CN102089440B - 微生物群落生理状态判断方法以及排水处理方法 - Google Patents

微生物群落生理状态判断方法以及排水处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种快速并且准确地判断出在排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落的生理状态的微生物群落生理状态判断方法以及利用了该判断方法的排水处理方法。在本发明的微生物群落生理状态判断方法包括：染色步骤，对于从排水处理设备的处理槽中取样得到的微生物群落，利用与微生物的核苷酸链相结合的第一荧光色素和被微生物细胞内的酶分解而发出与第一荧光色素波长不同的荧光的第二荧光色素来对所述微生物群落进行染色；以及测量步骤，对经过染色的所述微生物群落测量来自所述第一荧光色素的第一荧光强度(F1)和来自所述第二荧光色素的第二荧光强度(F2)，进而根据所得到的测量值的比值(F1/F2)来判断微生物群落的生理状态的良好度。

Description

微生物群落生理状态判断方法以及排水处理方法
技术领域
本发明涉及一种快速并且准确地判断出在排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落的生理状态的微生物群落生理状态判断方法。本发明还涉及一种能够根据利用该判断方法所判断的微生物群落的生理状态，一面良好地维持管理该微生物群落的生理状态，一面稳定地进行排水处理的排水处理方法。本发明能够应用于诸如采用活性污泥法的排水处理设备的曝气槽或者采用生物膜法的排水处理设备的反应罐等各种排水处理设备的处理槽中。 
背景技术
在采用活性污泥法的排水处理设备中，一边向装有活性污泥的处理槽(曝气槽)供给空气，一边向该处理槽供给应该进行生物处理的排水，在有氧气氛下，通过使形成活性污泥的微生物群落与排水接触，微生物群落摄取排水中的营养成分，并进行增殖，从而减少排水中的有机性污浊。从处理槽流出的排水导入至沉淀槽等并使污泥沉降，进而与处理水分离。在这种采用活性污泥法的排水处理过程中，往往是在处理槽内同时存在有多种微生物，这些微生物大多形成污泥絮凝而在曝气槽内的水中浮游、悬浮着。 
在这种排水处理设备中，为了长时间在稳定的状态下实施处理，就要求掌握并管理在处理槽内所存在的微生物群落的生理状态。 
作为处理槽内的微生物群落的生理状态较差时的一个例子，可以给出如下这种情况：污泥絮凝形成为体积庞大的棉絮状而与水的比重差变小，在沉淀槽中由于污泥絮凝的压密性下降而发生处理水与污泥絮凝的分离变得困难的污泥膨胀现象。如果发生这种膨胀，则在沉淀槽中处理水与活 性污泥的分离就会变得困难，因而排水处理设备的运行效率就会极端地下降。 
为了防止这种污泥膨胀，需要准确地掌握存在于处理槽内的微生物群落的生理状态，并采取一些措施，以使丝状细菌等导致膨胀的菌不能优势增殖。 
然而，直到现在为止，还尚未确立用于对存在于处理槽内的微生物群落的生理状态进行快速并且准确判断的、有效的微生物群落生理状态判断方法，防止膨胀等异常情况于未然是困难的。 
以前图31是在实施例3中进行添加微生物制剂、固形物停留时间缩短处理70天后的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图32是在图31中所使用的同一样品的CFDA的第二荧光色素以及与第一和第二荧光色素波长不同的第三荧光色素对含有微生物的检样进行染色处理，利用流式细胞仪或者激光扫描细胞仪测定荧光，根据该结果来掌握能够分解并通过脱氯作用来净化检样中环境污染化合物的微生物的细胞数、环境污染化合物的净化活性以及生存状态。 
在专利文献2中，公开了一种微生物的生理活性的判断方法，其特征在于，在将微生物捕集到滤膜上并进行了培养之后，用使从该滤膜的下面一侧浸透的荧光染色液来对上述滤膜上的微生物进行染色。 
在专利文献3中公开了一种细胞周期分析方法，其由如下步骤组成：使细胞核可视化的步骤；使特定的细胞周期特异性表达的生物分子可视化的步骤；以及利用通过使上述细胞核可视化而得到的细胞核的数值数据和通过使上述生物分子可视化而得到的生物分子的数值数据来确认细胞群中的上述特定的细胞周期比例。 
并且，作为活性污泥型排水处理工艺的控制方法，在专利文献4中，提出了一种好氧活性污泥法的排水处理工艺的控制方法，其特征在于：对于活性污泥中最频繁出现的一种或者数种微生物，在持续性监视其数量 时，在活性污泥和/或取自活性污泥罐的流入口的典型试样中，通过使该微生物与该微生物的荧光标记抗体结合或者利用该微生物的特异性代谢能力使荧光团(fluorogen)基质转换，从而利用流式细胞仪来测量被荧光标记的微生物的量，并且，与此同时，利用散射光和/或DNA染色测量该试样中所存在的微生物的总量，相应于如此得到的测量值来适当地调节一种或者数种特定的微生物的量和/或该微生物的成长条件，进而来监视微生物的量。 
现有技术文献 
专利文献 
专利文献1：日本特开2003-284592号公报 
专利文献2：日本特开2007-97532号公报 
专利文献3：日本特开2008-99625号公报 
专利文献4：日本特开平2-31892号公报 
非专利文献 
非专利文献1：用水和废水第48卷第一号p48-52 
发明内容
发明所要解决的技术问题 
然而，在专利文献1～3中公开的现有技术并不是用于判断排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落的生理状态的。并且，关于判断排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落处于怎样的状态为良好或者生理状态较差，一点也没有说明。所以，根据这些现有技术想到判断排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落的生理状态的方法是不可能的。 
并且，在专利文献4所公开的现有技术中，从通过纯粹培养法而从活性污泥分离的微生物中，选择了一种或者数种所要控制的主要微生物。 
但是，就目前来说，对于环境中的微生物(细菌)的90％以上(例如，参照非专利文献1)，具体而言为90％～99％，一般的培养基还不能够进行纯粹培养，这一点已经为人们所知。 
根据采用分子生物学方法得到的活性污泥的菌相分析结果可知，活性污泥中存在有多种多样的细菌，而并不是特定种类特别多，并且，存在着多种与截至目前为止已经知道的细菌所不同的细菌(例如，参照非专利文献1)。 
