JPS59853B2 - ハツケツキユウノ ケイコウブンセキホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は白血球の蛍光分析法に関するものである。

本発明の蛍光分析法において、各種の白血球を分別して
分析するために用いる染色用組成物は、例えばアクリジ
ンオレンジなどの異染性蛍光染料の低張水溶液である。
またこの溶液のｐＨは生理的に正常な人血のｐＨの範囲
にある。白血球の分析は、新鮮な血液試料を染料溶液中
に懸濁させて白血球を蛍光染料で染色し、染色作用が平
衡に達する前に前記懸濁液を、染料の吸収波長範囲内の
波長を有する光源（例えば青色のレーザー光線）で照射
し、その照射によつて白血球から発生する蛍光（例えば
緑色蛍光）を検出して白血球と他の血球とを識別し、更
に白血球の個々の蛍光（例えば赤色および緑色蛍光）を
測定して白血球の各種類を分別する。各種の白血球が蛍
光染料で染色される比率の相違は、染料溶液を低張溶液
にすることによつて強調することができる。血液は高等
動物および多くの無を椎動物が有する液体循環組織であ
る。

血液は、生きた細胞を含有し、主として体の一部分から
他の部分へ物質を運搬するような特殊の作用を有するの
で、皮膚や筋肉や骨などと同様に、体組織の一種である
と云うことができる。体の化学的作用についての一般的
原則によれば、各生存細胞はそれぞれが生存するために
必要な化学的反応を各細胞自体の中で行つている。従つ
て、各細胞が必要とする全ての物質をその細胞まで運ば
なければならず、また不要な物質はその細胞から除去し
なければならない。高等動物の体中には、非常に高度の
運搬系統、即ち血管系ができており、血液の効果的通路
を形成し、各生存細胞に血液が必要にして充分なだけ接
触するようになつている。生存細胞が必要とする基本的
な物質は、糖類、アミノ酸、脂肪、ビタミン、酸素、塩
類、ホルモンおよび水である。

消化器官は食物の固体成分を、血液が吸収して体内の細
胞へ運ぶことができるような形態に変化させる。細胞が
排出すべき基本的な物質は、炭酸と簡単な可溶性窒素化
合物である。血液はこれらの化合物を各種の排泄器官に
運搬することによつて、体内の有害物質を除去する。高
等動物の血液は、水性の流体部分、即ち血漿と、この中
に懸濁している各種の小体からなつており、小体として
は赤血球、白血球および血小板がある。血漿は淡い麦わ
ら色で、脂肪を含有した食事を摂取しない場合には透明
である。

脂肪を摂取すると、血漿中に脂肪の小球が生成して乳濁
する。血漿中に大量に溶存している物質はアルブミン質
（蛋白質）と食塩である。血漿の一般的性質は、生の卵
白を０．９％の食塩水で希釈したものに似ている。

更に詳しく云えば、血漿の組成は次の通りである。即ち
、水・・・９０％；蛋白質（フイブリノーゲン、グロブ
リン、アルブミン）・・・９％；塩類（Ｎａ，Ｋ，Ｃａ
，Ｍｇ，Ｆｅ，Ｃｕ，その他の塩類）・・・０．９％、
糖、尿素、尿酸およびクレアチニン・・・痕跡量等であ
る。水は他の物質を溶解し、血液が血管系の微細な毛細
血管中を流動できるように充分な流動性を与えるもので
ある。血漿中の塩化ナトリウムは主として蛋白質を溶解
する作用をする。

血液中の大部分の蛋白質は純水に溶解せず、また蛋白質
は溶液状態においてのみ生存用基本物質を生成すること
ができるので、塩化ナトリウムは重要である。正常な血
漿の水素イオン濃度は、１１当り０．４×１０−JャOラ
ム（ＰＨ＝７．４）である。

また、水素イオンが増加すると（ＰＨ値の低下、または
酸血症など）、呼吸が激しく増加して、血漿から空気中
へ炭酸ガスを排出し、血液のＰＨ値を正常値まで上昇さ
せようとする。反対に、血液が異常にアルカリ性になる
と（アルカロージス）、腎臓が尿中にアルカリを多量に
分泌して正常な状態に戻す。このようにして酸とアルカ
リとが釣合つた状態を血液の酸一塩基平衡と云い、血液
の反応をＰＨ７．４に保つことができる。外周血液、即
ち骨髄の外側の血液の小体は二種に分類することができ
る。

１つは酸素を運搬する赤血球であり、他の１つは血液中
の微生物や他の異物質を取り込んで死滅させる作用（食
菌作用）を有する白血球である。

これらの細胞の他に、血液中にはいわゆる血小板も含ま
れている。種々の形状で血液中に存在する成熟した白血
球は数種類に分類することができる。

また、下記の表に示すように、正常な血液中の各種類の
百分率は一定の限度内にある。多形核白而球（顆粒白血
球） 好中球：３８〜７０％ 好エオジン球： １〜５％ 好塩基球： Ｏ〜２％ 単核白血球 リンパ球：１５〜４５％ 単核大白血球： １〜８％ 多形核白而球は割球核を有するのみでなく、細胞原形質
中にも顆粒を有するので、しばしば顆粒白血球とも云わ
れる。

この顆粒白血球は骨髄中の骨髄母細胞から生成し、好中
球、好エオジン球または好塩基球になる。未成熟の顆粒
白血球の成長段階は分類されており、それらの外観には
それぞれ特徴がある。正常血液中の未成熟の顆粒白血球
の数は少ないが、これを多量に観察することは、感染症
あるいは白血病の診断において特に重要である。更に、
血球の各種の形態については、例えば１９７０年にアボ
ツト・ラボラトリーズ（ＡｂｂＯｔｔＬａｂＯｒａｔＯ
ｒｉｅｓ）から発行された）「人間の血球の形態学（Ｔ
ｈｅＭＯｒｐｈＯｌＯｇｙＯｆＨｕｍａｎＢｌＯＯｄＣ
ｅｌｌｓ）玉エル・ダブル・デイツグズ（Ｌ．Ｗ．Ｄｉ
ｇｇｓ）他著；および［臨床血液学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ
ＨｅｍａｔＯｌＯｇｙ）」、エム・エム・ウイントロー
ブ（Ｍ．Ｍ．ＷｉｎｔｒＯｂｅ）著、１９６７年第６版
、２２４〜６０頁、などに詳細に記載されている。

