CN111003813B - 一种确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。本发明方法利用流式细胞术测定不同温度保存的硫自养反硝化菌生物膜的细胞活性状态，将其中细胞活性状态最接近硫自养反硝化菌中试运行时的细胞活性状态的保存温度确定为最适保存温度，测试数据经活性恢复后细胞活性状态和性能效果验证可靠。本发明方法能够简化硫自养反硝化菌生物膜微生物活性恢复过程，快速启动硫自养反硝化菌生物膜污水处理，可使污水处理厂对硝态氮和总氮的去除率分别达到96％和88％以上，同时实现节能降耗的效果，具有非常高的工业化可行性。
Description
技术领域
本发明涉及一种确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。
背景技术
污水处理厂总氮达标排放一直是污水处理厂运行的难点，随着污水处理排放标准的日益提高，大量的碳源被投加到缺氧池或反硝化滤池中以强化脱氮。但是采取投加碳源的方法，不仅是对石油类资源物质的浪费(投加的碳源如乙酸或乙酸钠，一般是石油炼制的产物)，同时也会显著增加污水处理的运行成本，进而对污水处理厂的节能降耗运行产生阻力。因此，基于节地目标和零外加碳源的污水脱氮技术被日益重视。硫自养反硝化是指在缺氧条件下，自养反硝化菌以单质硫为电子供体，将污水处理厂二次沉淀池中较高浓度的硝态氮转化为氮气的过程。此工艺无需额外投加碳源，只需要将深度处理单元反硝化滤池中投加的碳源更换为单质硫颗粒，自养反硝化菌附着在单质硫颗粒上，通过自养反硝化作用，实现污水处理厂总氮的超低排放与节能降耗稳定运行。其化学反应方程式如下：
55S+50NO3 -+38H2O+20CO2+4NH4 +→4C5H7O2N+25N2+55SO4 2-+64H+
自养反硝化菌生长速率较低，代时较长，会附着在单质硫颗粒上形成生物膜以强化其对硝态氮的去除，如果将培养成熟的，具有良好总氮去除效果的硫自养反硝化菌生物膜予以保存，应用于总氮达标存在难度，运行经费有限的污水处理厂，则可以有效缩短污水处理厂总氮达标排放的时间，节省碳源类物质资源，降低污水处理厂运行成本。温度是影响微生物活性的重要参数，确定最适于硫自养反硝化菌生物膜保存的温度，有助于简化硫自养反硝化菌生物膜的微生物活性恢复过程，缩短硫自养反硝化菌生物膜工程化应用启动时间，实现节能降耗效果。目前，尚未有针对硫自养反硝化菌生物膜活性恢复的研究，使硫自养反硝化菌生物膜的工程化应用受到影响。
发明内容
为了简化硫自养反硝化菌生物膜微生物活性的恢复过程，使污水处理厂总氮可以短时间达标排放，同时实现节能降耗的效果。本发明基于流式细胞术对不同温度条件下保存的硫自养反硝化菌生物膜的细胞活性状态进行表征，通过硫自养反硝化菌生物膜活性恢复效果和微生物活性恢复后细胞活性状态，对流式细胞术的表征结果进行验证，最终建立基于流式细胞术的确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的方法，为污水处理厂总氮超低排放和节能降耗运行提供技术支撑。
本发明的第一个目的是提供一种确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的方法，所述方法是利用流式细胞术测定不同温度保存的硫自养反硝化菌生物膜的细胞活性状态，将其中细胞活性状态最接近硫自养反硝化菌生物膜中试运行时的细胞活性状态时保存的温度确定为最适保存温度；所述硫自养反硝化菌生物膜细胞活性状态的测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定。
在本发明的一种实施方式中，所述利用流式细胞术确认最适温度的方法包括：
(1)硫自养反硝化菌生物膜测试样液的制备：用缓冲液稀释硫自养反硝化菌生物膜样品，混合均匀后通过装有水滑石的过滤装置，过滤后的样品离心、留用上清液，使用预冷缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin VBinding Buffer混匀制得；
(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液包括39％v/v磷酸二氢钠(0.2mol/L)和61.0％v/v磷酸氢二钠(0.2mol/L)。
在本发明的一种实施方式中，所述中试运行系统的最适pH为6.2-7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为6.2～6.8，与硫自养反硝化菌生物膜的稀释体积比为8～10：1。