并且，专利文献4虽然公开了通过调节营养素的供给量、pH值和/或温度，能够对利用酶活性来使特定的微生物或者该微生物中的荧光基质转换的微生物的成长条件进行调节或者改良，但是，达到本领域的普通技术人员能够进行实施的程度所需要的具体条件还尚未公开。 
并且，在专利文献4中虽然公开了通过用荧光团基质羧基荧光素二乙酸酯和碘化丙啶染色，根据酯酶活性和向细胞的通透性能够判断细胞的生死情况，但这是公知的技术。 
并且，在专利文献4中，尚未阐明通过监视、控制这些微生物而在活性污泥处理中可以得到怎样的改善。 
根据上述情况，监视、控制一种或者数种通过纯粹培养而得到的微生物这种在专利文献4中公开的现有技术，作为活性污泥处理的控制方法来说并不充分。 
本发明就是鉴于上述情况而完成的。本发明的目的在于提供快速并且准确地判断在排水的生物处理设备的处理槽中存在的微生物群落的生理状态的微生物群落生理状态判断方法以及能够根据利用该判断方法所判断的微生物群落的生理状态，一面良好地维持管理该微生物群落的生理状态，一面稳定地进行排水处理的排水处理方法。 
解决技术问题的手段 
为了达到上述目的，本发明提供一种判断在排水的生物处理设备的处理槽中存在的微生物群落的生理状态的微生物群落生理状态判断方法，具有如下步骤： 
取样步骤，对存在于上述处理槽中的微生物群落进行取样； 
染色步骤，利用第一荧光色素和第二荧光色素来对该微生物群落进行染色，其中，上述第一荧光色素是与该微生物群落中的微生物的核苷酸链相结合的色素，上述第二荧光色素是被该微生物细胞内的酶分解而发出与上述第一荧光色素不同波长的荧光的色素； 
荧光强度测量步骤，对经过染色的该微生物群落，测量来自上述第一荧光色素的第一荧光强度F1和来自上述第二荧光色素的第二荧光强度F2；以及 
判断步骤，对于在上述测量步骤中得到的测量值，当第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2大于或等于预先设定的基准值时，则判断该微生物群落的生理状态为良好，而当该比值F1/F2低于上述基准值时，则判断为该微生物群落的生理状态差。 
在本发明的微生物群落生理状态的判断方法中，上述第一荧光色素为选自由碘化丙啶、溴化乙啶、溴乙啡啶二聚体、DAPI、7-氨基放线菌素D、SYTOX Green中的一种，上述第二荧光色素为选自由荧光素二乙酸酯、羧基荧光素二乙酸酯、磺酸基荧光素二乙酸酯、二氯荧光素二乙酸酯、钙黄绿素-AM、CFSE中的一种。 
在本发明的微生物群落生理状态的判断方法中，通过对经过染色的上述微生物群落进行荧光显微镜观察或者使用流式细胞仪加以分析来进行上述荧光强度测量步骤。 
在本发明的微生物群落生理状态的判断方法中，通过用荧光显微镜观察经过染色的上述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件，根据预先设定的信号强度的阈值，将来自上述第一荧光色素和上述第二荧光色素的荧光信号面积数值化，再求出分别来自上述第一荧光色素和上述第二荧光色素的信号面积的比值来进行上述荧光强度测量步骤。 
在本发明的微生物群落生理状态的判断方法中，通过用荧光显微镜观察经过染色的上述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理 软件算出亮度和信号面积，将来自荧光色素的荧光总量(即信号面积×亮度)数值化，进而求出来自上述第一荧光色素和上述第二荧光色素的荧光总量的比值S1/S2来进行上述荧光强度测量步骤。 
在本发明的微生物群落生理状态的判断方法中，通过使用流式细胞仪测量经过染色的上述微生物群落的第一荧光强度F1和第二荧光强度F2，进而求出第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2来进行上述荧光强度测量步骤。 
在本发明的微生物群落生理状态的判断方法中，优选，第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2为1～20的范围内时，判断为上述微生物群落的生理状态良好；该比值F1/F2不到1或者大于20时，判断为上述微生物群落的生理状态差。 
并且，本发明提供一种包括如下步骤的排水处理方法： 
进行根据本发明的微生物群落生理状态判断方法的步骤；以及 
在根据该判断方法的判断、微生物群落的生理状态被判断为差时，进行以下步骤： 
(A)向处理槽中投入微生物制剂、和/或 
(A)控制处理槽中的固形物停留时间， 
从而为使上述微生物群落的生理状态变为良好，边调整排水的生物处理设备的处理槽的运行状态，边进行排水处理。 
在本发明的排水处理方法中，在进行上述(B)控制处理槽的固形物停留时间时，作为控制对象的处理槽的固形物停留时间控制在按下式(1)算出的固形物停留时间的±2天的范围内来： 
固形物停留时间(天)＝(τ×X)/((a×Ci)+(b×Si)-(c×τ×X))           ......(1) 
其中，式(1)中的各符号表示下述意义： 
τ：反应罐的水力学停留时间V/Qi(天) 
Qi：排水量(m3/天) 
Ci：排水的溶解性BOD值(mgO/L) 
Si：排水的SS浓度(mg/L) 
X：反应罐内的MLSS(mg/L) 
V：反应罐容积(m3) 
a：相对于溶解性BOD的污泥转换率(gMLSS/gBOD) 
b：相对于SS的污泥转换率(gMLSS/gSS) 
c：表示活性污泥微生物的内源呼吸所引起的减少量的系数(L/天)。 
发明效果 
本发明的微生物群落生理状态判断方法能够快速并且准确地判断出在排水的生物处理设备的处理槽中存在的微生物群落的生理状态是否良好。 
本发明的排水处理方法能够根据利用本发明的判断方法所判断的微生物群落的生理状态，一面良好地维持管理该微生物群落的生理状态，一面稳定地进行排水处理。 
附图说明
图1是在实施例1中微生物制剂添加前的样品的CFDA荧光图像； 
图2是在图1中所使用的同一样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图3是在图1中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图4是在图1中所使用的同一样品的CFDA明视野图像； 
图5是在图1中所使用的同一样品的PI荧光图像； 
图6是在图1中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图7是在图1中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图8是在实施例1中微生物制剂添加后第9天的样品的CFDA荧光图像； 