白血球は赤血球よりも非常に数が少ない（約７００対１
）が、病気や感染に抵抗するために身体にとつて非常に
重要である。

更に、白血球が前記のような作用を有するので、病気や
感染などの異常な体調のときには、血液中の白血球が明
らかに変化することが解つている。この変化には、血液
中の赤血球の数に対する比率が非常に増加する場合（白
血球増多症）と減少する場合（白血球減少症）とが有る
。また、血液中の白血球の種類間の比率が変化し、この
変化は特定の病気に対しでそれぞれ特徴を有するもので
ある。この現象については、前記のエム・エム・ウイン
トローブ著、「臨床血液学」、１９６７年第６版、２６
０〜９４頁に詳述されている。従つて、全白血球数（一
定容積の血液中の白血球の全数）および白血球百分率（
血液中の各種の白血球数の百分率）は、診断および医、
学研究上の２つの非常に重要な数値である。通常の医学
研究所で白血球数を求める場合には、正確な容積の血液
試料と正確な容積の赤血球を破壊する溶液（溶解剤）と
を混合し、その希釈試料の一部分を血球計算盤付顕微鏡
スライドに入れて、計算盤の各四角枠内の白血球の数を
眼で数える。

計数結果は通常１ｍ１当りの白血球数で表わす。この白
血球数の計算は退屈な作業であり、かつ少ない試料に基
いて計算するので不正確になり易い。通常の医学研究所
で血液中の白血球の百分比を求める場合には、清浄なガ
ラス製の顕微鏡スライド上に血液試料を塗布し乾燥する
。次にメチルアルコールなどの固定剤と染料混合物を含
有する適宜の試薬で処理する。上記の方法における固定
剤処理は別途に行つてもよい。欠に、処理した血液塗抹
標本を油浸により顕微鏡で観察し、血液塗抹標本の種々
の部分の白血球を眼で数え、記録する。白血球を均一に
分布させることは困難であるから、標本の中央部と共に
周縁部も数え、また２００個以上の白血球を数えること
が望ましい。白血球の百分率はこのようにして計算する
ものであるが、血液塗抹標本が均一でないこと、実際に
数える試料が非常に少量であること、作業自体が退屈で
あること（従つて研究者は隅部を数えずに少ない数値を
出す）、実際に研究者が見た各白血球を分別し、正確に
記録する作業が研究者により一致しないことなどのため
に、従来の計数方法には難点や限界があり、これが正確
さにも影響を及ぼしている。前記の手作業による方法は
、非常に熟練した技術者が行つても時間がかかり、従つ
て分析費用は必然的に高くなり、試験の迅速性にも限度
がある。

白血球の数を数え、その種類を分別する手作業は上記の
ような問題点があるので、この試験を自動的に行い、か
つ生存血液にも嫡用できるように、機械による分析法が
開発されている。機械によつて白血球の数を数える場合
に、白血球を破壊せずに赤血球を破壊するように調整し
た溶解剤を含有する血液試料懸濁液を作る工程がある。

次に残存細胞全部を数えてこれら全部が白血球であると
仮定する。この従来の機械的方法は、赤血球の破壊が必
ずしも完全ではなく、残存した赤血球が白血球として数
えられ、従つて数値の正確さが損なわれるので望ましく
ない。また、赤血球を破壊する条件は白血球をも損傷す
るものであり、白血球が損なわれると白血球の検出が不
正確になる。生存白血球の百分率を機械的に求める場合
は、〔例えば、エム・イングラム（Ｍ．ｎｇｒａｍＸ瓢
「サイエンテイフイツク・アメリカン（Ｓｃｉｅｎ一Ｔ
ｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ）］、１９７０年１１月号、
７２〜８２頁〕、本件出願人の有する米国特許第３，６
８４，３７７号：エム・アール・メラムド（Ｍ．Ｒ．Ｍ
ｅｌａｍｅｄ）他、「ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ
●キヤンナ一（ＥｕｒＯｐｅａｎＪ．Ｃａｎｃｅｒ）」
、第９巻、１８１〜１８４頁、パーガモン・プレス（Ｐ
ｅｒｇａｍＯｎＰｒｅｓｓ） １９７３年発行；エム・
アール・メラムド他、「アメリカン．ジヤーナル・オブ
・クリニカル・パソロジ一（．Ａｒ］１．Ｊ．Ｃ１１ｎ
ｉｃａ１Ｐａｔｈ０１０ｇｙ）」、第５７巻第１号、９
５〜１０２頁、１９７２年１月号；エム・アール・メラ
ムド他、「キヤンサ一（Ｃａｎｃｅｒ）、第２９巻第５
号、１３６１〜６８頁、１９７２年５月号；およびエル
・アール・アダムス（Ｌ．Ｒ．Ａｄａｍｓ）他、「アク
タ・シトロジカ（ＡｃｔａＣｙｔＯＩＯｇｉｃａ）」、
第１５巻第３号、２８９〜９１頁、１９７１年などに記
載された装置以外には満足すべきものがなかつた。

上記の特許および文献等には、生存白血球をリンパ球、
単核大白血球および多形核白血球（顆粒白血球）に分別
する装置が記載されている。しかし、各種の顆粒白血球
（好中球、好エオジン球および好塩基球）を分別するこ
と、および成熟白血球と未成熟白血球とを分別すること
、特に未成熟の顆粒白血球がある場合にこれを識別する
ことなどは、従来は不可能であつた。前記のアボツトラ
ボラトリーズおよびウイントローベの文献によると、未
成熟の顆粒白血球は、いわゆる骨髄細胞を包含している
。生存白血球の数の数え、かつこれらを６種類（リンパ
球、単核大白血球、好中球、好エオジン球、好塩基球お
よび未成熟顆粒白血球）に分別することにより、この６
種の白血球の百分率が正常でないことを明らかにするこ
とができるので、身体的疾病を診断するために非常に望
ましい。

