JPS6022661A - 細胞の同時的定量測定法およびそのための試薬 - Google Patents

細胞の同時的定量測定法およびそのための試薬

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JPS6022661A
JPS6022661A JP58191063A JP19106383A JPS6022661A JP S6022661 A JPS6022661 A JP S6022661A JP 58191063 A JP58191063 A JP 58191063A JP 19106383 A JP19106383 A JP 19106383A JP S6022661 A JPS6022661 A JP S6022661A
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cell
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ギユンタ−・フアレ−ト
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞の同時的定量測定法およびその実施に適す
る試薬に関する。
血球計数は診断および臨床分野でもつとも頻繁に行われ
る研究室試験の１つである。西独だけで毎日致方のこの
ような測定が実施されていると推定される。測定は災害
医学、強力薬剤および手術室の分野でとくに重要である
。
完全な血液像を得るため通常各血液試料から６つの別個
の試験が実施される： Ｉ赤血球計数（電気的計数器、血球計算板）２白面球計
数（電気的計数器、血球計算板）：３．血小板計数（電
気的または光散乱計数器、血球計算板） ４ヘマトクリツト（平均赤血球容積（ＭＣＶ）を計算す
るための遠心器） ５網赤血球（ブリリアントクレシルゾル−による染色、
塗抹および計数） ６、白血球分画（塗抹、ギームザ染色および計数９ と（に網赤血球および白血球計数ならびに分画血液像は
時間を要し、方法的に困難である。血球の１つの定量測
定の所要時間は数時間である単細胞として存在する他の
細胞のたとえば組織の機械的または化学的分離による測
定の場合も同様である。それゆえ現在まで必要な大きい
所要時間および労力を著しく小さくシつる迅速かつ自動
化可能な方法の開発が要求される。
この目的は本発明により測定すべき細胞を含む試料を血
球の少な（とも１つの性質を染色する蛍光染料とともに
定温保持し、次に細胞の容積および蛍光を少なくとも１
つの波長で同時に測定ずろ細胞の同時的定量測定法によ
って解決される′。
本発明の方法は細胞の性質を染料によって着色し、同時
に細胞容積をたとえば貫流形細胞計数器で測定する原理
に基く。染色した細胞の容積および蛍光の自動装置で実
施される同時的測定によって個々の細胞の種類および量
が検出され、細胞の種類ごとに蛍光および細胞容積は特
定の値を有するので、測定した細胞容積および蛍光に応
じて血球の種類を特定することができる。この方法によ
りたとえば数分内に完全な血液像をきわめて小さい労力
で得ることができる。
本発明により使用する染料によって染色される細胞の性
質は成分性質または機能性質である。
成分性質は細胞の合成によって発生ずるたとえばＤＮＡ
　、　ＲＮＡ　、タン白質およびリピ１のようなもので
あり、機能性質は物質交換過程の結果たとえば膜電位お
よび細胞内ｐＨ値のようなものである。
Ｄ　Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａ染料および窓膜電位染料による細
胞の同時染色が本発明の方法にと（に適することが実証
され、それゆえ特に有利である。本発明のこの有利な実
施例にと（に適するＤＮＡ／ＲＮＡ染料はアクリジンオ
レンジ（ＡＯ）、キナクリンおよびビロニンＹであり、
アクリジンオレンジがと（に有利である。窓膜電位染料
の群の５ち３、イージヘキシルーオキサー力ルぎシアニ
ン（ＤｉＯＣ６（３）　）が有利である。有利な物質は
同じスペクトル帯域が同じ光源で励起され、それゆえ細
胞試料に添加しうる前混合した試薬の製造に適する。
本発明に適する前記群の他の染料の例は細胞タン白質染