图9是在图8中所使用的同一样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图10是在图8中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图11是在图8中所使用的同一样品的CFDA明视野图像； 
图12是在图8中所使用的同一样品的PI荧光图像； 
图13是在图8中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图14是在图8中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图15是在实施例2中进行固形物停留时间缩短处理前的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图16是在图15中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图17是在图15中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图18是在图15中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图19是在实施例2中进行固形物停留时间缩短处理后的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图20是在图19中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图21是在图19中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图22是在图19中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图23是在实施例3中进行微生物制剂添加、固形物停留时间缩短处理前的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图24是在图23中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图25是在图23中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图26是在图23中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图27是在实施例3中进行微生物制剂添加、固形物停留时间缩短处理28天后的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图28是在图27中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图29是在图27中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图30是在图27中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图31是在实施例3中进行添加微生物制剂、固形物停留时间缩短处理70天后的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图32是在图31中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图33是在图31中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图34是在图31中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图35是在实施例4中微生物制剂添加前的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图36是在图35中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图37是在图35中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像； 
图38是在图35中所使用的同一样品的PI二值化图像； 
图39是在实施例4中微生物制剂添加17天后的样品的CFDA荧光总量测量图像； 
图40是在图39中所使用的同一样品的CFDA二值化图像； 
图41是在图39中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像；以及 
图42是在图39中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
具体实施方式
如果活性污泥的构成微生物群落处于对数增殖期(增殖活性高、高负荷、固形物停留时间短)，则其处理水质、固液分离性将很差；如果该构成微生物群落处于稳定期(几乎没有增殖、标准负荷、合适的固形物停留时间)，则其处理水质良好，固液分离性良好。 
本发明者对判断排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落生理状态的方法反复进行了深入的研究，其结果，以细胞膜的通透性为指标，用第一荧光色素和第二荧光色素对从处理槽中取样得到的污泥絮凝进行了双重染色，其中，该第一荧光色素与该微生物群落中的微生物的核苷酸链结合，该第二荧光色素被该微生物细胞内的酶分解而发出与第一荧光色素波长不同的荧光，在用荧光显微镜对经过染色的污泥絮凝进行观察时，发现了成为污泥膨胀原因的分散增殖状态的细菌或者增殖中的丝状细菌等主要被第二荧光色素染色，确认观察到发生膨胀的污泥絮凝的来自第二荧光色素的荧光比来自第一荧光色素的荧光强烈。另一方面，从没有发生膨胀、被判断为处于良好的运行状态的处理槽中进行采样，对该污泥絮凝同样地进行了双重染色，在用荧光显微镜观察时，确认了来自第一荧光色素的荧光比来自第二荧光色素的荧光要强。 
本发明者还发现了如下情况：对经过染色的上述微生物群落测量来自第一荧光色素的第一荧光强度(F1)和来自第二荧光色素的第二荧光强度(F2)，并将所得到的测量值与预先设定的基准值进行比较，在测定值的第一荧光强度(F1)与第二荧光强度(F2)的比值(F1/F2)大于或等于上述基准值时，判断该微生物群落的生理状态为良好，而在该比值(F1/F2)比上述基准值低时，判断为上述微生物群落的生理状态较差。通过上述过程，便能够快速并且准确地判断在处理槽中存在的微生物群落的生理状态是否良好。而且，本发明这还获得了如下信息：用上述第一荧光色素和第二荧光色素对所有污泥絮凝进行双重染色，在第一荧光强度(F1)与第二荧光强度(F2)的比值(F1/F2)为1以上时，可以得到良好的处理水质和固液分离性。 
