JPH01242962A - 植物細胞核を標識する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物の裸細胞の核を迅速に標識することによ
って細胞融合を行った際に、混合してくる同種および異
種細胞融合物の識別マーカーとして使用する技術に関す
る。

〔従来技術〕

植物細胞を細胞壁溶解酵素でプロトプラスト（裸細胞）
化したときに、細胞の表面は澱粉粒で覆われているため
細胞核を直接見ることはできない、従って、異なる遺伝
子を細胞内に導入して形質転換を図るには、マイクロイ
ンジェクション法か、ブリッキレグ法（特開昭５８−７
６０９１号）か、あるいは高電圧パルス法、またはパル
スレーザ−法（特開昭６０−８３５８３号）で細胞に孔
をあけるかショックを与えて目的遺伝子を移入する方法
を採用している。しがし、これらの方法は比較的小さい
遺伝子の導入には適しているが、核自身あるいは細胞質
等の細胞内か粒を導入するのは困叢であった。

一方、動物細胞の場合は、マウス卵のように核を直接見
ることができる細胞では外見上の変化が分かるからその
必要はないが、総ての動物細胞がこうした特徴をもって
いるわけではない。

従って、古（からカルミン酸、クリスタルバイオレット
、ヨードグリーン、ヌクレアファーストレッド等の色素
で核染色を施す研究も行われてきた。その中で、白血球
をパパニコロ染色して細胞を検査する方法等はよく知ら
れている。

しかしながら、これらの色素は細胞表面を変形させたり
、細胞を死滅させてしまうなどで動植物体の生きたまま
の標識色素としては適切でなかった。このような状況に
あるために生細胞を扱う新たな樺識法の開発が求められ
ていた。

新植物を創製するには、二種類の植物を細胞融合するこ
とによって可能であることはよく知られた事実である。

植物の細胞融合を行うとき、大量の細胞を用いた場合に
、同種・異種融合体が同時に発生するから、それを選抜
せずに再生させると効率が大変悪い。しかし、これを予
め異種融合体のみ選抜できれば培養および植物体再生の
際に、少ないスペースで済ませることができるから生産
コストの低減につながる。従って、従来は特殊な例とし
て、植物自身が持っている外観上の特徴を利用する選抜
法の研究が行われた。例えば、タバコ細胞では色の異な
る変異株（黄色）と正常株（緑色）の融合（長尾照義二
日本作物学会記事、４７巻、４９１頁（１９７８））や
植物色素細胞のハナキリン（赤色）とセリバオウレン（
黄色）の融合（山田康之：１ｍ胞工学、１巻。

２２０頁（１９８２））のような色による識別法がある
。そのほか栄養要求性の性質を利用する選抜法もある。

しかし、これらの特徴ないし性質はごく限られた植物の
みにしか有効でないから一般性がない。そこで他の手法
の開発が求められている理由がある。

従来の方法では、一方の細胞をニュートラルレッド色素
で染色して識別に使う方法が知られていた。そこで発明
者はこの方法の問題点を検討してみた。それによると、
細胞表面の澱粉粒がとれているときによく染まり、そう
でないときは染まりにくい、一方、この点を改善するた
めに澱粉粒によく染まる色素のクリスタルバイオレット
を使用した場合は、細胞の生存率の低下が見られた。前
者のよく染まる澱粉粒がとれているケースにおいても生
存率はかなり低い結果しか得られなかった。その他の色
素としてサフラニンについて検討したが、上記の点で若
干の改善は見られたものの、まだ満足できるものではな
かった。

そこで種々検討を行った結果、細胞核を蛍光色素で標識
する方法を見出した。植物細胞自身は蛍光顕微鏡でＢ励
起フィルターを通してｗＡ察すると赤色に輝いて見える
。それを蛍光色素で染色すると色の変化を見ることがで
きる。蛍光色素は極めて微量でその効果を発揮できる特
徴がある。試みに、はうれん草（学名ニスビナシア・オ
レラシア）の発芽後３０日日の幼葉をプロトプラスト化
して、アクリジンオレンジ色素で標識すると約１０分で
５０％程度の細胞が標識されることが分かった。しかし
、成葉に達したものは細胞に欠陥のあるものを除き、速
やかにｗ識されるものは少なかった。また、ほかの植物
細胞においても同様の傾向があるのが分かった。もちろ
ん、植物の種属や成長過程のどの部位を用いるかによっ
ての違いがある。しかし、一般に生存に好適な生理的条
件下で、成葉細胞は外的刺激を与えずに蛍光色素で標識
するのに時間がかかり標識率も１〜２％程度であった。

そのほかの蛍光色素として、ルシフェラーＣＨについて
も検討を行った。しかし、この色素は、細胞表面にかす
かに色素が付くのみで１色かあまり鮮明でない欠点にあ
った。そのほかのＦＩ　　　　　　−ＴＣ色素等では細
胞分裂を起こさせるのも雛しいことが分かった。

〔発明の目的〕

植物プロトプラスト細胞の表面を植物色素で染色する方
法は９通常の光学顕微鏡下、明視野で操作できる利点も
あるが、前項で述べたような欠点もあった。従って、本
発明で解決しようとした点は、種々の植物に二種類の蛍
光色素を生きた状態でそれぞれの細胞内に短時間で導入
して、細胞融合の際に発生する同種および異種融合物の
識別に利用する試料を提供することにある。

