算出の精度低下の原因となる。
この点、本発明の検出用試薬では、ＤＮＡ選択的蛍光色素を用いているので、スキャッタグラムにおいて網状赤血球は正常赤血球と同様の領域に現れることになり、網状赤血球に起因する感染率の精度低下を防止することができる。
本発明の検出用試薬は、上記ＤＮＡ選択的蛍光色素と上記赤血球膜部分溶解試薬とを含む１液タイプの試薬であってもよいし、ＤＮＡ選択的蛍光色素と赤血球膜部分溶解試薬とを別々の容器に収容した試薬キットとしてもよい。試薬キットとして用いる場合、測定前に試料とこれらの試薬とを混合して使用することができる。ＤＮＡ選択的蛍光色素には、溶媒として、エチレングリコール等のアルコール、精製水、緩衝剤などが含まれていてもよい。
〔マラリア原虫感染赤血球の検出方法〕
本発明のマラリア原虫感染赤血球の検出方法は、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素を含み且つマラリア原虫を内部に保持した状態で前記蛍光色素が透過できるように赤血球の細胞膜を部分的に溶解することができる試薬と、マラリアに感染した赤血球を含む試料とを混合して、測定試料を調製する工程；前記測定試料に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；並びに前記散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリアに感染した赤血球を検出する工程を含む。
本発明のマラリア原虫感染赤血球の検出方法は、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素を含み且つマラリア原虫を内部に保持した状態で前記蛍光色素が透過できるように赤血球の細胞膜を部分的に溶解することができる試薬と、マラリアに感染した赤血球を含む試料とを混合して、測定試料を調製する工程；前記測定試料に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；並びに前記散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリアに感染した赤血球を検出する工程を含む。
上記測定試料調製工程は、所定の対象者から採取された全血検体を、上記本発明のマラリア原虫の検出用試薬と混合して測定試料を調製する工程である。測定試料の調製工程では、試料中のマラリアに感染した赤血球の細胞膜を、マラリア原虫を内部に保持でき且つ蛍光色素が透過できるように部分的に溶解し、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素を用いて前記マラリア原虫のＤＮＡを蛍光染色する。具体的には、測定試料は、全血検体と検出用試薬を混合後、通常、例えば４０秒間インキュベートすることによって測定試料が調製される。インキュベートの間に、血液中のＤＮＡを有する細胞が染色されることから、全血検体では、白血球及びマラリア感染赤血球が染色されることになる。
ここで、感染赤血球には、図１に示すマラリア原虫の生活環に示すリングフォーム、トロポゾイト、又はシゾントが含まれることになる。また、リングフォームを含む感染赤血球には、１個の赤血球に１つのマラリア原虫が入り込んだリングフォーム（シングル）の他、２つ以上のマラリア原虫が侵入したリングフォーム（マルチ）がある。このような赤血球内生活環を示すマラリア原虫を含む赤血球は、マラリア原虫の成育段階によってＤＮＡの総量が異なるので、それぞれ異なった蛍光強度を示す。また、リングフォーム（シングル）とリングフォーム（マルチ）もそれぞれ異なる量のＤＮＡを有しているため、異なった蛍光強度を示す。
また、リングフォーム、トロポゾイド、シゾントとマラリア原虫が成育するに従って感染赤血球のサイズが大きくなるので、それぞれ異なった散乱光強度を示す。以上より、ＤＮＡ量を反映する蛍光強度と、細胞サイズを反映する散乱光強度とに基づいてマラリア原虫感染赤血球をマラリア原虫の成育段階毎に分類することが可能である。
また、リングフォーム、トロポゾイド、シゾントとマラリア原虫が成育するに従って感染赤血球のサイズが大きくなるので、それぞれ異なった散乱光強度を示す。以上より、ＤＮＡ量を反映する蛍光強度と、細胞サイズを反映する散乱光強度とに基づいてマラリア原虫感染赤血球をマラリア原虫の成育段階毎に分類することが可能である。
測定試料からの散乱光情報及び蛍光情報の取得は、測定試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、前記フローセル内を流れる前記測定試料に前記蛍光色素の蛍光を励起する励起光を照射することにより行なうことが好ましい。また、取得した散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリア感染赤血球を検出する工程は、散乱光強度と蛍光強度とを二軸とする散布図を作成し、マラリア感染赤血球が含まれる領域を特定することにより行なうことが好ましい。特定した感染赤血球領域内の細胞数を計数することにより、感染率を知ることができる。さらに、領域の特定について、マラリア原虫の成育段階毎に感染赤血球を細分類し、それぞれの生育段階のマラリア原虫が感染した赤血球が出現する領域を特定して、各領域内の細胞数を計数してもよい。