即，本发明的微生物群落生理状态判断方法是一种判断在排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落的生理状态的方法，其特征在于，具有如下步骤： 
取样步骤，对存在于上述处理槽中的微生物群落进行取样； 
染色步骤，利用第一荧光色素和第二荧光色素来对该微生物群落进行染色，其中，上述第一荧光色素是与该微生物群落中的微生物的核苷酸链相结合的色素，上述第二荧光色素是被该微生物细胞内的酶分解而发出与上述第一荧光色素不同波长的荧光的色素； 
荧光强度测量步骤，对经过染色的该微生物群落，测量来自上述第一荧光色素的第一荧光强度F1和来自上述第二荧光色素的第二荧光强度F2；以及 
判断步骤，对于在上述测量步骤中得到的测量值，当第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2大于或等于预先设定的基准值时，判断该微生物群落的生理状态为良好，而当该比值F1/F2低于上述基准值时，判断为该微生物群落的生理状态差。 
在这里，上述第一荧光强度(F1)与第二荧光强度(F2)的比值(F1/F2)可以看作是在判断生理状态的污泥絮凝中细胞膜完整的、具有增殖性的细菌与细胞膜不完整的、非增殖性的细菌的比值。 
一般来说，为了控制对数增殖期或者稳定期这样的活性污泥增殖相，将固形物停留时间作为参数。 
合适的固形物停留时间由于随处理设备、排水水质、处理环境的不同而不同，因而通过根据上述的荧光染色结果来操控固形物停留时间，便能够找出最合适的固形物停留时间，从而能够维持处理水质良好的活性污泥处理。 
作为在本发明中所使用的第一荧光色素，可以根据细胞膜的通透性不同，使用在细胞内与核酸结合的荧光试剂。具体能够采用从碘化丙啶(以下记作PI)、溴化乙啶、溴乙啡啶二聚体(ethidium homodimer)等菲啶(Phenanthridium)类荧光试剂、DAPI、7-氨基放线菌素D、和SYTOX Green中选择的一种，而特别优选PI。 
作为上述第二荧光色素，可以使用在细胞内利用酶的作用而显示出荧光性的荧光试剂。具体能够采用从荧光素二乙酸酯(FDA)、羧基荧光素二乙酸酯(以下记作CFDA)、磺酸基荧光素二乙酸酯(SFDA)、二氯荧光素二乙酸酯(DCFDA)、钙黄绿素-AM、和CFSE中选择的一种，而特别优选CFDA。 
此外，来自第一荧光色素的荧光的波长范围与来自第二荧光色素的荧光的波长范围必须为可以用波长选择滤光片等可明确分离的不同的波长范围，根据这一点，也优选将PI用作第一荧光色素，将CFDA用作第二荧光色素。 
该第一荧光色素仅在细菌的细胞膜不完整的情况下浸透，而上述第二荧光色素在细菌的细胞膜完全或者不完全的情况下都浸透。利用该作用机理便能够进行上述的判断。 
一般来说，细菌丧失了其细胞膜的完整性的状态，可以解释为该细菌已经死亡。但是，本发明者实际研究了从处理槽内取样得到的很多污泥絮凝，根据该研究结果可知，即使为细胞膜不完整的细菌占据优势的活性污泥，BOD分解率也高，可以得到良好的处理水质，固液分离性也较好等，这表明活性污泥中的细胞膜不完整的细菌可能依然在存活。 
并且，在细胞膜不完整的活性污泥中，还得到了具有高呼吸活性或者进行了蛋白质合成等之类的代谢的证据。虽然由细胞膜不完整的细菌构成的活性污泥没有增殖(剩余污泥较少)，但是可通过进行代谢、呼吸而分解污浊物质，因而是一种理想的活性污泥。 
上述荧光强度测量步骤能够通过对经过染色的上述微生物群落进行的荧光显微镜观察或者使用了流式细胞仪的分析来进行。 
在使用荧光显微镜进行观察时，可以通过如下两种方法进行： 
(a)用荧光显微镜观察经过染色的上述微生物群落，对于该荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件，根据预先设定的信号强度的阈值，将来自上述第一荧光色素和第二荧光色素的荧光信号面积数值化，再求出分别来自上述第一荧光色素和第二荧光色素的信号面积的比值。 
(b)用荧光显微镜观察经过染色的上述微生物群落，对于该荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件算出亮度和信号面积，将来自荧光色素的荧光总量(即信号面积×亮度)数值化，进而求出来自上述第一荧光色素和第二荧光色素的荧光总量的比值(S1/S2)。 
在上述(a)、(b)方法中，来自第一荧光色素的信号面积或者荧光总量成为第一荧光强度(F1)，来自第二荧光色素的信号面积或者荧光总量成为第二荧光强度(F2)，从而就可以算出它们的比值(F1/F2)。 
在上述(a)、(b)方法中，为了将来自第一荧光色素的第一荧光强度(F1)和来自第二荧光色素的第二荧光强度(F2)数值化，例如，能够采用如下方法： 
用荧光显微镜观察经过双重染色的上述微生物群落(以下，有时记作样品)。对来自第一荧光色素的荧光(以下记作第一荧光)，利用使该波长范围内的荧光透过的滤光片进行仔细观察。并且，对来自第二荧光色素的荧光(以下记作第二荧光)，利用使该波长范围内的荧光透过的滤光片进行仔细观察。对第一荧光和第二荧光的各自的荧光显微镜图像进行拍照，对于各自的荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件，进行二值化处理，再将各自的信号区域的面积(pixel)和荧光总量(pixel×亮度)数值化。 
所得到的数值作为“第一荧光的信号面积/第二荧光的信号面积”和“第一荧光的荧光总量/第二荧光的荧光总量”而进行计算，进而求出各个比值。 
并且，在使用流式细胞仪时，能够通过如下方法进行：使用流式细胞仪测量经过双重染色的样品的第一荧光强度(F1)和第二荧光强度(F2)，进而求出第一荧光强度(F1)与第二荧光强度(F2)的比值(F1/F2)。 
在本发明的微生物群落的生理状态判断方法中，在根据上述第一荧光强度(F1)与第二荧光强度(F2)的比值(F1/F2)来判断处理槽的微生物群落的生理状态时，虽然其基准值可以根据应该判断的处理槽的尺寸、运行状况(排水的种类、排水量、BOD浓度等)等进行恰当地改变，但是，通常情况下，第一荧光强度(F1)与第二荧光强度(F2)的比值(F1/F2)以1.0作为基准，当该比值(F1/F2)不到1.0时，能够判断为微生物群落的生理状态差，当该比值(F1/F2)超过1.0时，能够判断为微生物群落的生理状态良好。能够判断为良好时的上述比值(F1/F2)优选为1～20的范围内。 