色用の蛍光アミン（フルラム）、１−アニリノナフタリ
ン−８−スルホン酸（ＡＮ’Ｓ）および０−フタルアル
デヒド、す・ビド染色用の４−アミノアクリジン、遊離
ＳＲ基染色用のＮ−（３−フルオランチル）マレイミｒ
、Ｌ　酵素活性（この場合エステル活性）染色用のフル
オレセインジアセテー）　（ＦＤＡ）および細胞内ｐＨ
値染色用の１．４−ジアセトキシ−２，３−、、＞シア
ノ−ペンゾール（ＡＤＨ）である。
細胞・の容積またはサイズ分布は光の散乱により　（Ｊ
、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　２　７　
、　３　５　９〜３　６　５ページ、　］、　９７９年
参照）または狭い通路を通過する際の電気抵抗変化の測
定により（Ｃｏｕｌｔｅｒ法、たとえばＭｅｌａｍｅｄ
、Ｍｕｌｌａｎｅｙ　ｕｎｄ　Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎに
よるＦｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｓｏｒｔ
ｉｎｇ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｃｙａｎｄ　５ｏｎｓ、Ｉ
ｎｃ、　１９７９年６１〜１’０　’１ページ参照）測
定される。Ｃｏｕｌｔｅｒ法は有利である。
この方法は血液試料を小さい直径の短い孔を通して流し
、この位置で電気抵抗の変化を測定し、その寿粒子抵抗
が電解質の抵抗と異なる事実に基く。孔を介して２つの
電極の間に一定電流が流されるこの孔を細胞が通過する
除虫ずる電圧変化は粒子容積に直接比例する。
染料による定温保持は有利に室温で数分間実施される。
一般に有利に等張索塩水で適当に稀釈した被検血液試料
に染料溶液を添加することを考慮して、１〜ＩＯ分と（
に２〜６分の室温静置で十分である。静置後被検試料を
適当な装置たとえば市販の貫流形細胞計数器へ導入する
。
この計数器は細胞容積および蛍光を同時に測定すること
ができ、したがって各粒子に対して測定した容積と、相
当する蛍光測定が対応し得なければならない。
電気的方法は絶対容積が測定されるため各種血球単細胞
の実験的に測定した染料含量を染料濃度として表わしう
るので有利である。したがって種々の細胞の６１１１定
した性質は標準化した方法で直接互いに比較することが
できる。これに反し光散乱法は光の散乱が細胞容積およ
び形状のほかにこらに細胞表面および細胞内部の性質に
関係するので、これができない。
アクリジンオレンジ（ＡＯ）をＤｉＯＣ６とともに使用
する本発明の有利な実施例によれば、ＡＯによって赤血
球を除くすべての血球がよく染色され、ＤｉＯＣ６によ
って赤血球もよく染色され、さらに同時に他の細胞の染
色が改善される事実を利用することができる。
本発明のもう１つの有利な実施例によれば測定はと（に
蛍光染料で染色した単分散蛍光性検量相の存在のもとに
実施される。添加した蛍光性検量相の濃度が既知の場合
、血液中の郁々の細胞の絶対濃度を測定することが可能
になる。
検量相としては直径１〜１０μｍ１とくに４〜６μｍの
単分散ラテックス粒子が使用される。しかし血球程度の
既知均一サイズおよび既知濃度の他の蛍光粒子を使用す
ることもできる。
本発明の方法の実施はきわめて簡単である。
血液に生理的食塩水および染料ならびに場合いより検量
相の粒子を添加する。たとえば３〜５分の染色時間後、
染色した血球は適当な装置、たとえば市販の貫流形血球
計数器を使用して毎秒約２０００細胞の速度で約５〜１
５分の時間測定する。この方法ですべての種類の血球を
十分な量で定量的に測定することができる。
組織細胞を測定する場合、組織はまず相当する組織の解
離たとえば組織チヨツ・ξによる切断によって分離され
る。この後の方法は血球に対し前記した方法と同様であ
る。
さらに本発明の方法によれば１つだけでな（多数の蛍光
を測定することができる。たとえばＡＯおよびＤｉＯＣ
６を使用する本発明の有利な実施例によれば、天然のＤ
ＮＡ／ＲＮＡ　（ら線形）の黄色蛍光も、ら線を除いた
形の赤色蛍光も測定することができる。それによって付
