JP6621620B2 - 血液分析方法ならびにそれに用いる染色液および血液分析装置 - Google Patents
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Description
本発明は、血液分析方法ならびにそれに用いる染色液および血液分析装置に関する。
特許文献１には、マラリア原虫を赤血球内部に保持した状態で蛍光色素が透過できるように、赤血球の細胞膜を部分的に溶解するための赤血球膜部分溶解試薬が開示されている。また、実施例において、検体２０μｌに、蛍光色素としてヘキスト３４５８０をエチレングリコールで溶解した色素液（０．５ｍｇ／ｍｌ）２μｌと、前記赤血球膜部分溶解試薬を１ｍｌ添加して調製した測定試料（ヘキスト３４５８０の濃度:1.80μM）を用い、フローサイトメータにかけてマラリア感染赤血球を検出したことが記載されている。
しかしながら、特許文献１に記載のマラリア感染赤血球の検出方法では、例えば網赤血球(RET)高値サンプル等ではマラリア感染赤血球とそれ以外の粒子とが重なってしまう場合がある。また、マラリア感染率の低い検体ではマラリア非感染赤血球との弁別が困難である、という課題があった。そのため、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離能を更に向上させることが望まれていた。
今回、本発明者は、蛍光色素としてヘキスト３４５８０を高濃度で用いるのではなく、逆に低濃度で用いることによって、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離能を更に向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、血液、下式１で示される蛍光色素および検体希釈液から、前記蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下の測定試料を調製する工程と、前記測定試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程と、前記蛍光情報に基づいて、前記血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程と、を備える血液分析方法が提供される。
また、本発明によれば、下式１で示される蛍光色素を含み、前記蛍光色素の濃度が３μＭ以上２００μＭ以下である、マラリア分析用染色液が提供される。
更に、本発明によれば、血液、下式１で示される蛍光色素および検体希釈液から、前記蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下の測定試料を調製する測定試料調製部と、前記測定試料に光を照射する光源部と、光が照射された前記測定試料から得られる蛍光情報を取得する検出部と、前記蛍光情報に基づいて、前記血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する制御部と、を備える血液分析装置が提供される。
本発明によれば、検出精度の良いマラリア感染赤血球の検出方法が提供される。
本発明の血液分析方法は、血液、下式１で示される蛍光色素および検体希釈液から、前記蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下の測定試料を調製する工程を含む。
＜測定試料＞
測定試料は、フローサイトメータに流し測定を行うための試料であり、検体として血液、上記の式１で示される蛍光色素(ヘキスト３４５８０)および検体希釈液を含む。測定試料中における蛍光色素の濃度の下限は、０．１５μＭ、好ましくは０．１６μＭ、より好ましくは０．１８μＭである。測定試料中における蛍光色素の濃度の上限は、１．０μＭ、好ましくは０．９５μＭ、より好ましくは０．８９μＭである。測定試料中における蛍光色素の濃度の具体的数値は、例えば０．１５、０．１８、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．３６、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６２、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．８９、０．９、０．９５、１．０（単位：μＭ）であり得る。
測定試料は、フローサイトメータに流し測定を行うための試料であり、検体として血液、上記の式１で示される蛍光色素(ヘキスト３４５８０)および検体希釈液を含む。測定試料中における蛍光色素の濃度の下限は、０．１５μＭ、好ましくは０．１６μＭ、より好ましくは０．１８μＭである。測定試料中における蛍光色素の濃度の上限は、１．０μＭ、好ましくは０．９５μＭ、より好ましくは０．８９μＭである。測定試料中における蛍光色素の濃度の具体的数値は、例えば０．１５、０．１８、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．３６、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６２、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．８９、０．９、０．９５、１．０（単位：μＭ）であり得る。
特許文献１に記載されるようなフローサイトメトリー法を用いる血球分類においては、蛍光色素の濃度を増大させることによって、染色対象の粒子は全体的に高蛍光強度側にシフトする(例えば、特許文献１の図３等)。このため、ある血球集団と別の血球集団との分離能を向上させようとする場合には、通常、蛍光色素の濃度を増大させようとするのが当業者において自然である。
そこで、本発明者は、特許文献１に記載されているよりも高い濃度（18.0μM）の蛍光色素を用いて分離能の向上を図った。しかしながら、予想とは異なり、マラリア感染赤血球の蛍光強度は上がらなかった(後述する図１２参照)。一方で、マラリア感染赤血球よりも低い蛍光強度を示すマラリア非感染赤血球の蛍光強度が上昇したため、逆に分離能が悪化してしまった。
蛍光色素としてヘキスト３４５８０を高濃度で用いるのではなく、逆に低濃度で用いることによって、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離能を更に向上できることは、今回、本発明者が意外にも見出した観点である。
（蛍光色素）
