CN114410618A - 一种固定化微生物载体的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固定化微生物载体的制备方法及其产品和应用，涉及焦化废水处理技术领域；该方法包括以下步骤：将聚乙烯醇、海藻酸钠和碳酸钙加入去离子水中，加热溶解至凝胶状，得到PVA混合溶液；在所述PVA混合溶液中加入盐酸，反应得到制孔后载体；将高效菌Comamonas sp.ZF‑3发酵菌体、活化污泥、粉末活性炭和聚羟基丁酸酯混合后，加入到所述制孔后载体中，混匀后得到混合物；将所述混合物进行循环冻融定型，之后将冻融定型后的载体投入氯化钙饱和硼酸溶液中进行化学交联表层强化，得到所述固定化微生物载体。发明制备的固定化微生物载体，在长时间的焦化废水降解过程中表现出高稳定性、高微生物活性、大孔性的特征。

Description

一种固定化微生物载体的制备方法及其产品和应用
技术领域
本发明涉及焦化废水处理技术领域，特别是涉及一种固定化微生物载体的制备方法及其产品和应用。
背景技术
截至2020年年底，我国焦炭年产量达4.71亿吨占全球总产量70％左右，是全球第一大焦炭生产、消费及出口国。以吨焦产生约0.6吨废水的理论基础计算，我国一年至少产生2.83亿吨焦化废水，其污染物负荷高、毒性效应显著是典型的难降解有机工业废水。在复杂的焦化废水环境中，功能降解菌的定殖和维持是实现焦化废水有效生物强化降解的基础，若想达到良好的生物强化效果，投加的微生物必须在废水生物处理系统中保持一定的代谢活力，维持相当的数量。在传统活性污泥生物处理系统中，为保持生物强化的连续性，部分废水处理厂周期性地投加菌体作为生物补剂，不可避免地增加了生物强化应用难度及成本。固定化技术为高效菌在难降解有机污染物治理中充分发挥其生物潜力提供了一个重要的手段。目前，研究者普遍采用生物强化联合固定化载体的方法进行难降解废水处理研究，该方法一方面可有效解决游离态细菌直接投加易于流失的不足，提高生物强化的稳定性和有效性；另一方面可缓解有毒废水对微生物的生物毒害作用。同时，固定化微生物易于固液分离，生物密度高，降解效率优于传统悬浮态的活性污泥，与生物膜法相比，这种方法更容易控制固定微生物的种类和数量，制备好的固定化微生物载体可长期贮藏，便于运输。以聚乙烯醇(PVA)为基础材料的包埋法固定化是目前研究较多、性能较好的固定化方法，其合成理论及应用研究仍是一个前沿领域，具有良好的发展前景和巨大应用市场。目前为止，固定化微生物进行生物强化在水处理中的应用研究尚处于初级阶段，新型载体的设计与制备是固定化技术研发的重点，寻找同时能满足微生物固定化载体稳定性、传质性及微生物活性要求的固定化方法是固定化技术发展的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化微生物载体的制备方法及其产品和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的固定化微生物载体采用循环冻融-表层硼酸交联-碳酸钙制孔耦合方法制备得到，在长时间的焦化废水降解过程中表现出高稳定性、高微生物活性、大孔性的特征。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种固定化微生物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、海藻酸钠和CaCO3加入去离子水中，加热溶解至凝胶状，得到PVA混合溶液；
(2)在所述PVA混合溶液中加入盐酸，反应得到制孔后载体；
(3)将高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体、活化污泥、粉末活性炭和聚羟基丁酸酯混合后，加入到所述制孔后载体中，混匀后得到混合物；
(4)将所述混合物进行循环冻融定型，得到冻融定型后的载体；
(5)将所述冻融定型后的载体投入CaCl2饱和硼酸溶液中进行化学交联表层强化，得到所述固定化微生物载体。
进一步地，在步骤(1)中，所述聚乙烯醇、所述海藻酸钠、所述CaCO3和所述去离子水的质量体积比为10g：2g：1g：90mL。
进一步地，在步骤(1)中，所述加热溶解为在90℃条件下加热溶解20min。
进一步地，在步骤(3)中，所述高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体的制备方法为：将高效菌Comamonas sp.ZF-3接种于LB培养基，在pH 7.0，30℃，130r/min条件下培养16h，得到高效菌Comamonas sp.ZF-3的发酵液；所述发酵液离心，除去上清，得到沉淀物；所述沉淀物经磷酸盐缓冲溶液冲洗后，再次离心取沉淀，得到所述高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体。
进一步地，在步骤(3)中，所述高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体和所述活化污泥的质量比为1：4。
进一步地，在步骤(3)中，所述高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体和所述活化污泥组成的生物强化污泥，在所述固定化微生物载体中的添加量为28mg/mL。
进一步地，在步骤(4)中，所述冻融定型为循环冻融4次，每次冻融具体为：将所述混合物在-8℃的条件下冷冻20h，然后再在室温条件下解冻4h。
进一步地，在步骤(5)中，所述化学交联的时间为70min。
本发明还提供一种根据上述制备方法制备得到的固定化微生物载体。