加的に血球の機能状態に関する情報を得ることができる
。
それゆえ本発明の方法はこの実施例によれば定量的血球
計数を実施しうるのみならず、公知法で不可能であった
特定の個々の種類の細胞の機能状態に関する情報を得る
ことができろ。
本発明により使用する染料は水銀またはキセノンランプ
を備える光学系でもレーザ装置を備える光学系でも測定
することができる。
本発明のも５１つの目的は本発明の方法を実施する試薬
であり、その特徴はＤＮＡ／ＲＮＡ染料、細胞クン白質
染料、リビド染料、酵素染料、窓膜電位染料、細胞内ｐ
Ｈ染料、ＳＲ基染料の群から選択した蛍光染料および付
加的に単分散検量相を含むことである。
本発明による有利な試薬はＤＮＡ／ＲＮＡ染料および窓
膜電位染料を含む。
アクリジンオレンジ、３．了−ノヘキシルーオキサー力
ルポシアニン、直径１〜１０μｍの単分散ラテックス粒
子および溶剤を含む試薬はと（に有利である。
本発明の試薬に適当な溶剤はそれぞれ選択した染料およ
び単分散相を十分な濃度で溶解し、検量相の粒子を攻撃
たとえば溶解しないものである。有利な溶剤はジメチル
スルホキシ１、ジメチルホルムアミドおよびアルカノー
ルで゛ある。
本発明により同時にすべての種類の細胞を数分間で定量
的に測定することが達成され、その際迅速な染色時間お
よび方法ずなわち染色、測定および評価の完全な自動化
可能性が重要な役割を演する。この場合細胞計数のほか
にさらに個々の種類の細胞の機能状態に関する情報を得
ることもできる。
さらにこの方法は測定時間の短縮および情報力の拡大が
可能であるだけでなく、とくに約２、　ｓ　ｌｏｇｌｏ
ずなわち約１：５００の大きい測定範囲に適用すること
ができる。
この利点の意義は次の事実から説明することができる：
種々の血球の正常濃度すなわち赤血球５×１０６、血小
板３×１０５、白血球５×１０３／闘３から出発して、
これらずぺての血球を同時に測定しようとすれば、どう
しても広い測定範囲が必要となることは明らかである。
現在まで５〜７１０／ｉ＋ｉ　より低い血小板濃度を測
定することは困難であった。本発明によればこの下限は
Ｉ　Ｘ　１．０　／ｙｎｍ　に低下される。これはちょ
うど１０００００／ｘｉ３の範囲および３００００／ｍ
ｍ”にとくに臨界範囲があるので重要である。前者は病
理範囲、後者は急性危険範囲である。
本発明の方法のもう１つの適用法は薬剤の個々の細胞へ
の効果たとえば静細胞因子剤の腫瘍細胞への効果の試験
である。これはとくに毒性の高い薬剤の場合、特殊な個
体におけるその効果が毒性副作用に耐えることを正当化
するかどうかの事前テストを可能にする。たとえば腫瘍
組織から単細胞を機械的に採取し、適当な栄養媒体たと
えばへ・クリン化した患者血漿中で試験薬剤存在のもと
に試験し、次に本発明の方法により腫瘍細胞が薬剤によ
って死滅した割合と、なお生存している割合を定量的に
測定することができる。本発明の方法は使用しうる多数
の薬剤の中からそれぞれもつとも有効なものを見いだす
ために使用することができる。
次に本発明の図面と関連して説明する。
例１： 指先の内側から血液５μｌを採取し、等張索塩水（トリ
スＨＣｌ１　ＯｍＭを含むＮａＣ１０，１５Ｍ、ｐＨ７
，４（ＴＢＳ　）で１／２５０に稀釈する。細胞１１■
濁液を試薬（Ａ　Ｏ０，４ｍｇ／　ｍ１３、ＤｉＯＣ６
０，０２Ｉｔ　９／　ｍ１３および濃度５　Ｘ　１０７
／ｍｉのＦＩＴＣで染色した４μｍ単分散ラテックス粒
子）５μｌとともに３〜５分間室温で定温保持する。試
薬の溶媒および懸濁媒としてジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）を使用する。懸濁液を振とうしてよ（混合し、
第１図に構造原理を示す貫流形血球計数器へ導入する。
この計数器は市販でＦｌｕｒｏ−ｎｅｔｒｉｃｅｌｌの
名称で入手される。ＡＯ／ＤｉＯＣ６による染色の場合
法のフィルタおよびミラーを使用する〜１　短波長ノξ
ス（ＫＰ）５００ｎｍ　、長波長ノξス（ＬＰ）４１８
ｎｍのフィルタ； ２２色性分割ミラー（Ｄ）５００ｎｍ；３２・ξラメー
タ測定の場合反射ミラーまたは３ノ８ラメ−タロ（１１