上記の式１で示される蛍光色素は、ＣＡＳ番号９１１００４−４５−０で当業者に周知であり、ヘキスト３４５８０とも呼ばれる。この蛍光色素は、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素である。上記の蛍光色素は、例えば青紫色レーザ光（波長が約４０５ｎｍ）により励起することができる。上記の蛍光色素は、公知の方法に従って合成してもよいし、市販品を用いてもよい。
上記の式１で示される蛍光色素は、ＣＡＳ番号９１１００４−４５−０で当業者に周知であり、ヘキスト３４５８０とも呼ばれる。この蛍光色素は、ＲＮＡよりもＤＮＡを強く染色するＤＮＡ選択的蛍光色素である。上記の蛍光色素は、例えば青紫色レーザ光（波長が約４０５ｎｍ）により励起することができる。上記の蛍光色素は、公知の方法に従って合成してもよいし、市販品を用いてもよい。
蛍光色素は、溶液中にイオンの形態で存在する。本明細書では、このような溶液をマラリア分析用染色液または染色液ともいう。染色液の溶媒は、血液分析に支障がない限り特に限定されない。溶媒は、好ましくはエチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、水、生理食塩水、炭素数１〜６の低級アルコール(エタノール等)およびそれらの混合物であり、より好ましくはエチレングリコールである。カウンターイオンは、血液分析に支障がない限り特に限定されない。好ましくはハロゲン化物イオン、より好ましくは塩化物イオン(Ｃｌ−)である。
染色液中における蛍光色素の濃度の下限は、好ましくは３μＭ、より好ましくは１０μＭ、更に好ましくは５０μＭである。染色液中における蛍光色素の濃度の上限は、好ましくは２００μＭ、より好ましくは１８０μＭ、更に好ましくは１５０μＭである。染色液中における蛍光色素の濃度の具体的数値は、例えば３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００（単位：μＭ）であり得る。
上記の染色液中における蛍光色素の濃度の下限および上限の値は、本実施形態で用いられるような血液分析装置による測定試料の調製に際して、精度管理上の限界があることに基づく。すなわち、本実施形態で用いられるような血液分析装置を用いて測定試料を調製する際、ピペッティング可能な染色液の容量は一般的に約５μL以上約50μL以下である。上記の血液分析装置中で染色液に加えられる検体希釈液の容量は1.0 mLであるから、染色液から測定試料を調製する際の蛍光色素の希釈倍率は、約２０倍〜約２００倍となる。測定試料中の蛍光色素濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下であることに鑑みれば、染色液中における蛍光色素の濃度の下限および上限は、それぞれ３μＭおよび２００μＭとなる。なお、血液の容量は微量であるため、上記の濃度の下限および上限の算出において無視した。
このような染色液の調製方法は特に限定されず、当業者に公知の方法に従って調製することができる。例えば、上記の蛍光色素と上記の溶媒とを混合することによって調製することができる。染色液の調製において蛍光色素と溶媒とを混合する際、混合物を撹拌してもよい。撹拌速度および撹拌時間等の撹拌条件は、当業者が適宜設定できる。
（検体希釈液）
検体希釈液は、赤血球を可溶化する溶血剤、好ましくは界面活性剤を含む。界面活性剤としては、例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライドおよびセチルトリメチルアンモニウムクロライド等のカチオン系界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム等のアニオン系界面活性剤、CHAPS等の両性界面活性剤、PBC-44等のノニオン系界面活性剤、あるいはこれらの混合物が挙げられる。界面活性剤は、好ましくはラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドおよびPBC-44である。より好ましくは、溶血剤は、赤血球膜に対する溶解力が異なる少なくとも２種類の界面活性剤を含む。このような少なくとも２種類の界面活性剤の組合せとしては、具体的にはラウリルトリメチルアンモニウムクロライドとステアリルトリメチルアンモニウムクロライドとPBC-44との組合せ、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライドとセチルトリメチルアンモニウムクロライドとの組合せ等が挙げられ、好ましくはラウリルトリメチルアンモニウムクロライドとステアリルトリメチルアンモニウムクロライドとPBC-44との組合せである。
検体希釈液は、赤血球を可溶化する溶血剤、好ましくは界面活性剤を含む。界面活性剤としては、例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライドおよびセチルトリメチルアンモニウムクロライド等のカチオン系界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム等のアニオン系界面活性剤、CHAPS等の両性界面活性剤、PBC-44等のノニオン系界面活性剤、あるいはこれらの混合物が挙げられる。界面活性剤は、好ましくはラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドおよびPBC-44である。より好ましくは、溶血剤は、赤血球膜に対する溶解力が異なる少なくとも２種類の界面活性剤を含む。このような少なくとも２種類の界面活性剤の組合せとしては、具体的にはラウリルトリメチルアンモニウムクロライドとステアリルトリメチルアンモニウムクロライドとPBC-44との組合せ、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライドとセチルトリメチルアンモニウムクロライドとの組合せ等が挙げられ、好ましくはラウリルトリメチルアンモニウムクロライドとステアリルトリメチルアンモニウムクロライドとPBC-44との組合せである。
検体希釈液のｐＨの下限は、好ましくは５．０、より好ましくは５．５である。検体希釈液のｐＨの上限は、好ましくは７．０、より好ましくは６．５である。検体希釈液のｐＨの具体的数値は、例えば５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０（単位なし）であり得る。
