CN111705117A - 一种dna稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，包括：(1)采集氮素污染河湖底泥样品；(2)进行13C‑和15N‑同位素孵育实验；(3)采用氯化铯密度梯度溶液超高速离心方法分离重层DNA；(4)进行DNA标记程度评价及菌群结构分析。本发明提供了一种分析天然水体环境下鉴定非培养混合菌群中厌氧铁氨氧化细菌的方法，为研究和认识铁还原参与的氮素循环过程和开发自养型氮转化技术具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物生态学技术领域，更具体地，涉及一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法。
背景技术
河流(湖泊)氮素污染是一个广泛、持久的环境污染问题，其主要成因是河流接受沿岸大量的氮素输入负荷超出了自身的自净能力，长期受到来自流域农村生活、农业施肥、畜禽养殖及城市生活等面源污染。为提高生态系统的修复能力和寻求新的生物脱氮方法，人们一直对自然界氮循环路径进行着不断的探索与认识。厌氧铁氨氧化(又称Feammox)是水、陆生态系统中新发现的氮素转化途径，连同异养反硝化、共反硝化及厌氧氨氧化路径共同促进污染水域的氮素转化。Feammox已经在森林土壤、沼泽、湿地等有见报道，将氨氮(NH4 +-N)分别氧化为氮气(N2)、亚硝酸盐氮(NO2 --N)和硝酸盐氮(NO3 --N)作为最终产物。过程产生的NO2 --N和NO3 --N再联合Fe(II)氧化和异养反硝化等过程可实现深度的总氮(TN)去除效果。由于Fe元素在地球生物圈广泛存在，储存量高，其变价态形式多样(包括零价铁、Fe(II)和Fe(III)等)且易转化，因此Feammox具有广泛的研究与应用价值。厌氧铁氨氧化具有在厌氧条件下利用Fe(III)氧化NH4 +产生的N2的特性，相比于传统硝化反硝化具有节省100％曝气和100％有机碳源的优势，具有巨大的环境与经济效益。
然而，受研究水平和时间的限制，与Feammox相关的微生物群落生物信息非常缺少，物种鉴定和生理特征分析受到很大挑战。有研究者观察到Geobacter和Shewanella属的细菌丰度与Fe(III)的还原速率和15NH4 +-N降解速率呈正相关，从而推断其是Feammox的执行者。另有同位素示踪实验表明Geothrix与Shewanella属与Feammox驱动的30N2产生有关。这些研究仅从统计和观察角度间接推断该途径的功能微生物群落，无直接证据显示Feammox细菌的群落生态功能和生理代谢特点。由于具有厌氧铁氨氧化功能的细菌在自然界种类较多，并且与其他细菌生态关联性较高，实验室不可以单独培养，因其环境非培养的特点而难以依靠传统单纯培养技术鉴定。因此，基于群落代谢功能的微生物鉴定方法显得尤为重要。
基于DNA的稳定性同位素探针技术(DNA-based Stable Isotope Probing，DNA-SIP)是联系微生物群落功能和分子系统发育鉴定的优选方法之一。通过在微生物代谢底物中标记重同位素(例如13C或15N)的方法，可对代谢活跃且特异性降解底物的微生物基因组进行标记，然后通过氯化铯(CsCl)密度梯度离心，分离出重层功能细菌DNA，与现代第二代高通量测序技术结合，达到活性群落下游结构分析的目的。该方法数据结果可靠、重复性高、操作系统性强，适合复杂环境样品的群落结构鉴定。专利CN103966318B公开有利用DNA稳定性同位素探针原位揭示判别稻田甲酸利用型产甲烷古菌的方法，能够敏锐的、原位的揭示稻田甲酸利用型产甲烷古菌，但是其所针对的是稻田甲酸利用型产甲烷古菌，并不适用于厌氧铁氨氧化细菌的群落生态功能和生理代谢特点。虽然厌氧铁氨氧化为自养型生物脱氮技术，相比消耗碳源的传统异养反硝化具有不可比拟的经济优势。然而，在复杂微生物体系环境中，由于厌氧铁氨氧化细菌丰度限制和异养反硝化、厌氧氨氧化等其他脱氮路径存在的干扰，针对厌氧铁氨氧化细菌的鉴定和表征是一个微生物分析技术上的难点。同时，在天然有机碳源较高和溶解氧高的底泥中，异养反硝化脱氮菌群丰度通常较高，而利用Fe(III)作为电子受体的自养型厌氧铁氨氧化细菌丰度通常较小。因此，利用传统高通量测序反映出的菌群比例也较小，分析困难。因此，亟需发开一种针对厌氧铁氨氧化细菌的可靠、准确的鉴定方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，包括如下步骤：
S1.原位采集水体底泥样本；