図２に示す散布図の具体例に基づいて、説明する。図２は、熱帯熱マラリアの血液検体を含んでいる測定試料をフローセルに導入し、フローセル内を流れる前記測定試料に、検出用試薬に含まれる蛍光色素を励起する励起光を照射し、測定試料から発せられる散乱光と蛍光を検出し、散乱光強度（縦軸）と蛍光強度（横軸）を２軸として作成された散布図である。
図２において、マラリアに感染していない赤血球は、蛍光強度の低い領域に出現し、リングフォーム、トロポゾイド、シゾントとマラリア原虫が生育するに従って蛍光強度が大きい領域、さらにはサイズ（散乱光強度）が大きい領域に出現する。リングフォームについては、サイズ（散乱光強度）は同等のままで、シングルよりもダブル、マルチのものが蛍光強度の大きい方に出現することになる。また、白血球はそのサイズ及びＤＮＡ量から、蛍光強度及び散乱光強度いずれも大きい領域に出現する。
このような領域に存在する細胞を特定するために、スキャッタグラムを各領域のゲートで区切る。測定試料のフローサイトメータにかけて、得られた二次元散布図において、感染赤血球のゲート領域内のドットの有無に基づいて、マラリアに感染しているかどうかを判断することができる。
さらに、感染赤血球のゲート領域のうち、リングフォーム（マルチ）に存在するドットが多い場合には、熱帯熱マラリアと判断することができる。熱帯熱マラリアは他のマラリアと比べて、リングフォーム（マルチ）が多い傾向にあることが経験的に知られていることに基づく。
またさらに、感染赤血球ゲート領域、後述する感染率の算出方法に応じて非感染赤血球ゲート領域、白血球ゲート領域に存在するドット数を計数し、感染率を算出することができる。
本発明のマラリア原虫の検出方法では、感染赤血球を溶血して遊離したマラリア原虫に基づいて検出するのではなく、感染赤血球の形態を保持したままで、フローサイトメータにかけるので、作成した散布図において、マラリア生育段階を把握することができる。従って、感染した原虫の生育状態や感染した原虫の数に依存せず、それぞれ感染赤血球１個と計数するため、顕微鏡観察のときに匹敵する感染率を求めることができる。
〔感染率の算出方法〕
感染率は以下の方法Ａ〜Ｃのいずれかにより求められる。
方法Ａ：白血球濃度と赤血球濃度の比率を利用する方法
方法Ａは、予め検体の赤血球濃度ＲＢＣと白血球濃度ＷＢＣを測定しておき、その比率を利用して、フローサイトメータで作成したスキャッタグラムに基づいて感染率を求める方法である。
感染率は以下の方法Ａ〜Ｃのいずれかにより求められる。
方法Ａ：白血球濃度と赤血球濃度の比率を利用する方法
方法Ａは、予め検体の赤血球濃度ＲＢＣと白血球濃度ＷＢＣを測定しておき、その比率を利用して、フローサイトメータで作成したスキャッタグラムに基づいて感染率を求める方法である。
まず、対象となる検体を血球計数器（例えば既存のシスメックス社のＸＥ−２１００など）で測定し、白血球濃度ＷＢＣ（／μL)、赤血球濃度ＲＢＣ（／μL)を求める。
一方、本発明によるゲートで各細胞領域を区切ったスキャッタグラム（図３）から、各細胞領域内のドットを計数して、白血球粒子数（Ｗ１ゲート内ドット数）Ｗ、マラリア感染赤血球数（Ｍ１ゲート領域内ドット数）Ｍを求める。
一方、本発明によるゲートで各細胞領域を区切ったスキャッタグラム（図３）から、各細胞領域内のドットを計数して、白血球粒子数（Ｗ１ゲート内ドット数）Ｗ、マラリア感染赤血球数（Ｍ１ゲート領域内ドット数）Ｍを求める。
さらに、上記で求めたＷＢＣとＲＢＣの比率及び白血球数Ｗから、式１により測定試料に含まれる赤血球数ｘを求める。
ｘ = (Ｗ×ＲＢＣ)／ＷＢＣ （式１）
赤血球数ｘと上記で得られた感染赤血球数Ｍから、感染率Ｒａｔｉｏを式２に基づいて算出する。式中、Ｋは、測定装置内部での損失等を考慮して決定される補正定数である。
Ｒａｔｉｏ= Ｋ×Ｍ／ｘ×１００ （式２）
式１及び式２から、あるいは直接、式３により感染率を求めることができる。
Ｒａｔｉｏ＝Ｋ×(Ｍ×ＷＢＣ)／（Ｗ×ＲＢＣ）×１００ （式３）
ｘ = (Ｗ×ＲＢＣ)／ＷＢＣ （式１）
赤血球数ｘと上記で得られた感染赤血球数Ｍから、感染率Ｒａｔｉｏを式２に基づいて算出する。式中、Ｋは、測定装置内部での損失等を考慮して決定される補正定数である。
Ｒａｔｉｏ= Ｋ×Ｍ／ｘ×１００ （式２）
式１及び式２から、あるいは直接、式３により感染率を求めることができる。
Ｒａｔｉｏ＝Ｋ×(Ｍ×ＷＢＣ)／（Ｗ×ＲＢＣ）×１００ （式３）