本发明还提供上述的固定化微生物载体在焦化废水处理中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用循环冻融-表层硼酸交联-碳酸钙制孔耦合方法制备的固定化微生物载体，在长时间的焦化废水降解过程中表现出高稳定性、高微生物活性、大孔性的特征。载体采用循环冻融，短时间表层硼酸交联的固定化方式，内层是以链分子间、分子内的氢键形成的空间网络结构，表面为与硼酸交联反应形成的不溶性凝胶聚合物，具有良好稳定性，在长时间振荡运行后仍能保持稳定的物理形态；同时，通过响应面法建模优化载体制备菌泥量、交联时间和冻融次数，采用表层交联实现了载体物理稳定性及机械强度的前提下，最大限度保证了载体内部微生物活性，载体内部的微生物群落结构在整个反应过程中基本保持稳定，高效菌在继续保持优势状态的情况下，实现包括硝化菌属在内的功能微生物得到有效增殖目的，这也反映了固定化载体微生物对于焦化废水污染负荷冲击所具有的耐受性和抗冲击性；相对于小孔载体，通过碳酸钙制孔提高了载体内微生物的活动空间，有助于载体内微生物增殖、更新，减少硼酸法制备的PVA载体内微生物更替过程中出现的载体孔隙堵塞、有机污染物传质效果不佳等问题。本发明为焦化废水生物强化处理提供了一个有效的固定化方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制备的固定化载体的内部微生物形态特征；
图2为固定化微生物载体中主要细菌属的相对丰度分类树；
图3为菌泥量、交联时间、冻融次数对载体稳定性的影响：(a)菌泥量和交联时间的交互作用对载体稳定性的影响；(b)菌泥量和冻融次数的交互作用对载体稳定性的影响；(c)交联时间和冻融次数的交互作用对载体稳定性的影响；
图4为菌泥量、交联时间、冻融次数对载体微生物活性的影响：(a)菌泥量和交联时间的交互作用对载体微生物活性的影响；(b)菌泥量和冻融次数的交互作用对载体微生物活性的影响；(c)交联时间和冻融次数的交互作用对载体微生物活性的影响；
图5为菌泥量、交联时间、冻融次数对载体综合性能的影响：(a)菌泥量和交联时间的交互作用对载体基本性能的影响；(b)菌泥量和冻融次数的交互作用对载体基本性能的影响；(c)交联时间和冻融次数的交互作用对载体基本性能的影响；
图6为固定化载体合成机理及化学特征：(a)载体合成过程FT-IR分析，其中加热为对比例1制备的载体，加热+冻融为对比例2制备的载体，加热+冻融+交联为对比例3制备的载体，加热+冻融+交联+制孔为实施例1制备的载体；(b)载体合成过程化学结构变化；
图7为固定化载体合成过程表观形貌变化：(a)为对比例1制备的载体，(b)为对比例2制备的载体，(c)为对比例3制备的载体，(d)为实施例1制备的载体；
图8为载体合成过程孔径分布变化：(a)为对比例1制备的载体，(b)为对比例2制备的载体，(c)为对比例3制备的载体，(d)为实施例1制备的载体；
图9为固定化微生物载体降解COD性能；
图10为固定化微生物载体降解NH4 +-N性能；
图11为固定化微生物载体降解有机组分效果GC-MS分析：(a)进水；(b)菌泥降解出水；(c)载体降解出水；
图12为焦化水降解反应前后固定化微生物载体的形貌及内部特征对比：(a)反应前载体表观形貌观察；(b)反应后载体表观形貌观察；(c)反应前载体内部结构激光共聚焦3D观察；(d)反应后载体内部结构激光共聚焦3D观察；(e)反应前载体内部形貌观察；(f)反应后载体内部形貌观察；
图13为焦化水降解反应后固定化微生物载体孔径分布；
图14为焦化水降解反应后固定化微生物载体中主要细菌属的相对丰度分类树(圆圈的大小代表每个门、纲、目和科的丰度，星星的大小代表每个属的比例)；
图15为焦化水降解反应后菌泥中主要细菌属的相对丰度分类树；
图16为焦化水降解反应后固定化载体与菌泥微生物群落功能差异分析(左边所示为不同功能丰度在两个样品中的丰度比例，中间所示为95％置信度区间内，功能丰度的差异比例，最右边的值为p值，p值＜0.05，表示差异显著，功能丰度用红色标识)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例或对比例中所用高效菌Comamonas sp.ZF-3参见论文“Treatment ofcoking wastewater in biofilm-based bioaugmentation process:Biofilm formationand microbial community analysis”；所用活化污泥(悬浮固体浓度MLSS＝3000mg/L)取自焦化厂废水处理工艺二沉池，在30℃摇床活化12h，6000r/min转速条件下离心8min，除去上清后使用。以下效果验证实验所用焦化废水取自焦化厂废水处理工艺调节池，该废水已经过蒸氨、隔油、气浮等预处理，水中COD、NH4 +-N浓度分别为2490mg/L和189mg/L。
高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体制备方法：将高效菌Comamonas sp.ZF-3接种于LB培养基，在pH 7.0，30℃，130r/min条件下培养16h，得到高效菌Comamonas sp.ZF-3的发酵液，发酵液再在6000r/min转速条件下离心8min，除去上清，再经磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)冲洗后，再次离心得高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体。
实施例1
(1)称量10g 1799型PVA、2g海藻酸钠(SA)和1g CaCO3加入盛有90mL去离子水的烧杯中，在90℃条件下水浴搅拌加热20min直至混合物完全溶解变成凝胶状，得到PVA混合溶液，将烧杯从水浴装置中取出，静置降温。
(2)待PVA混合溶液降温至50℃，在烧杯中加入5mL溶质质量分数为10％的稀盐酸，快速搅拌至不再产生气泡以使CaCO3与盐酸充分反应，增加载体的孔隙度及孔隙均匀度，继续降温至35℃，得到制孔后载体。
(3)高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体与活化污泥按质量比1:4混合，取2.8g作为生物强化污泥，与1g粉末活性炭(PAC)和1g聚羟基丁酸酯(PHB)提前混匀吸附30钟后，加入步骤(2)降温至35℃的制孔后载体中，充分搅拌，得到混合物。