S2.13C-、15N-双标记特异性孵育厌氧铁氨氧化细菌：将底泥样本置于容器中，添加Fe(III)，再添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，并同时添加C2H2气体，密封容器；孵育5～6天后，提取土壤DNA；
S3.将步骤S2的土壤DNA通过氯化铯超高速离心分离重层DNA；
S4.对步骤S3浮力密度梯度分层DNA进行标记程度鉴定，对13C，15N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行高通量测序分析。
本发明利用微生物合成代谢的差异，通过13C-和15N-双重同位素孵育标记活性铁氨氧化细菌的方法，同时利用乙炔抑制干扰细菌异养反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌，通过超高速离心方法分离重层标记的13C-和15N-DNA，利用第二代高通量测序技术分析重层DNA基因库中的微生物群落结构，使非培养厌氧铁氨氧化细菌鉴定成为可能，提高了稀有丰度厌氧铁氨氧化细菌的鉴定率，为鉴定厌氧铁厌氧化细菌提供了一套可靠、准确的鉴定方法。
优选地，步骤S1所述水体为河流或湖泊。
优选地，步骤S2所述底泥样本为预培养后的污泥，具体为将混合均匀的新鲜污泥置于容器中并加水稀释，置换容器中的气体，以制造无氧反应环境，24～26℃避光孵化4～5天；目的在于以耗尽样品中原有的电子接受体。
优选地，所述Fe(III)的添加浓度为20～25mg-Fe/L。
优选地，所述13C-NaHCO3和15N-NH4Cl的用量分别为30～35mg-C/L和15～20mg-N/L。
优选地，所述C2H2气体的用量为其所填充的容器体积的30％。
优选地，步骤S2还包括同时以添加12C-NaHCO3和14N-NH4Cl，添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl的处理分别作为对照。
具体地，步骤S2为将实验污泥样品等量分成三份，将污泥样本分别置于不同容器中，添加Fe(III)，在1#对照组分别添加12C-NaHCO3和14N-NH4Cl，2#对照组分别添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，3#实验组分别添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，并同时添加30％顶空气体积C2H2以抑制异养反硝化和厌氧氨氧化细菌实验组，分别用丁基橡胶塞和铝盖密封血清瓶，在避光恒温摇床分别孵育5～6天；针对孵育后的污泥样品，分别采用土壤DNA提取试剂盒提取基因组总DNA样品。
优选地，步骤S3具体为将DNA样品与GB缓冲液混合得DNA-GB样品溶液，再分别添加CsCl溶液、GB溶液，调整样品目标折射率为1.4029±0.0002；再18～22℃，180000～200000×g，超高速离心44～46h；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，用PEG6000和70％乙醇洗涤每层DNA。
优选地，所述DNA-GB样品溶液、CsCl溶液、GB溶液的体积比为0.1：0.9：4.9。
具体为先测定各个样品的DNA浓度，并各取5μg DNA样品与GB缓冲液混合定容至100μL；在15mL离心管中分别添加上述DNA-GB样品溶液、4.9mL CsCl溶液以及0.9mL GB溶液；针对上述每个离心溶液样品，利用CsCl溶液和GB缓冲液分别调整样品目标折射率(nD-TC值)为1.4029±0.0002；再20℃，190000×g，超高速离心45h；再采用1mL注射器针头置入离心管顶部，通过固定流速泵向离心管输入灭菌MiliQ水，同时在离心管底部穿入小孔，采用事先准备的15个1.5mL无菌离心管收集置换流出的密度梯度分级DNA样品；测定各个分级样品的折射率，并计算相应层级浮力密度；最后采用550μL PEG 6000溶液加入到各个分级DNA样品中，混合均匀，分别在35℃条件下加热1h，以沉淀DNA样品。在20℃，12000×g条件下离心0.5h，并去除离心上清液，风干样品；采用500μL乙醇溶液悬浮沉淀样品，在20℃，12000×g条件下离心10min，去除离心上清液，重复操作两次，并风干样品；采用30μL TE溶液溶解固体DNA样品，并于-20℃条件下保存。
优选地，步骤S4具体为针对不同浮力密度层级DNA样品，采用通用细菌16s rRNA特异性正向引物1055F和反向引物1392R，通过qPCR扩增各层16s rRNA基因，通过各层基因比较的相对丰度，反映13C，15N-双标记的重层DNA在浮力密度梯度中的分布状况，再针对被13C，15N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行二代高通量测序分析。