同様にして、スキャッタグラムから、所定の生育段階にあるマラリア原虫を含む赤血球の数、すなわちリングフォーム（シングル）を含む赤血球の数（Ｒ１ゲート内ドット数）Ｒ１、シングルフォーム（マルチ）を含む赤血球の数（Ｒ２ゲート内ドット数）Ｒ２、トロポゾイトを含む赤血球の数（Ｔゲート内ドット数）Ｔ、シゾントを含む赤血球の数（Ｓゲート内ドット数）Ｓを計数し、赤血球中の各生育段階の感染率を求めることができる。
Ｍｒ：マラリア感染ＲＢＣに占めるリングフォームを含む赤血球の比率 (%)
Ｍｒ＝（Ｒ１＋Ｒ２）／Ｍ×１００
Ｍｔ：マラリア感染ＲＢＣに占めるトロポゾイトを含む赤血球の比率 (%)
Ｍｔ＝Ｔ／Ｍ×１００
Ｍｓ：マラリア感染ＲＢＣに占めるシゾントを含む赤血球の比率 (%)
Ｍｓ＝Ｓ／Ｍ×１００
さらに、リングフォーム（Ｒ１＋Ｒ２）を含む赤血球（Ｒ１＋Ｒ２）のうちのリングフォーム（マルチ）の割合Ｍｒｍ（％）は、下記式４により算出できる。
Ｍｒｍ＝Ｒ２／（Ｒ１＋Ｒ２）×１００ （式４）
Ｍｒ＝（Ｒ１＋Ｒ２）／Ｍ×１００
Ｍｔ：マラリア感染ＲＢＣに占めるトロポゾイトを含む赤血球の比率 (%)
Ｍｔ＝Ｔ／Ｍ×１００
Ｍｓ：マラリア感染ＲＢＣに占めるシゾントを含む赤血球の比率 (%)
Ｍｓ＝Ｓ／Ｍ×１００
さらに、リングフォーム（Ｒ１＋Ｒ２）を含む赤血球（Ｒ１＋Ｒ２）のうちのリングフォーム（マルチ）の割合Ｍｒｍ（％）は、下記式４により算出できる。
Ｍｒｍ＝Ｒ２／（Ｒ１＋Ｒ２）×１００ （式４）
方法Ｂ：絶対的定量法
予め、検体の赤血球濃度ＲＢＣを測定し、測定試料の調製に使用する検体の容積から測定試料中に含まれる赤血球数を算出して、図３のスキャッタグラムから計数される感染赤血球数との割合を求める方法である。
予め、検体の赤血球濃度ＲＢＣを測定し、測定試料の調製に使用する検体の容積から測定試料中に含まれる赤血球数を算出して、図３のスキャッタグラムから計数される感染赤血球数との割合を求める方法である。
方法Ａと同様にして、赤血球濃度ＲＢＣを測定し、次いで本発明によるスキャッタグラム及び特定した測定領域に基づいて、感染赤血球数Ｍを求め、測定試料の調製に供した検体容積Ｖ（μＬ）とから、下式５により、感染率Ｒａｔｉｏを求める。
Ｒａｔｉｏ＝Ｋ×Ｍ／（ＲＢＣ×Ｖ）×１００ （式５）
Ｒａｔｉｏ＝Ｋ×Ｍ／（ＲＢＣ×Ｖ）×１００ （式５）
また、各生育段階の感染率を求める場合には、方法Ａと同様にして、スキャッタグラムから、所定の生育段階にあるマラリア原虫を含む赤血球、すなわちリングフォーム（シングル）を含む赤血球の数Ｒ１、リングフォーム（マルチ）を含む赤血球の数Ｒ２、トロポゾイトを含む赤血球の数Ｔ、シゾントを含む赤血球の数Ｓを計数し、方法Ａで示した、各生育段階の感染率を求める式を用いて、各生育段階の感染率を求めることができる。リングフォームを含む赤血球のうちのリングフォーム（マルチ）の割合Ｍｒｍ（％）も、上記式４により同様にして求めることができる。
この方法では、方法Ａと比べて白血球濃度を測定しなくてもよいというメリットがあるが、測定試料に供するサンプル量を正確に計量する必要がある。
方法Ｃ：赤血球カウント法
測定試料中の赤血球数と感染赤血球数を計数し、それから感染率を算出する方法である。
測定試料中の赤血球数と感染赤血球数を計数し、それから感染率を算出する方法である。
図３のスキャッタグラムから、非感染赤血球数（ＧＨＯゲート領域内ドット数）Ｇ、感染赤血球数（Ｍ１ゲート内ドット数）Ｍを計数して、式６によりマラリア感染率Ｒａｔｉｏを求める。
Ｒａｔｉｏ＝Ｍ／（Ｇ＋Ｍ）×１００ （式６）
Ｒａｔｉｏ＝Ｍ／（Ｇ＋Ｍ）×１００ （式６）
各生育段階の感染率を求める場合には、方法Ａと同様にして、各生育段階のドット数を計数し、方法Ａで示した式により算出すればよい。また、リングフォームを含む赤血球のうちのリングフォーム（マルチ）の割合Ｍｒｍ（％）も、上記式４により同様にして求めることができる。
〔フローサイトメータ〕
本発明の検出方法で使用するフローサイトメータは、特に限定しないが、例えば特開２００４−１０５０２７に開示されている装置、すなわち、測定試料を導入するためのフローセルと、フローセル内を流れる測定試料中の細胞に励起光を照射するための光源；励起光を照射された前記細胞より発せられる散乱光強度を検出するための第１の検出器；励起光を照射された前記細胞より発せられる蛍光光強度を検出するための第２の検出器；散乱光強度と蛍光強度を二軸とする散布図を作成し、前記散布図上でマラリア非感染赤血球領域及び感染赤血球領域を特定し、計数する解析部；を備えた装置を用いることができる。
本発明の検出方法で使用するフローサイトメータは、特に限定しないが、例えば特開２００４−１０５０２７に開示されている装置、すなわち、測定試料を導入するためのフローセルと、フローセル内を流れる測定試料中の細胞に励起光を照射するための光源；励起光を照射された前記細胞より発せられる散乱光強度を検出するための第１の検出器；励起光を照射された前記細胞より発せられる蛍光光強度を検出するための第２の検出器；散乱光強度と蛍光強度を二軸とする散布図を作成し、前記散布図上でマラリア非感染赤血球領域及び感染赤血球領域を特定し、計数する解析部；を備えた装置を用いることができる。