在本发明的一种实施方式中，所述方法中的水滑石能够去除混合液中的硫酸盐。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤装置还包括15～25μm孔径的尼龙膜。
在本发明的一种实施方式中，所述离心速度为5000～10000rpm/min。
在本发明的一种实施方式中，所述样品清液与10x Annexin V Binding Buffer的混合体积比例为1：2～4。
在本发明的一种实施方式中，所述流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态是在对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITC Annexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育，之后于流式细胞仪上机检测。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育为10～20min。
本发明的第二个目的是提供一种快速启动硫自养反硝化菌生物膜工程的方法，所述方法是利用上述方法确定最适保存温度，在最适保存温度下，将培养成熟的硫自养反硝化菌生物膜置于保存基质中进行保存，活性恢复后即可启动硫自养反硝化菌生物膜工程。
在本发明的一种实施方式中，所述保存基质的COD浓度为40～50mg/L,NH4 +-N浓度为0.3～0.5mg/L，NO3 --N浓度为8～12mg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述活性恢复是将硫自养反硝化菌生物膜接种于生物反应器中，所述生物反应器有效容积20.0～40.0L，有效高度120～180cm，底部铺设粗砂与石块以承托上部单质硫颗粒，粗砂与石块上部为单质硫颗粒，孔隙率约35～45％。
本发明的第三个目的是提供一种污水处理的方法，所述是利用上述方法快速启动硫自养反硝化菌生物膜工程。
本发明有益效果
本发明通过流式细胞术对硫自养反硝化菌生物膜中活细胞，凋亡早期细胞，凋亡晚期细胞和死细胞比例进行表征，并与硫自养反硝化菌生物膜活性恢复过程的特征指标进行关联性分析，建立了基于流式细胞术的确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的方法。运用此方法，可以省略硫自养反硝化菌生物膜活性恢复的步骤，有效帮助准备采用硫自养反硝化菌生物膜技术进行硝态氮和总氮达标排放的污水处理厂实现节能降耗运行，降低运行成本，同时可以有效缩短硫自养反硝化菌生物膜工程化应用启动时间，维持硫自养反硝化菌生物膜工艺长期稳定运行，具有很高的可行性。
附图说明
图1为保存的硫自养反硝化菌生物膜的硝态氮去除率；
图2为保存的硫自养反硝化菌生物膜的总氮去除率。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1
硫自养反硝化菌生物膜保存培养：
硫自养反硝化菌生物膜的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将中试反应装置中硫自养反硝化菌生物膜约90个取出，平均三等份分别置于装有250ml保存基质的500ml血清瓶中(血清瓶预先充N2以排出空气中的O2)，保存基质为污水处理厂二次沉淀池出水，COD浓度为40-50mg/L,NH4 +-N浓度为0.3-0.5mg/L，NO3 --N浓度为8-12mg/L。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
中试系统在调试运行过程中、出水pH在6.2到7.0之间波动，稳定运行后，出水一般在pH6.4～6.8。
保存的硫自养反硝化菌生物膜细胞状态测试：
(1)取100ml硫自养反硝化菌生物膜混合液，用pH为6.6的磷酸盐缓冲液稀释至1L，于磁力搅拌器上搅拌5min，使生物膜破碎为絮体并保证均匀分布；
(2)样品经过水滑石滤层以去除液相中的硫酸盐后，用20μm孔径的尼龙膜过滤絮体样品，并于8000rpm/min离心5min；
(3)取沉淀置于50ml离心管中，样品于8000rpm/min离心5min；
(4)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用预冷磷酸盐缓冲液(pH为7.8)吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(5)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(6)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