(4)将步骤(3)得到的混合物缓慢匀速倒入160mm*160mm*160mm的多孔硅胶模具，保证混合物填满模具方孔不留空隙。将装有混合物的模具盒加盖放入-8℃的冰箱冷冻20h，然后取出室温(25℃)解冻4h，如此循环冻融4次，得到冻融定型后的载体。
(5)将冻融定型后的载体投入2％CaCl2饱和硼酸溶液中化学交联70min，最后用去离子水冲洗新制备载体3次，清除残留硼酸溶液，得到固定化微生物载体。
如图1所示，在不同放大倍数下对实施例1制备的固定化微生物载体内部形貌进行扫描电镜(SEM)观察，图像表明制备的固定化微生物载体内部空隙发达、孔径分布均匀，固定化微生物多以菌团形式镶嵌于固定化载体孔道内，由于大孔结构，污染物和代谢产物可自由通过载体孔道，同时能够实现微生物群落更新，避免微生物生长繁殖更新带来的孔道堵塞影响传质性能。同时均匀分布的大孔为固定化载体内部溶解氧的传质提供有利条件。
采用高通量16SrRNA基因测序技术对实施例1制备的固定化载体微生物群落结构进行分类树分析，如图2所示，变形菌门Proteobacteria(85.29％)是系统中最丰富的一门，其包括的优势属有：丛毛单胞菌属Comamonas(32.61％)、假单胞菌属Pseudomonas(4.32％)、索氏菌属Thauera(2.60％)和硫杆菌属Thiobacillus(2.31％)等。高效菌株Comamonas sp.ZF-3在载体微生物群落中占32.61％，表明其成功固定化，成为微生物载体中优势菌。载体中包含的假单胞菌属Pseudomonas、索氏菌属Thauera和硫杆菌属Thiobacillus等都是水处理系统常见菌属，在焦化废水处理中广泛存在。此外，厚壁菌门Firmicutes(1.65％)、拟杆菌门Bacteroidetes(5.29％)和浮霉菌门Planctomycetes(1.84％)也占一定比例，这些微生物在废水处理中普遍存在并发挥相应作用。在硝化菌方面，固定化微生物载体内检测到小比例的硝化螺菌属Nitrospira(0.72％)，它们负责亚硝酸盐的氧化，在废水脱氮过程中起到关键作用，但由于其属于自养菌，生长周期长，对环境要求高，在活性污泥中比例降低，包埋比例较低。
实验例1
本发明采用响应面法和Box-Behnken(BBD)实验设计法研究固定化载体制备参数对载体性能的影响并求出最优制备参数。
采用傅立叶变换红外吸收光谱(FT-IR)对载体合成过程化学结构特征进行分析，载体经切片冷冻干燥后使用傅立叶红外光谱仪Nicolet iS10 FT-IR spectrometer进行功能团、化学结构分析，光谱扫描范围是400-4000cm-1，光谱仪分辨率4cm-1，信躁比是50000:1，扫描32次。
采用比表面积测试法(BET)对载体比表面积进行测试，载体经切片冷冻干燥后，采用APAS2460型全自动物理吸附仪进行液氮吸附脱附实验，分析测定载体的比表面积。
采用压汞法(MIP)对载体孔径分布、孔隙度、表观密度等物理特性进行测试，载体经切片冷冻干燥后使用AutoPore lv9510高性能全自动压汞仪进行分析，测试温度为室温，高压分析最大压力60000psia，对应最小可测孔径为3nm，低压分析压力范围为0.5-50psia，对应可测孔径范围360-3.6μm，检测进/退汞量小至1μL。
采用扫描电子显微镜(SEM)对载体样品进行形貌观察，在SEM观察前需对载体样品进行制样处理：将样品置于2.5％的戊二醛溶液4℃固定2h，用磷酸缓冲溶液冲洗3次后，依次使用浓度为30％，50％，70％，80％，90％的乙醇各进行15min脱水，再用100％的乙醇脱水20min后用乙酸异戊酯置换两次，冷冻干燥24h后喷金在15kv工作电压下进行观察。
采用高通量16SrRNA基因测序技术对固定化载体内部生物群落进行分析。载体样品用无菌刀片从载体内部获得，将样品在-50℃(BT2KXL，Virtis，USA)冷冻干燥并用无菌陶瓷研磨后进行基因提取扩增。
本发明采用循环冻融-表层硼酸交联-碳酸钙制孔耦合方法进行固定化载体制备，制备参数中影响载体性能的主要自变量因素有固定化菌泥量、交联时间和冻融次数。参照实施例1的制备方法，选取菌泥量(单位mg/mL，即实施例1步骤(3)中生物强化污泥在步骤(3)得到的混合物中的含量)、交联时间和冻融次数作为三个自变量，分别以固定化微生物载体稳定性和固定化载体内微生物活性作为响应变量，采用响应面(RSM)三因素Box-Behnken Design(BBD)法进行实验设计，得到最佳回归模型，对影响固定化微生物载体稳定性和固定化载体内微生物活性的各个自变量因素进行量化分析，分析自变量因素交互作用对固定化微生物载体稳定性和载体内微生物活性的影响，每个自变量的水平和范围列于表1。
表1 BBD(Box-Behnken)设计中自变量和代码值的水平和范围
Figure BDA0003445560330000081
表2制备参数对载体稳定性影响BBD实验设计方案和结果
Figure BDA0003445560330000082
通过响应面三因素Box-Behnken Design(BBD)实验方案设计，共得到17组固定化微生物载体稳定性探究实验。载体的稳定性通过它在水中10日总有机碳(TOC)损失量来表征，具体操作是将17个实验组载体浸入去离子水中，30℃恒温条件下摇床振荡，10天后取样分析水中TOC浓度，从而计算溶出的载体量。其在在水中溶解浓度越低，表明载体TOC损失量越少，载体稳定性就越好。BBD实验设计方案及实验结果列于表2。
运用Design-Expert 8.06软件对表2中实验数据进行分析，选用Quadratic模型进行关联，关联过程中对模型各项系数进行方差分析。方差分析表明该模型的F值为15.79意味着模型是显著的，“Prob>F”值小于0.0500表示模型项是有效的，其中A、B、C、B2、C2是重要的模型项。根据Design-Expert 8.05软件绘制响应面3D立体分析图和等高线图，得出菌泥量、交联时间、冻融次数三个因素对响应变量载体稳定性的影响大小，如图3所示。