并且，本发明提供一种如下的方法：判断排水的生物处理设备的处理槽中所存在的微生物群落的生理状态，根据该判断结果，一边调整上述处理槽的运行状态以使微生物群落的生理状态变为良好，一边进行排水处理。 
具体而言，提供一种如下的排水处理方法：利用根据本发明的微生物群落生理状态判断方法判断上述处理槽中所存在的微生物群落的生理状态，在判断为微生物群落的生理状态较差时，再通过对上述处理槽的运行状态进行如下任何一种或者两种操作： 
(A)向处理槽中投入微生物制剂、 
(B)控制处理槽中的固形物停留时间， 
从而为使上述微生物群落的生理状态变为良好，边调整排水的生物处理设备的处理槽的运行状态，边进行排水处理。 
作为在上述(A)中所使用的微生物制剂，例如，可以列举出：星光PMC株式会社的商品名MC-003、MC-004、MC-005、MC-008、MC-038、MC-Cap。 
并且，在进行上述(B)控制处理槽的固形物停留时间时，作为控制对象的处理槽的固形物停留时间控制在按下式(1)算出的固形物停留时间的±2天的范围内： 
固形物停留时间(天)＝(τ×X)/((a×Ci)+(b×Si)-(c×τ×X))           ......(1) 
其中，式(1)中的各符号表示下述意义： 
τ：反应罐的水力学停留时间V/Qi(天) 
Qi：排水量(m3/天) 
Ci：排水的溶解性BOD值(mgO/L) 
Si：排水的SS浓度(mg/L) 
X：反应罐内的MLSS(mg/L) 
V：反应罐容积(m3) 
a：相对于溶解性BOD的污泥转换率(gMLSS/gBOD) 
b：相对于SS的污泥转换率(gMLSS/gSS) 
c：表示活性污泥微生物的内源呼吸所引起的减少量的系数(L/天)。 
下面，利用实施例来验证本发明的效果。 
此外，在下述的实施例中所使用的术语的意义解释如下： 
所谓“固形物停留时间”是指活性污泥在处理槽内停留的期间。 
所谓“COD下降率改善值”是从试验后的排水的COD下降率减去试验前的排水的COD下降率所得的值(单位：％)。如果该值为正，则表明与试验前相比，改善了COD下降率。 
所谓“SVI”是指1g活性污泥所占的容积(ml)，表示了活性污泥膨胀的程度。 
所谓“SVI改善值”是指从试验后的SVI减去试验前的SVI所得的值(单位：ml/g)。该值如果为负，则表明与试验前相比，SVI得到了改善。 
所谓“透视度”是指能够目视量筒底部的双十字的液面高度。30cm以上为良好透视度的基准。 
所谓“SV30”是指将活性污泥装入到容器中之后静置30分钟，沉淀后的污泥容积占活性污泥总量的百分率。 
所谓“SV30改善值”是指从试验后的SV30减去了试验前的SV30所得的值。该值如果为负，则表明与试验前相比，SV30即活性污泥的沉降性得到了改善。 
实施例1 
[向活性污泥系统添加微生物制剂的改善例] 
在工业排水的活性污泥处理设备中，以改善活性污泥的膨胀(SVI值)作为目的，根据构成污泥的微生物群落的荧光显微镜观察图像，采用了添加微生物制剂的对策。 
作为对象的活性污泥处理设备的容积负荷是1.4kg-BOD/m3/日。 
[活性污泥的荧光染色] 
对从该活性污泥处理设备的曝气槽出口取样得到的活性污泥样品，使用第一荧光色素PI(终浓度1mg/L)和第二荧光色素CFDA(终浓度10mg/L)进行了双重染色。 
此外，PI和CFDA使用了如下的试剂： 
··PI(Propidium iodide，和光纯药工业公司生产，160-16723)。 
··CFDA(6-Carboxyfluorescein diacetate，西格玛(Sigma)公司生产，C5041)。 
[根据荧光显微镜观察来判断污泥构成微生物群落的生理状态] 
使用荧光显微镜(奥林巴斯公司制造的荧光显微镜BX51)观察上述样品，并以400倍的倍率对PI和CFDA的荧光图像进行了拍照。 
PI的荧光观察使用了镜组件：U-MWIG3、激发滤光片：BP-530-550、吸收滤光片：BA575IF进行。 
CFDA的荧光观察使用了镜组件：U-MNIBA3、激发滤光片：BP-470-495、吸收滤光片：BA510-550进行。 
所拍摄的图像使用图像分析软件(三谷商事株式会社制造的WinRoof)进行二值化处理，将各自的信号区域面积(pixel)和荧光总量(pixel×亮度)数值化。 
所得到的数值作为“PI信号面积/CFDA信号面积”和“PI荧光总量/CFDA荧光总量”而进行计算，进而分别求出了比值。上述比值都以1.0为界限，如果上述比值大于等于1.0，则判断为活性污泥的构成微生物群 落的生理状态良好，而如果上述比值不到1.0，则判断为需要改善的状态。以下仅对“PI信号面积/CFDA信号面积”进行了记载。 
图1～图7是对试验开始前(添加前)的污泥絮凝进行了双重染色后的样品的PI和CFDA的荧光染色图像。图1是微生物制剂添加前的样品的CFDA荧光图像，图2是在图1中所使用的同一样品的CFDA荧光总量测量图像，图3是在图1中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图4是在图1中所使用的同一样品的CFDA明视野图像，图5是在图1中所使用的同一样品的PI荧光图像，图6是在图1中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图7是在图1中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
根据上述方法将各个信号面积数值化，结果得到了PI信号面积/CFDA信号面积的比值为0.66这样的值。 
在形成活性污泥的微生物群落中，被PI染色的细胞群为非增殖的细胞，具有提高活性污泥的凝集性的趋势，而在被CFDA染色的细胞群中，成为膨胀原因的分散增殖状态的细菌、增殖中的丝状细菌较多。对于在图1～图7中所示的微生物制剂添加前的样品而言，发现来自增殖中的丝状细菌的CFDA信号较多，PI信号面积/CFDA信号面积＝0.66，比作为膨胀指标而设定的1.0小，因此，判断其处于需要改善构成活性污泥的微生物群落的生理状态的状态。 
[添加微生物制剂改善污泥形成微生物群落的凝集性] 
在上述活性污泥处理设备中，以改善活性污泥的生理状态为目标，进行了8天时间的向曝气槽中添加微生物制剂(星光PMC株式会社，商品名MC-008)。微生物制剂的投入量设定为11kg/天。 
