JPS60210997A - 微生物粒子数の計数法 - Google Patents
微生物粒子数の計数法Info
- Publication number
- JPS60210997A JPS60210997A JP6713784A JP6713784A JPS60210997A JP S60210997 A JPS60210997 A JP S60210997A JP 6713784 A JP6713784 A JP 6713784A JP 6713784 A JP6713784 A JP 6713784A JP S60210997 A JPS60210997 A JP S60210997A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- particles
- stranded dna
- microorganisms
- fluorescence
- microbial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は微生物粒子数の計数法に関するものでおる。
とくに、微生物粒子と種々の夾雑物粒子とが混在する混
合糸における微生物粒子数を計数する方法に関するもの
である。
合糸における微生物粒子数を計数する方法に関するもの
である。
一般に自然環境の解析や環境衛生の調査のために、海水
、河川水、湖沼水、産業用水、土壌などに含まれる細菌
数は最も重要な因子の７つである。従来、このような試
料において、細菌のような微生物粒子の数を計数するた
めには。
、河川水、湖沼水、産業用水、土壌などに含まれる細菌
数は最も重要な因子の７つである。従来、このような試
料において、細菌のような微生物粒子の数を計数するた
めには。
平板培養法や直接検鏡法などの方法が採用されてきた。
しかし、これらの方法は血液や尿のような夾雑物が少な
く、シかもある程度組成が分かつている試料では正確な
結果を与えても、上記のように比較的に夾雑物粒子（土
壌粒子、微生物その他の生物の遺骸、鉱物粒子等）が多
い試料については測定誤差が極めて大きくなシ実用性に
乏しくなる。本発明は上記のような、不特定の夾雑物を
多く含有する試料においても十分な精度で計数する方法
を提供するもので、その要旨は下記（１）および（２）
Ｋ存する。
く、シかもある程度組成が分かつている試料では正確な
結果を与えても、上記のように比較的に夾雑物粒子（土
壌粒子、微生物その他の生物の遺骸、鉱物粒子等）が多
い試料については測定誤差が極めて大きくなシ実用性に
乏しくなる。本発明は上記のような、不特定の夾雑物を
多く含有する試料においても十分な精度で計数する方法
を提供するもので、その要旨は下記（１）および（２）
Ｋ存する。
（１） 微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中
の微生物粒子数を計数するｋあたシ、上九色素を用いて
上記混合系を処理し、上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結
合した場合に発する螢光と同一の螢光を発する粒子数Ｘ
を計数し、ついで上記螢光色素で処理した混合糸１−。
の微生物粒子数を計数するｋあたシ、上九色素を用いて
上記混合系を処理し、上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結
合した場合に発する螢光と同一の螢光を発する粒子数Ｘ
を計数し、ついで上記螢光色素で処理した混合糸１−。
上ｄＣ微生物の二本鎖が一本鎖に解離する条件下に保持
して上記螢光色素が二本＆ＤＮＡと結合した場合に発す
る螢光と同一の螢光を発する粒子数Ｙｔ−計数し、粒子
数Ｘから粒子数Ｙｔ−差し引いた値をめるととｔ−％徴
とする微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中の
微生物粒子数の計数法 （２） 微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中
の微生物粒子数を計数するにあたル、上記微生物の二本
鎖ＤＮＡ及び一本＊ＤＮＡと結合した場合に大々異る色
相の螢光を発する螢光色素を用いて、上記混合系を処理