由图3(a)所示，当冻融次数固定的情况下，随着菌泥量的增加，载体在水中TOC损失量变大，载体稳定性降低，稳定性的降低在菌泥量25mg/mL以上尤为明显，由等高线在菌泥量轴线上的疏密度可看出。相反，交联时间的延长可明显提高载体稳定性，且在开始的45min内提高最为显著，由等高线在交联时间轴线上的疏密度可看出；如图3(b)所示，冻融次数对载体稳定性的提高主要集中在前三次，三次以上冻融对载体稳定性影响不显著，其体现在等高线在冻融次数轴线的稀疏性。同时，观察等高线图发现，等高线图为椭圆形，说明菌泥量与冻融次数对载体的稳定性有一定的交互影响作用；图3(c)表明交联时间与冻融次数对载体的稳定性也有一定的交互影响作用。
表3制备参数对载体微生物活性影响BBD实验设计方案和结果
Figure BDA0003445560330000091
通过响应面三因素Box-Behnken Design(BBD)实验方案设计，共得到17组固定化微生物活性探究实验。固定化载体内微生物活性可通过载体摇瓶降解焦化废水化学需氧量(COD)实验进行表征，具体操作是将17个实验组载体加入含150mL稀释3倍的焦化废水锥形烧瓶中，30℃恒温条件下摇床振荡，在130r/min转速下降解48h后出水取样进行COD浓度检测，从而判断出固定化载体中微生物降解COD量。出水COD越低，表明固定化微生物载体内微生物活性越强。BBD实验设计方案及实验结果列于表3。
运用Design-Expert 8.06软件对表3中实验数据进行分析，选用Quadratic模型进行关联，关联过程中对模型各项系数进行方差分析。方差分析表明该模型的F值为1593.9意味着模型是显著的，“Prob>F”值小于0.0500表示模型项是有效的，其中A、B、AB、A2、C2是重要的模型项。根据Design-Expert 8.06软件绘制响应面3D立体分析图和等高线图，得出菌泥量、交联时间、冻融次数三个因素对响应变量固定化载体中微生物活性的影响大小。
由图4(a)所示，当冻融次数固定的情况下，随着菌泥量的增加，降解实验出水COD降低，表明固定化载体中微生物活性较高，当菌泥量大于25mg/mL后，出水COD的降低相对缓慢。相反，交联时间的延长可降低载体中微生物的活性，且在63min以后影响较为明显，由等高线在交联时间轴线上的疏密度可看出，等高线图为椭圆形，说明菌泥量与交联时间对固定化载体中微生物活性有一定的交互影响作用；如图4(b)所示，冻融次数对载体中微生物活性影响微弱，可忽略不计；图4(c)表明交联时间与冻融次数对载体中微生物活性有一定的交互影响作用，但冻融次数对载体中微生物活性影响不明显。
表4制备参数对载体综合性能影响BBD实验设计方案和结果
Figure BDA0003445560330000101
Figure BDA0003445560330000111
上述研究表明包埋菌泥量、交联时间和循环冻融次数作为三个自变量因素，对固定化微生物载体稳定性和固定化载体内微生物活性产生了直接影响或交互影响。固定化微生物载体的制备既要考虑载体本身稳定性，也要考虑到载体内部微生物活性，在此基础上载体综合性能这个响应变量是载体稳定性和载体微生物活性的综合体，根据TOC损失量和COD出水的数值差异，我们以4TOC+COD作为固定化载体综合性能的表征，4TOC+COD数值越小，表明TOC损失和出水COD越低，载体稳定性和载体微生活性越好，载体综合性能越好。选取菌泥量、交联时间和冻融次数作为三个自变量，以固定化微生物载体综合性能作为响应变量，得到最佳回归模型，利用模型寻求最优条件，并分析自变量因素交互作用对固定化微生物载体综合性能的影响，通过对上述实验数据进行处理，BBD实验设计方案及实验结果列于表4。
运用Design-Expert 8.06软件对表4中实验数据进行分析，选用Quadratic模型进行关联，关联过程中对模型各项系数进行方差分析。方差分析表明该模型的F值为42.43意味着模型是显著的，“Prob>F”值小于0.0500表示模型项是有效的，其中A、B、AB、A2、B2、C2是重要的模型项。失拟显著系数Lack offit为3.21(Lack offit>0.05)不显著。根据Design-Expert 8.05软件分析绘制响应面3D立体分析图和等高线图，得出菌泥量、交联时间、冻融次数三个因素对响应值固定化载体综合性能的影响大小。
由图5(a)所示，当冻融次数固定的情况下，随着菌泥量的增加，4TOC+COD先降后升，相应的载体综合性能先升后降，表明菌泥量在约30mg/mL之前主要表现为对固定化载体内微生物降解活性的提高，30mg/mL后主要体现在菌泥量对固定化微生物载体稳定性的不良影响。同理，随着交联时间的延长的增加，4TOC+COD先降后升，相应的载体综合性能先升后降，表明菌交联时间在72min之前主要表现为对固定化载体稳定性的提高，72min后主要体现为对固定化微生物载体活性的影响，等高线图为椭圆形，说明菌泥量与交联时间对固定化载体综合性能有一定的交互影响作用；如图5(b)所示，随着冻融次数的增加，4TOC+COD先降后升，相应的载体综合性能先升后降，表明冻融次数在4次之前主要表现为对固定化载体稳定性的提高，4次后主要体现为对固定化微生物载体活性的影响，等高线图为椭圆形，说明菌泥量与冻融次数对固定化载体综合性能有一定的交互影响作用；图5(c)表明交联时间与冻融次数对载体综合性能有一定的交互影响作用，但并不显著。
经回归拟合后，各因素与响应值之间的关系可用以下回归方程式(1-1)和(1-2)表示。
根据编码因子得出的方程式：
4TOC+COD＝446.06-107.84A-82.90B-51.76C+64.33AB+27.80AC-16.22BC+222.80A2+72.47B2+65.34C2 (1-1)
根据实际因素得出的方程式：
4TOC+COD＝1238.42000-26.37810菌泥量-5.95172交联时间-129.68625冻融次数+0.057178菌泥量*交联时间+0.55600*菌泥量*冻融次数-0.18028*交联时间*冻融次数+0.35647*菌泥量2+0.035788*交联时间2+16.33625*冻融次数2 (1-2)
方程相关系数R＝0.7883，表明拟合方程精确度较高，实验失拟项较小，可用于实际值的分析。由以上回归方程求解固定化微生物载体最佳制备参数，即求4TOC+COD最小值时自变量的取值，求得最佳条件为：菌泥量28mg/mL、交联时间70min、冻融次数4次。