従つて、前記の白血球数および百分率を迅速かつ正確に
、機械的方法によつて算出する技術は、医者が患者の診
断および治療を行う場合に非常に役立つ。従つて、本発
明の目的は、高精度でかつ低廉に白血球の分別分析を行
う新規な方法および自動的装置を提供することである。
本発明の他の目的は、従来の方法では１０分以上要した
白血球の分別分析を、１分以下で迅速に行う新規な方法
および装置を提供することである。

本発明の他の目的は、白血球を染色する間に、非生理的
溶媒に接触させて「シヨツク］を与えた状態で、白血球
を分別して計数する新規な方法および装置を提供するこ
とである。本発明の他の目的は、白血球を非生理的溶媒
に接触させた場合に、白血球が発生する蛍光を測定する
ことによつて白血球の分別分析を行う新規な方法および
装置を提供することである。

白血球を分別して計数する装置を製作するために重要な
他の問題点は、血液中の白血球と他の赤血球や血小板と
を識別できるような信号を装置に与えることである。

機械的に全ての白血球を検出し識別することは、白血球
を分類して分別的に分析するために不可欠なことである
。従つて、本発明の更に他の目的は、白血球を染色し、
白血球から信号を発生し、この信号を機械的に検出する
ことによつて、すべての白血球を識別し、白血球の百分
率を算出するための新規な組成物を提供することである
。

本発明のこれ等以外の目的、利点および特徴は、以下の
記載により明らかになるであろう。

本発明における上記のような目的は、新規な血球染色組
成物、およびこれを用いる方法および装置を見出したこ
とによつて達成されたものである。

前記の組成物は、６種類の生存白血球（未成熟顆粒白血
球を含む）を機械分析法によつて迅速に識別できるよう
な明確な特徴を与えるものである。本発明の染色組成物
は、例えばアクリジンオレンジなどの異染性蛍光染料（
吸収波長範囲内の光を照射して励起することによつて、
各種の波長の蛍光を発生する染料）の水溶液からなるも
のである。この溶液は正常な生理的ＰＨ７．４に調整す
る。但し溶液の表面張力は低く、浸透性即ち食塩濃度は
正常な人血よりも低い。生存血液試料中の白血球を前記
の染色組成物で処理すると、白血球は刺激を受けるが、
そのまま存在し、血液分析中に成分の変性は起らない。
このような条件下で、染色組成物を血液試料に添加して
から約１０秒から数分の間に発生する、所定の２つの波
長（アクリジンオレンジの場合は赤および緑）における
異染性蛍光の強度は、染色された白血球の種類、即ちリ
ンパ球、単核大白血球、好塩基球、好中球、好工オジン
球あるいは未成熟顆粒白血球によつて相違するというこ
とを見出した。この現象を理論的に断定するわけではな
いが、前記６種類の細胞の類臓器間に、染料吸収率の差
異を生じさせるような性質を、低張性染色組成物が有す
るためであると考えられる。云い換えると、各種の白血
球間の蛍光強度の差異は各種の血球の染料吸収率によつ
て定まるものである。一般的に、本発明の染色組成物は
低張性であり、食塩（ＮａＣｌ）の濃度は約２．５〜７
．５９／ｌである。

この内、４．２５９／ｌの溶液が望ましい。また、食塩
の代りに例えばクエン酸ナトリウムなどもこの目的に使
用することができる。染色組成物の染料成分としてアク
リジンオレンジを使用する場合には、前記の米国特許第
３，６８４，３７７号に記載されている量の約４倍の濃
度にする。

即ち、新しく調製した染色組成物中のアクリジンオレン
ジの濃度は、血液試料の懸濁液中に約４Ｘ１０−４〜１
０−２ｇ／ｌとなる程度にする。このように異常に高い
濃度の染料を用いる理由は、各種の白血球の染料吸収率
を増大させるためである。本発明の方法を実施する場合
、新しい血液試料を前記の低張性アクリジンオレンジ水
溶液に懸濁させ、この懸濁液を約３０〜１００秒間放置
する。

この間静かにかくはんすることが望ましい。その後懸濁
液に青色のレーザー光線（波長４８８ｍμ）を照射し、
この青色レーザー光線の照射によつて励起された各白血
球から発生する赤色および緑色の蛍光の強度の相異によ
つて、白血球を分類する。本発明の染色組成物の重要成
分であるアクリジンオレンジ、即ちオイクリシンは単に
「０Ａ」と略示することがある。この染料は異染性蛍光
を有するので本発明の方法に使用することができる。こ
の化合物は、３，６−ビス−（ジメチルアミの′アクリ
ジニウムクロライドという化学名を有する有機化合物で
次のような構造式で示す。

また、アクリジンオレンジは、英国の染料色素業者協会
および米国マサチユーセツツ州ローエルの米国織物化学
者および染色業者協会が共同で発行した「カラー・イン
デツクス」の１９５６年および１９５７年の第２版にカ
ラー・インデツクス番号第４６，００５号として記載さ
れている。

アクリジンオレンジは、例えばニユーヨーク州ロチエス
タ一のイーストマン・コダツク社から市販されている。
アクリジンオレンジはリボ核酸（ＲＮＡ）やデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）などの核酸を染色することができる蛍
光染料として知られている。