し、上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結合した場合に発す
る螢光と向−の螢光を発する粒子数Ｘを計数し、一方上
記螢光色素による処理を行う前の混合系を、上記微生物
の二本鎖が一本鎖に解離する条件下に保持して上記螢光
色素で処理し。
して上記螢光色素が二本＆ＤＮＡと結合した場合に発す
る螢光と同一の螢光を発する粒子数Ｙｔ−計数し、粒子
数Ｘから粒子数Ｙｔ−差し引いた値をめるととｔ−％徴
とする微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中の
微生物粒子数の計数法 （２） 微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中
の微生物粒子数を計数するにあたル、上記微生物の二本
鎖ＤＮＡ及び一本＊ＤＮＡと結合した場合に大々異る色
相の螢光を発する螢光色素を用いて、上記混合系を処理
し、上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結合した場合に発す
る螢光と向−の螢光を発する粒子数Ｘを計数し、一方上
記螢光色素による処理を行う前の混合系を、上記微生物
の二本鎖が一本鎖に解離する条件下に保持して上記螢光
色素で処理し。
上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結合した場合に発する螢
光と同一の螢光を発する粒子数Ｙ′を計数し、粒子数Ｘ
から粒子数Ｙ′を差し引いた値をめることｔｏ童とする
微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中の微生物
粒子数の計数法。
光と同一の螢光を発する粒子数Ｙ′を計数し、粒子数Ｘ
から粒子数Ｙ′を差し引いた値をめることｔｏ童とする
微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中の微生物
粒子数の計数法。
本発明の詳細な説明するに１本発明における微生物粒子
としては、例えは、大腸凶、枯草菌。
としては、例えは、大腸凶、枯草菌。
乳酸自、メタン菌、硝酸菌等の細菌類の細胞及びその他
各檎のカビや酵母の細胞などの微生物粒子が挙けられる
。本発明においては、これらの微生物粒子と、糧々の夾
雑物粒子１例えば土壌粒子、上述の微生物その他の生物
の遺骸、鉱物粒子等とが混在する混合糸中の生きている
微生物粒子数のみを計数するものである。このような混
合糸としては、例えは、海水、河川水、湖沼水、産業用
水、土壌等上挙けることができる。
各檎のカビや酵母の細胞などの微生物粒子が挙けられる
。本発明においては、これらの微生物粒子と、糧々の夾
雑物粒子１例えば土壌粒子、上述の微生物その他の生物
の遺骸、鉱物粒子等とが混在する混合糸中の生きている
微生物粒子数のみを計数するものである。このような混
合糸としては、例えは、海水、河川水、湖沼水、産業用
水、土壌等上挙けることができる。
本発明においては、上記の混合系中の微生物粒子数を計
数する際に、特定の螢光色素を使用するものである。
数する際に、特定の螢光色素を使用するものである。
本発明に使用される螢光色素とは、その色素が微生物の
二本％Ｄ％Ａ（デオキシリボ核酸）と結合した場合に発
する螢光の色相と、同色素が当該微生物の一本１！ＪＩ
Ｄ Ｎ Ａと結合した場合に発する螢光の色相とが識
別しうる程度に異るというａ質をＭするものを指示する
０ このような螢光色素としては１例えば、核酸の染已に叫
々使用されているアクリジンオレンジ（ｊ、４−ビス−
ジメチルアミノ−アクリジンの塩酸塩）が挙けられ′る
。この色素は、微生物の二本％ＤＮＡと結合しｆｃ場合
にはｊ ３ ｊ ｎｍにピークをもつ黄緑色の螢光を発
し、また一本ｇ Ｄ Ｎ Ａと結合した場合には６００
ｎｍ付近にピークをもつ赤色の螢光を発し、両者は明瞭
に識別される。
二本％Ｄ％Ａ（デオキシリボ核酸）と結合した場合に発
する螢光の色相と、同色素が当該微生物の一本１！ＪＩ
Ｄ Ｎ Ａと結合した場合に発する螢光の色相とが識
別しうる程度に異るというａ質をＭするものを指示する