对比例1
(1)称量10g 1799型PVA、2g海藻酸钠(SA)和1g CaCO3加入盛有90mL去离子水的烧杯中，在90℃条件下水浴搅拌加热20min直至混合物完全溶解变成凝胶状，得到PVA混合溶液，将烧杯从水浴装置中取出，静置降温。
(2)高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体与活化污泥按质量比1∶4混合，取2.8g作为生物强化污泥，与1g粉末活性炭(PAC)和1g聚羟基丁酸酯(PHB)提前混匀吸附30钟后，加入步骤(1)降温至35℃的PVA混合溶液中，充分搅拌，得到固定化微生物载体。
对比例2
(1)称量10g 1799型PVA、2g海藻酸钠(SA)和1g CaCO3加入盛有90mL去离子水的烧杯中，在90℃条件下水浴搅拌加热20min直至混合物完全溶解变成凝胶状，得到PVA混合溶液，将烧杯从水浴装置中取出，静置降温。
(2)高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体与活化污泥按质量比1:4混合，取2.8g作为生物强化污泥，与1g粉末活性炭(PAC)和1g聚羟基丁酸酯(PHB)提前混匀吸附30钟后，加入步骤(1)降温至35℃的PVA混合溶液中，充分搅拌，得到混合物。
(3)将步骤(2)得到的混合物缓慢匀速倒入160mm*160mm*160mm的多孔硅胶模具，保证混合物填满模具方孔不留空隙。将装有混合物的模具盒加盖放入-8℃的冰箱冷冻20h，然后取出室温解冻4h，如此循环冻融4次，得到固定化微生物载体。
对比例3
(1)称量10g 1799型PVA、2g海藻酸钠(SA)和1g CaCO3加入盛有90mL去离子水的烧杯中，在90℃条件下水浴搅拌加热20min直至混合物完全溶解变成凝胶状，得到PVA混合溶液，将烧杯从水浴装置中取出，静置降温。
(2)高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体与活化污泥按质量比1:4混合，取2.8g作为生物强化污泥，与1g粉末活性炭(PAC)和1g聚羟基丁酸酯(PHB)提前混匀吸附30钟后，加入步骤(1)降温至35℃的PVA混合溶液中，充分搅拌，得到混合物。
(3)将步骤(2)得到的混合物缓慢匀速倒入160mm*160mm*160mm的多孔硅胶模具，保证混合物填满模具方孔不留空隙。将装有混合物的模具盒加盖放入-8℃的冰箱冷冻20h，然后取出室温解冻4h，如此循环冻融4次。
(4)将冻融定型后的载体投入2％CaCl2饱和硼酸溶液中化学交联70min，最后用去离子水冲洗新制备载体3次，清除残留硼酸溶液，得到固定化微生物载体。
利用傅立叶变换红外吸收光谱仪(FTIR)对对比例1-3和实施例1制备的固定化微生物载体进行表征以探究载体合成过程中化学结构特征，对其合成化学基础进行分析。
如图6(b)所示，聚乙烯醇(PVA)具有多元醇的化学结构，可看作是在交替相隔碳原子上含有羟基活性基团的多元醇，完全醇解的PVA(醇解度≥98％)至少在水中加热到80℃以上才能全部溶解，通过对其水溶液进行90℃水浴加热，得到完全溶解的均质胶状溶液，表明其在加热条件下具有良好的亲水性。
如图6(a)所示，加热处理后样品的FT-IR光谱在3250cm-1、2905cm-1、1601cm-1、1415cm-1、1321cm-1、1081cm-1出现六个吸收峰，归属于PVA中羟基(-OH)、亚甲基(-CH2-)、C-O等的伸缩振动峰或弯曲振动峰，表明PVA溶液加热处理后化学结构保持稳定。
羟基的尺寸小、极性强、易形成氢键，本发明通过冻融法对其进行改性，图6(a)显示经加热和循环冻融处理样品的FT-IR光谱在3150cm-1处出现归属于氢键(O·H)的吸收峰，表明PVA溶液经加热和循环冻融后形成链分子间、分子内的氢键和微晶区三维网络，化学结构如图6(b)所示。
本发明采用硼酸交联法对PVA进行改性，图6(a)显示经加热、循环冻融和硼酸交联后样品的FT-IR光谱在1283cm-1处出现归属于B-O键的吸收峰，表明PVA溶液中的羟基与硼酸离子反应生成B-O的共价键，反应方程式如图6(b)所示，同时3250cm-1吸收峰表明羟基(-OH)依旧存在，交联反应不完全停留于表层结构。
碳酸钙制孔的原理是稀盐酸与载体中碳酸钙制孔剂在搅拌过程中反应释放二氧化碳，二氧化碳气泡的内部气压与PVA溶液之间压力达到平衡，气泡受扩散阻力难以溢出，在载体内部形成稳定均匀的孔洞实现载体传质性能的提高，如图6(a)所示，经制孔后样品FT-IR光谱未发生明显改变，表明制孔对载体化学结构未产生影响。
综上所述，最优制备参数下，采用循环冻融-表层硼酸交联-碳酸钙制孔耦合方法制备的固定化微生物载体，内层是以链分子间、分子内的氢键形成的空间网络结构，表面为与硼酸交联反应形成的不溶性凝胶聚合物，具有良好稳定性，同时，制孔不会对载体化学结构产生影响。
利用扫描电子显微镜(SEM)、比表面积测试仪(BET)、压汞法孔隙测试对对比例1-3和实施例1制备的固定化微生物载体进行表征以探究其合成过程中物理性质特征，结果见图7、图8和表5。
如图7(a)所示，PVA溶液加热后具有良好的成膜性，表观上未出现明显孔道，图8(a)也表明加热后样品无明显孔径分布。表5显示该样品BET比表面积为1.0740m2/g，孔隙度Porosity为11.7031％，表观密度Apparent(skeletal)Density为1.1.3584g/mL。
如图7(b)所示，经循环冻融后样品在表观上表现为多孔网状的结构，归因于循环冻融形成的链分子间、分子内的氢键和微晶区三维网络，图8(b)表明循环冻融后样品出现100～1000nm范围的孔径分布，表5显示该样品BET比表面积迅速扩大约十倍为10.7358m2/g，中位孔径Median Pore Diameter(V)为325.9nm，孔隙度Porosity提高到41.1221％，表观密度Apparent(skeletal)Density随之下降为1.1622g/mL。