定の場合Ｄ　５３０ｎｍ　；４　ＬＰ　５００ｎｙｎ； ５　反射ミラー： ６　ＬＰ　ｓｓｏｎｍ； ＡＯ／ＤｉＯＣ６を４１−８〜５００　ｎｕで励起する
。発生する蛍光は２・ξラメータ測定（容積対蛍光１）
の場合、５００〜７００ｎ１ｎの間を光電管ｔ　（ＰＭ
Ｉ）によって集光する。３ノξラメータ測定の場合、５
００〜５３０ｎｍの黄色光および５５０〜７００ｎｍの
赤色光をＰＭ、１およびＰＭ２によって測定する。
第２〜６図に示す結果を得るため直径５０μｍ。
長さ５０μｍの円筒形測定孔を設ける。貫流形血球計数
器の液体系に２５℃の緩衝液を充てんする。細胞容積は
０．３８５ｍＡの電流で測定した。
蛍光をＨＢＯ〜１００水銀高圧ランプで励起した。対数
的に強くなる細胞の蛍光および容積信号をマルチチャネ
ル解析器内に２ノξラメ−ターヒストグラムとして蓄積
し、またはオンラインで磁気テープに記録した。磁気テ
ープによって曲線をグラフおよびコンピュータにより評
価した。マイクロプロセッサ制御したデータモジュール
を使用ずろ場合、色素添加および測定ならびに評価を原
則的に完全に自動化することができる。
第２ａ図は細胞容積を蛍光に対しグラフ表示で示す。
第２ａ図の細胞群の積分による計算により次の値が得ら
れる 第２ｂ図は染料添加なしの同様の結果を示す。
細胞に結合した蛍光は認められない。
ＦＬＵＶＯ−ＭＥＴＲｆＣＥＬＬ貫流形血球計ｉＷの容
積および蛍光・ξルスを２．５　ｌｏｇ１ｏ増幅器によ
り対数化し、次にその最大振幅に応じてマルチチャネル
解析器の６４．Ｘ６４マトリツクスへインプットした。
グラフィック表示のためマトリックスのチャネル内容を
対数化しく　３１ａｇ１ｏ振幅）７Ｍで示す値へ標準化
した。最大チャネル内容Ｍを２０等分した（５チステツ
ゾ）。各チャネル内容はその相対頻度に応じて１−１０
の値を得た。
振幅が最大値の５０％より高いチャネル内容は壷記号で
示した。
例２〜９： 例１に記載したものと同じ装置を使用して、各５００μ
ｇを１：２５０に稀釈したヒトの血液で血球め同時的定
量測定を実施し、その際それぞれ次表に示す試薬５μｌ
で染色した：結果は第３および４図にグラフで示される
。
例１Ｏ： 例１゛記載のように、ＡＯ／ＤｉＯＣ６で染色したなわ
ち黄色（蛍光１　：　ＡＯ／ＤｉＯＣ６染色による膜電
位）および赤色（蛍光２：ら線を除いたＲＮＡ／ＤＮＡ
　）の蛍光によって図示する。この３・ξラメータ検出
により第５図に示す測定値の雲形表示が可能になる。
第５および６図の各軸の目盛は２．　ｓ　ｌｏｇ　１ｏ
を含む。個々の細胞の３つの測定・ξルスは第５図の表
示のため対数化し、オンラインで磁気テープに伝送した
。評価のため測定値を３２Ｘ３２Ｘ３２マトリツクスに
分類ｔ７、雲プログラム（ｃｙｔｏｍｃｔｒｙｌ、　、
　２２２〜２２８ページ、１９８０年参照）により表示
した。細胞および検量粒子の存在は最大チャネル内容の
１％境界線によって示される。個々の細胞種類および検
討粒子は互いに良好に区別される。
第６図は１１５００に稀釈したヒトの血液をＤｉＯＣ６
（ａ）およびＡＯ／Ｄ　ｉ　ＱＣ［３（ｂ）で同時に染
色して３・ぐラメータ測定の黄色（蛍光ｌ）を赤色（蛍
光２）に対して表示した。これから明らかなように３ノ
ξラメータ測定により種々の細胞のＲＮＡ濃度を測定す
ることができる。付加的ＡＯ染色により曲線６ｂのＴｈ
＋Ｒｅで示す部分は著しい赤色シフトを示す。赤色シフ
トした粒子（Ｊ、）および不変化に留まる粒子（１０の
ヒストグラフを細胞容積対蛍光ｌで示す場合（ｃ、ｄ）
、第６ａ図との比較によりＲＮＡ含有赤色細胞が血小板
（Ｔｌ＋）、網赤血球（Ｒｅ）、力粒白血球（Ｇｒ　）
に相当し、赤血球（Ｅｒ）、検量粒子（Ｓｔ）およびリ
ンパ球（Ｌｙ　）はＲＮＡを含まないので、その黄色蛍
光が維持されることが明らかである。２図染色により２
次的結果として網赤血球が赤血球より高い膜電位を有す
ることが示される。これは第６３および６ｂ図から明ら
かである。赤血球群の直上にある細胞は第６ａ図にＴｈ
＋Ｒｅで示ずゾーンに相当する。このゾーンは伺加的Ａ
Ｏ染色（６ｂ）によって定量的に赤色へシフトし゛、こ
れはＤｉＯＣ６によって黄色に染色された細胞がＲＮＡ
を含むことを意味する。容積／蛍光ヒス！・ダラムでこ
