CN111006991B - 一种确定污水处理好氧反硝化菌最适保存温度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种确定污水处理好氧反硝化菌最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。本发明方法利用流式细胞术测定不同温度保存的好氧反硝化菌的细胞活性状态，将其中细胞活性状态最接近好氧反硝化菌中试运行时的细胞活性状态的保存温度确定为最适保存温度，测试数据经活性恢复后细胞活性状态和性能效果验证可靠。本发明方法可以省略好氧反硝化菌活性恢复的步骤，有效帮助准备采用好氧反硝化技术进行硝态氮和总氮高效去除的污水处理厂实现节能降耗，降低运行成本，其中硝态氮和总氮的去除率分别可达90％和88％以上，同时可以有效缩短好氧反硝化菌工程化应用的启动时间，维持好氧反硝化工艺长期稳定运行，具有很高的工业可行性。
Description
技术领域
本发明涉及一种确定污水处理好氧反硝化菌最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。
背景技术
总氮的稳定高效去除一直是污水处理厂运行的重点和难点，随着污水处理排放标准的日益提高，研发和推广应用适宜的脱氮技术尤为重要。由于污水处理厂用地的限制，向缺氧池投加碳源成为大多数污水处理厂提升总氮去除效能的方法，采用这一方法不仅会会显著增加污水处理的成本，同时也会造成污水中缓慢降解有机物和污泥内碳源的浪费。因此，基于节地目标和零外加碳源的污水脱氮技术被日益重视。好氧反硝化是指在好氧条件下，好氧反硝化菌通过周质硝酸盐还原酶(perplasmic nitrate reductases)，将好氧池中较高浓度的硝态氮转化为氮气的过程。此工艺无需额外投加碳源，只需要将富集了好氧反硝化菌的聚氨酯填料投加至好氧池，通过周质硝酸盐还原酶的催化作用，实现污水处理厂总氮的稳定达标排放和节能降耗运行。
好氧反硝化菌因具有良好的反硝化能力，一般使其附着在聚氨酯类悬浮填料上生长，以防止其随好氧池出水而排出，如果将培养成熟的富集了好氧反硝化菌的聚氨酯悬浮填料进行保存，应用于总氮达标存在难度，用地有限的污水处理厂，不仅可以有效缩短污水处理厂总氮达标排放的时间，同时可以有效节省碳源类物质资源。温度是影响微生物活性的重要参数，确定最适于好氧反硝化菌保存的温度，有助于简化好氧反硝化菌的微生物活性恢复过程，缩短好氧反硝化菌工程化应用启动时间，进而实现节能降耗效果。目前，尚未有针对好氧反硝化菌活性保存和活性恢复的研究，使好氧反硝化菌的工程化应用受到影响。
发明内容
为了简化好氧反硝化菌微生物活性的恢复过程，使污水处理厂总氮可以短时间达标排放，同时实现节能降耗的效果。本发明基于流式细胞术对不同温度条件下保存的好氧反硝化菌的细胞活性状态进行表征，通过好氧反硝化菌活性恢复效果和微生物活性恢复后细胞活性状态，对流式细胞术的表征结果进行验证，最终建立基于流式细胞术的确定好氧反硝化菌最适保存温度的方法，为污水处理厂总氮稳定达标排放和节能降耗运行提供技术支撑。
本发明的第一个目的是提供一种确定好氧反硝化菌最适保存温度的方法，所述方法是利用流式细胞术测定不同温度保存的好氧反硝化菌的细胞活性状态，将最接近好氧反硝化菌在中试运行中的细胞活性状态时的保存温度确定为最适保存温度；所述好氧反硝化菌细胞活性状态的测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定。
在本发明的一种实施方式中，所述利用流式细胞术确认最适温度的方法包括：
(1)好氧反硝化菌测试样液的制备：用缓冲液稀释好氧反硝化菌样品，混合均匀后过滤取沉淀，离心，留用上清液，使用预冷缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin V Binding Buffer混匀制得；
(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液包括(8～28)％v/v磷酸二氢钠和(72～92)％v/v磷酸氢二钠。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为7.3～7.6。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液与好氧反硝化菌的稀释体积比为4～10：1。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤是利用孔径6～15μm的尼龙膜。
在本发明的一种实施方式中，所述离心速度为5000～10000rpm/min。
在本发明的一种实施方式中，所述样品清液与10x Annexin V Binding Buffer的混合体积比例为1：2～4。
在本发明的一种实施方式中，所述流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态是在对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITC Annexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育，之后于流式细胞仪上机检测。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育为10～20min。
本发明的第二个目的是提供一种快速启动好氧反硝化菌的方法，是利用上述方法确定最适保存温度，在最适保存温度下，将培养成熟的好氧反硝化菌置于保存基质中进行保存，活性恢复后即可启动好氧反硝化菌工程。
在本发明的一种实施方式中，所述保存基质的COD浓度为100-150mg/L,NH4 +-N浓度为27.5-38.5mg/L，NO3 --N浓度为4.5-8.0mg/L。
在本发明的一种实施方式中，所述活性恢复是将好氧反硝化菌的聚氨酯悬浮填料接种于生物反应器中，所述生物反应器有效容积8.0～20.0L，控制反应器DO为4-5mg/L，HRT为4-8h，聚氨酯悬浮填料填充比为30-40％。