例えば、ルドルフ・リグラ一（ＲｕｄＯｌｆＲｉｇｌｅ
ｒ）の報告、アクタ・フイジオロジカ・スカンジナビカ
（ＡｃｔａＰｈｙｓｉＯｌＯｇｉｃａＳｃａｎｄｉｎａ
ｖｉｃａ）、ストツクホルム、１９６６年発行、第６７
巻、追補２６７の「アクリジンオレンジによる細胞内核
酸および核蛋白質の微量蛍光分析」およびアヌルズ・オ
ブ・ザ・ニユ一・ヨーク・アカデミ一●オブ・サイエン
シーズ（ＡｎｎａｌｓＯｆｔｈｅＮｅｗＹＯｒｋＡｃａ
ｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓ）、第１５７巻、第１章
、２１１〜２２４頁、１９６９年３月３１日発行の「核
酸分析におけるアクリジンオレンジ」などに記載されて
いる。細胞の染色にアクリジンオレンジを使用すること
は、ホイールズ（（Ｗｈｅｅｌｅｓｓ）他の米国特許第
３，４９７，６９０号に記載されている。しかし、アク
リジンオレンジを本発明のような異染性蛍光染料として
白血球を染色するため使用することは未だ認められてい
ない。アクリジンオレンジはＲＮＡの赤色蛍光染料とみ
なされており、白血球中のＲＮＡの量は非常に少ないと
通常考えられているので、アクリジンオレンジは前記の
６種類の白血球について意味のある情報を与えるものと
は考えられていなかつた。し力化、予想に反して、アク
リジンオレンジが利用できることを見出したので、白血
球を他の血球と識別し、かつその白血球をリンパ球、単
核大白血球、好塩基球、好中球、好エオジン球および骨
髄細胞（未成熟顆粒白血球）に分別することが可能にな
つた。本発明の方法および装置は、オイクリシン即ちア
クリジンオレンジを使用した場合について説明するが、
他の適宜の蛍光染料（例えば異染性蛍光染料の性質を有
する染色用染料）も本発明の範囲内で使用することがで
きる。

前記のように、本発明の染色組成物は、アクリジンオレ
ンジを４×１０−４〜４Ｘ１０−２９／ｌの濃度で添加
した低張溶液である。

この溶液は、他に浸透圧を人血の血漿の正常値よりも低
くする添加物を含有する。この濃度のアクリジンオレン
ジ溶液は、真の溶液ではなく、一部分は染料分子の集合
体の懸濁液であり、云い換えれば、非常に微細な不溶解
粒子が液中に懸濁したコロイド性分散液である。しかし
、本願の明細書中においては、この組成物を溶液と云う
。一方血液試料とアクリジンオレンジ溶液との混合物を
懸濁液と云う。従つて、アクリジンオレンジ溶液は真の
溶液ではないが、溶液という表現によつて染色組成物自
体を、血液試料添加後の懸濁液と区別することとする。
人血の生理的に正常なＰＨ値は通常７．４０±０．０５
であると考えられており、染色溶液のＰＨも同様な値に
調整することが望ましく、実際の限度としてはＰＨ７．
４Ｏ±１とする。反対に溶液中の塩類の濃度によつて定
まる浸透性は、食塩約８．５ｇ／ｌの溶液に相当する生
理的数値よりも低く調整して、溶媒が血球に対して外傷
を与えるようにする。以下の実施例１においては、アク
リジンオレンジの溶液と食塩緩衝液とを別途に調製し、
次にこれらを混合する。この混合液はアクリジンオレン
ジのコロイド粒子を生成する傾向がある。またコロイド
粒子を含有する混合溶液は寿命に限度が有ることが判明
した。コロイドは容器の壁や底に析出する。従つて、ア
クリジンオレンジを含有する溶液と、食塩緩衝液とを個
別に保存することが望ましい。この２種の溶液は、使用
する田こ適量ずつ混合する。２種の溶液を別々に保存し
ても、あるいは混合して保存しても、熟成が起り、新し
く調製した溶液と比較すると、古い溶液の場合には、所
望の結果を得るために高濃度のアクリジンオレンジが必
要である。

理論的に断定するわけではないが、本発明の方法におけ
る染色組成物の効果は、染料が溶液、顆粒および核の間
で競合するということに関係があると考えられる。

染色率は細胞膜に関連している。本発明の染料溶液は、
各種の白血球の細胞核と顆粒の染色量の差を拡大する。
他の因子としては、細胞核上の顆粒の防護効果、および
各種の細胞中の顆粒の数およびその化学的性質である。
更に、赤血球などの粒子と白血球とを識別する顕著な蛍
光（緑）は、染料が細胞核のＤＮＡ（デオキシリボ核酸
）と結合して、これに青いレーザー光線を照射して励起
することにより発生するものである。

各細胞に結合した染料で、核のＤＮＡと結合しないもの
の大部分は、細胞原形質を染色しており、特に顆粒とし
て知られている原形質類臓器に高濃度に結合している。
細胞原形質中に顆粒が存在するという特徴を有する白血
球、即ち顆粒白血球が細胞原形質内へ多量のアクリジン
オレンジを吸収し、赤い蛍光を多く発生する理由はこの
ためである。細胞原形質に結合したすべてのアクリジン
オレンジは、核に結合したものと異なり、レーザー光線
によつて赤い蛍光を発生する。緑の蛍光は平衝時におけ
るＤＮＡ（：！）染色によるものではあるが、平衝に達
する前における顆粒による染色の阻害や光の防護効果な
どに起因する緑色蛍光の差異を測定することが本発明の
特徴である。顆粒白血球の最大値および最小値は、染色
時間が長くなると近接する。以下に本発明の方法を実施
するための装置について説明する。

この装置は、本出願人の米国特許第３，７０５，７７１
号「光学分析装置」に記載した試料流路と光学系とを備
えている。また、本発明の方法を実施するための装置の
他の部分、特に計数器、陰極線オシロスコープおよびこ
れらの回路は、米国特許第３，６６２，１７６号「粒子
分析法および装置」および前記の米国特許第３，６８４
，３７７号の記載に準じたものであり。参考のために前
記特許の説明を引用する。第１図は、本発明の方法を実
施するための装置の説明図である。