具体地，利用二代高通量测序分析数据再结合河流(湖泊)现场采用的环境数据，应用多元统计分析手段，可以探究天然流域水体底泥中的Feammox细菌生长机制及分布状态。
本发明提供的DNA稳定性同位素探针原位鉴定厌氧铁氨氧化细菌的方法克服了该类功能菌不可实验室单独培养的瓶颈难题，为后续群落鉴定、生理生态特征、环境效应等研究提供了基础条件，有利于该项自养脱氮技术的发展。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的DNA稳定性同位素探针是在原位水平上添加特定种类标记同位素培养，在不破坏原有生态群落结构的基础上筛选分离执行特定功能的细菌，反映的是代谢底物活跃的功能菌结构，使非培养厌氧铁氨氧化细菌鉴定成为可能。
(2)本发明采用特定种类的同位素标记、同时利用乙炔气体和超高速离心的方法可以针对性的筛选出活跃的目标微生物群体DNA，提高了厌氧铁氨氧化细菌目标菌群在重层DNA中的分布比例，提高了稀有种鉴定的成功率，提高了稀有丰度厌氧铁氨氧化细菌的鉴定率。
(3)本发明方法解决了厌氧铁氨氧化细菌因其环境非培养的特点而难以依靠传统单纯培养技术鉴定这一问题，为后续厌氧铁氨氧化自养脱氮技术的发展提供了微生物鉴定方法。
附图说明
图1为13C，15N-双标记DNA-SIP流程操作图。
图2为厌氧铁氨氧化实验组微宇宙培养底物浓度周期变化图。
图3为16s rRNA的基因QPCR标准曲线制作图。
图4为不同浮力密度层中16s rRNA的基因分布图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
主要试剂配制
(1)配制1.0mol/L Tris-HCl溶液，调节pH为8.0；
(2)TE缓冲溶液：包括0.01mol/L Tris-HCl和0.001mol/L EDTA；
(3)GB缓冲溶液：包括0.1mol/L Tris-HCl、0.1mol/L KCl和0.001mol/L EDTA；
(4)70％(v/v)乙醇溶液：量取70mL无水乙醇加入30mL的去离子水；
(5)CsCl溶液：称取50g CsCl于30mL上述GB缓冲液中，其光反射指数约为1.4153±0.0002；
(6)PEG 6000溶液：溶解150g Polyethylene Glycol 6000和46.8g NaCl于500mL去离子水中，定容、过滤并储存。
实施例1
一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，流程操作如图1所示，具体包括如下步骤：
1、13C，15N-SIP孵育与DNA提取
(1)现场采样：根据考察目的和取样计划，在每个取样点收集河流(湖泊)底泥0-20cm深度的生物样品约2L，平均分成两份分别置于无菌的塑料采样袋中，排空采样袋上部空气并密封，通过内置冰块的采样箱运送至实验室；
(2)对于每个采样点样品，其中一份样品根据《土壤理化分析》(中国林业出版社，2017)方法分别测定含水量、pH、粒径分布、溶解性三氮、有机质等指标分析。另一份样品用于DNA-SIP孵育实验；
(3)接种污泥：实验分成三组进行，分别为1#对照组、2#13C，15N-双标记对照组和3#13C，15N-双标记+C2H2抑制实验组，每组样品一式三份作为平行，实验设计如表1所示。取10g混合均匀的新鲜污泥置于120mL血清瓶中，并分别加入三倍体积的灭菌MiliQ水。然后，分别用丁基橡胶塞和铝盖密封血清瓶；
表1实验设计
| 序号 | 分组名称 | 标记方案 |
| 1 | 1#对照组 | <sup>12</sup>C-NaHCO<sub>3</sub>和<sup>14</sup>N-NH<sub>4</sub>Cl |
| 2 | 2#对照组 | <sup>13</sup>C-NaHCO<sub>3</sub>和<sup>15</sup>N-NH<sub>4</sub>Cl |
| 3 | 3#实验组 | <sup>13</sup>C-NaHCO<sub>3</sub>和<sup>15</sup>N-NH<sub>4</sub>Cl+C<sub>2</sub>H<sub>2</sub> |
(4)预培养：采用双路进样针和氦气(99.999％)分别置换血清瓶中的顶空气体，制造无氧反应环境，在25℃生化培养箱避光孵化4-5天，以耗尽样品中原有的电子接受体；
(5)利用氦气(99.999％)再次置换血清瓶中的顶空气体，随后用无菌注射器抽取污泥样品1mL用于分析可还原态Fe(III)本底浓度；