検体希釈液の赤血球に対する浸透圧の下限は、好ましくは２００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ、より好ましくは２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏである。検体希釈液の赤血球に対する浸透圧の上限は、好ましくは３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ、より好ましくは２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏである。検体希釈液の赤血球に対する浸透圧の具体的数値は、例えば２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００（単位：ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ）であり得る。
赤血球にマラリア感染赤血球が含まれている場合、マラリア感染赤血球の内部には、マラリア原虫が入っている。溶血剤の作用により、測定試料中の赤血球は縮小している。マラリア感染赤血球は、内部にマラリア原虫を保持したまま、溶血剤によって縮小される。
（血液）
検体となる血液は、血液の通った生体から採取されたものであれば特に限定されない。生体はヒトまたは鶏、サル等のヒト以外の動物であってもよく、好ましくはヒトである。生体は、網赤血球（ＲＥＴ）高値検体またはマラリア感染率の低い検体であってもよい。血液は、当業者に公知の方法、例えば採血等によって生体から取得することができる。
検体となる血液は、血液の通った生体から採取されたものであれば特に限定されない。生体はヒトまたは鶏、サル等のヒト以外の動物であってもよく、好ましくはヒトである。生体は、網赤血球（ＲＥＴ）高値検体またはマラリア感染率の低い検体であってもよい。血液は、当業者に公知の方法、例えば採血等によって生体から取得することができる。
測定試料は、測定試料中における蛍光色素の濃度が下限および上限の範囲内であることを前提として、ＤＣ測定用希釈液によって希釈されていてもよい。ＤＣ測定用希釈液は、血液分析に適したものであれば特に限定されず、好ましくはシスメックス社製セルパックである。しかし、本実施形態では、マラリア測定用の測定試料は、ＤＣ測定用希釈液によって希釈を行わないことが好ましい。なお、後述するように、本実施形態では、ＤＣ測定用希釈液は、光学測定やＤＣ測定のためのシース液としても用いることができる。
本発明の別の実施形態では、マラリア感染赤血球の検出またはマラリア感染赤血球数の測定に加えて、赤血球数の測定または赤血球数に基づいてマラリア感染赤血球率の算出が行われる。この場合、マラリア測定用の測定試料とは別に、赤血球数測定用の測定試料を調製する。赤血球数測定用の測定試料は、上記の希釈液によって希釈されていることが好ましい。
（測定試料の調製方法）
測定試料の調製方法は特に限定されず、当業者に公知の方法に従って調製することができる。例えば、検体となる血液、上記の蛍光色素(好ましくは上記の蛍光色素を含む染色液)および検体希釈液を混合することによって調製することができる。
測定試料の調製方法は特に限定されず、当業者に公知の方法に従って調製することができる。例えば、検体となる血液、上記の蛍光色素(好ましくは上記の蛍光色素を含む染色液)および検体希釈液を混合することによって調製することができる。
測定試料の調製温度の下限は、好ましくは２０℃、より好ましくは３９℃である。測定試料の調製温度の上限は、好ましくは４５℃、より好ましくは４３℃である。
測定試料の調製時間の下限は、好ましくは１０秒、より好ましくは２０秒である。測定試料の調製時間の上限は、好ましくは６０秒、より好ましくは３０秒である。
測定試料の調製において血液、蛍光色素および検体希釈液を混合する際、混合物を撹拌してもよい。撹拌速度および撹拌時間等の撹拌条件は、当業者が適宜設定できる。測定試料がＤＣ測定用希釈液を含む場合、上記の血液、蛍光色素および検体希釈液に加えて、更にＤＣ測定用希釈液を混合すること以外は、上記測定試料の調製方法と同様にして調製することができる。
本発明の血液分析方法は、上記のようにして調製した測定試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程を含む。照射光の波長は、上記式１で示される蛍光色素を励起可能な波長であれば特に限定されない。このような波長域としては、例えば３７５ｎｍ以上４２０ｎｍ以下である。照射光の強度は当業者が適宜設定できる。
また、上記の取得工程では、上記のようにして調製した測定試料に光を照射して得られる散乱光情報を取得してもよい。
散乱光情報および蛍光情報の取得方法は、血液分析に資する情報を提供可能なものであれば特に限定されない。散乱光情報および蛍光情報の取得方法は、好ましくはフローサイトメトリー法である。散乱光情報および蛍光情報の取得は、汎用のフローサイトメータを用いて行うことができる。本実施形態では、後述する血液分析装置１に内蔵されたフローサイトメータを用いて、散乱光情報および蛍光情報の取得が行うことができる。
本発明の血液分析方法は、上記のようにして取得した蛍光情報および任意に散乱光情報に基づいて、血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程を含む。マラリア原虫に感染した赤血球の検出方法は、特に限定されない。検出方法は、好ましくはフローサイトメトリー法によって得られた前方散乱光情報および側方蛍光情報を解析可能なコンピュータプログラムを用いる方法である。
なお、図１に示される血液分析装置を用いれば、上記の散乱光情報および蛍光情報の取得工程とマラリア原虫に感染した赤血球の検出工程とを続けて行うこともできる。
本実施形態では、図１に示される血液分析装置に内蔵されたコンピュータプログラムを用いて、マラリア原虫に感染した赤血球の検出が行われる。より具体的には、上記のコンピュータプログラムを用いて、前方散乱光情報および蛍光情報をプロッティングしてスキャッタグラムを作成し、検体となる血液中の成分をマラリア感染赤血球、マラリア非感染赤血球および白血球の３群に分類する。本実施形態では、上記式１で示される蛍光色素を所定濃度で用いることによって、スキャッタグラム上において、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球とを良好に分離することができる。
なお、本実施形態で用いられる血液分析装置は、マラリア感染赤血球の検出だけではなく、他の血液分析を行っても良い。例えば、このような血液分析装置を用いれば、白血球をより細かな群(例えばリンパ球、好酸球等)に分類することや赤血球数および血色素量を測定すること等も可能である。上記のマラリア感染赤血球の検出が、白血球分類や赤血球数および血色素量の測定等のその他の血液分析と同時に行われる場合も、本発明の範囲内である。