装置には、ミクロキユベツト１１を有する光室１０を設
け、このミクロキユベツト１１の中へ血球の流れ１２を
通過させる。この場合、血球は懸濁液にして容器（図示
せず）から試料管１４を経て供給する。この懸濁液は水
１５の層で包囲して血球粒子を非常に細い流れにするこ
とが望ましい。血球の流れ１２が光室１０を通過すると
同時に、この流れ１２は光源２２から来る細い光線２０
を通過する。この光源２２としてはアルゴンレーザーが
好適であり、光源２２には光の形と方向を定める筒状レ
ンズ２３を付与する。光線２０を各血球に照射すると異
なる蛍光が各血球から発生し、この蛍光を光電式検出器
２４および２６で検出する。

この検出器としては光電子増倍管を用いることができる
。光電式検出器２４および２６で検出した信号は、これ
らの検出器によつて電気信号パルスに変換し、この信号
パルスを接続線３０および３２からソリツドステート増
幅器３４および３６へ送る。検出器２４は赤色蛍光を検
出し、検出器２６は緑色蛍光を検出する。また、検出器
へ到達する蛍光信号はコンデンサーレンズ１６で強めら
れる。二色性鏡１８は約５，８００人の公称遮断波長を
有する。従つて、鏡１８は前記の値よりも短い波長の光
をすべて反射して、フイルタ一１８Ａから検出器２６へ
送る。５，８００λ以上の長波長の光の信号は二色性鏡
１８およびフイルタ一１８Ｂを通過して検出器２４へ到
達する。

検出器２４は赤色蛍光を受光し、フイルタ一１８Ｂは波
長約６，３００Ａの赤色光を透過する。同様に、検出器
２６は緑色蛍光を受光し、フイルタ≧１８Ａは波長約５
，３００λの緑色光を透過する。増幅器３４および３６
で増幅された赤色および緑色の光電子増倍管の信号は、
サンプルホールド増幅回路３８および４０によつて保持
し、２つの蛍光量に比例する振幅を有する２つの信号を
発生する。

比較回路４２は符号４３の接続点で緑色の光電子増倍管
の信号と接続し、緑色信号が白血球を表わす一定の値以
上になつたときに制御信号パルスを発生し、サンプルホ
ールド増幅回路３８および４０を作動させ、またアナロ
グ・デイジタル変換器４４および４５、および計算器４
６へも信号を送る。２つの保留した蛍光パルスは、アナ
ログ・デイジタル変換器４４および４５によつて蛍光量
を表わす計数値に変換して、２つのデイジタル記憶装置
４８および５０へ２つの８ビツトの数値を伝える。

デイジタル記憶装置４８および５０は更に計算器４６の
入力データ記憶装置に接続する。オシロスコープ５２は
取出し一保留回路３８および４０の出力を監視するため
に、オシロスコープのスクリーン５４上に映像を表わす
。また、第２のオシロスコープ（図示せず）を、計算機
４６が処理したデータを表示するために計算機に取付け
ることもできる。計算機４６は、アナログ・デイジタル
変換器４４および４５からの信号と共に、オペレータが
テレタイプ５６によつて与えた入力信号を処理して、分
別分析の結果を算出する。

第２図は、本発明の方法を実施した場合の、陰極線管上
の白血球の表示で、特に実施例１１および実施例１２に
関連するものである。

緑色蛍光信号は底辺から上方への垂直偏向で表わし、赤
色蛍光信号は左辺から右辺への水平偏向で表わす。典型
的な細胞群の明るい信号点を符号６０，７０，８０，９
０，１００および１１０で示す。これらは、それぞれリ
ンパ球（Ｌ）、単核大白血球（財）、好中球Ｎ１好塩基
球（Ｂ）、好エオジン球（Ｅ）および未成熟顆粒白血球
（ＩＧ）に相当する。誤つた信号を検出することを防止
するために、緑色蛍光は、例えば水平線Ｙ。

で示すような比較値を用いて測定する方が良い。このよ
うにすることによつて、比較用水平線Ｙ。よりも大きい
緑色蛍光信号のみが実際に記憶され、かつスクリーンに
表示されることになる。同様にして、Ｙ２で示すような
上限も設ける。

更に、線Ｘ。，Ｘｌ，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４およびＸ，で示
すような限界線を設けることによつて、個々の細胞を別
々に表示し、あるいは以下の実施例１２に示すように数
えることができる。例えば、細胞群７０は、上限をＹ２
およびＸ３とし、下限をＹ１およびＸ１とすることによ
つて選択することができる。第２図に示すような陰極線
管の表示を得るために、第１図に示すような装置を使用
する場合、計算機４６は先ず染色直後の細胞の赤色蛍光
Ｘ−Ｘ３からＸ−Ｘ５の範囲の緑色蛍光Ｙを測定する。

緑色蛍光が増加すると、好中球の平均緑色蛍光を計算し
て、特定の時間の細胞識別プログラムのデータを出す。
従つて、Ｘ３〈Ｘ＜Ｘ５に対してＹの値が所定の範囲に
なると、プログラムはデータ変換に移る。計算機は、２
種類の蛍光量に対する細胞の数からなる２元のヒストグ
ラムを記憶する。

このヒストグラムの第１のパラメーターは緑色蛍光に比
例させる。第２のパラメーターは赤色蛍光に比例させる
か、あるいは緑色蛍光対赤色蛍光の比率に比例させる。
２つのパラメーターのヒストグラムのとり方は以下の第
１表に示す。

ＸｉおよびＹ１の値は操作者が定める。プログラムは各
区分の細胞数を数え、この数値を印刷するようになつて
いる。実施例 １本発明の方法に使用する染色組成物を
次のようにして調製した。

先ず、４Ｘ１０−３９／ｌのアクリジンオレンジを含有
する水溶液に、４．２５９Ａの塩化ナトリウムを添加し
て、溶液の浸透圧を通常の生理的等張液の半分の値に調
節し、更にＰＨ約７．４の緩衝液にした。緩衝液にする
操作は、溶液１１に対して、ＮａＨ２ｐＯ４・Ｈ２Ｏを
４５η、およびＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２０を２５０η添
加して、リン酸のナトリウム塩のリンのモル濃度を０．
００１２５にすればよい。この組成物は次のような工程
により調製することができる。