の細胞は血小板および網赤血球に相当する。
これは赤血球上にあるＤｉＯＣ６で染色された細胞が網
赤血球であることを示す。
例ＩＪ： 乳ガンのリンパ節転移の新しい滅菌材料を機械的に組織
分離装置（組織チヨッ・Ｊ？）で小片に切断し、これを
目の内のり開き６０μｍのふるいによってふるい分けす
る。得られた細胞を微量滴定板上の培地としてのへ・ｅ
リン化した患者血漿中で７日間、種々の静細胞因子剤の
存在または不存在のもとに培養した１１次に細胞懸濁液
を洗浄し、５分間１．イージアセトキシ−２，３−ジシ
アノ−〈／ゾール（ＡＤＨ）およびヨー化グロピジウム
（ＰＩ）を染色する。ＡＤＢは細胞質エステラーゼの活
性および生細胞の細胞内ｐＨ値を示し、ＰＩは死細胞の
ＤＮＡを染色する。染色した細胞の細胞容積ならびに青
色および緑色蛍光を第１図に示すような貫流形血球計数
器で同時に測定する。測定前に細胞懸濁液に濃度および
蛍光標準として６μｍの蛍光性単分散ラテックス粒子を
添加する。各細胞のｐＨ値、エステラーゼ活性およびＤ
ＮＡに相当する細胞１容積および蛍光信号を同時に測定
する。
次に１培養の生存または生残腫瘍細胞または炎症細胞の
数を標準化した検量粒子数との比から算定゛する。種々
の試験静細胞因子剤および未処理比較試験の結果は第７
図の剛性曲線に示される。図の横軸は個々の薬剤および
未処理を示し、縦軸は未処理試験の１００％に対する腫
瘍細胞または炎症細胞の数を表わす。静細胞因子剤１．
４．５および７で腫瘍細胞の減少が達成され、その他の
薬剤は効果を示さないことが明らかである。別個に炎症
細胞への効果をめ、これは毒性の低い薬剤を明らかに示
す。定温保持後の残存炎症細胞の腫瘍細胞に対ずろ比は
治療係数として同様図面に示される。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の実施に適ずろ貫流形血球劇数器の原理
図、第２図は１　二２５０に稀釈した染色した血液試料
（ａｌおよび染色しない血液試料（ｂ）の蛍光と細胞容
積の関係を示ず図（Ｔ　ｈ　＝ｌｌｌ小板、Ｅｒ−赤血
球、Ｒｅ　−網赤血球、Ｓｔ　＝検量粒子、Ｌ　ｙ　＝
　ｌ）７７３球、Ｇｒ−力粒白血球）、第３図は他の染
料を使用した第２図と同様の図、第４図はさらに異なる
染料を使用した第２図と同様の図、第５図は細胞容積の
ほかに２つの蛍光を記録した３・ぐラメーク同時測定の
際のグラフ表示図、第６図は第５図の３パラメータ測定
で得た２つの蛍光相互の関係および蛍光１と細胞容積の
関係を示す図、第７図は乳ガンのリン・８節転移の破砕
した細胞による薬剤試験の結果をグラフ表示した図であ
る。 ］、４．６・・フィルタ、２・・・２色性分割ミラー、
３．５・・反射ミラー 第７図 手続補正書（自船 昭和５８年１１月２（？日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１９１０６．３号 ２、発明の名称 細胞の同時的定量測定法およびそのための試薬 ３、補正２する者 事件との関係　生！ｊ￥「出願人 ４、復代理人 ５、補正により増加する発明数　０ ６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７、　補正の内容 （］）明細書１５ページ下から６行の「管１　（ＰＭＩ
）」を「管ＰＭＩ　ｊ　と、同ページ同行の「測定孔」
を「−測定孔７」と、１６イー）３行の「ランプ」を「
ランプ８」と、同ページ１３行の１第２ａ図は細胞」を
「第２図ａはＡＯ／ＤｉＯＣ（染色により細胞」と、同
ページ１５行の１−第２ａ図」を「第２図ａ」と、１７
ペ一ジ７行（表の下の第１行）の「第２ｂ図」を「第２
図ｂ」と補正する。 （２）　明細書１８ページの表の最下竹屑右列（図面の
列）にｒ４ｄＪを加入する。 （３）　明細１２０ペ一ジ２行の「曲線６ｂｊを「第６
図ｂ」と、同ページ１５行のｒ　（Ｃ，、ｄ　）」を「
（第６図ｃ、ｄ）Ｊと、同ページ同行の「第６ａ図」を
「第６図ａ」と、同ページ１２行〜１３行の「第６ａ・
・・・・・・・・　６ｂ図」を「第６図ａおよびｂ」と
、同ページ１４行の「第６ａ図」を１第６図ａ」と、同