図４は、本発明で使用されるフローサイトメータの光学系の一例である。
図４において、励起光源（例えば青色レーザダイオード：波長４０５ｎｍ）２１から出射されたビームは、コリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。ノズル６から吐出されたオリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は集光レンズ２４とピンホール板２５を介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２９とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。また、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２９とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２，３３，３４により増幅され、解析部３５に入力される。
図４において、励起光源（例えば青色レーザダイオード：波長４０５ｎｍ）２１から出射されたビームは、コリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。ノズル６から吐出されたオリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は集光レンズ２４とピンホール板２５を介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２９とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。また、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルタ２９とピンホール板３０を介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２，３３，３４により増幅され、解析部３５に入力される。
ここで、解析部３５は、入力された前方散乱光信号及び側方蛍光信号からそれぞれ前方蛍光強度及び蛍光強度を算出し、前方散乱光強度及び蛍光強度をそれぞれパラメータとする二次元散布図（スキャッタグラム）を作成して、図示しない表示部に表示させるとともに、その二次元散布図に設定される任意の領域内のドット数（粒子数）を計数し、所望の演算を行ない、計数結果や演算結果を表示部に表示させる。
さらに、フローサイトメータにＣＣＤカメラ及び画像解析部が備えられていることが好ましい。本発明の検出方法では、赤血球の形状が維持された状態でフローサイトメータに導入することから、感染赤血球の画像を表示解析することにより、リングフォーム（マルチ）の存在、リングフォーム（シングル）とリングフォーム（マルチ）の差違、トロポゾイドを含む赤血球、シゾントを含む赤血球などの形態を、画像で区別することが可能である。
尚、上記実施形態では、リングフォーム（シングル）の領域及びリングフォーム（マルチ）の領域を特定しているが、これらのうちの何れか一方の領域のみを特定してもよい。
尚、上記実施形態では、リングフォーム（シングル）の領域及びリングフォーム（マルチ）の領域を特定しているが、これらのうちの何れか一方の領域のみを特定してもよい。
〔検出用試薬〕
１：界面活性剤濃度について
表１に示す組成を有する赤血球膜部分溶解試薬において、界面活性剤の濃度を表２に示すように変え、塩酸量によりいずれもｐＨ６．１に調整した試薬Ｎｏ．１〜５を調製した。検体ａ（ヒト全血）、検体ｂ（ヒト全血に培養マラリア原虫を添加）それぞれ２０μｌに、色素としてヘキスト３４５８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：励起波長３９２ｎｍ、蛍光波長４９８ｎｍ）をエチレングリコールで溶解した色素液（０．５ｍｇ／ｍｌ）２μｌと、前記試薬Ｎｏ．１〜５を１ｍｌ添加し、４０℃、４０秒間混合して、測定試料とした。この測定試料を、光源として青半導体レーザ（波長４０５ｎｍ）を用いたフローサイトメータにかけて測定した。
１：界面活性剤濃度について
表１に示す組成を有する赤血球膜部分溶解試薬において、界面活性剤の濃度を表２に示すように変え、塩酸量によりいずれもｐＨ６．１に調整した試薬Ｎｏ．１〜５を調製した。検体ａ（ヒト全血）、検体ｂ（ヒト全血に培養マラリア原虫を添加）それぞれ２０μｌに、色素としてヘキスト３４５８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社：励起波長３９２ｎｍ、蛍光波長４９８ｎｍ）をエチレングリコールで溶解した色素液（０．５ｍｇ／ｍｌ）２μｌと、前記試薬Ｎｏ．１〜５を１ｍｌ添加し、４０℃、４０秒間混合して、測定試料とした。この測定試料を、光源として青半導体レーザ（波長４０５ｎｍ）を用いたフローサイトメータにかけて測定した。