本発明の範囲には、上記の測定試料そのものも含まれる。すなわち、本発明によれば、血液、下式１で示される蛍光色素および検体希釈液を含む測定試料であって、蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下の測定試料が提供される。
血液、蛍光色素、染色液、検体希釈液、調製方法等については上述のとおりである。上述のとおり、測定試料は、蛍光色素の濃度が上記の下限および上限の範囲内であることを前提として、ＤＣ測定用希釈液によって希釈されていてもよい。ＤＣ測定用希釈液についても上述のとおりである。
本発明の範囲には、上記の測定試料の調製方法も含まれる。すなわち、本発明によれば、血液、上記の式１で示される蛍光色素および検体希釈液から測定試料を調製する工程を含む、上記の式１で示される蛍光色素を含み、蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下の測定試料を調製する方法が提供される。血液、蛍光色素、染色液、検体希釈液、調製方法等については上述のとおりである。
本発明の範囲には、血液分析のための測定試料の使用も含まれる。すなわち、本発明によれば、血液、上記の式１で示される蛍光色素および検体希釈液を含む測定試料であって、蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下の測定試料の血液分析のための使用が提供される。血液、蛍光色素、染色液、検体希釈液、調製方法等については上述のとおりである。上述のとおり、測定試料は、蛍光色素の濃度が上記の下限および上限の範囲内であることを前提として、ＤＣ測定用希釈液によって希釈されていてもよい。ＤＣ測定用希釈液についても上述のとおりである。
本発明の範囲には、上記のマラリア分析用染色液そのものも含まれる。すなわち、本発明によれば、上記の式１で示される蛍光色素を含み、蛍光色素の濃度が３μＭ以上２００μＭ以下である、マラリア分析用染色液が提供される。蛍光色素、溶媒、調製方法等については上述のとおりである。
本発明の範囲には、上記のマラリア分析用染色液の調製方法も含まれる。すなわち、本発明によれば、上記の式１で示される蛍光色素および溶媒から染色液を調製する工程を含む、上記の式１で示される蛍光色素を含み、蛍光色素の濃度が３μＭ以上２００μＭ以下である、マラリア分析用染色液の調製方法が提供される。蛍光色素、溶媒、調製条件等については上述のとおりである。
本発明の範囲には、血液分析のためのマラリア分析用染色液の使用も含まれる。すなわち、本発明によれば、上記の式１で示される蛍光色素を含み、蛍光色素の濃度が３μＭ以上２００μＭ以下である、マラリア分析用染色液の血液分析のための使用が提供される。蛍光色素、溶媒、調製方法等については上述のとおりである。
本発明の範囲には、上記の血液分析方法を行うための装置も含まれる。すなわち、本発明によれば、血液、上記の式１で示される蛍光色素および検体希釈液から、前記蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下の測定試料を調製する測定試料調製部と、前記測定試料に光を照射する光源部と、光が照射された前記測定試料から得られる蛍光情報を取得する検出部と、前記蛍光情報に基づいて、前記血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する制御部と、を備える血液分析装置が提供される。
上記の検出部は、測定試料に光を照射して得られる散乱光情報を更に取得するように構成されていてもよい。また、上記の制御部は、上記の散乱光情報に基づいて、前記血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出するように構成されていてもよい。
以下、上記の血液分析装置の実施形態を図面に基づいて説明する。まず、図１〜図１０を参照して、一実施形態としての血液分析装置１の構成について説明する。
本実施形態による血液分析装置１は、図１に示すように、血液検査に使用される装置であり、測定ユニット２と、データ処理ユニット３とによって主として構成されている。また、血液分析装置１は、たとえば、病院または病理検査施設等の医療機関の施設内に設置されている。また、血液分析装置１では、測定ユニット２により血液中に含まれる成分について所定の測定を行い、この測定データをデータ処理ユニット３で受信して分析処理を行っている。そして、測定ユニット２とデータ処理ユニット３とは、互いにデータ通信可能なように、データ伝送ケーブル３ａにより接続されている。なお、測定ユニット２とデータ処理ユニット３とは、データ伝送ケーブル３ａにより直接接続される構成であってもよいし、たとえば、電話回線を使用した専用回線、ＬＡＮまたはインターネット等の通信ネットワークを介して接続されていてもよい。
測定ユニット２は、図２に示すように、試料供給部４と、光学測定部５と、ＤＣ測定部６と、ＨＧＢ測定部７と、制御部８と、通信部９とを含んでいる。また、図３に示すように、測定ユニット２の正面右下部分には、血液を収容した採血管２０をセット可能に構成された採血管セット部２ａが設けられている。この採血管セット部２ａは、その近傍に設けられたボタンスイッチ２ｂをユーザが押下することにより、手前方向に迫り出すように構成されている。ユーザは、採血管セット部２ａが迫り出した状態で採血管２０をセットすることが可能である。そして、採血管２０をセットした後、ユーザが再度ボタンスイッチ２ｂを押下することにより、採血管セット部２ａは測定ユニット２の内部に戻されるように構成されている。
測定ユニット２の内部には、図４および図５に示すように、血液を吸引するピペット２１、および、血液と蛍光色素等とを混合調製するためのチャンバ２２、２３（図５参照）等が設けられている。ピペット２１は、上下方向に延びた管状に形成されており、その先端は鋭く尖っている。また、ピペット２１は、図示しないシリンジポンプに連結されており、このシリンジポンプの動作によって液体を所定量だけ吸引するとともに、吐出することが可能なように構成されている。また、ピペット２１は、移動機構に接続されており、上下方向および前後方向にそれぞれ移動可能に構成されている。また、ピペット２１は、採血管２０を密閉するゴム製のキャップ２０ａに、鋭利な先端を穿刺することにより、採血管２０に収容された血液を吸引するように構成されている。また、ピペット２１は、血液を吸引した後、移動機構により所定の位置まで移動され、チャンバ２２または２３内に血液を供給するように構成されている。なお、本実施形態では、２つのチャンバを備える態様について説明したが、血液分析装置に設けられる上記のようなチャンバは、１つであってもよいし、２以上であってもよい。