以下に実施例を挙げて本発明の内容を具体的に説明する
。

実施例−１ 植物細胞を培養する際に問題となる微生物による汚染を
避けるため、すべての操作はクリーンベンチ内で行える
ような器具が望ましい。それ故、第１図に示すような器
具を製作して試料の調整を行った。第１図の器具の用途
を説明すると、ｌはプロトプラスト作成セル、２は染料
ａ識および洗浄用セル、３は電気融合セルである。４は
プロトプラスト細胞と葉片残渣を分離するための２重に
したナイロンまたはステンレスの網で、上を１００メツ
シユ、下を３０メツシユにして目づまりを防いでいる。

細胞の大きさによって網目のサイズを変更できるように
すれば便利である。はじめにプロトプラスト細胞を作成
するために、１のセルに細胞壁溶解酵素液と裏皮を剥い
だ葉を一緒に入れて一定時間静置する。細胞壁の固い試
料では、はじめに１０の気孔口から吸引操作を行うと分
離に良い結果を得る。しかし、静置処理だけで充分な場
合は、後処理においても細胞に傷がつかず、細片も少な
い、２のセルを傾斜させた理由はプロトプラスト細胞を
下のセルに移すとき、できるだけ壊れないようにするた
めである。プロトプラスト細胞が分離してきたら、５の
コックを開いて２のセルに移送する。７より染料液を注
入して９の電気パルス発生器を用いて６の円筒型電極に
直流パルスを印加して染色を行う。その後、洗浄液で不
用の酵素と染料を洗い去る。もう一方の同型のセルには
別の葉を入れて同様の操作を行うことによって２種類の
標識されたプロトプラスト細胞を作成することができる
。これを３の融合セルに送って細胞融合を行う。

実施例−２ オランダミツバ（学名：アピューム・グラベオレアス）
の成葉を滅菌して裏皮を剥ぎ、ｐＨ５，７に調整した０
、６Ｍマニトール液内に細胞壁溶解酵素を入れて、第１
図の１のセルで細胞壁を溶解してプロトプラスト細胞と
する。これを２のセルに移送して滅菌液で洗浄する。こ
の懸濁液をアクリジンオレンジ（ＡＯ）５０〜２５０μ
Ｍ濃度および、細胞濃度約１０３ｃａｌｌｓ／ｍｌの懸
濁液に調整する。これに電極両端からパルス幅０．１ｍ
ｓ、パルス電圧３００〜５００ｖを１〜３回印加すると
３〜５分内にＩＩされて蛍光顕微鏡で核ないし細胞質を
観察することができる。アクリジンオレンジの蛍光波長
域は５２０ｎｍで黄色に光るから容易に分かる。パルス
電圧は試料の種類や調整を上手に行えば更に下げること
ができる。

実施例−３ チンゲン菜（学名：ブラシ力・バラチネンシス）の成葉
を滅菌して裏皮を剥いで、ｐＨ５，７に調整した０、７
Ｍマニトール液内に細胞壁溶解酵素を入れて、細胞壁を
溶解してプロトプラスト細胞とする。以下の操作方法は
実施例２と殆ど同様である。この懸濁液を第１図の２の
セルに移して、４−６−ジアミンノー２−フェニルイン
ドール（ＤＡＰＩ）１〜２ｍＭ濃度液に調整する。電極
両端からパルス幅０．１ｍｓ、パルス電圧３００〜５０
０ｖを１〜５回印加すると３〜５分内に＃Ａ識されて光
学顕微鏡で核を観察することができる。ＤＡＰＩの蛍光
波長域は３６０ｎｍで青色に光るからＡＯによって標識
されたものとは容易に識別できる。

このように二種類の蛍光色素でそれぞれの細胞を染色す
れば、お互いの接触状態が分かりやすく選別に便利であ
る。

〔発明の効果〕

本発明によって、細胞融合に用いる種々の植物プロトプ
ラスト細胞は電気パルスを印加することによって短時間
で蛍光色素を導入できるようになった。従って、単に色
素を細胞表面に付着させている場合に比べて、他方の細
胞に色移りを起こさせず、しかも微量の色素で標識でき
るため細胞に与える障害が少なく異種融合物の選別に有
利に作用する。そのため、他の方法で識別マーカーを付
ける場合より簡単で有効な手段を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は植物プロトプラスト細胞の蛍光色素標識用器具
の原理構成図を示す。 ■・・・プロトプラスト作成セル、２・・・染料標識お
よび洗浄用セル、３・・・電気融合セル、４・・・２重
金網、５・・・コック、６・・・円筒型電極、７及び８
・・・洗浄液注入口および出口、９・・・電気パルス発
生器、ｌＯ・・・気孔口又は吸引口。 特許出願人　工業技術院長　飯　塚　幸　三指定代理人
　工業技術院大阪工業技術試験所長速水諒三 一￥１　回 ノ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アクリジン基およびフェニルインドール基よりな
   る２種類の蛍光色素を使用することを特徴とする植物細
   胞核を標識する方法
2. （２）蛍光色素を迅速に核に染色させるために電気パル
   スを用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の方法
3. （３）特許請求の範囲第１項および第２項記載の方法を
   実施する際に使用するセルは、裸細胞作成槽および電気
   パルス印加用染色槽を具備し、この二槽を一体化して雑
   菌汚染の防止機能を有することを特徴とする植物細胞核
   を標識する装置