各試薬Ｎｏ．１〜５について、各検体ａ、ｂで得られたスキャッタグラムを、それぞれ図５〜図９に示す。各図において、（ａ）は検体ａ、（ｂ）は検体ｂのスキャッタグラムである。また、図中、ＧＨＯゲート領域は、非感染赤血球の領域であり、Ｗ１ゲート領域は白血球の領域であり、Ｍ１は感染赤血球の領域である。
図５〜図９からわかるように、低濃度の界面活性剤１種類で、マラリア感染赤血球を検出できた。しかし、界面活性剤を１種類しか含まない試薬（Ｎｏ．１，２）を用いた場合では、非感染赤血球の一部がマラリア感染赤血球球領域（Ｍ１）に入り込むため、より低感染率の検体におけるマラリア感染赤血球の検出が困難である。一方、２種類の界面活性剤を含有させた試薬（Ｎｏ．３〜５）では、図７のようにマラリア感染赤血球、非感染赤血球、白血球がそれぞれの領域にゲーティングされる場合もあったが、図８及び図９に示されるように、マラリア感染赤血球の一部が非感染赤血球領域（ＧＨＯ）に入り込むことがあった。従って、精度の高い感染率算出のためには、界面活性剤を２種類以上混合し、個々の濃度のバランスをとった赤血球膜部分溶解試薬を用いる必要がある。
２：試薬ｐＨについて
表１に示す組成を有する赤血球膜部分溶解試薬において、界面活性剤としてＳＴＡＣ９０ｐｐｍ、ＬＴＡＣ９００ｐｐｍを含み、さらに塩酸量を変えることにより、表３に示すように、ｐＨを調節した試薬Ｎｏ．１１〜１３を調製した。検体ａ（ヒト全血）、検体ｂ（ヒト全血に培養マラリア原虫を添加）それぞれ２０μｌに、上記１で用いた蛍光色素（ヘキスト３４５８０）液２μｌと、前記試薬Ｎｏ．１１〜１３を１ｍｌ添加し、４０℃、４０秒間混合して、測定試料とした。この測定試料を、光源として青半導体レーザを用いたフローサイトメータにかけて測定した。
表１に示す組成を有する赤血球膜部分溶解試薬において、界面活性剤としてＳＴＡＣ９０ｐｐｍ、ＬＴＡＣ９００ｐｐｍを含み、さらに塩酸量を変えることにより、表３に示すように、ｐＨを調節した試薬Ｎｏ．１１〜１３を調製した。検体ａ（ヒト全血）、検体ｂ（ヒト全血に培養マラリア原虫を添加）それぞれ２０μｌに、上記１で用いた蛍光色素（ヘキスト３４５８０）液２μｌと、前記試薬Ｎｏ．１１〜１３を１ｍｌ添加し、４０℃、４０秒間混合して、測定試料とした。この測定試料を、光源として青半導体レーザを用いたフローサイトメータにかけて測定した。
各試薬Ｎｏ．１１〜１３について、各検体ａ、ｂで得られたスキャッタグラムを図１０〜図１２に示す。各図において、（ａ）は検体ａ、（ｂ）は検体ｂのスキャッタグラムである。また、図中、ＧＨＯゲート領域は、非感染赤血球の領域であり、Ｗ１ゲート領域は白血球の領域であり、Ｍ１は感染赤血球の領域である。
図１０〜１２の比較からわかるように、検体ｂについて、ＧＨＯ領域と区別して、Ｍ１領域に現れるようにするためには、試薬Ｎｏ．１２でなければならないことがわかる。
３．試薬の浸透圧について
浸透圧は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＡｄｖａｎｃｅｄ ３Ｄ３ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（凝固点降下法）で測定した。
浸透圧は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＡｄｖａｎｃｅｄ ３Ｄ３ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（凝固点降下法）で測定した。
表１に示す組成を有する赤血球膜部分溶解試薬（界面活性剤としてＳＴＡＣ９０ｐｐｍ、ＬＴＡＣ９００ｐｐｍ、ｐＨ６．１）に、塩化ナトリウムの量を変えて混合することにより、表４に示すように浸透圧を変えた試薬Ｎｏ．２１〜２３を調製した。検体ａ（ヒト全血）、検体ｂ（ヒト全血に培養マラリア原虫を添加）それぞれ２０μｌに、上記１で用いたヘキスト３４５８０色素液２μｌと、前記試薬Ｎｏ．２１〜２３を１ｍｌ添加し、４０℃、４０秒間混合して、測定試料とした。この測定試料を、光源として青色半導体レーザを用いたフローサイトメータにかけて測定した。
各試薬Ｎｏ．２１〜２３について、各検体ａ、ｂで得られたスキャッタグラムを図１３〜図１５に示す。各図において、（ａ）は検体ａ、（ｂ）は検体ｂのスキャッタグラムである。また、図中、ＧＨＯゲート領域は、非感染赤血球の領域であり、Ｗ１ゲート領域は白血球の領域であり、Ｍ１は感染赤血球の領域である。
図１３〜１５との比較からわかるように、検体ｂについて、ＧＨＯ領域と区別して、ＭＩ領域に現れるようにするためには、試薬Ｎｏ．２２でなければならないことがわかる。