試料供給部４は、チャンバ２２および２３、複数の電磁弁、ダイヤフラムポンプ等を有する流体ユニットである。チャンバ２２および２３は、測定試料を調製するために設けられている。また、試料供給部４により構成される流体ユニットには、試薬容器が接続されている。具体的には、ＤＣ測定用希釈液を収容するためのＤＣ測定用希釈液容器２４、検体希釈液を収容するための検体希釈液容器２５およびマラリア検出用の測定試料に用いられる染色液を収容するための染色液容器２６が流体ユニットに接続されている。これにより、ＤＣ測定用希釈液、検体希釈液および染色液をチャンバ２２または２３に供給することが可能である。ＤＣ測定用希釈液は、必要に応じてチャンバ２２または２３に供給されてもよいし、または供給されなくてもよい。
光学測定部５は、光学式のフローサイトメータであり、半導体レーザ光を用いたフローサイトメトリー法により、マラリア感染赤血球検出（以下、マラリア検出という）を行うために設けられている。また、光学測定部５は、測定試料の液流を形成するフローセル５１（図６参照）を有している。フローセル５１は、透光性を有する石英、ガラス、合成樹脂等の材料によって管状に構成されており、その内部が測定試料およびシース液としてのＤＣ測定用希釈液が通流する流路となっている。このフローセル５１には、内部空間が他の部分よりも細く絞り込まれたオリフィス５１ａが設けられている。また、オリフィス５１ａの入口付近は二重管構造となっており、その内側管部分は試料ノズル５１ｂとなっており、これを介して、チャンバ２２等において調製された測定試料が供給される(図７)。また、試料ノズル５１ｂの外側の空間はシース液としてのＤＣ測定用希釈液が通流する流路５１ｃであり、シース液としてのＤＣ測定用希釈液は、流路５１ｃを通流し、オリフィス５１ａに導入される。このようにフローセル５１に供給されたシース液としてのＤＣ測定用希釈液は、試料ノズル５１ｂから吐出された測定試料を取り囲むように流れる。そして、オリフィス５１ａによって測定試料の流れが細く絞り込まれ、測定試料に含まれる白血球、赤血球等の粒子がシース液としてのＤＣ測定用希釈液に取り囲まれて１つずつオリフィス５１ａを通過する。
また、光学測定部５には、半導体レーザ光源５２が、フローセル５１のオリフィス５１ａへ向けてレーザ光を出射するように配置されている。この半導体レーザ光源５２は、青紫色半導体レーザ素子５２ａを有し、波長が約４０５ｎｍの青紫色レーザ光を出射することが可能なように構成されている。また、半導体レーザ光源５２とフローセル５１との間には、複数のレンズからなる照射レンズ系５３が配置されている。この照射レンズ系５３によって、半導体レーザ光源５２から出射された平行ビームがビームスポットに集束されるようになっている。また、半導体レーザ光源５２から直線的に延びた光軸上には、フローセル５１を挟んで照射レンズ系５３に対向するように、ビームストッパ５４ａが設けられており、ビームストッパ５４ａは、半導体レーザ光源５２からの直接光を遮光するように構成されている。
また、ビームストッパ５４ａのさらに光軸下流側には、フォトダイオード５４が配置されている。フォトダイオード５４は、フローセル５１を流れる測定試料により生じるレーザ光の散乱光を受光するように構成されている。具体的には、半導体レーザ光源５２から直線的に延びた光軸に沿って進行する光のうち、半導体レーザ光源５２の直接光はビームストッパ５４ａによって遮断されるので、フォトダイオード５４は、概ね光軸方向に沿って進行する散乱光（以下、前方散乱光という）のみを受光するように構成されている。また、フォトダイオード５４は、フローセル５１から発せられた前方散乱光を光電変換し、これによって生じた電気信号（以下、前方散乱光信号という）をアンプ５４ｂに伝達するように構成されている。そして、アンプ５４ｂは、伝達された前方散乱光信号を増幅し、制御部８に出力するように構成されている。なお、光信号のゲイン(増幅率)や受光感度等は当業者が適宜設定または変えることができる。なお、ゲインを変えるとは、光情報を取得する際に、アンプ５４ｂおよび／または５８ｂの増幅率を変更することをいう。
また、フローセル５１の側方であって、半導体レーザ光源５２からフォトダイオード５４へ直線的に延びる光軸に対して直交する方向には、側方集光レンズ５５が配置されており、この側方集光レンズ５５は、フローセル５１内を通過する血球にレーザ光を照射したときに発生する側方光（前記光軸に対して交差する方向へ出射される光）を集光するように構成されている。側方集光レンズ５５の下流側にはダイクロイックミラー５６が設けられており、ダイクロイックミラー５６は、側方集光レンズ５５から送られる信号光を散乱光成分と蛍光成分とに分けるように構成されている。ダイクロイックミラー５６の側方（側方集光レンズ５５とダイクロイックミラー５６とを結ぶ光軸方向に交差する方向）には、側方散乱光受光用のフォトダイオード５７が設けられており、ダイクロイックミラー５６の光軸下流側には、光学フィルタ５８ａおよびアバランシェフォトダイオード５８が設けられている。また、フォトダイオード５７は、ダイクロイックミラー５６で分けられた側方散乱光成分を光電変換し、これによって生じた電気信号（以下、側方散乱光信号という）をアンプ５７ａに伝達するように構成されている。そして、アンプ５７ａは、伝達された側方散乱光信号を増幅し、制御部８に出力するように構成されている。なお、光信号のゲイン(増幅率)や受光感度等は当業者が適宜設定または変えることができる。
なお、フォトダイオード５７およびアンプ５７ａを介して得られる側方散乱光情報は、本実施形態のマラリア検出においては用いられないので、本発明の血液分析装置の構成に必須というわけではないが、フォトダイオード５７およびアンプ５７ａを備えたフローサイトメータがより一般的である。マラリア検出に加えて、赤血球数測定や血色素量測定等を行う場合には、フォトダイオード５７およびアンプ５７ａを介して得られる側方散乱光情報が用いられ得る。
また、アバランシェフォトダイオード５８は、光学フィルタ５８ａにより波長選択された後の側方蛍光成分を光電変換し、これによって生じた電気信号（側方蛍光信号）をアンプ５８ｂに伝達するように構成されている。そして、アンプ５８ｂは、伝達された側方蛍光信号を増幅し、制御部８に出力するように構成されている。なお、光信号のゲイン(増幅率)や受光感度等は当業者が適宜設定または変えることができる。