化学交联后样品中的羟基与硼酸离子反应生成单二醇型的B-O共价键，图7(c)显示样品在表观结构上多孔网状的结构更加致密，可归因于共价形成的多孔结构，图8(c)表明循环冻融后样品孔径向10～100nm移动，表5显示该样品BET比表面积增加不明显为11.7276m2/g，中位孔径Median Pore Diameter(V)为130.5nm，孔隙度Porosity降到38.0594％，表观密度Apparent(skeletal)Density为1.0455g/mL。
如图7(d)所示，经碳酸钙制孔样品在冻融交联后的多孔网状结构上分布着孔径较大的孔，图8(d)观察到样品出现大量1000～10000nm孔径分布，表5显示该样品BET比表面积也迅速增加到15.8477m2/g，中位孔径Median Pore Diameter(V)为2266.2nm，孔隙度Porosity提高到64.6818％，表观密度Apparent(skeletal)Density随之下降为0.9932g/mL，低于水密度。
综上所述，最优制备参数下，采用循环冻融-表层硼酸交联-碳酸钙制孔耦合方法制备的固定化微生物载体，内层是以链分子间、分子内的氢键形成的空间网络结构，表面为与硼酸交联反应形成的不溶性凝胶聚合物，具有良好稳定性，经碳酸钙制孔后载体内部出现大量1000～10000nm孔径分布，BET比表面积也迅速增加到15.8477m2/g，中位孔径MedianPore Diameter(V)为2266.2nm，孔隙度Porosity提高到64.6818％，表观密度Apparent(skeletal)Density随之下降为0.9932g/mL，载体制孔成功，具有良好的大孔结构。
表5固定化载体合成过程物理特性
Figure BDA0003445560330000151
效果验证
1.分析方法
(1)降解效果分析方法
在固定化载体降实验中，进出水氨氮(NH4 +-N)和化学需氧量(COD)浓度采用纳氏试剂分光光度法和重铬酸盐法测定，水中有机污染物使用固相微萃取-气相色谱质谱法(SPME-GC-MS)测定。
(2)固定化载体特性分析方法
采用Leica TCS-SP8激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)对载体内部结构进行观察，激发波长设定为480和520nm。在CLSM下观察前，固定化载体样品需在在25℃暗室中使用Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit L7012(Invitrogen,USA)试剂盒进行荧光染色20min，该试剂盒包含SYTO9和Propidium iodide(PI)两种荧光核酸标记物，可分别穿透完整细胞(染为绿色荧光)和受损细胞(染为红色荧光)进行染色；采用扫描电子显微镜(SEM)对载体表观形貌进行观察，在SEM观察前需对固定化载体样品进行制样处理：将样品置于2.5％的戊二醛溶液4℃固定2h，用磷酸缓冲溶液冲洗3次后，依次使用浓度为30％，50％，70％，80％，90％的乙醇各进行15min脱水，再用100％的乙醇脱水20min后用乙酸异戊酯置换两次，冷冻干燥24h后喷金在15kv工作电压下进行观察。采用压汞法(MIP)、BET法对载体比表面积、孔径分布、孔隙度、表观密度等物理特性进行测试。
(3)固定化载体微生物群落分析方法
采用高通量16SrRNA基因测序技术对固定化载体内部生物群落进行分析。在分析之前，将混合固定化载体样品在-50℃(BT2KXL，Virtis，USA)冷冻干燥并用无菌陶瓷研磨，使用E.Z.N.A.soil.DNA试剂盒(OMEGA Bio-Tek，USA)提取载体样品基因组DNA并用琼脂糖凝胶检测DNA完整性。使用V3-V4区用通用引物341F(5′-CCTAGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)PCR扩增载体样品16SrRNA基因：94℃预变性3min，94℃变性30s，45℃退火20s，65℃延伸30s，以上步骤循环3次后，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，以上步骤循环20次后72℃最后延伸5min，然后将Illumina桥式PCR兼容引物引入进行第二次PCR扩增：95℃预变性3min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，以上步骤循环5次后最后72℃延伸5min，PCR产物经Agencourt AMPure XP处理纯化。使用
Figure BDA0003445560330000161
3.0荧光计(Life Invitrogen)进行定量和等体积均质后，由上海生工科技有限公司(中国上海)Illumina MiSeq PE300系统对扩增产物进行测序。利用Mothur程序(http://www.Mothur.org)将获得的序列以97％相似水平聚类成操作分类单元(OTU)，并对每个样本进行Alpha多样性分析，包括稀疏曲线、Chao1丰度估计指数、Shannon多样性指数、Simpson指数、和Coverage覆盖率分析，以测量样品物种多样性和覆盖率。
(4)固定化载体微生物群落功能预测
采用PICRUSt工具对固定化载体微生物群落功能进行预测，PICRUSt工具全称是Phylogenetic Investigation ofCommunities by Reconstruction ofUnobservedStates。此工具基于已测细菌16SrDNA的信息和对比Greengene数据库后近缘物种的OTU信息，推断它们的共同祖先的基因功能谱，同时对Greengenes数据库中其它未测物种的基因功能谱进行推断，构建古生菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱；最后，将测序得到的菌群组成映射到数据库中，继而对菌群代谢功能进行预测。此方法的准确性在84％-95％，能非常好的反映样品中的功能基因构成。此外，基于KEGG代谢功能数据库和PICRUSt功能二级分类结果，可进行样本或组间群落功能差异分析，找出样本或组间丰度存在显著差异的功能分类，默认筛选条件为P<＝0.05。