表1同时记载了在实施例1中，在试验期间中取样得到的活性污泥的荧光染色图像的数值化数据和处理槽的操作参数。并且，图8是在实施例1中微生物制剂添加后第9天的样品的CFDA荧光图像，图9是在图8中所使用的同一样品的CFDA荧光总量测量图像，图10是在图8中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图11是在图8中所使用的同一样品的 CFDA明视野图像，图12是在图8中所使用的同一样品的PI荧光图像，图13是在图8中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图14是在图8中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
[表1] 
由表1可知，微生物制剂添加前，PI信号面积/CFDA信号面积的比值为0.66这样具有膨胀倾向的数值，而到添加微生物制剂后第9天的时候，经过双重染色的样品的PI信号面积/CFDA信号面积的比值变为了2.26，超过了目标值1.0，污泥构成微生物群落的生理状态发生了很大的变化。并且，到添加后第9天的时候，SVI值与添加前相比较减少了163ml/g，污泥的膨胀得到了改善。 
实施例2 
[基于活性污泥系统中固形物停留时间缩短操作的改善例] 
在工业排水的活性污泥处理设备中，以改善处理水的透视度作为目的，根据构成污泥的微生物群落的荧光显微镜观察图像，进行了缩短固形物停留时间的操作。 
在实施例中作为对象的活性污泥处理设备的容积负荷为1.2kg-BOD/m3/天。 
活性污泥样品的双重染色法、观察法以及样品的生理状态的判断基准是与上述实施例1的情况同样进行的。 
[采用缩短固形物停留时间的操作来改善形成污泥的微生物群落的凝集性] 
对在缩短固形物停留时间的操作之前的活性污泥样品，进行了荧光显微镜观察。 
其结果如图15～18所示。图15是在实施例2中固形物停留时间缩短处理前的样品的CFDA荧光总量测量图像，图16是在图15中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图17是在图15中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图18是在图15中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
对于该样品，将PI信号面积和CFDA信号面积进行了数值化。对该样品来说，PI信号面积/CFDA信号面积的比值为0.37，判断为需要改善。在该活性污泥样品中，成为膨胀主要原因的丝状细菌的增殖性高，具有被CFDA强烈染色了的趋势，因而尝试了采用缩短固形物停留时间的操作来进行的改善，该操作通过增加污泥的排出量来进行。 
[采用缩短固形物停留时间的操作进行的改善] 
在该活性污泥处理设备中，进行了将固形物停留时间从12.6天缩短至6.7天的操作，在自处理开始35天后，再次进行了荧光显微镜观察。 
表2同时记载了实施例2中在试验期间中取样得到的活性污泥的荧光染色图像的数值化数据和处理槽的操作参数。并且，图19是在实施例2中进行固形物停留时间缩短处理后的样品的CFDA荧光总量测量图像，图20是在图19中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图21是在图19中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图22是在图19中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
[表2] 
由表2可知，在进行缩短固形物停留时间的操作前，PI信号面积/CFDA信号面积的比值为0.37这样具有膨胀倾向的数值，而在进行了将固形物停留时间从12.6天缩短至6.7天的操作，自处理开始35天后，PI信号面积/CFDA信号面积的比值变为了2.74，污泥构成微生物群落的生理状态的变化得到确认。主要变化是CFDA染色时显示出荧光的丝状细菌的增殖受到抑制，因而污泥的凝集性得到了改善，作为改善目的的处理水的透视度从20cm变为30cm，大幅度地得到了改善。 
实施例3 
[采用向活性污泥系统添加微生物制剂、缩短固形物停留时间操作的改善例] 
在工业排水的活性污泥处理设备中，以改善污泥的沉降率和提高COD下降率为目的，根据构成污泥的微生物群落的荧光显微镜观察图像，进行了添加微生物制剂、缩短固形物停留时间的操作。 
在实施例中作为对象的活性污泥处理设备的容积负荷为2.2kg-BOD/m3/天。 
活性污泥样品的双重染色法、观察法以及样品的生理状态的判断基准是与上述实施例1的情况同样进行的。 
[采用添加微生物制剂、缩短固形物停留时间操作而进行的改善] 
对操作前的活性污泥样品进行了荧光显微镜观察。其结果如图23～26所示。图23是在实施例3中固形物停留时间缩短处理前的样品的CFDA荧光总量测量图像，图24是在图23中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图25是在图23中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图26是在图23中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
对于该样品，将PI信号面积和CFDA信号面积进行了数值化。对该样品来说，PI信号面积/CFDA信号面积的比值为0.56，判断为需要改善。在该活性污泥样品中，成为膨胀主要原因的丝状细菌的增殖性高，具有被CFDA强烈染色了的趋势，因而尝试了通过添加微生物制剂、缩短固形物停留时间而进行的改善。 
在上述活性污泥处理设备中，进行了8天时间的向曝气槽中添加微生物制剂(星光PMC株式会社，商品名MC-008)以及将固形物停留时间从12.4天缩短至12.0天的操作，尝试着进行了改善。微生物制剂的投入量设定为5.7kg/天。 
在从开始添加微生物制剂、缩短固形物停留时间操作28天后，再次对污泥进行了荧光显微镜观察。图27是在实施例3中进行添加微生物制剂、缩短固形物停留时间处理28天后的样品的CFDA荧光总量测量图像，图28是在图27中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图29是在图27中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图30是在图27中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