制备样品时的过滤孔径的选择尤为重要，孔径过大，会引入更多生物絮体，造成染色不均匀问题，影响最终结果；孔径过小，又无法有效获得生物絮体。
硫自养反硝化菌生物膜细胞状态测试结果如表1所示。污水处理厂生化反应池中硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例较高，表明污水处理厂运行效果良好。于-20℃，4℃和20℃保存的硫自养反硝化菌生物膜在保存超过100d后，用于测定硫自养反硝化菌生物膜细胞状态，结果如表1所示。中试反应装置中硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例较高，表明中试系统硫自养反硝化效果良好。保存于20℃的用于测定硫自养反硝化菌生物膜的活细胞含量最低，表明20℃不适于硫自养反硝化菌生物膜的保存。保存于4℃的硫自养反硝化菌生物膜其活细胞比例为47.1％，凋亡晚期细胞和死细胞比例约为48.3％，较高的凋亡晚期细胞和死细胞比例表明4℃亦不适于硫自养反硝化菌生物膜的保存。保存温度为-20℃时，硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例达到60.8％，仅比中试反应装置中硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例低23.4％，同时其死细胞比例约为20.4％，与中试反应装置中硫自养反硝化菌生物膜死细胞比例较为接近。因此，初步确定-20℃为保存硫自养反硝化菌生物膜的最适温度。
表1保存的硫自养反硝化菌生物膜细胞活性状态
| 硫自养反硝化菌生物膜 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 中试运行系统 | 79.4±3.8 | 0.1±0.1 | 0.1±0.1 | 20.5±1.5 |
| 保存于-20℃ | 60.8±3.2 | 3.0±0.2 | 15.8±1.0 | 20.4±1.7 |
| 保存于4℃ | 47.1±3.0 | 4.6±0.9 | 23.7±1.8 | 24.6±2.2 |
| 保存于20℃ | 36.3±3.0 | 9.2±1.2 | 30.4±2.7 | 24.1±0.8 |
实施例2保存的硫自养反硝化菌生物膜的活性恢复条件
取源于不同血清瓶的硫自养反硝化菌生物膜，接种于生物反应器(有效容积20.0L，有效高度150cm)中，用以对硫自养反硝化菌生物膜进行活性恢复。于-20℃，4℃和20℃保存的硫自养反硝化菌生物膜分别置于R1，R2和R3中。生物反应器底部20cm铺设粗砂与石块以承托上部单质硫颗粒，粗砂与石块上部为100cm单质硫颗粒，孔隙率约40％。
实施例3活性恢复后硫自养反硝化菌生物膜特性
经过30d的活性恢复后，R1，R2和R3中的硫自养反硝化菌生物膜特性如表2所示，在硫自养反硝化菌生物膜活性恢复后，保存于4℃和20℃下硫自养反硝化菌生物膜硝态氮去除速率低于保存之前的硫自养反硝化菌生物膜硝态氮去除速率，只有保存在-20℃的硫自养反硝化菌生物膜硝态氮去除速率与保存之前一致。不同保存温度下硫自养反硝化菌生物膜的总氮去除速率均低于保存之前，经过活性恢复后，20℃和-20℃温度下保存的硫自养反硝化菌生物膜的总氮去除速率较接近保存前硫自养反硝化菌生物膜的总氮去除速率，但4℃下保存的硫自养反硝化菌生物膜的总氮去除速率相对较低。
通常硫自养反硝化菌生物膜硝态氮去除速率和总氮去除速率分别为140gNO3 --N/(m3·h)和125gTN/(m3·h)，中试运行系统驯化的硫自养反硝化菌生物膜达到相同硝态氮去除速率和总氮去除速率的时间分别为65和70d。将保存的硫自养反硝化菌生物膜进行活性恢复后，R1中硫自养反硝化菌生物膜达到相同硝态氮去除速率和总氮去除速率的时间分别需要12和15d，R2中硫自养反硝化菌生物膜达到相同硝态氮去除速率和总氮去除速率的时间分别需要21和22d，R3中硫自养反硝化菌生物膜达到相同硝态氮去除速率和总氮去除速率的时间分别需要18和20d。说明经活性恢复后的硫自养反硝化菌生物膜均具有较好的脱氮效果，其中保存于-20℃条件的硫自养反硝化菌生物膜具有最短的微生物活性恢复时间，较为适宜保存硫自养反硝化菌生物膜。
表2保存和活性恢复后硫自养反硝化菌生物膜的特性
实施例4活性恢复后硫自养反硝化菌生物膜对污染物去除效能
经过活性恢复过程后，不同保存温度下的硫自养反硝化菌生物膜对硝态氮和总氮的去除率均逐渐升高(图1和图2)，其对硝态氮和总氮的去除率分别超过96％和88％。在活性恢复的第15d，R1中的硫自养反硝化菌生物膜对硝态氮和总氮的去除效果最好，并一直呈现硝态氮和总氮去除率稳定升高的趋势，此结果也同表2中R1内硫自养反硝化菌生物膜最快恢复较高的硝态氮去除速率和总氮去除速率相对应，说明-20℃的条件较为适宜保存硫自养反硝化菌生物膜，在实际应用中具有很高的可行性。