即ち、１１の容器に、１１より少ない蒸留水を入れ、４
．２５９の塩化ナトリウムと、０．０４５９のＮａＨ２
ｐＯ４・Ｈ２Ｏと０．２５０９のＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ
２０とを添加する。次に、この混合物を撹拌して添加し
た塩類を溶解した後、蒸留水を更に加えて全量を１１に
する。一方、他の容器で、４００７ｎ９のアクリジンオ
レンジを蒸留水に溶解し、１００ｍ１のアクリジンオレ
ンジ溶液を調製する。この溶液をアクリジンオレンジが
水に溶解するまで撹拌すると、赤昧を帯びたオレンジ色
の清澄な溶液になる。この１００ｍ１のアクリジンオレ
ンジ溶液から１ｍ１を採取し、これを前に調製した１１
の食塩緩衝液に添加して、前記のようなアクリジンオレ
ンジ粗成物を調製する。食塩緩衝液とアクリジンオレン
ジ溶液とを混合すると、一部のアクリジンオレンジはコ
ロイド状懸濁になる。この混合液はＰＨメーターで検査
をすることが望ましい。

そして、もしＰＨの調整が必要な場合には、０．１Ｎの
塩酸を１，２滴加えてＰＨを下げるか、あるいは０．１
Ｎの水酸化ナトリウムを加えてＰＨを上げればよい。前
記の染色組成物を本発明の方法に使用したところ、非常
に満足すべき結果を得ることができた。

実施例 ２実施例１における、リン酸塩緩衝液の代りに
、０．００５Ｍの濃度の、通常「へヘス（ＨＥＰＥＳ）
」と云うＮ−２−ヒドロキシーエチルピペラジンＮ′−
２−エタンスルホン酸の緩衝液を使用した他は、実施例
１と同様にして染色組成物を調製した。

実施例 ３実施例１における、リン酸塩緩衝液の代りに
、０．１５Ｍの濃度の、通常「トリス（ＴＲＩＳ）」と
云う２−アミノ−２−（ヒドロキシ−メチル）１、３−
プロパンジオールの緩衝液を使用した他は、実施例１と
同様にして染色組成物を調製した。

実施例 ４アクリジンオレンジの濃度を実施例１の４倍
の１．６×１０−２ｇ／ｌにした他は、実施例１と同様
にして染色組成物を調製した。

この濃度でも本発明の方法を良好に実施することができ
た。実施例 ５ アクリジンオレンジの濃度を４×１０−２９／ｌに上昇
させた他は実施例１と同様にして染色組成物を調製した
。

この濃度の組成物でも満足な結果を得ることができたが
、前記の実施例の低濃度の場合のように効果的ではなか
つた。従つて、この濃度が本発明の方法におけるアタリ
ジンオレンジの濃度の上限であると考えられる。この場
合は、白血球の種類を効果的に識別するためには、染色
効果が大き過ぎるように思われる。実施例 ６ アクリジンオレンジの濃度を３×１０−３９／ｌにした
他は、実施例１と同様にして、染色組成物を調製した。

この組成物は本発明の方法に好適であり、良好な結果を
得た。

従つて、白血球と他の血球との明確な識別が可能であつ
た。しかし、白血球自体の種類を識別する効果は実施例
１の染色組成物よりも劣つた、従つて、アクリジンオレ
ンジのこの濃度は本発明の方法における良好な範囲の下
限であると考えられる。実施例 ７ アクリジンオレンジの濃度を４×１０−４９／ｌに減少
させた他は、実施例１と同様にして染色組成物を調製し
た。

この組成物は本発明の方法の一部の目的には効果的であ
つた。

即ち、白血球と他の血球とを明確に識別することができ
たが、白血球自体の種類を識別する効果は非常に阻害さ
れた。従つて、この濃度が、本発明の方法におけるアク
リジンオレンジ濃度の下限である。実施例１に説明した
ように、実施例２から７のアクリジンオレンジ溶液を食
塩緩衝液に加えた場合、いずれも多少のコロイドを生成
した。

実施例 ８ 塩化ナトリウムを２．５５９／ｌ添加して浸透圧を等張
溶液の約０，３倍にした他は、実施例１と同様にして染
色組成物を調製した。

この組成物を使用した場合には、分析する前に一部の白
血球が死滅するので、本発明の方法には適当ではなかつ
た。

従つて、等張溶液の０．３倍の浸透圧は本発明の方法に
おける低張溶液の下限である。実施例 ９ 塩化ナトリウムを５．９５９／ｌ添加して浸透圧を等張
溶液の０．７倍にした他は、実施例１と同様にして染色
組成物を調製した。

この組成物を使用した場合には、明るい蛍光信号点の群
が充分に分離しないので、本発明の方法においては不満
足であつた。

従つて、等張溶液の０．７倍の浸透圧が、本発明の方法
における低張溶液の上限である。実施例 １０ 本発明の方法を実施するために、新鮮な血液試料０．１
０ｍ１を、実施例１で調製したアクリジンオレンジ染色
組成物１ｍ１に添加した。

この懸濁液を時々静かに撹拌し、１０秒から数分間放置
し血液試料中の白血球に染料を結合させた。次に、懸濁
液を非常に微細な流れにして光室を通過させる流動系に
供給した。この流動系は各血球（赤血球および白血球）
が１つずつ単一の列になつて系を通過する程度に細くな
つており、光室中で、血球は青色レーザー光線の均一な
光の中を通過する。このレーザー光線は波長４８８０人
（４８８ｍμ）のアルゴンイオンレーザーが好適である
。レーザーからの均一な光束は、血球の流動方向におけ
る幅を非常に狭くすることが望ましい。この幅は単一の
血球の最大寸法と同程度にして、血球を１個ずつ照射し
た。次に、アルゴンレーザー光線で白血球を光学的に励
起することにより発生する、中心波長が約５３００Ａの
緑色蛍光を検出した。

白血球の全数はこの緑色蛍光パルスの数によつて測定し
た。正確に計量した懸濁液試料について測定を行い、単
位容積当りの白血球数を求めた。前記の範囲のアクリジ
ンオレンジ濃度では、赤血球はアクリジンオレンジを実
質的に吸収しないので、前記の検出器では検出されない
ことを見出した。