０ このような螢光色素としては１例えば、核酸の染已に叫
々使用されているアクリジンオレンジ（ｊ、４−ビス−
ジメチルアミノ−アクリジンの塩酸塩）が挙けられ′る
。この色素は、微生物の二本％ＤＮＡと結合しｆｃ場合
にはｊ ３ ｊ ｎｍにピークをもつ黄緑色の螢光を発
し、また一本ｇ Ｄ Ｎ Ａと結合した場合には６００
ｎｍ付近にピークをもつ赤色の螢光を発し、両者は明瞭
に識別される。
本発明においては、上記のような識別可能な螢光色素の
すべてを使用することができる。
すべてを使用することができる。
本発明方法に従って、微生物粒子と夾雑物粒子とが混在
する混合糸中の微生物粒子数を計数するには、以下に示
す一通シの方法が採出される。
する混合糸中の微生物粒子数を計数するには、以下に示
す一通シの方法が採出される。
第一の方法は、まず上記混合糸試料Ｋ、適切な績度に調
整した前述の螢光色素、例えはアクリジンオレンジを加
えて染色処理する。この処［Ｋよって、微生物粒子の二
本鎖Ｄ Ｎ Ａと螢光色素が結合し、微生物粒子は前述
のように。
整した前述の螢光色素、例えはアクリジンオレンジを加
えて染色処理する。この処［Ｋよって、微生物粒子の二
本鎖Ｄ Ｎ Ａと螢光色素が結合し、微生物粒子は前述
のように。
ｊＪｊｎｍにピークｔもっ黄緑色の螢光を発する。同時
に、試料中に存在する夾雑物のうち。
に、試料中に存在する夾雑物のうち。
螢光色素との親和性の大きい粒子もまた螢光色素と結合
して同一の螢光を発する〇 従って、螢光色素による染色処理後の試料を螢光地微鏡
によシ検鏡し％ ｊ ｊ ｊ ｎｍにピークをもつ螢光
を発する粒子数を計数すれば、試料中の主きている微生
物粒子数と、螢光色素と結合した夾雑物粒子数との和Ｘ
が計数される。
して同一の螢光を発する〇 従って、螢光色素による染色処理後の試料を螢光地微鏡
によシ検鏡し％ ｊ ｊ ｊ ｎｍにピークをもつ螢光
を発する粒子数を計数すれば、試料中の主きている微生
物粒子数と、螢光色素と結合した夾雑物粒子数との和Ｘ
が計数される。
ついで螢光色素で染色処理後の試料を、微生物の二本鎖
ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離する条件下に保持する。例
えば７００℃で十数分間加熱後急冷すると、前述の！
ｊ ｊ ｎｍにピークをもつ黄緑色螢光の微生物粒子は
二本鎖ＤＮＡが一重鎖ＤＮＡＩ／（解離することによＪ
）、６００ｒｘｍ付近にピークｔもつ赤色に変色する。
ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離する条件下に保持する。例
えば７００℃で十数分間加熱後急冷すると、前述の！
ｊ ｊ ｎｍにピークをもつ黄緑色螢光の微生物粒子は
二本鎖ＤＮＡが一重鎖ＤＮＡＩ／（解離することによＪ
）、６００ｒｘｍ付近にピークｔもつ赤色に変色する。
上記条件に保持した直後の試料を螢光朧微鏡で検鏡し。
！ ３ ｊ ｎｍにピークをもつ螢光を発する粒子数Ｙ
を計数する。粒子数Ｙは、螢光色素と結合し沈火雑物粒
子の数である。従って、粒子数Ｘから粒子数Ｙｔ−差し
引いた値が微生物粒子数となる。 ・・ 〔方法コ〕 第二の方法は％まず、混合系試料ｔ−第一の方法と全（
同様に螢光色素で染色処理して、試料中の微生物粒子数
と螢光色素が結合した夾雑物粒子数との和Ｘｔ−計数す
る。
を計数する。粒子数Ｙは、螢光色素と結合し沈火雑物粒
子の数である。従って、粒子数Ｘから粒子数Ｙｔ−差し
引いた値が微生物粒子数となる。 ・・ 〔方法コ〕 第二の方法は％まず、混合系試料ｔ−第一の方法と全（
同様に螢光色素で染色処理して、試料中の微生物粒子数
と螢光色素が結合した夾雑物粒子数との和Ｘｔ−計数す
る。
第二の方法では、ついで上記螢光色素で染色処理する前
の混合系試料１−、予め微生物の二本鎖ＤＮＡが一本鎖
ＤＮＡに解離する条件下に保持（例えば１００℃で十数
分間加熱し急冷する）したのち、前記と同一の螢光色素
で染色処理し。
の混合系試料１−、予め微生物の二本鎖ＤＮＡが一本鎖
ＤＮＡに解離する条件下に保持（例えば１００℃で十数
分間加熱し急冷する）したのち、前記と同一の螢光色素
で染色処理し。
染色処理後の試料を螢光顕微鏡で検鏡し、５３夕ｎ１１
にピークをもつ螢光を発する粒子数Ｙｔ−計数する。粒