对于上述28天后的样品，将PI信号面积和CFDA信号面积进行了数值化。对该样品来说，PI信号面积/CFDA信号面积的比值变为了0.92， 在污泥构成微生物群落的生理状态上发现了得以改善的倾向，COD下降率也提高了。然而，作为其中一个目标，用SV30表示的污泥的沉降性却未得到改善。 
于是，再次追加了操作，通过增加污泥的排出量而使固形物停留时间缩短至6.2天。 
表3同时记载了实施例3中在试验期间中取样得到的活性污泥的荧光染色图像的数值化数据和处理槽的操作参数。并且，图31是在实施例3中进行微生物制剂添加、固形物停留时间缩短处理70天后的样品的CFDA荧光总量测量图像，图32是在图31中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图33是在图31中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图34是在图31中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
[表3] 
正如表3所示，对于操作后70天的样品，PI信号面积/CFDA信号面积的比值变为了1.31，确认了污泥构成微生物群落的生理状态得到了进一步改善，并且，SV30的值也得到了6％的改善。 
实施例4 
[向生物膜系统添加微生物制剂的改善例] 
在工业排水的生物膜处理设备中，以改善处理水的COD下降率为目的，根据构成生物膜的微生物群落的荧光显微镜观察图像，进行了添加微生物制剂的对策。生物膜样品的双重染色法、观察法以及样品的生理状态的判断基准是与上述实施例1的情况同样进行的。 
在本实施例中作为对象的生物膜处理设备是使微生物附着于处理槽内的载体上而进行排水处理的设备。载体通常不会向系统外流出，因而不必返回。在本实施例中作为对象的生物膜处理设备的容积负荷为3.0kg-BOD/m3/天。 
[通过添加微生物制剂来改善COD下降率] 
从上述生物膜处理设备中选取生物膜进行了荧光显微镜观察。图35是在实施例4中微生物制剂添加前的样品的CFDA荧光总量测量图像，图36是在图35中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图37是在图35中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图38是在图35中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
对于该样品，将PI信号面积和CFDA信号面积进行了数值化。对该样品来说，PI信号面积/CFDA信号面积的比值为0.45，判断为需要改善。向生物膜处理设备中添加微生物制剂，尝试着进行了改善。 
在上述生物膜处理设备中，向生物膜处理槽内添加了微生物制剂(星光PMC株式会社，商品名MC-008)，来改善活性污泥的生理状态。微生物制剂的投入量设定为5.4kg/天。 
在自添加微生物制剂17天后，再次对生物膜取样，并进行了荧光显微镜观察。 
表4同时记载了实施例4中在试验期间中取样得到的活性污泥的荧光染色图像的数值化数据和处理槽的操作参数。并且，图39是在实施例4中微生物制剂添加17天后的样品的CFDA荧光总量测量图像，图40是在图39中所使用的同一样品的CFDA二值化图像，图41是在图39中所使用的同一样品的PI荧光总量测量图像，图42是在图39中所使用的同一样品的PI二值化图像。 
[表4] 
正如表4所示，对于添加后17天的样品来说，PI信号面积/CFDA信号面积的比值变为了2.31，构成生物膜的微生物群落的生理状态发生了很大的变化。并且，处理槽的COD下降率提高了27％。 
工业适用性 
本发明的微生物群落生理状态的判断方法能够快速并且准确地判断出在排水的生物处理设备的处理槽中存在的微生物群落的生理状态是否良好。 
本发明的排水处理方法能够根据利用本发明的判断方法所判断的微生物群落的生理状态，一面良好地维持管理该微生物群落的生理状态，一面稳定地进行排水处理。 

Claims (16)

1.一种微生物群落生理状态判断方法，用于判断存在于排水的生物处理设备的处理槽中的微生物群落的生理状态，所述微生物群落生理状态判断方法包括：
取样步骤，对存在于所述处理槽中的微生物群落进行取样；
染色步骤，利用第一荧光色素和第二荧光色素来对该微生物群落进行染色，其中，所述第一荧光色素是与该微生物群落中的微生物的核苷酸链相结合的色素，所述第二荧光色素是被该微生物细胞内的酶分解而发出与所述第一荧光色素不同波长的荧光的色素，所述第一荧光色素为选自由碘化丙啶、溴化乙锭、溴乙啡锭二聚体、DAPI、7-氨基放线菌素D、和SYTOX Green组成的组中的一种，所述第二荧光色素为选自由荧光素二乙酸酯、羧基荧光素二乙酸酯、磺酸基荧光素二乙酸酯、二氯荧光素二乙酸酯组成的组中的一种；
荧光强度测量步骤，对经过染色的该微生物群落，测量来自所述第一荧光色素的第一荧光强度F1和来自所述第二荧光色素的第二荧光强度F2；
判断步骤，对于在所述测量步骤中得到的测量值，当第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2为1～20的范围内时，判断为所述微生物群落的生理状态良好；该比值F1/F2不到1或者大于20时，判断为所述微生物群落的生理状态差；以及
在判断微生物群落的生理状态为差时，进行以下步骤：
（A）向处理槽中投入微生物制剂、和/或
（B）控制处理槽的固形物停留时间，
从而为使所述微生物群落的生理状态变为良好，边调整排水的生物处理设备的处理槽的运行状态，边进行排水处理。
2.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过对经过染色的所述微生物群落进行荧光显微镜观察或者使用流式细胞仪加以分析来进行所述荧光强度测量步骤。
3.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过用荧光显微镜观察经过染色的所述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件，根据预先设定的信号强度的阈值，将来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的荧光信号面积数值化，再求出分别来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的信号面积的比值，来进行所述荧光强度测量步骤。