（し力化、これには後記のような例外がある）。これに
反して、各白血球はアクリジンオレンジを吸収して緑色
蛍光を発生したので、白血球を迅速かつ正確に数えるこ
とができた。未成熟の赤血球、即ち網状赤血球はアクリ
ジンオレンジを多少吸収するが、この場合実質的に網状
赤血球から緑色蛍光は発生しない。従つて、緑色蛍光の
発生は白血球を他の血球から正確に識別する基準になる
。実施例 １１ 実施例１０と同様に行つたが、この場合、緑色蛍光を検
出した他に、各血球の赤色蛍光（波長約６５００人）も
検出した。

赤色および緑色の信号は二色性鏡および適当なフイルタ
一で分離することができ、これらは別々の光電子増倍管
で増幅した。緑色信号は全白血球数を測定するために用
い、また緑色および赤色の信号を組合わせて陰極線管上
に表示した。この場合、陰極線管上の各白血球の表示に
ついて、緑色信号は縦座標を定めるために用い、赤色信
号は横座標を定めるために用いた。従つて、各種の白血
球の種々の大きさの赤色蛍光および緑色蛍光を陰極線管
上に表示することができた。赤色および緑色の蛍光量が
相違するのは、白血球の種類によつて特徴が相違するか
らであり、細胞原形質中に最も多くの顆粒を有する白血
球は一般的に最大の赤色蛍光信号を発生する。しかし、
顆粒白血球中の顆粒の化学組成は種類によつて相違して
いるので、赤色蛍光量が相違することになる。白血球は
すべて同量のＤＮＡを含有しているが、各種の血球中の
顆粒による染料要求度が相違しているので、発生する緑
色蛍光量は相違する。各血液試料は白血球の各種類別を
示す顕著な点の群を生ずることを見出した。従つて、２
次元のパターンを陰極線管上に表示すると、試料中の白
血球の分布に関する定性的情報を得ることができる。正
常な人の血液試料のパターンと、白血球の釣合いを失つ
た患者の血液試料のパターンとを比較することにより、
この相違を定性的に迅速に検査することができる。この
ようにして表示したパターンは、後日解析し研究するた
めの永久的資料や同一患者の後日の比較資料として、写
真的に記録しておくことが望ましい。

実施例 １２ 実施例１１と同様な操作を行つた。

但しこの場合、各群の緑色および赤色蛍光信号を選択す
るために比較回路を使用し、所望の白血球の信号を計数
した。比較回路の設定値を変更して、他の白血球につい
ても同様なことを行い、各種の白血球について、それぞ
れの数を数えた。このようにして、全白血球数に対する
各白血球の比率を算出した。この比率は百分率で表わす
ことが望ましい。また、多数の比較回路を用いて一度に
各種の白血球を計数することも可能である。この装置は
非常に迅速に作動するので、１秒間に１０００個位の速
度で白血球を数えることができる。

従来の顕微鏡的方法において各血球数が２００位であつ
たものに比較して、本発明の方法では数千個の白血球を
数えることができるので、従来では達成できなかつたよ
うな正確さを以て測定することができる。更に、血球を
数えるときに各血球は生存しており、また赤血球を死滅
させるような工程を経ないので血球が損傷されることも
なく、患者の生存血液の血球数に非常に良く対応した白
血球数を測定することができる。本発明の方法および染
色組成物は、緑色蛍光で白血球と赤血球とを識別するこ
とによつて（赤血球の存在を検出しないで）白血球を検
出し計数し、かつ白血球の種類を識別するという点で非
常に効果的である。

白血球の各種類は、それぞれ異なつた点の群を陰極線管
上に作るので、識別することが可能である。従つて、６
種類の白血球、即ちリンパ球、単核大白血球、好中球、
好塩基球、好エオジン球および未成熟の顆粒白血球を識
別することができる。実施例 １３ アルゴンレーザーの代りにヘリウム−カドミウムレーザ
ーを用いて実施例１１と同様な操作を行つた。

この試験結果は満足すべきものであつたが、オシロスコ
ープ上の映像群の一部はアルゴンレーザーのものに比較
して明瞭でなかつた。多分これはヘリウム−カドミウム
レーザーの質の相違によるためであろうと考えられる。
実施例 １４ これまでの説明は、すべて血液中の白血球を他の粒子か
ら識別し、かつ白血球に関する有用な数値を求めること
に関するものであつた。

しかし、本発明は血液に関してこれら以外の知見を得る
ためにも有用である。例えば、本発明は、単位容積の血
液中の網状赤血球を検出し、数えるためにも利用するこ
とができる。網状赤血球は、未成熟の段階を表わす顆粒
や線糸の網状構造を含んだ赤血球である。網状赤血球は
全赤血球の約１％を占めているが、この比率は、体が異
常な場合には非常に変化するので、この変化によつて疾
病を見出すことができる。前記の実施例に示したような
条件下で、網状赤血球はアクリジンオレンジ染料を、他
の赤血球よりも多量に吸収する。

他の赤血球によるアクリジンオレンジの吸収は重要では
ないが、網状赤血球はかなりの染料を吸収し赤い蛍光信
号を発生する。この蛍光量は白血球のリンパ球が発生す
るものと実質的に同じ位である。しかし、網状赤血球は
緑色蛍光を多量に発生することはない。従つて、血液試
料を本発明のアクリジンオレンジ組成物で染色し、次に
緑色蛍光を発生する白血球をすべて除外することによつ
て網状赤血球を識別し、赤い蛍光を発生するこの血球を
検出することによつて、網状赤血球を測定することがで
きる。以下の実施例はこの工程を説明するものである。
実施例１０と同様な操作を行つた。