に一ノ１６行の「６ｂ」を１第６図ｂ」と補正する。 手続補正去：（方式） ％式％ １、事件の表示　昭和５８年特許願１４１９１０６３号
２、発明の名称 細胞の同時的定量測定法およびそのための試薬３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 ４、復代理人 ６　補正の対象 ７、補正の内容 別紙のとおシ 但し図面の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、　測定すべき細胞を含む試料を細胞の少なくとも１
    つの性質を染色する蛍光染料とともに定温保持し、次に
    細胞の容積および蛍光を少な（とも１つの波長で同時に
    測定することを特徴とする細胞の同時的定量測定法。 ２、ＤＮＡ／ＲＮＡ染料、細胞タン白質染料、リビド染
    料、酵素染料、黒膜電位染料、細胞内ｐＨ染料および８
    １（基染料の群から選択した少な（とも１つの染料を使
    用する特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ＤＮＡ／ＲＮＡ染料および黒膜電位染料とともに定温
    保持する特許請求の範囲第２項記載の測定法。 ４、　アクリジンオレンジ、キナクリンまたはビロニン
    Ｙの群から選択したＤ　Ｎ　Ａ／ＲＮ　Ａ染料を使用す
    る特許請求の範囲第３項記載の測定法。 ５、　黒膜電位染料として３，３′−ジヘキシルーオキ
    サーカルゼシアニンを使用する特許請求の範囲第３項ま
    たは第４項記載の測定法。 ６、　試料中に蛍光性単分散検量相を存在させて測定す
    る特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１つに記載
    の測定法。 ７、検量相として直径１〜ｌＯμｍの単分散ラテックス
    粒子を使用する特許請求の範囲第６項記載の測定法。 ８、染色した血液試料流れを流れが狭い断面を通過する
    際に単色性・ｑルス光糺瓢レーザ光線または水銀もしく
    はキセノンランプによって照射し、発生した細胞蛍光信
    号を測定する特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれか
    １つに記載の測定法。 ９、　試料流れが狭い断面を通過する際の電導塵の変化
    を測定して細胞容積を決定する特許請求の範囲第１項〜
    第８項のいずれが１つに記載の測定法。 １０、試料流れが狭い断面を通過する際の光の散乱を測
    定して細胞容積を決定する特許請求の範囲第１項〜第８
    項のいずれか１つに記載の測定法。 １１　測定を貫流形血球計数器または細胞選別器で実施
    ずろ％許請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１つに
    記載の測定法。 １２　測定すべき細胞を含む試料を細胞の少なくとも１
    つの性質を染色する蛍光染料とともに定温保持し、次に
    細胞の容積および蛍光を少なくとも１つの波長で同時に
    測定する細胞の同時的定量測定法に使用する試薬にお〜
    ・て、ＤＮＡ／ＲＮＡ染料、細胞タン白質染料、リビｒ
    染料、酵素染料、窓膜電位染料、細胞内ｐＨ染料、Ｓ　
    Ｈ基染料の群から選択した蛍光染料および付加的に単分
    散蛍光性検量相を含むことを特徴とする細胞の同時的定
    量測定法に使用する試薬。 １３、ＤＮＡ／ＲＮＡ染料および窓膜電位染料を含む特
    許請求の範囲第１２項記載の試薬。 １４、単分散検量相として直径１〜１０μｍのラテック
    ス粒子を含む特許請求の範囲第１２項または第１３項記
    載の試薬。 １５、アクリジンオレンジ、３．３’−）ヘキシル−オ
    キサ−カルｌシアニンおよび溶剤を含む特許請求の範囲
    第１３項または第１４項記載の試薬。 １６　溶剤として・ジメチルスルホキシＰ、ジメチルホ
    ルムアミドまたはアルカノールを含む特許請求の範囲第
    １５項記載の試薬。
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