ＤＣ測定部６は、シースフローＤＣ検出法により、赤血球数（ＲＢＣ）および血小板数（ＰＬＴ）を測定することが可能なように構成されている。また、ＤＣ測定部６は、赤血球パルス波高値検出法により、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）を算出するための測定データも得ることが可能に構成されている。また、ＤＣ測定部６は、フローセルを有しており、このフローセルにチャンバ２２から測定試料が移送されるようになっている。たとえば、図９に示すように、チャンバ２２において血液とＤＣ測定用希釈液とが混合調製された測定試料が、シース液としてのＤＣ測定用希釈液とともに試料供給部４からフローセルに移送される。そして、フローセル内では、測定試料がシース液としてのＤＣ測定用希釈液によって取り囲まれた状態の液流が形成される。
なお、ＤＣ測定部６は、本実施形態のマラリア検出においては用いられないので、本発明の血液分析装置の構成に必須というわけではないが、ＤＣ測定部６を備えた血液分析装置がより一般的である。特に、マラリア検出に加えて、赤血球数測定等を行う場合や、赤血球数に基づいてマラリア感染率を算出する場合には、ＤＣ測定部６を備えていることが好ましい。ＤＣ測定部６を用いて赤血球数を算出する場合、測定試料は、図９に示すように、ＤＣ測定用希釈液によって希釈されていることが好ましい。
ＨＧＢ測定部７は、メトヘモグロビン法により、血色素量（ＨＧＢ）を測定するように構成されている。ＨＧＢ測定部７は、図１０に示すように、希釈試料を収容するセルを有しており、このセルにチャンバ２２から測定試料が移送されるようになっている。そして、ＨＧＢ測定部７は、波長が約５５５ｎｍの光を照射する発光ダイオードを有しており、上記セル中の測定試料に発光ダイオードからの光を照射することによって、その吸光度を測定するように構成されている。
なお、ＨＧＢ測定部７は、本実施形態のマラリア検出においては用いられないので、本発明の血液分析装置の構成に必須というわけではないが、ＨＧＢ測定部７を備えた血液分析装置がより一般的である。マラリア検出に加えて、血色素量測定等を行う場合には、ＨＧＢ測定部７が用いられ得る。
制御部８は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等から構成されており、測定ユニット２の各部の動作制御を行うように構成されている。
通信部９は、たとえば、ＲＳ−２３２Ｃインタフェース、ＵＳＢインタフェース、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）インタフェースであり、データ処理ユニット３との間でデータの送受信を行うことが可能なように構成されている。
データ処理ユニット３は、図２に示すように、ＣＰＵ３１、ＲＯＭ３２、ＲＡＭ３３、ハードディスク３４、通信インタフェース３５、キーボードおよびマウス等の入力部３６、およびディスプレイ装置３７を備えるコンピュータによって構成されている。データ処理ユニット３のハードディスク３４には、オペレーティングシステムと、測定ユニット２から受信した測定データを分析処理するためのアプリケーションプログラムがインストールされている。
本実施形態では、データ処理ユニット３のＣＰＵ３１は、このアプリケーションプログラムを実行することにより、測定データを分析処理し、前方散乱光信号および側方蛍光信号を用いてスキャッタグラムを作成するように構成されている。
通信インタフェース３５は、たとえば、ＲＳ−２３２Ｃインタフェース、ＵＳＢインタフェース、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）インタフェースであり、測定ユニット２との間でデータの送受信を行うことが可能に構成されている。
次に、図１１を参照して、血液分析装置１における試料分析処理の一実施形態について説明する。
まず、血液分析装置１が起動されると、アプリケーションプログラム等の初期化が行われた後、ステップＳ１において、データ処理ユニット３のＣＰＵ３１により、ユーザからの測定開始指示があったか否かが判断され、指示があるまでこの判断が繰り返される。そして、測定開始指示があった場合には、ステップＳ２において、データ処理ユニット３から測定ユニット２に測定開始指示信号が送信される。
そして、ステップＳ２１において、測定ユニット２の制御部８により、測定開始指示信号が受信されたか否かが判断され、受信するまでこの判断が繰り返される。測定ユニット２が測定開始指示信号を受信すると、ステップＳ２２において、ピペット２１により、採血管セット部２ａにセットされた採血管２０から血液が吸引される。
そして、ステップＳ２３において、試料供給部４により、測定試料が調製される。具体的には、チャンバ２２または２３に血液、蛍光色素を含む染色液、検体希釈液および必要に応じてＤＣ測定用希釈液が供給され、チャンバ２２または２３内において混合されることにより、測定試料が調製される。チャンバ２２または２３を加温および／または振盪させることにより、測定試料の調製温度や撹拌速度等の調製条件を整えてもよい。その後、ステップＳ２４において、チャンバ２２または２３内の測定試料が、シース液としてのＤＣ測定用希釈液とともに光学測定部５に移送され、光学測定部５によりマラリア検出が行われる。マラリア検出に加えて赤血球検出を行う場合、赤血球検出用の測定試料がシース液としてのＤＣ測定用希釈液とともにＤＣ測定部６に移送され、ＤＣ測定部６により赤血球検出が行われる。マラリア検出に加えて血色素(ＨＧＢ)検出を行う場合、血色素検出用の測定試料がＨＧＢ測定部７に移送され、ＨＧＢ測定部７により血色素検出が行われる。そして、ステップＳ２５において、各検出部において測定された測定データが、測定ユニット２からデータ処理ユニット３に送信される。
データ処理ユニット３では、ステップＳ３において、測定ユニット２が送信した測定データが受信されたか否かが判断され、受信するまでこの判断が繰り返される。そして、測定データを受信すると、ステップＳ４において、ＣＰＵ３１により、ステップＳ２４で測定されたマラリア検出による測定データに基づいて、マラリア感染赤血球がマラリア感染赤血球以外の集団から分類される。具体的には、ＣＰＵ３１は、前方散乱光信号および側方蛍光信号を用いてスキャッタグラムを作成し、このスキャッタグラムから、マラリア感染赤血球をマラリア感染赤血球以外の集団から分類する。より具体的には、スキャッタグラムにおいて、マラリアに感染していない赤血球は蛍光強度の小さい領域に現れる一方、マラリア感染赤血球は比較的蛍光強度の大きい領域に現れる。また、白血球は、そのサイズおよびＤＮＡ量に起因して、蛍光強度および散乱光強度の両方が大きい領域に現れる。これにより、マラリア感染の有無を判断することが可能となる。また、従来技術では達成できなかったマラリア感染赤血球数の測定も可能となる。ステップＳ２４において赤血球検出および／または血色素検出を行った場合には、それらの測定データに基づいて、赤血球数および／または血色素量を算出することもできる。マラリア感染赤血球検出および赤血球検出を両方行う場合、それらの測定データに基づいて、マラリア感染赤血球比率を算出することもできる。マラリア感染赤血球比率は、以下の式により算出できる。