但し、染料の濃度を実施例５に示した濃度まで上昇させ
、白血球からの緑色蛍光は白血球を除去するための識別
信号として用い、更に赤色蛍光は波長６，５００八で測
定することによつて、赤色蛍光を発生し、かつ緑色蛍光
を発生しないすべての血球を選択した。実施例１１に記
載したように、緑色信号は垂直座標値として用い、かつ
緑色信号の限界値を低くした状態にして全ての白血球を
除外し、赤色信号を水平座標値として用いることにより
、網状赤血球を検出した。実施例 １５ 第１図に示した装置を使用して実施例１１と同様な操作
を行つた。

増幅後の緑色および赤色の光電子増倍管信号を取出して
保留し、２つの蛍光の強さに比例する振幅のパルスを発
生した。比較回路を緑色の光電子増倍管信号に接続し、
緑色信号が白血球を示す一定の値以上になつたときに制
御信号を発生し、取出し保留用増幅器およびタイミング
信号を変換器と計算器に対して作動させた。２つの保留
した蛍光信号は、それぞれのアナログ・デイジタル変換
器で蛍光量を表わす２つの８ビツトの数値に変換し、２
つのデイジタル記憶装置に送つた。

記憶装置は計算機の入力装置、例えばデーター゜ジエネ
ラル（ＤａｔａＧｅｍｅｒａＩ）へ接続した。計算機は
前記信号およびオペレーターがテレタイプで与えた入力
を処理して、テレタイプに分別計数値の出力を送つた。
計算器は最初に、血球が染色された直後に測定した赤色
蛍光がＸ＝Ｘ３からＸ＝Ｘ５の範囲内の緑色蛍光Ｙの値
を監視した。

緑色蛍光が増加してから、好中球の平均蛍光値を計算し
、血球識別プログラムのデーターを算出する特定の時間
を計算した。従つて、Ｘ３くＸ＜Ｘ５に対してＹが所定
の値になつたときに、プログラムをデーター処理のモー
ドへ切換えた。計算機は、２元のヒストグラム、即ち２
つの蛍光値の各々に対しての細胞数を記憶することが可
能である。

この実施例ではこの２元のヒストグラムは６４×６４で
あつた。このヒストグラムの第１のパラメーターは緑色
蛍光に比例させ、第２のパラメーターは赤色蛍光あるい
は赤色蛍光と緑色蛍光との比率にした。簡単な識別プロ
グラムによつて、Ｙが所定の値になつた後に、１０，０
００の血球を測定して、緑色蛍光対赤色蛍光あるいは緑
色蛍光対赤色蛍光と緑色蛍光との比率のヒストグラムを
作つた。

２つのパラメーターのヒストグラムは前記第１表のよう
に区分した。

ＸｉおよびＹｉの数値はオペレーターが定めた。このプ
ログラムによつて、各区分の細胞数を計算し、この数値
を印刷した。各区分のデーターの最初の３つの集計モー
メントを両方のパラメーターについて計算することによ
つて、特定の疾病に関連した指標を得ることができる。

更に複雑なプログラムでは、各度数を分割する線は一定
ではないが、プログラムによつて定めることができる。

例えば、Ｘ１に対する適当な数値を見出すために、Ｙ１
およびＹ２間のデーターを集計し、緑色蛍光Ｙ１〜Ｙ２
内の一元ヒストグラムを作る。この場合、リンパ球と単
核大白血球との間に蛍光値の最小部分が存在し、そこが
細胞数の最小値である。この最小値は種々の方法で決定
することができ、例えば二次関数を用いて回帰分析を行
つても良い。前記の実施例は、本発明の方法、組成物お
よび装置を説明するためのものであり、これらを限定す
るものではない。

従つて、頭書の特許請求の範囲内で、各種の変更を行い
得ることは明らかであるＯ

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するための蛍光分析装置の
説明図、および第２図は本発明の方法によつて生ずる６
種類の白血球の群を表示する説明図である。 １０・・・・・・光室、１１・・・・・・ミクロキユベ
ツト、１２・・・・・・血球の流れ、１４・・・・・・
試料管、１６・・・・・・コンデンサーレンズ、１８・
・・・・・二色性鏡、１８Ａ，１８Ｂ・・・・・・フイ
ルタ一、２０・・・・・・光線、２２・・・・・・光源
、２４，２６・・・・・・光電式検出器、３４，３６・
・・・・・増幅器、５２・・・・・・オシロスコープ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の工程（イ）から（ニ）よりなる、血液試料中
   の白血球の蛍光分析法。 （イ）白血球の核物質を染色して、他の血球とは異なる
   蛍光を、前記核物質から発生させる異染性蛍光染料を用
   いて、生理的正常ｐＨ値を有し、かつ白血球の種類によ
   つて染色度の相違する低張水溶液を調整する工程；（ロ
   ）血液試料を、工程（イ）で調製した染料溶液に懸濁さ
   せて、血液試料中の生存白血球を染色する工程；（ハ）
   染料の吸収が平衡に達する前に、工程（ロ）で調製した
   懸濁液を、染色された血球が吸収し得る波長を有する光
   で照射する工程；および（ニ）２種の蛍光の強度および
   差によつて、各種の白血球を識別する工程。 ２ 以下の工程（イ）から（ハ）よりなり、血液試料中
   の白血球と他の血球とを識別し、かつ白血球を好中球、
   好エオジン球、好塩基球、リンパ球、単核大白血球およ
   び未成熟顆粒白血球に分別することを特徴とする白血球
   の蛍光分析法。 （イ）約４×１０＾４〜４×１０＾２ｇ／ｌのアクリジ
   ンオレンジを含有し、生理的正常ｐＨ値を有し、かつ生
   理的正常浸透圧よりも低い浸透圧を呈する量の食塩を含
   有する溶液に血液試料を混合して、懸濁液を調製する工
   程；（ロ）工程（イ）で調製した懸濁液に光線を照射し
   て、該光線の照射により各白血球から発生する緑色蛍光
   を検出することによつて白血球と他の血球とを識別する
   工程；および（ハ）同時に、前記放射線の照射により各
   白血球から発生する赤色蛍光および緑色蛍光の光量を検
   出することによつて、白血球を種類別に分類する工程。