〔多重感染マラリア赤血球の検出〕
実施例１：
表１に示す組成において、界面活性剤としてＳＴＡＣ９０ｐｐｍ及びＬＴＡＣ９００ｐｐｍを含有する赤血球膜部分溶解試薬（ｐＨ６．１、浸透圧２５６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ）１ｍｌと、上記で用いたヘキスト３４５８０色素液２μｌを混合して、検出用試薬を調製した。
実施例１：
表１に示す組成において、界面活性剤としてＳＴＡＣ９０ｐｐｍ及びＬＴＡＣ９００ｐｐｍを含有する赤血球膜部分溶解試薬（ｐＨ６．１、浸透圧２５６ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ）１ｍｌと、上記で用いたヘキスト３４５８０色素液２μｌを混合して、検出用試薬を調製した。
ヒト全血に培養マラリア２０μｌを、４０℃、４０秒間混合した検体に、上記検出用試薬を混合して、測定試料とした。
この測定試料について、位相顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察したところ、マラリア感染赤血球の形状が保持されたリングフォーム（シングル）及びリングフォーム（マルチ）が認められた。それぞれの顕微鏡写真を図１６及び図１７に示す。
次に、この測定試料を、光源として青色半導体レーザを用いたフローサイトメータにかけて、横軸：蛍光強度、縦軸：散乱光強度とするスキャッタグラム作成し、図１８に示すように各領域を特定した。Ｒ１ゲート領域（リングフォーム(シングル））、Ｒ２ゲート領域（リングフォーム(マルチ））のドット数を計数し、リングフォーム全体に示すリングフォーム(マルチ）の割合（Ｒ２／（Ｒ１＋Ｒ２））を求めた。
同じマラリア感染検体について、塗抹標本を作製し、ギムザ染色を行ない、顕微鏡観察した。それぞれ２回ずつリングフォーム(シングル）及びリングフォーム(マルチ）をカウントして平均値を算出し、リングフォーム全体に示すリングフォーム(マルチ）の割合（Ｒ２／（Ｒ１＋Ｒ２））を求めた。
スキャッタグラムに基づく計数結果及び顕微鏡観察に基づくカウント結果を、それぞれ表５に示す。
表５からわかるように、リングフォーム全体に示すリングフォーム(マルチ）の割合は、本発明の方法では１８．６％であり、従来の顕微鏡観察の方法では１９．２％であった。フローサイトメータを用いる本発明の測定方法で領域を特定して計数することにより、顕微鏡観察で形態を確認しつつカウントする場合と同程度の精度で、リングフォーム(マルチ）の割合を求めることが可能であることが確認できた。
実施例２〜４：
表１に示す組成において、界面活性剤としてＳＴＡＣ２８１ｐｐｍ、ＬＴＡＣ９２４ｐｐｍを含有する赤血球膜部分溶解試薬（実施例２）、実施例２の試薬にさらにＰＯＥ（２０）フィトステロールを５００ｐｐｍ含有させた赤血球膜部分溶解試薬（実施例３）、及び実施例２の試薬にさらにＰＯＥ（２５）フィトスタノールを５００ｐｐｍ含有させた赤血球膜部分溶解試薬（実施例４）を調製した。実施例２〜４の赤血球膜部分溶解試薬のｐＨは６．１、浸透圧は２５７ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであった。これらの試薬のいずれか１ｍｌと、上記で用いたヘキスト３４５８０色素液２μｌを混合して、検出用試薬を調製した。
表１に示す組成において、界面活性剤としてＳＴＡＣ２８１ｐｐｍ、ＬＴＡＣ９２４ｐｐｍを含有する赤血球膜部分溶解試薬（実施例２）、実施例２の試薬にさらにＰＯＥ（２０）フィトステロールを５００ｐｐｍ含有させた赤血球膜部分溶解試薬（実施例３）、及び実施例２の試薬にさらにＰＯＥ（２５）フィトスタノールを５００ｐｐｍ含有させた赤血球膜部分溶解試薬（実施例４）を調製した。実施例２〜４の赤血球膜部分溶解試薬のｐＨは６．１、浸透圧は２５７ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであった。これらの試薬のいずれか１ｍｌと、上記で用いたヘキスト３４５８０色素液２μｌを混合して、検出用試薬を調製した。
測定試料として、三日熱マラリアに感染した患者から採取した検体（三日熱マラリア感染検体）を用いた。
次に、この測定試料を上記検出用試薬と混合した後、光源として青色半導体レーザを用いたフローサイトメータに導入し、横軸：蛍光強度、縦軸：散乱光強度とするスキャッタグラムを作成した。実施例２〜４の試薬を用いた際のスキャッタグラムを、それぞれ図１９〜２１に示す。そして、このスキャッタグラムに基づいて、上記の方法Ａを使用して、マラリア粒子のカウント数およびマラリア感染率を求めた。なお、方法Ａによる感染率の算出に用いられる補正定数Ｋは１である。これらの結果を表６に示す。また、同じ検体について塗抹標本を作製し、ギムザ染色を行ない、顕微鏡観察（目視）により算出した感染率の結果も、あわせて表６に示す。