子数Ｙ′は、螢光物質と結合した夾雑物粒子数であり、
方法／における粒子数Ｙと近似するか実質的に同一であ
る。それゆえ１粒子数Ｘから粒子数Ｙ′を差し引いた値
が微生物粒子数となる。
にピークをもつ螢光を発する粒子数Ｙｔ−計数する。粒
子数Ｙ′は、螢光物質と結合した夾雑物粒子数であり、
方法／における粒子数Ｙと近似するか実質的に同一であ
る。それゆえ１粒子数Ｘから粒子数Ｙ′を差し引いた値
が微生物粒子数となる。
本発明方法によればＪｈ述べたように、 ／）微生物の
二本鎖Ｉ）ＮＡｔ−染色した際に、上記二本鎖ＤＮＡ以
外の物質を染色した場合とは明確に識別し得る螢光を発
する色素を選び、２）こｒｔ５−当該二本鎖ＤＮＡの解
離条件と組み合せることによって１種々の夾雑物粒子と
微生物粒子とが混在する混合系における微生物粒子数を
。
二本鎖Ｉ）ＮＡｔ−染色した際に、上記二本鎖ＤＮＡ以
外の物質を染色した場合とは明確に識別し得る螢光を発
する色素を選び、２）こｒｔ５−当該二本鎖ＤＮＡの解
離条件と組み合せることによって１種々の夾雑物粒子と
微生物粒子とが混在する混合系における微生物粒子数を
。
簡単な操作で精度よく計数することができる。
例えばフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｙ）等の手段を適用すれば、さらに効率的な計測を
行なうことが可能である。以下実施例について本発明方
法をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施
例に限らｎるものではない。
ｔｒｙ）等の手段を適用すれば、さらに効率的な計測を
行なうことが可能である。以下実施例について本発明方
法をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施
例に限らｎるものではない。
実施例／
ｌＬ中に塩化ナトリウムｔ、ｏｙ、塩化カリウムｏ、−
ｚｙ、ｍ”＊リン酸−水素ナトリウム１．／！Ｉ及び無
水リン酸二水素カリウム０．２．９ ’ｉ含む生理食塩
水−２−に、大腸菌（ｇ、ｃｏｌｌ）細胞３．６×７０
１個（／、Ｊ’ ｘ ＃７”個／ｍ７り ｔ ７１０．
ｔ、 サラＫ 滅菌土壌θ、θダｙｔ−添７１１１ ｔ
、て試料を１ｌｌｌ製した０この試料に、アクリジンオ
レンジ（メルク社製品、以下ＡＯと略記する） ｔ−ｓ
１０−’ｗ （モル）となるように混和して、トーマ
（Ｔｈｏｍａ）の血球計算盤上に置き、落射型螢光顕微
鏡（倍率λθＯ〜４ｔＱθ倍、！Ｊｊｎｍの螢光全通す
干渉フィルターを使用）を用いて倹鋭し、ｊＪｊｎｍに
ピークｔもつ螢光ｔ−発する粒子数３．４ｔＸ１０”個
／−（粒子数ｘ＞”を計数し九〇 一万、前記試料−２１Ｒ１に、上記と同様にＡＯＪ−／
θ″Ｍとなるように混和し％ １００℃でｌｊ分間加熱
したのち０℃に急冷し、前記と同様に落射型螢光顕微鏡
を用いて検鏡し、ｊ３ｊｎｍにピークをもつ螢光を発す
る粒子数／、？Ｘ１０”個／づ（粒子数Ｙ）を計数した
。粒子数Ｘから粒子数Ｙ全差し引いた値、即ち、／。７
Ｘ ／ ０”個／づが試料中の微生物粒子数の計数値
であ＃）、この値は、前記試料の調製時に実際添〃口し
た大腸菌の細胞数（／、？×／♂個／コ）と近似し、拳
法は実用上充分な稍度をもつことが示された。
ｚｙ、ｍ”＊リン酸−水素ナトリウム１．／！Ｉ及び無
水リン酸二水素カリウム０．２．９ ’ｉ含む生理食塩
水−２−に、大腸菌（ｇ、ｃｏｌｌ）細胞３．６×７０
１個（／、Ｊ’ ｘ ＃７”個／ｍ７り ｔ ７１０．
ｔ、 サラＫ 滅菌土壌θ、θダｙｔ−添７１１１ ｔ
、て試料を１ｌｌｌ製した０この試料に、アクリジンオ
レンジ（メルク社製品、以下ＡＯと略記する） ｔ−ｓ
１０−’ｗ （モル）となるように混和して、トーマ
（Ｔｈｏｍａ）の血球計算盤上に置き、落射型螢光顕微
鏡（倍率λθＯ〜４ｔＱθ倍、！Ｊｊｎｍの螢光全通す
干渉フィルターを使用）を用いて倹鋭し、ｊＪｊｎｍに
ピークｔもつ螢光ｔ−発する粒子数３．４ｔＸ１０”個
／−（粒子数ｘ＞”を計数し九〇 一万、前記試料−２１Ｒ１に、上記と同様にＡＯＪ−／
θ″Ｍとなるように混和し％ １００℃でｌｊ分間加熱
したのち０℃に急冷し、前記と同様に落射型螢光顕微鏡
を用いて検鏡し、ｊ３ｊｎｍにピークをもつ螢光を発す