2.降解实验
将实施例1制备的固定化微生物载体全部投入到含有500mL焦化废水的锥形瓶中，30℃，130r/min转速条件下进行摇床降解试验，降解实验进行123天，每48h取样检测并更换全部废水；同时将2.8g菌泥(其中高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体与活化污泥质量比1:4，与实施例1使用的菌泥量一致)投入到另一个含有500mL焦化废水的锥形瓶中，以同等条件进行对照组降解试验，对固定化载体处理焦化废水性能进行研究。
2.1COD和氨氮去除效果
每48h对上述降解实验锥形瓶取样进行COD、氨氮浓度检测，结果见图9和图10。
图9显示了固定化载体和菌泥降解焦化废水试验过程中进水、出水COD浓度及其去除率随时间的变化。根据进水浓度，将试验分为三个阶段。第一阶段(第1-13天)是载体适应废水阶段，将稀释的焦化废水(COD＝312，NH4 +-N＝24，mg/L)每隔48h进行更换，在以48h为间隔的6次换水处理过程中，固定化载体和菌泥微生物逐渐适应进水水质，表现为COD浓度快速下降，去除率快速升高，固定化载体COD去除率增长速度由落后于菌泥逐渐超过菌泥。从第二阶段(第13-63天)开始，进水污COD浓度不断增长，载体COD去除率能基本维持在90％以上，菌泥COD去除率出现明显的波动并在63天出现下降趋势，63天时载体COD去除率也出现明显波动。在第三阶段开始时(第63-123天)，载体和菌泥COD去除率都有下降，菌泥下降表现明显，这意味着快速升高的焦化废水负荷对载体中微生物中也有一定的抑制作用，但抑制弱于菌泥。在减缓COD浓度增长速度后，载体COD去除率逐渐上升恢复，表明固定化载体中微生物具有良好的抗冲击和适应性，菌泥降解性能未见明显恢复。109天后，进水COD、氨氮浓度达到2490mg/L、189mg/L，固定化载体COD的去除率基本稳定在92％，菌泥则为50％左右。
图10显示了固定化载体和菌泥降解焦化废水试验过程中进水、出水NH4 +-N浓度及其去除率随时间的变化。第一阶段(第1-13天)是载体和菌泥适应废水阶段，将稀释的焦化废水(COD＝312，NH4 +-N＝24，mg/L)每隔48h进行更换，在以48h为间隔的6次换水处理过程中，固定化载体和菌泥微生物均未表现出明显的氨氮去除率升高且存在波动，菌泥降解表现相对较好。从第二阶段(第13-63天)开始，进水NH4 +-N浓度不断增长，载体NH4 +-N去除率缓慢上升，菌泥NH4 +-N去除率出现波动下降趋势。在第三阶段开始时(第63-123天)，载体和菌泥NH4 +-N去除率均出现波动，快速升高的焦化废水负荷对载体中硝化菌产生抑制作用。在减缓NH4 +-N浓度增长速度后，载体NH4 +-N去除率基本稳定，表明固定化载体中硝化菌能够在载体定殖并增长，菌泥降解性能未见明显恢复，去除率低表明菌泥中硝化菌受抑制严重，活性降低。109天后，进水COD、氨氮浓度达到2490mg/L、189mg/L，载体NH4 +-N的去除率基本稳定在60％左右，菌泥则低于10％。
2.2有机污染物降解效果
在123天，采集进水和出水样本，用GC-MS进行有机成分分析，结果见图11和表6。由图11和表6可知，焦化废水中的主要有机成分包括酚类化合物如苯酚、2-甲基苯酚、3-甲基苯酚、2,3-二甲基苯酚、3,5-二甲基苯酚，杂环化合物如喹啉、异喹啉、吲哚和多环芳烃如1-甲基萘、2-甲基萘、1,5-二甲基萘、苊、蒽和咔唑等，这些有机污染物经固定化微生物载体降解基本可以去除，出水中仅检测到少量降解产物如6-十一烷酮、难降解有机物如1-甲基萘、1,5-二甲基萘以及塑料残留物2,4-二叔丁基苯酚，有机物降解结果与COD去除的降解数据吻合较好。而菌泥出水样品中仍存在大量酚类化合物如苯酚、2-甲基苯酚、3-甲基苯酚、3,5-二甲基苯酚，杂环化合物如喹啉、吲哚和多环芳烃如氧芴、蒽和咔唑等，表明菌泥生物降解有机污染物性能弱于载体微生物，出水有机污染物浓度高。
表6固定化微生物载体降解有机组分效果GC-MS检索结果
Figure BDA0003445560330000191
注：ND代表未检出。
3.固定化载体特性分析
3.1载体形貌结构变化
对固定化载体对焦化水降解实验反应前后表观形貌和内部特征进行了对比(图12)。如图12(a)和图12(b)所示，经过123天的摇瓶实验，载体外观结构稳定，未出现破损和膨胀，表明载体具有稳定的机械强度。运用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜对固定化载体内部进行荧光染色3D观察和形貌观察，图12(c)、(e)和图12(d)、(f)对比表明载体内微生物在降解焦化废水过程中经历了进一步的生长繁殖，载体内部微生物数量明显增长，证明载体经过与高负荷焦化废水反应，载体内微生物仍能保持良好的活性，同时也间接表明载体内部传质效果良好，污染物等有机质在载体内流通性较好为微生物增殖提供基本物质条件。
3.2载体物理特性变化
对固定化微生物载体123天样品进行压汞法孔隙测试，如图13所示反应123天后载体内部仍存在100～10000nm范围的孔径分布，能保持良好的大孔结构，但相对于未反应前载体大孔量明显下降，可能由于降解实验过程中微生物大量增殖生长进入大孔导致，表7显示载体运行123天后BET比表面积为13.7420m2/g，中位孔径Median Pore Diameter(V)为1804.5nm，孔隙度Porosity为51.4698％。相对于未反应前载体，各参数都略有下降，但下降程度有限，载体物理特征保持基本稳定。
表7固定化载体反应后物理特性变化
Figure BDA0003445560330000201
3.3载体微生物群落丰度和多样性变化
表8反应前后固定化载体微生物群落丰富度和多样性指数
Figure BDA0003445560330000202
Figure BDA0003445560330000211
aSeqnum:样品中获得有效序列数量。
bOTUnum:操作分类单元数量，数字越大表明群落多样性越丰富。
cShannonindex:样品微生物多样性指数之一，指数越高表明群落多样性越丰富。.