次に、この測定試料を上記検出用試薬と混合した後、光源として青色半導体レーザを用いたフローサイトメータに導入し、横軸：蛍光強度、縦軸：散乱光強度とするスキャッタグラムを作成した。実施例２〜４の試薬を用いた際のスキャッタグラムを、それぞれ図１９〜２１に示す。そして、このスキャッタグラムに基づいて、上記の方法Ａを使用して、マラリア粒子のカウント数およびマラリア感染率を求めた。なお、方法Ａによる感染率の算出に用いられる補正定数Ｋは１である。これらの結果を表６に示す。また、同じ検体について塗抹標本を作製し、ギムザ染色を行ない、顕微鏡観察（目視）により算出した感染率の結果も、あわせて表６に示す。
表６に示すように、算出されたマラリア感染率は、実施例２の試薬を用いた場合には０．３１％であり、実施例３の試薬を用いた場合には０．２９％、実施例４の試薬を用いた場合には０．２８％であり、従来の顕微鏡観察（目視）の方法では０．２８％であった。本発明の検出試薬（実施例２〜４）を用いて測定試料を調製し、フローサイトメータを利用して算出された感染率は、顕微鏡観察で形態を確認しつつカウントすることにより求められた感染率と、同程度の精度を有することが確認できた。また、ノニオン界面活性剤を添加した試薬（実施例３、４）を用いることにより、スキャッタグラム上で各生育段階のマラリア感染赤血球の集団をより明確に識別することができ、生育段階毎のマラリア感染赤血球の分類性能が向上することが確認できた。
本発明の赤血球膜部分溶解試薬は、赤血球の形状を保持したままフローサイトメータに適用できる測定試料を調製できるので、細胞の蛍光強度に基づく分布だけでなく、赤血球の形態を観察したい場合にも利用できる。
本発明の検出方法は、所定の生育段階のマラリア原虫を含む赤血球の存在割合、感染率を、形態を実際に観察しながらカウントする顕微鏡観察に匹敵する精度で、迅速かつ簡易に知ることができる。また、本発明の方法は、熱帯熱マラリアの感染赤血球と、他のマラリアの感染赤血球を区別することも可能である。
以上より、顕微鏡観察を行なう技術者の技能によって、結果の再現性が悪い点や検出限界感度が異なるなどの問題を回避できる。また、技術者の主観に基づく判断を防止して、より客観的な検査結果を提供できる。実際の医療現場では、迅速な診断、さらには薬剤投与量、投与スパンなどの治療方法の選択決定に利用できる。
以上より、顕微鏡観察を行なう技術者の技能によって、結果の再現性が悪い点や検出限界感度が異なるなどの問題を回避できる。また、技術者の主観に基づく判断を防止して、より客観的な検査結果を提供できる。実際の医療現場では、迅速な診断、さらには薬剤投与量、投与スパンなどの治療方法の選択決定に利用できる。
また、本発明の検出方法は、例えば、マラリアの感染メカニズムや抗マラリヤ薬の創薬など、マラリア原虫の感染率及び生育状態を確認する必要がある研究分野で利用できる。例えば、マラリア治療薬の開発時に、本発明の方法でマラリア感染赤血球をマラリア原虫の生育段階毎に精度良く分類することにより、効果の高い治療薬の選別を行なうことができる。具体的には、培養したマラリア原虫を赤血球に感染させると、各生育段階のマラリア感染赤血球が検出されるが、ここに所定のマラリア治療薬を添加すると、リングフォームのみしか検出されない場合がある。このような場合、このマラリア治療薬が、リングフォームからトロポゾイドへの生育を阻害していると考えられる。また、マラリア治療薬を添加しても依然として各生育段階のマラリア感染赤血球が同程度検出される場合は、この治療薬はマラリアの成長を阻害する作用が小さい薬剤であると考えられる。
２１ 光源
２６ 散乱光検出器
３１ 蛍光検出器
３５ 解析部
２６ 散乱光検出器
３１ 蛍光検出器
３５ 解析部
Claims (11)
- 試料中の赤血球の細胞膜を部分的に溶解するための試薬であって、
前記赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、
該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、
ｐＨ５〜７であり、浸透圧が２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、
マラリア原虫を赤血球内部に保持した状態で蛍光色素が透過できるように、赤血球の細胞膜を部分的に溶解し、
前記第一の界面活性剤が、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、
前記第二の界面活性剤が、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、
前記ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度は、４０ｐｐｍ〜６００ｐｐｍであり、