4.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过用荧光显微镜观察经过染色的所述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件算出亮度和信号面积，将来自荧光色素的荧光总量、即信号面积×亮度数值化，进而求出来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的荧光总量的比值S1/S2，来进行所述荧光强度测量步骤。
5.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过使用流式细胞仪测量经过染色的所述微生物群落的第一荧光强度F1和第二荧光强度F2，进而求出第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2来进行所述荧光强度测量步骤。
6.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，在进行所述（B）控制处理槽的固形物停留时间时，作为控制对象的处理槽的固形物停留时间控制在按下式（1）算出的固形物停留时间的±2天的范围内：
固形物停留时间（天）＝（τ×X）／（（a×Ci）+（b×Si）-（c×τ×X））……（1）
其中，式（1）中的各符号表示下述意义：
τ：反应罐的水力学停留时间V/Qi（天）
Qi：排水量（m3/天）
Ci：排水的溶解性BOD值（mgO/L）
Si：排水的SS浓度（mg/L）
X：反应罐内的MLSS（mg/L）
V：反应罐容积（m3）
a：相对于溶解性BOD的污泥转换率（gMLSS/gBOD）
b：相对于SS的污泥转换率（gMLSS/gSS）
c：表示活性污泥微生物的内源呼吸所引起的减少量的系数（L/天）。
7.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过对经过染色的所述微生物群落进行荧光显微镜观察或者使用流式细胞仪加以分析来进行所述荧光强度测量步骤。
8.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过用荧光显微镜观察经过染色的所述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件，根据预先设定的信号强度的阈值，将来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的荧光信号面积数值化，再求出分别来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的信号面积的比值，来进行所述荧光强度测量步骤。
9.根据权利要求2所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过用荧光显微镜观察经过染色的所述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件，根据预先设定的信号强度的阈值，将来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的荧光信号面积数值化，再求出分别来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的信号面积的比值，来进行所述荧光强度测量步骤。
10.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过用荧光显微镜观察经过染色的所述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件算出亮度和信号面积，将来自荧光色素的荧光总量、即信号面积×亮度数值化，进而求出来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的荧光总量的比值S1/S2，来进行所述荧光强度测量步骤。
11.根据权利要求2所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过用荧光显微镜观察经过染色的所述微生物群落，对于荧光显微镜观察图像，使用图像处理软件算出亮度和信号面积，将来自荧光色素的荧光总量、即信号面积×亮度数值化，进而求出来自所述第一荧光色素和所述第二荧光色素的荧光总量的比值S1/S2，来进行所述荧光强度测量步骤。
12.根据权利要求1所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过使用流式细胞仪测量经过染色的所述微生物群落的第一荧光强度F1和第二荧光强度F2，进而求出第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2来进行所述荧光强度测量步骤。
13.根据权利要求2所述的微生物群落生理状态判断方法，其特征在于，通过使用流式细胞仪测量经过染色的所述微生物群落的第一荧光强度F1和第二荧光强度F2，进而求出第一荧光强度F1与第二荧光强度F2的比值F1/F2来进行所述荧光强度测量步骤。
14.一种排水处理方法，包括：
进行权利要求3所述的微生物群落生理状态判断方法的步骤；以及
在根据该判断方法判断微生物群落的生理状态为差时，进行以下步骤：
（A）向处理槽中投入微生物制剂、和/或
（B）控制处理槽的固形物停留时间，
从而为使所述微生物群落的生理状态变为良好，边调整排水的生物处理设备的处理槽的运行状态，边进行排水处理。
15.一种排水处理方法，包括：
进行权利要求4所述的微生物群落生理状态判断方法的步骤；以及
在根据该判断方法判断微生物群落的生理状态为差时，进行以下步骤：
（A）向处理槽中投入微生物制剂、和/或
（B）控制处理槽的固形物停留时间，
从而为使所述微生物群落的生理状态变为良好，边调整排水的生物处理设备的处理槽的运行状态，边进行排水处理。
16.一种排水处理方法，包括：
进行权利要求5所述的微生物群落生理状态判断方法的步骤；以及
在根据该判断方法判断微生物群落的生理状态为差时，进行以下步骤：
（A）向处理槽中投入微生物制剂、和/或
（B）控制处理槽的固形物停留时间，
从而为使所述微生物群落的生理状态变为良好，边调整排水的生物处理设备的处理槽的运行状态，边进行排水处理。
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