る粒子数／、？Ｘ１０”個／づ（粒子数Ｙ）を計数した
。粒子数Ｘから粒子数Ｙ全差し引いた値、即ち、／。７
Ｘ ／ ０”個／づが試料中の微生物粒子数の計数値
であ＃）、この値は、前記試料の調製時に実際添〃口し
た大腸菌の細胞数（／、？×／♂個／コ）と近似し、拳
法は実用上充分な稍度をもつことが示された。
さらに、上記試料２ｍｌ’Ｃ採シ、これを予め７００℃
で７５分間加熱したのち０℃に急冷し、ＡＯｆ １０−
’Ｍとなるように混和し、前記と同様に落射型螢）℃顕
微鏡を用いて検鏡し、夕Ｊｊｎｍにピークをもつ螢光を
発する粒子数／、７Ｘ１０”個／、６（Ｙつを計数した
。粒子数Ｘから粒子数ｒｔ−差し引いた値、即ち、／、
７×／θ８個／−１が試料中の微生物粒子数の計数値で
ある。
で７５分間加熱したのち０℃に急冷し、ＡＯｆ １０−
’Ｍとなるように混和し、前記と同様に落射型螢）℃顕
微鏡を用いて検鏡し、夕Ｊｊｎｍにピークをもつ螢光を
発する粒子数／、７Ｘ１０”個／、６（Ｙつを計数した
。粒子数Ｘから粒子数ｒｔ−差し引いた値、即ち、／、
７×／θ８個／−１が試料中の微生物粒子数の計数値で
ある。
上述のように１本実施例において、試料の螢光色素によ
る染色処理と加熱処りの順序を逆にしても、微生物粒子
数の計数値の実施的相違は認められなかった。
る染色処理と加熱処りの順序を逆にしても、微生物粒子
数の計数値の実施的相違は認められなかった。
実施例コ
羽田沖で採取した東京溝表面水／θＯ−をθ、θ／規定
の塩酸で中和（ｐＨ７，θ）し試料とした。この試料ｊ
ｒｎｔｔ−採シ、これにＡＯ’ｉｉ／θ−′Ｍとなるよ
うに混和したのち、実施例／と同様に落射型螢光顕微鏡
を用いて検鏡し、夕３夕ｎ１ｌｌにピークｒもつ螢光を
発する粒子数３Ｘ１０’個／′ｔｎｔ（粒子数ｘ）ｔ−
計数した。
の塩酸で中和（ｐＨ７，θ）し試料とした。この試料ｊ
ｒｎｔｔ−採シ、これにＡＯ’ｉｉ／θ−′Ｍとなるよ
うに混和したのち、実施例／と同様に落射型螢光顕微鏡
を用いて検鏡し、夕３夕ｎ１ｌｌにピークｒもつ螢光を
発する粒子数３Ｘ１０’個／′ｔｎｔ（粒子数ｘ）ｔ−
計数した。
−万、前記試別ターに上記と同様にＡＯを１０−’Ｍと
なるように混和し、７００℃でｌｊ分間加熱処理したの
ち０℃に急冷し、上記と同様に落射型螢光顕微鏡を用い
て検鏡しでｊ” ｊ ｊｎｍにピークをもつ螢光ｔ−宛
する粒子数コ、ｔ Ｘ ／ ０’個／−（粒子数Ｙ）を
計数した。上記粒子数Ｘから粒子数Ｙｆ差し引いた値、
即ち、ｊＸｌｏ”個／ゴが試料中の微生物粒子数の計数
値である。
なるように混和し、７００℃でｌｊ分間加熱処理したの
ち０℃に急冷し、上記と同様に落射型螢光顕微鏡を用い
て検鏡しでｊ” ｊ ｊｎｍにピークをもつ螢光ｔ−宛
する粒子数コ、ｔ Ｘ ／ ０’個／−（粒子数Ｙ）を
計数した。上記粒子数Ｘから粒子数Ｙｆ差し引いた値、
即ち、ｊＸｌｏ”個／ゴが試料中の微生物粒子数の計数
値である。
さらに、前記試料ｊ−を１００℃で７！分間加熱処理し
、ついで０℃に急冷したのち、こｔにＡＯｔ−／θ−４
Ｍとなるように混和して前記と同様に落射型螢光顕微鏡
を用いて検鏡し、夕３夕ｎｍにピークをもつ螢光を発す
る粒子数２．！×７ ｏ４個／ ｔｎｔ （Ｈ子ｉＹ’
）’に計数した。粒子数Ｙ′は粒子数Ｙと同等であ如１
粒子数Ｘから粒子数Ｙ’２差し引いた値、！×ＩＱ３個
／ｄが試料中の微生物粒子数の８＋数値である。
、ついで０℃に急冷したのち、こｔにＡＯｔ−／θ−４
Ｍとなるように混和して前記と同様に落射型螢光顕微鏡
を用いて検鏡し、夕３夕ｎｍにピークをもつ螢光を発す
る粒子数２．！×７ ｏ４個／ ｔｎｔ （Ｈ子ｉＹ’
）’に計数した。粒子数Ｙ′は粒子数Ｙと同等であ如１
粒子数Ｘから粒子数Ｙ’２差し引いた値、！×ＩＱ３個
／ｄが試料中の微生物粒子数の８＋数値である。
不実１ｊＩｉＩ例において、試４；）の螢光色素による
染色処理と加熱処理の順序ｒ逆にしても微生物粒子数の
計数ＩＩ＝の実質的相違は認められなかった。
染色処理と加熱処理の順序ｒ逆にしても微生物粒子数の
計数ＩＩ＝の実質的相違は認められなかった。
実施ｙＩＩＪ’
神奈川県長津田の水田で採取した田囲水１００−に−）
８．施Ｖυ／で使用し／こ生理食塩水！θゴを混和して