前記ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度は、５００ｐｐｍ〜１４００ｐｐｍである、赤血球膜部分溶解試薬。 - 実質的に赤血球の細胞膜を溶解しないノニオン界面活性剤をさらに含む請求項１に記載の赤血球膜部分溶解試薬。
- 前記ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル型界面活性剤、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル型界面活性剤、ポリオキシエチレンフィトステロール型界面活性剤、及びひまし油からなる群より選ばれる請求項２に記載の赤血球膜部分溶解試薬。
- 前記ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノイソステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル、ポリオキシエチレン水素化ひまし油、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタノール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンセチルエーテル、およびポリオキシエチレンモノラウリン酸エステルからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の赤血球膜部分溶解試薬。
- マラリア原虫に感染した赤血球を検出するための試薬であって、
請求項１〜４の何れかに記載の赤血球膜部分溶解試薬と、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素とを含むマラリア感染赤血球検出用試薬。 - 前記ＤＮＡ選択的蛍光色素が、下式で示される蛍光色素である請求項５記載のマラリア感染赤血球検出用試薬。
- ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素を含み且つマラリア原虫を内部に保持した状態で前記蛍光色素が透過できるように赤血球の細胞膜を部分的に溶解することができる試薬と、マラリアに感染した赤血球を含む試料とを混合して、測定試料を調製する工程；
前記測定試料に光を照射して散乱光情報及び蛍光情報を取得する工程；及び
前記散乱光情報及び蛍光情報に基づいてマラリアに感染した赤血球を検出する工程；
を含むマラリア感染赤血球の検出方法であって、
前記試薬は、
前記赤血球の細胞膜に対して所定の溶解力を有する第一の界面活性剤と、
該第一の界面活性剤よりも溶解力が弱い第二の界面活性剤とを含み、
ｐＨ５〜７であり、浸透圧が２００〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏであり、
前記第一の界面活性剤が、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、
前記第二の界面活性剤が、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであり、
前記ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度は、４０ｐｐｍ〜６００ｐｐｍであり、
前記ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドの濃度は、５００ｐｐｍ〜１４００ｐｐｍである、マラリア感染赤血球の検出方法。 - 前記取得工程において、前記測定試料をフローサイトメータのフローセルに導入し、前記フローセル内を流れる前記測定試料に前記蛍光色素の蛍光を励起する励起光を照射し、前記測定試料中の赤血球から散乱光情報及び蛍光情報を取得し、
前記検出工程において、前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、マラリアに感染した赤血球が含まれるマラリア感染赤血球領域を特定する、
請求項７に記載の検出方法。 - 前記検出工程において、前記散乱光情報および前記蛍光情報を二軸とする散布図を作成し、前記散布図中に、マラリアに感染した赤血球が含まれるマラリア感染赤血球領域を設定し、前記マラリア感染赤血球領域内のマラリアに感染した赤血球を検出する、請求項８に記載の検出方法。
- 前記マラリア感染赤血球領域のうち、リングフォーム（シングル）を含む赤血球の領域及びリングフォーム（マルチ）を含む赤血球の領域を特定する工程をさらに含む請求項８又は９に記載の検出方法。
- 前記マラリア感染赤血球領域に含まれる赤血球数（感染赤血球数Ｍ）を計数し、前記試料におけるマラリア感染赤血球の割合（感染率）を算出する、請求項９又は１０に記載の方法。
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