(6)正式培养：根据现场采样的浓度分别确定培育实验中HCO3 -和NH4 +-N的浓度，添加Fe(III)离子浓度为25mg-Fe/L，在1#对照组中分别添加未标记的12C-NaHCO3和14N-NH4Cl，添加量分别为35mg-C/L和20mg-N/L，在2#对照组中分别添加同等数量重同位素标记的13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，在3#实验组中分别添加相同数量重同位素标记的13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，并同时利用C2H2气体(99.9％)置换顶空体积30％的气体，以抑止可能存在的厌氧氨氧化细菌和异养反硝化细菌，定向标记Feammox细菌。
(7)孵育5天后的底泥样品，其培养周期和氮素浓度变化如图2所示；分别采用土壤DNA提取试剂盒(
Spin Kit for Soil，MP，USA)和按照相应说明书方法提取基因组总DNA样品。
2、超高速密度梯度离心溶液配制
(1)利用DNA密度测定仪测定各个样品的DNA浓度，并各取5μg DNA样品与GB缓冲液混合定容至100μL，得到DNA-GB溶液；
(2)在15mL离心管中按照以下表2所示体系配制离心溶液，并混合均匀；
表2
| 序号 | 名称 | 体积(mL) |
| 1 | CsCl溶液 | 4.9 |
| 2 | GB溶液 | 0.9 |
| 3 | DNA-GB溶液 | 0.1 |
(3)调节折光率：针对步骤(2)中每个离心溶液样品，利用步CsCl溶液与GB缓冲液分别调整样品目标折射率(nD-TC值)为1.4029±0.0002；
3、超高速密度梯度离心
(1)采用注射器分别将步骤3中的离心溶液样品转移至5.1mL Beckman Coulter超速离心管中，调整每批离心管质量之差小于0.01g，保证转子上机平衡，并采用专用封口枪密封离心管；
(2)按照以下参数设置超高速离心机工作参数；
| 序号 | 参数名称 | 参数值 |
| 1 | 温度 | 20℃ |
| 2 | 转速 | 190000×g |
| 3 | 离心时间 | 45h |
| 4 | 加速模式 | 9档 |
| 5 | 刹车模式 | no break |
(3)离心结束后，采用专用转子开启装置取出离心管，尽量保持操作过程转子无振动；
4、梯度溶液分级
(1)将每个离心管依次垂直固定于铁架台上；
(2)体积置换法：采用1mL注射器针头置入离心管顶部，通过固定流速泵向离心管输入灭菌MiliQ水，同时在离心管底部穿入小孔，采用事先准备的15个1.5mL无菌离心管收集置换流出的密度梯度分级DNA样品；
(3)测定各个分级样品的折射率，并计算相应层级浮力密度；
5、DNA回收
(1)沉淀DNA样品：采用550μL PEG 6000溶液加入到各个分级DNA样品中，混合均匀，分别在35℃条件下加热1h，以沉淀DNA样品。在20℃，12000×g条件下离心0.5h，并去除离心上清液，风干样品；
(2)清洗DNA样品：采用500μL步骤1.4中的乙醇溶液悬浮步骤6.1中的沉淀样品，在20℃，12000×g条件下离心10min，去除离心上清液；
(3)重复步骤(2)两次，并风干样品，采用30μL步骤1.2中TE溶液溶解固体DNA样品，并于-20℃条件下保存；
6、标记DNA富集度分布评估
针对每个DNA样品通过步骤5(3)获取的不同浮力密度层级DNA样品，采用通用细菌16s rRNA特异性正向引物1055F(5’-ATGGCTGTCGTCAGCT-3’)和反向引物1392R(5’-ACGGGCGGTGTGTAC-3’)，建立实时荧光定量QPCR标准曲线(图3)，用于测定各层16s rRNA基因丰度，评估13C，15N-双标记的重层DNA在浮力密度梯度中的分布状况，作为轻、重层DNA分离并收集的依据。由图4可以看出，1#对照组在浮力密度8-9层出现基因富集现象，为本底基因分布区。而在第2#对照组，除了在第8-9层有基因富集外，在第3-4层重浮力密度区，有明显的基因富集分布，发生了“浮力密度迁移”，证明了自养型反硝化细菌(比如厌氧氨氧化和厌氧铁氨氧化细菌)的基因组成分中标记了13C，15N原子，从而增加了标记DNA的质量密度。在第3#实验组中，由于C2H2对厌氧氨氧化和异养反硝化细菌有选择性抑制，在第8-9层重浮力密度区降低了基因丰度，被标记的基因数量减少，但是正好筛选出了厌氧条件下具有的Fe(III)还原性细菌，达到鉴定Feammox细菌的目的。
7、微生物群落结构鉴定