試料ｔ−調製した。この試料２ ｄ （（採シ、これに
Ａ ＯＱ ／θ−４Ｍとなるように混和したのち。
８．施Ｖυ／で使用し／こ生理食塩水！θゴを混和して
試料ｔ−調製した。この試料２ ｄ （（採シ、これに
Ａ ＯＱ ／θ−４Ｍとなるように混和したのち。
実施例／と同様に落射型螢光顕微鏡を用いて検鋭し、夕
３夕ｎｍにピークをもつ螢光奮発する粒子数♂、ｌ×／
θ１個／−（粒子数Ｘ）を計数した◎−刀、［」σ記試
料−１！−に上記と同様にＡＯを１０−’Ｍとなるよう
に混１０し、１００℃で７１分間加熱処理したのちθ゛
Ｃに急冷し、上記と同様に落射型螢光顕微鏡全用いて検
鏡し、夕３ｊｎｍにピークをもつ螢光奮発する粒子数６
．ｊＸｌ♂個／−（粒子数Ｙ）を計数した。上記粒子数
Ｘから粒子数Ｙｔ−差し引いた値、即ち、／、６Ｘ１０
’個／−が試料中の微生物粒子の計数値である。
３夕ｎｍにピークをもつ螢光奮発する粒子数♂、ｌ×／
θ１個／−（粒子数Ｘ）を計数した◎−刀、［」σ記試
料−１！−に上記と同様にＡＯを１０−’Ｍとなるよう
に混１０し、１００℃で７１分間加熱処理したのちθ゛
Ｃに急冷し、上記と同様に落射型螢光顕微鏡全用いて検
鏡し、夕３ｊｎｍにピークをもつ螢光奮発する粒子数６
．ｊＸｌ♂個／−（粒子数Ｙ）を計数した。上記粒子数
Ｘから粒子数Ｙｔ−差し引いた値、即ち、／、６Ｘ１０
’個／−が試料中の微生物粒子の計数値である。
さらに、前記試料−２ｍｌ ｆ ７００℃でｌｊ分間力
ｔＩ熱処理したのち急冷し、ついでと几にＡＯを／ ０
−’Ｍとなるように混オロしで洛射型螢光顕＆鏡を用い
て検鏡し、６３５ｍｍ にピークをもつ螢光を元する粒
子ａｔ、、５ｊＸ１０’１固／−（粒子数τ）を計数し
た。この値は前記粒子数Ｙの値と近似し、粒子数Ｘから
粒子数Ｙ′奮走し引いた値、パ／、ｊｊＸ１０’個／ゴ
が試料中の微生物粒子数の計数値である。このように１
本実Ｎ例において。
ｔＩ熱処理したのち急冷し、ついでと几にＡＯを／ ０
−’Ｍとなるように混オロしで洛射型螢光顕＆鏡を用い
て検鏡し、６３５ｍｍ にピークをもつ螢光を元する粒
子ａｔ、、５ｊＸ１０’１固／−（粒子数τ）を計数し
た。この値は前記粒子数Ｙの値と近似し、粒子数Ｘから
粒子数Ｙ′奮走し引いた値、パ／、ｊｊＸ１０’個／ゴ
が試料中の微生物粒子数の計数値である。このように１
本実Ｎ例において。
試料の螢光色素による染色処理と加熱処理の順序を逆に
しても微生物粒子数の計数値に大きな相違は認められな
かった。
しても微生物粒子数の計数値に大きな相違は認められな
かった。
Claims (1)
- （１） 微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸中
の微生物粒子数を計数するにあたシ、上記微生物の二本
鎖Ｄ Ｎ Ａ及び−重鎖ＤＮＡと結合した場合に夫々外
る色相の螢″ｌｔ、ヲ発する螢光色素を用いて上記混合
系を処理し、上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結合した場
合に発する螢光と同一の螢光を発する粒子数ｘ’６計数
し、ついで上記螢光色素で処理した混合糸を、上記ｇ１
．化物の二本−ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離する条件下
に保持して、上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結合した場
合に発する螢光と同一の螢光を発する粒子数Ｙｔ−計数
し、粒子数Ｘから粒子数Ｙを差し引いた値をめることを
％徴とする微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合糸
中の微生物粒子数の計数法（２）微生物粒子と夾雑物粒
子とが混在する混合系中の微生物粒子数を計数するにあ
たシ、上記微生物の二本鎖ＤＮＡ及び−重鎖ＤＮＡと結
合した場合に夫々外る色相の螢光を発する螢ツＣ色素を
用いて上記混合系を処理し、上記螢光色素が二本能ＤＮ
Ａと結合した場合に発する螢ツ０と同一の螢光を発する
粒子数ｘを計数し、−万上記螢元色素による処理を行う
前の混合糸を、上記微生物の二本鎖ＤＮＡが一本Ｇ Ｄ
Ｎ Ａに解離する条件下に保持して上記螢光色素で処