その後、ステップＳ６において、ユーザからのシャットダウン指示の有無が判断され、指示がない場合には、ステップＳ１に移行される。シャットダウン指示があった場合には、血液分析装置１における試料分析処理のデータ処理ユニット３の動作が終了される。また、測定ユニット２側では、ステップＳ２５で測定データをデータ処理ユニット３に送信した後、ステップＳ２６において、ユーザからのシャットダウン指示があったか否かが判断され、指示がない場合には、ステップＳ２１に移行される。シャットダウン指示があった場合には、血液分析装置１における試料分析処理の測定ユニット２の動作が終了される。
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
比較例１
培養マラリア原虫（国立大学法人大阪大学微生物病研究所から入手；以下「Malaria」と言う場合がある）を添加したヒト全血（ACD採血・O型）(Golden West社製) 17μｌに、染色液20μｌおよび検体希釈液１ｍｌを添加し、４１℃で２０秒間混合し、測定試料を調製した。染色液および検体希釈液は以下のとおりにして調製した。
培養マラリア原虫（国立大学法人大阪大学微生物病研究所から入手；以下「Malaria」と言う場合がある）を添加したヒト全血（ACD採血・O型）(Golden West社製) 17μｌに、染色液20μｌおよび検体希釈液１ｍｌを添加し、４１℃で２０秒間混合し、測定試料を調製した。染色液および検体希釈液は以下のとおりにして調製した。
検体希釈液は、以下の組成のものを用いた。
染色液は、エチレングリコール１ｍｌに蛍光色素（ヘキスト３４５８０、シグマアルドリッチ社）を溶解したものを用いた。なお、各染色液を使用し、下記の測定試料の調製した際の、測定試料中の濃度もあわせて以下の表２に示す。
光源として４０５nmの青色発光ダイオードを有するフローサイトメータを用いて、上記のようにして調製した測定試料についての前方散乱光信号および側方蛍光信号を取得し、得られた信号に基づいてスキャッタグラムを作成した。
ヘキスト３４５８０の測定試料中の濃度を、特許文献１に記載の1.80μMよりも高い、18.0μMにしてマラリア感染赤血球を検出した結果を図１２に示す。ヘキスト３４５８０は核酸染色色素のため、核酸を含まない赤血球よりも、核酸を含む白血球やマラリア感染赤血球を良く染めることが予想される。図１２において、右上に表われる「ＷＢＣ」と表記される集団が白血球の集団であり、左下から中央にかけて表われる「Malaria」と表記される集団がマラリア感染赤血球の集団であり、マラリア感染赤血球の左側に表われる集団がマラリア非感染赤血球の集団である。図１２において、白血球（ＷＢＣ）は予想通り蛍光強度が上昇し、スキャッタグラムの出現位置が右に移動した。しかし、マラリア感染赤血球（Malaria）は蛍光強度の上昇が少なく、逆に高濃度のヘキスト３４５８０により影響を受け蛍光強度が上昇したマラリア非感染赤血球との分離能が悪化した。
実施例１
以下の表３に示す組成の染色液を用いて、比較例１と同様の実験を行った。
以下の表３に示す組成の染色液を用いて、比較例１と同様の実験を行った。
ヘキスト３４５８０の測定試料中の濃度を、特許文献１に記載の1.80μMよりも低い、0.45μMにしてマラリア感染赤血球を検出した結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、低濃度（0.45μM）のヘキスト３４５８０を用いることで、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離能が向上する。なお、図１３等においては、マラリア感染非赤血球の前方散乱光がマラリア感染赤血球よりも大きくなっているが、これは正常赤血球を除外するため蛍光強度が所定の閾値以下の粒子を除外していること、また、それではカットしきれないＲＥＴ等の若干の蛍光を発する正常赤血球がスキャッタ上に表示されていることに起因する。
次いで、ゲインを変えて取得したスキャッタグラムを図１４に示す。図１４においても、0.45μMのヘキスト３４５８０を用いた場合には、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球とが良好に分離していることが確認できた。図１４においては、ゲインを変えたことによって、1.80μMのヘキスト３４５８０を用いた場合のスキャッタグラムにおいて、0.45μMの場合とほぼ同じ位置に白血球集団が確認できる。1.80μMのスキャッタグラムと、0.45μMのスキャッタグラムとを比較すると、1.80μMのスキャッタグラムではマラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離が確認しづらい。一方、0.45μMのスキャッタグラムでは、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球とがより良好に分離していることが確認できる。以下の実施例２および３において、1.80μMのヘキスト３４５８０を用いた場合のスキャッタグラムについては、ゲインを変えて取得したスキャッタグラムを示す。
実施例２
マラリア感染ヒト全血に代えて、マラリアに感染しており且つ網赤血球（ＲＥＴ）が高値の患者から採取された血液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
マラリア感染ヒト全血に代えて、マラリアに感染しており且つ網赤血球（ＲＥＴ）が高値の患者から採取された血液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
結果を図１５に示す。図１５から明らかなように、特許文献１に記載の1.80μMのヘキスト３４５８０では、マラリア感染赤血球以外の粒子とマラリア感染赤血球が重なってしまうが、低濃度（0.45μM）のヘキスト３４５８０を用いることで、マラリア感染赤血球と他の粒子との分離能が向上する。
実施例３