实施例5活性恢复后硫自养反硝化菌生物膜特性与污泥细胞状态相关性
在硫自养反硝化菌生物膜活性恢复30d后，采用流式细胞术对硫自养反硝化菌生物膜细胞状态进行分析，结果如表3所示。不同保存温度下的硫自养反硝化菌生物膜中活细胞含量与中试运行系统中硫自养反硝化菌生物膜中活细胞含量基本一致，说明经过活性恢复后，硫自养反硝化菌生物膜均可发挥稳定的硝态氮和总氮去除效果。其中R1内硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例(79.5％±4.0％)最高，且凋亡晚期细胞比例(5.6％±1.0％)和死细胞比例(11.1％±1.1％)最低，说明-20℃的保存条件下硫自养反硝化菌生物膜细胞活性最高，较为适宜作为保存硫自养反硝化菌生物膜的条件。
表3活性恢复后硫自养反硝化菌生物膜细胞活性状态
| 硫自养反硝化菌生物膜 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 中试运行系统 | 82.5±4.1 | 2.5±0.5 | 4.3±0.8 | 10.7±1.0 |
| 保存于-20℃ | 79.5±4.0 | 3.8±0.5 | 5.6±1.0 | 11.1±1.1 |
| 保存于4℃ | 75.0±4.2 | 4.9±0.5 | 7.2±0.8 | 12.9±1.2 |
| 保存于20℃ | 77.8±4.0 | 5.0±0.7 | 6.0±0.8 | 11.2±1.2 |
依据Correl相关性分析发现，如表4所述，硫自养反硝化菌生物膜硝态氮去除速率和总氮去除速率和硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例具有极高的相关性，相关系数分别为0.9577和0.9450，表明利用硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例作为评价硫自养反硝化菌生物膜活性的方法具有极高的可行性。同时，由于保存的硫自养反硝化菌生物膜中，-20℃的保存条件下硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例最高，与活性恢复后R1中硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例结果相吻合。
表4活性恢复后硫自养反硝化菌生物膜特性与细胞活性状态关联性
因此，确定-20℃是保存硫自养反硝化菌生物膜的最适温度，利用流式细胞术可以作为确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的依据。流式细胞术操作简便，数据快速易得且准确可靠，亦可省略硫自养反硝化菌生物膜活性恢复过程，对于硫自养反硝化菌生物膜的保存与活性恢复具有重要意义。
对比例1
硫自养反硝化菌生物膜保存培养：
硫自养反硝化菌生物膜的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将中试反应装置中硫自养反硝化菌生物膜约90个取出，平均三等份分别置于装有250ml保存基质的500ml血清瓶中(血清瓶预先充N2以排出空气中的O2)，保存基质为污水处理厂二次沉淀池出水，COD浓度为40-50mg/L,NH4 +-N浓度为0.3-0.5mg/L，NO3 --N浓度为8-12mg/L。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
保存的硫自养反硝化菌生物膜细胞状态测试：
(1)取100ml硫自养反硝化菌生物膜混合液，用pH 6.6的磷酸盐缓冲液稀释至1L，于磁力搅拌器上搅拌5min，使生物膜破碎为絮体并保证均匀分布；
(2)用20μm孔径的尼龙膜过滤絮体样品，并于8000rpm/min离心5min；
(3)取沉淀置于50ml离心管中，样品于8000rpm/min离心5min；
(4)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用预冷pH 7.8磷酸盐缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(5)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(6)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
硫自养反硝化菌生物膜细胞状态测试结果如表5所示。