理し、上記螢光色素が二本鎖ＤＮＡと結合した場合に発
する螢光と同一の螢光を発する粒子数Ｙ′全計数し、粒
子数Ｘから粒子数Ｙ′を差し引いた値をめることｔ−特
徴とする微生物粒子と夾雑物粒子とが混在する混合系中
の微生物粒子数の計数法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6713784A JPS60210997A (ja) | 1984-04-04 | 1984-04-04 | 微生物粒子数の計数法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6713784A JPS60210997A (ja) | 1984-04-04 | 1984-04-04 | 微生物粒子数の計数法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60210997A true JPS60210997A (ja) | 1985-10-23 |
Family
ID=13336209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6713784A Pending JPS60210997A (ja) | 1984-04-04 | 1984-04-04 | 微生物粒子数の計数法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60210997A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0301600A2 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-01 | Sumitomo Electric Industries Limited | Method for detection of the presence of undesired microorganisms |
| JPH01242962A (ja) * | 1988-03-24 | 1989-09-27 | Agency Of Ind Science & Technol | 植物細胞核を標識する方法および装置 |
-
1984
- 1984-04-04 JP JP6713784A patent/JPS60210997A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0301600A2 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-01 | Sumitomo Electric Industries Limited | Method for detection of the presence of undesired microorganisms |
| US5003611A (en) * | 1987-07-31 | 1991-03-26 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Method for detection of the presence of undesired microorganisms |
| JPH01242962A (ja) * | 1988-03-24 | 1989-09-27 | Agency Of Ind Science & Technol | 植物細胞核を標識する方法および装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cesarone et al. | Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst | |
| FI83539C (fi) | Foerfarande foer detektering av mikroorganismer i ett kroppsvaetskeprov. | |
| Lemarchand et al. | Comparative assessment of epifluorescence microscopy, flow cytometry and solid-phase cytometry used in the enumeration of specific bacteria in water | |