マラリア感染ヒト全血に代えて、マラリアの感染率の低い患者から採取された血液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
マラリア感染ヒト全血に代えて、マラリアの感染率の低い患者から採取された血液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
その結果を図１６に示す。図１６から明らかなように、特許文献１に記載の1.80μMのヘキスト３４５８０では、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との弁別が困難であるのに対し、低濃度（0.45μM）のヘキスト３４５８０を用いることで、マラリア感染赤血球の存在をより明確に確認することが出来る。
比較例２
ヘキスト３４５８０に代えて、4'，6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド(DAPI、ライフテクノロジーズコーポレーション)を用いて調製した以下の表４に示す組成の染色液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
ヘキスト３４５８０に代えて、4'，6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド(DAPI、ライフテクノロジーズコーポレーション)を用いて調製した以下の表４に示す組成の染色液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
その結果を図１７ＡおよびＢに示す。DAPIはヘキスト３４５８０と同じくDNA選択的蛍光色素であるが、濃度を低下させることによるマラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離能向上は認められなかった。このことから、濃度低下によるマラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離能向上の効果は、ヘキスト３４５８０を所定濃度で用いたときに見られることが分かる。
実施例４
以下の表５に示す組成を有する染色液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。なお、測定試料を調製した際、染色液は、表５の右欄に示される「測定試料中の濃度」の値となるように添加した。
以下の表５に示す組成を有する染色液を用いて、実施例１と同様の実験を行った。なお、測定試料を調製した際、染色液は、表５の右欄に示される「測定試料中の濃度」の値となるように添加した。
その結果を図１８Ａ〜Ｊに示す。図１８Ａ〜Ｊから、0.18μMからマラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離が可能となることが分かる。また、白血球（WBC）はヘキスト３４５８０の濃度上昇に従い、蛍光強度が上昇しグラフ右側に分布が移動して行くのが分かる（0.89μMはグラフ右側にサチュレーションしている）。一方、0.36μMから濃度上昇させても、マラリア感染赤血球の蛍光強度の上昇が低く、殆ど分布の移動が無いのに対して、濃度上昇に伴ってマラリア非感染赤血球の蛍光強度は上昇するため、濃度を上昇させすぎると、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球とは分離し難くなることが分かる。これらの結果は、測定試料中における蛍光色素濃度が低すぎるとマラリア感染赤血球の蛍光強度が十分でないためにマラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との分離が難しく、逆に高すぎるとマラリア非感染赤血球の蛍光強度がマラリア感染赤血球に近づくためにマラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球とが分離し難くなることを示す。したがって、測定試料中における蛍光色素の濃度が０．１５μＭ以上１．０μＭ以下であれば、マラリア感染赤血球とマラリア非感染赤血球との良好な分離が得られると考えられる。
Claims (10)
- 血液、下式１で示される蛍光色素および検体希釈液から、前記蛍光色素の濃度が０．１８μＭ以上０．８９μＭ以下の測定試料を調製する工程と、
前記測定試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程と、
前記蛍光情報に基づいて、前記血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程と、を備える血液分析方法。
- 前記取得工程において、測定試料に光を照射して得られる前方散乱光情報を更に取得し、
前記検出工程において、前記前方散乱光情報に基づいて、前記血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を更に検出する、請求項１に記載の血液分析方法。 - 前記蛍光色素のカウンターイオンがハロゲン化物イオンである、請求項１または２に記載の血液分析方法。
- 前記蛍光色素のカウンターイオンがＣｌ−である、請求項１乃至３の何れか一項に記載の血液分析方法。
- 前記検体希釈液は、赤血球膜に対する溶解力が異なる少なくとも２種類の界面活性剤を含む、請求項１乃至４の何れか一項に記載の血液分析方法。
- 前記検体希釈液のｐＨが５．０以上７．０以下である、請求項１乃至５の何れか一項に記載の血液分析方法。
- 前記検体希釈液の赤血球に対する浸透圧が、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ2Ｏ以下である、請求項１乃至６の何れか一項に記載の血液分析方法。
- 下式１で示される前記蛍光色素を含み、前記蛍光色素の濃度が３μＭ以上２００μＭ以下であり、請求項１乃至７の何れか一項に記載の血液分析方法に用いるためのマラリア分析用染色液。
- 溶媒がエチレングリコールである、請求項８に記載のマラリア分析用染色液。
- 血液、下式１で示される蛍光色素および検体希釈液から、前記蛍光色素の濃度が０．１８μＭ以上０．８９μＭ以下の測定試料を調製する測定試料調製部と、
前記測定試料に光を照射する光源部と、
光が照射された前記測定試料から得られる蛍光情報を取得する検出部と、
前記蛍光情報に基づいて、前記血液中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する制御部と、を備える血液分析装置。
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