dChao1 index:样品微生物丰度指数，指数越高表明群落越丰富。
eCoverage:样品构建序列库的覆盖率，数值越高表明样本中序列没有被测出的概率越低。
fSimpson:样品微生物多样性指数之一，指数越低表明群落多样性越丰富。
采用高通量16SrRNA基因测序技术对反应后固定化载体及菌泥内微生物群落进行分析。同时，以未参加降解载体作为反应前样品进行对照分析，探究降解实验前后载体和菌泥内微生物群落多样性和丰度变化。表8的测序结果表明，未参加降解实验载体与反应123天载体中分别获得了51905和67333个合格序列，覆盖率均超过95％，说明构建的序列库能够反映微生物群落的多样性。根据有效读数，共观察到4154个和5081个OTU，Shannon指数、Chao 1指数和Simpson指数表明，降解实验进行123天后，载体内微生物群落丰富度和细菌多样性均有提高，进一步支持了载体内部激光共聚焦3D观察结果，而菌泥中微生物群落丰度和多样性相对于未反应载体均下降，表明反应过程中菌泥受到抑制，微生物多样性和丰度均受到影响降低。
3.4载体微生物菌群结构演替
对反应后固定化载体和菌泥微生物群落结构进行了分类树分析。如图14和图15所示，载体中变形菌门Proteobacteria(68.69％)是最丰富的菌门。变形菌门包括的优势属有：丛毛单胞菌属Comamonas(23.25％)、假单胞菌属Pseudomonas(5.09％)、硫杆菌属Thiobacillus(6.31％)、Diaphorobacter(3.23％)、索氏菌属Thauera(2.12％)和Tepidiphilus(2.19％)。其中，高效菌Comamonas.sp.ZF-3在反应后载体群落中占23.25％，仍保持优势状态，其所占比例相对于反应前载体降低是由载体微生物多样性增加引起。测序结果表明，降解实验123天后，固定化载体中大部分属于变形菌门Proteobacteria的优势菌属在载体能得到保持，相对稳定。这些菌属丰度的稳定是固定化微生物载体实现对焦化废水COD有效降解的原因。菌泥中高效菌Comamonas.sp.ZF-3没有得到有效保留，随着换水流失严重只检测到1.59％，是其降解COD效果不佳的主要原因，尤其是针对酚类化合物和杂环类化合物的降解。
厚壁菌门Firmicutes(1.69％)和拟杆菌门Bacteroidetes(13.96％)在载体中比例相对提高，可能是由于载体内部提供的厌氧和缺氧环境促进了相应厌氧菌和兼性菌的生长。这些微生物在废水处理中普遍存在，厚壁菌门Firmicutes细菌能产生纤维素、脂肪酶、蛋白酶等胞外酶，与焦化废水中难降解有机物的水解利用密切相关，而拟杆菌门Bacteroidetes菌属在反硝化和有效降解难降解大分子有机物中起着重要作用。在硝化菌方面，在载体内检测到硝化螺菌属Nitrospira(1.90％)，其相对丰度从载体反应前的0.72％提高到载体反应123天后的1.90％。这些增量代表了氨氮去除能力的增强，这与运行期间NH4 +-N去除量的变化一致。但由于本身活性污泥中自养型硝化螺菌属的不足，氨氮降解能力的进一步提升需考虑在载体制备时引入额外的硝化菌属。由于水中大量有毒有机物未得到充分降解，菌泥中硝化菌在污泥中受到抑制消耗殆尽，故菌泥表现出较差的脱氮效果。
3.5载体微生物群落功能差异分析
利用PICRUSt功能分析软件对固定化载体和菌泥微生物群落中已有测序微生物基因组的基因功能构成进行进一步功能差异分析。结果如图16所示，固定化载体和菌泥微生物群落功能在细胞膜运输(Membrane Transport)、外源物质生物降解代谢(Xenobioticsbiodegradation and metabolism)、能量代谢(Energy Metabolism)和复制和修复(Replication and Repair，7.1％)等功能丰度存在显著性差异(p<0.05)，其中固定化微生物载体群落在膜运输和外源物质生物降解代谢功能上表现出更高的丰度，表明其在焦化废水生物降解中良好的降解作用。菌泥群落表现出更高丰度的能量代谢和复制和修复基功能，表明菌泥中微生物活性受到一定抑制，微生物需要进行更多基础代谢以适应高负荷污染环境并进行细胞修复。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种固定化微生物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯醇、海藻酸钠和CaCO3加入去离子水中，加热溶解至凝胶状，得到PVA混合溶液；
(2)在所述PVA混合溶液中加入盐酸，反应得到制孔后载体；
(3)将高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体、活化污泥、粉末活性炭和聚羟基丁酸酯混合后，加入到所述制孔后载体中，混匀后得到混合物；
(4)将所述混合物进行循环冻融定型，得到冻融定型后的载体；
(5)将所述冻融定型后的载体投入CaCl2饱和硼酸溶液中进行化学交联表层强化，得到所述固定化微生物载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述聚乙烯醇、所述海藻酸钠、所述CaCO3和所述去离子水的质量体积比为10g：2g：1g：90mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述加热溶解为在90℃条件下加热溶解20min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述高效菌Comamonassp.ZF-3发酵菌体的制备方法为：将高效菌Comamonas sp.ZF-3接种于LB培养基，在pH 7.0，30℃，130r/min条件下培养16h，得到高效菌Comamonas sp.ZF-3的发酵液；所述发酵液离心，除去上清，得到沉淀物；所述沉淀物经磷酸盐缓冲溶液冲洗后，再次离心取沉淀，得到所述高效菌Comamonas sp.ZF-3发酵菌体。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述高效菌Comamonassp.ZF-3发酵菌体和所述活化污泥的质量比为1：4。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述高效菌Comamonassp.ZF-3发酵菌体和所述活化污泥组成的生物强化污泥，在所述固定化微生物载体中的添加量为28mg/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述循环冻融定型为循环冻融4次，每次冻融具体为：将所述混合物在-8℃的条件下冷冻20h，然后再在室温条件下解冻4h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述化学交联的时间为70min。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的固定化微生物载体。
10.一种根据权利要求9所述的固定化微生物载体在焦化废水处理中的应用。
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