| JP3837006B2 (ja) | 細菌の染色方法及び検出方法 | |
| EP0745139B1 (de) | Verfahren zur präparierung und hybridisierung von spezifischen proben | |
| US6599715B1 (en) | Real time viability detection of bacterial spores | |
| Bartie et al. | Identification methods for Legionella from environmental samples | |
| DE69511876T2 (de) | Fangtestverfahren | |
| Steen et al. | Bacterial growth studied by flow cytometry | |
| McFeters et al. | Acridine orange staining reaction as an index of physiological activity in Escherichia coli | |
| CA1155041A (en) | Fluorescent nucleic acid stains | |
| Nebe-von Caron et al. | Bacterial characterization by flow cytometry | |
| EP0497464A1 (en) | Rapid microbial diagnostics by in situ hybridization in aqueous suspension | |
| EP1448761B1 (en) | An improvement in a method bacterial endospore quantification using lanthanide dipicolinate luminescence | |
| JPH0822967B2 (ja) | 全血中の網状赤血球の定量測定における化合物、試薬組成物及びその用途 | |
| CN110982870A (zh) | 一种微生物多重荧光染色液及其应用 | |
| Katsuragi et al. | Screening for microorganisms with specific characteristics by flow cytometry and single-cell sorting | |
| Back et al. | The differential fluorescence of bacteria stained with acridine orange and the effects of heat | |
| Allman et al. | Flow cytometric analysis of heterogeneous bacterial populations | |
| CN106929510A (zh) | 一种特异性核酸适配体及应用 | |
| DE60306865T2 (de) | Detektion von Vancomycin-resistenten Enterococcus-Subspezies | |
| Alderton et al. | Bacterial spores: chemical sensitization to heat | |
| EP0710291A1 (de) | Kulturmedium für den gleichzeitigen nachweis von coliformen bakterien und escherichia coli | |
| JPS60210997A (ja) | 微生物粒子数の計数法 | |
| Katsuragi et al. | Single‐Cell Sorting of Microorganisms by Flow or Slide‐Based (Including Laser Scanning) Cytometry |