表5保存的硫自养反硝化菌生物膜细胞活性状态(未经水滑石层吸附)
| 硫自养反硝化菌生物膜 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 中试运行系统 | 51.5％±4.9％ | 15.8％±1.9％ | 15.7％±1.8％ | 17.0％±1.9％ |
| 保存于-20℃ | 58.8％±5.1％ | 13.5％±2.1％ | 13.7％±2.0％ | 14.0％±2.1％ |
| 保存于4℃ | 45.7％±4.7％ | 18.0％±2.7％ | 18.5％±2.5％ | 17.8％±2.4％ |
| 保存于20℃ | 43.3％±4.7％ | 19.0％±3.0％ | 19.2％±3.5％ | 18.5％±2.9％ |
由表5结果发现，未经水滑石层吸附的样品，其测试结果具有相近的变化规律，不同保存温度下，-20℃条件下保存的硫自养反硝化菌生物膜活细胞含量较高，且三种保存温度条件下，凋亡早期细胞，凋亡晚期细胞和死细胞含量极为接近。同时，脱氮效果良好的中试运行系中，其硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例仅为51.5％±4.9％，低于-20℃保存条件下的硫自养反硝化菌生物膜活细胞比例。以上结果表明样品中如果存在较高浓度硫酸盐，会显著影响细胞活性状态的测试结果，导致无法实现最是保存温度的确认。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种确定硫自养反硝化菌生物膜最适保存温度的方法，其特征在于，所述方法是利用流式细胞术测定不同温度保存的硫自养反硝化菌生物膜的细胞活性状态，将细胞活性状态最接近硫自养反硝化菌中试运行的细胞活性状态的保存温度确定为最适保存温度；所述硫自养反硝化菌生物膜细胞活性状态的测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定；
所述流式细胞术确认最适保存温度的步骤包括：
(1)硫自养反硝化菌生物膜测试样液的制备：用缓冲液稀释硫自养反硝化菌生物膜样品，混合均匀后通过装有水滑石的过滤装置，过滤后的样品离心、留用上清液，然后使用预冷缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin VBinding Buffer混匀制得；
(2)利用流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态；
所述流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态是在对照FITC Annexin V组加入0.5μlPI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITC Annexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育10～20min，之后于流式细胞仪上机检测。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为6.2～6.8。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述缓冲液与硫自养反硝化菌生物膜的稀释体积比为8～10：1。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述过滤装置还包括15～25μm孔径的尼龙膜。
5.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于，所述缓冲液包括39％v/v磷酸二氢钠和61.0％v/v磷酸氢二钠。
7.一种快速启动硫自养反硝化菌生物膜工程的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-6任一所述方法确定最适保存温度，在最适保存温度下，将培养成熟的硫自养反硝化菌生物膜置于保存基质中进行保存，活性恢复后即可启动硫自养反硝化菌生物膜工程。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述保存基质的COD浓度为40～50mg/L,NH4 +-N浓度为0.3～0.5mg/L，NO3 --N浓度为8～12mg/L。
9.一种污水处理的方法，其特征在于，所述是利用权利要求7所述方法快速启动硫自养反硝化菌生物膜工程。
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