针对被13C，15N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA，采用第二代高通量测序技术精准分析自养型厌氧铁氨氧化细菌群落结构。结合河流(湖泊)现场采用的环境数据，应用多元统计分析手段，可以探究天然流域水体底泥中的Feammox细菌生长机制及分布状态。
实施例2
一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1-(6)正式培养中，添加Fe(III)离子浓度为20mg-Fe/L，12C-NaHCO3和14N-NH4Cl添加量分别为30mg-C/L和15mg-N/L；步骤3-(2)超高速离心，温度为18℃，180000×g，超高速离心44h。
实施例3
一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1-(6)正式培养中，添加Fe(III)离子浓度为23mg-Fe/L，12C-NaHCO3和14N-NH4Cl添加量分别为33mg-C/L和17mg-N/L；步骤3-(2)超高速离心，温度为22℃，200000×g，超高速离心46h。
Claims (10)
1.一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原位采集水体底泥样本；
S2.13C-、15N-双标记特异性孵育厌氧铁氨氧化细菌：将底泥样本置于容器中，添加Fe(III)，再添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl，并同时添加C2H2气体，密封容器；孵育5～6天后，提取土壤DNA；
S3.将步骤S2的土壤DNA通过氯化铯超高速离心分离重层DNA；
S4.对步骤S3浮力密度梯度分层DNA进行标记程度鉴定，对13C，15N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行高通量测序分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述水体为河流或湖泊。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述底泥样本为预培养后的污泥，具体为将混合均匀的新鲜污泥置于容器中并加水稀释，置换容器中的气体，以制造无氧反应环境，24～26℃避光孵化4～5天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe(III)的添加浓度为20～25mg-Fe/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述13C-NaHCO3和15N-NH4Cl的添加浓度分别为30～35mg-C/L和15～20mg-N/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C2H2气体的用量为其所填充的容器体积的30％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括同时以添加12C-NaHCO3和14N-NH4Cl，添加13C-NaHCO3和15N-NH4Cl的处理分别作为对照。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3具体为将DNA样品与GB缓冲液混合得DNA-GB样品溶液，再分别添加CsCl溶液、GB溶液，调整样品目标折射率为1.4029±0.0002；再18～22℃，180000～200000×g，超高速离心44～46h；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，用PEG6000和70％乙醇洗涤每层DNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述DNA-GB样品溶液、CsCl溶液、GB溶液的体积比为0.1：0.9：4.9。
10.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤S4具体为针对不同浮力密度层级DNA样品，采用通用细菌16s rRNA特异性正向引物1055F和反向引物1392R，通过qPCR扩增各层16s rRNA基因，通过各层基因比较的相对丰度，反映13C，15N-双标记的重层DNA在浮力密度梯度中的分布状况，再针对被13C，15N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行二代高通量测序分析。
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