本发明的第三个目的是提供一种污水处理的方法，是利用上述方法快速启动好氧反硝化菌工程。
本发明的有益效果：
本发明通过流式细胞术对好氧反硝化菌中活细胞，凋亡早期细胞，凋亡晚期细胞和死细胞比例进行表征，并与好氧反硝化菌活性恢复过程的特征指标进行关联性分析，建立了基于流式细胞术的确定好氧反硝化菌最适保存温度的方法。运用此方法，可以省略好氧反硝化菌活性恢复的步骤，有效帮助准备采用好氧反硝化技术进行硝态氮和总氮高效去除的污水处理厂实现节能降耗，降低运行成本，其中硝态氮和总氮的去除率分别可达90％和88％以上，同时可以有效缩短好氧反硝化菌工程化应用的启动时间，维持好氧反硝化工艺长期稳定运行，具有很高的可行性。
附图说明
图1为活性恢复后的好氧反硝化菌的硝态氮去除率；
图2为活性恢复后的好氧反硝化菌的总氮去除率。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1好氧反硝化菌最适保存温度测定
好氧反硝化菌的保存：
好氧反硝化菌的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将中试反应装置(处理规模100t/d)中好氧反硝化菌聚氨酯悬浮填料约180个取出，平均三等份分别置于装有600ml保存基质的1000ml血清瓶中，保存基质为污水处理厂缺氧池出水(即好氧池进水，COD浓度为100-150mg/L,NH4 +-N浓度为27.5-38.5mg/L，NO3 --N浓度为4.5-8.0mg/L。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
流式细胞术测试好氧反硝化菌微生物细胞状态：
于-20℃，4℃和20℃保存的好氧反硝化菌在保存超过60d后，用于测定好氧反硝化菌细胞状态，具体步骤如下：
(1)取好氧反硝化菌聚氨酯悬浮填料约20个(体积约200-300ml)，用pH为7.5的磷酸盐缓冲液稀释至1L，采用超声波破碎仪(超声能量密度90kJ/g)，使聚氨酯悬浮填料中的好氧反硝化菌释放到磷酸盐缓冲液中并保证其均匀分布；
(2)用10μm孔径的尼龙膜过滤絮体样品，并于8000rpm/min离心5min；
(3)取沉淀置于50ml离心管中，样品于8000rpm/min离心5min；
(4)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用预冷磷酸盐缓冲液(pH为7.8)吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(5)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(6)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
测试结果如表1所示，中试反应装置中好氧反硝化菌活细胞比例较高，表明中试系统好氧反硝化效果良好。保存于-20℃的用于测定好氧反硝化菌的活细胞含量最低，表明-20℃不适于好氧反硝化菌的保存。保存于4℃的好氧反硝化菌其活细胞比例为57.7％，凋亡晚期细胞和死细胞比例约为29.0％，较高的凋亡晚期细胞和死细胞比例表明4℃亦不适于好氧反硝化菌的保存。保存温度为20℃时，好氧反硝化菌活细胞比例达到66.0％，仅比中试反应装置中好氧反硝化菌活细胞比例低25.4％，同时其死细胞比例约为14.5％，20℃是死细胞比例最低的温度。因此，初步确定20℃为保存好氧反硝化菌的最适温度。
表1保存后好氧反硝化菌微生物细胞状态(％)
| 好氧反硝化菌 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 中试运行系统 | 88.5±4.9 | 4.7±0.1 | 3.3±0.1 | 3.5±0.1 |
| 保存于-20℃ | 45.5±2.2 | 12.5±0.8 | 9.9±0.5 | 32.1±1.7 |
| 保存于4℃ | 57.7±3.0 | 13.3±0.8 | 12.5±0.7 | 16.5±0.5 |
| 保存于20℃ | 66.0±3.5 | 12.5±0.7 | 7.0±0.3 | 14.5±0.4 |
实施例2好氧反硝化菌最适保存温度的验证
保存的好氧反硝化菌的活性恢复：取源于不同血清瓶的好氧反硝化菌聚氨酯悬浮填料，接种于生物反应器(有效容积10.0L)中，用以对好氧反硝化菌进行活性恢复。于-20℃，4℃和20℃保存的好氧反硝化菌分别置于R1，R2和R3中。控制反应器DO为4-5mg/L，HRT为6h，聚氨酯悬浮填料填充比为35％。
活性恢复后好氧反硝化菌特性：
经过30d的活性恢复后，R1，R2和R3中的好氧反硝化菌特性如表2所示，在好氧反硝化菌活性恢复后，R1和R2中的硝态氮去除速率和总氮去除速率均低于保存之前的好氧反硝化菌的硝态氮去除速率和总氮去除速率，只有保存在20℃的好氧反硝化菌硝态氮去除速率和总氮去除速率与保存之前的较为一致。不同保存温度下好氧反硝化菌的反硝化速率和同步硝化反硝化速率均低于保存之前，经过活性恢复后，R2中好氧反硝化菌的反硝化速率和R3中好氧反硝化菌的反硝化速率和同步硝化反硝化速率较接近保存之前，但R1中保存的好氧反硝化菌的反硝化速率和同步硝化反硝化速率均相对较低。
通常好氧反硝化菌的反硝化速率和同步硝化反硝化速率分别为6.0mg/(m2·h)和1.5mg/(m2·h)，中试运行系统驯化的好氧反硝化菌达到相同反硝化速率和同步硝化反硝化速率的时间分别为21和30d。将保存的好氧反硝化菌进行活性恢复后，R1中好氧反硝化菌达到相同反硝化速率和同步硝化反硝化速率的时间分别需要18和25d，R2中好氧反硝化菌达到相同反硝化速率和同步硝化反硝化速率的时间分别需要15和20d，R3中好氧反硝化菌达到相同反硝化速率和同步硝化反硝化速率的时间分别需要11和18d。说明经活性恢复后的好氧反硝化菌均具有较好的脱氮效果，其中保存于20℃条件的好氧反硝化菌膜具有最短的微生物活性恢复时间，是较为适宜保存好氧反硝化菌的温度。
表2保存和活性恢复后好氧反硝化菌的特性
活性恢复后好氧反硝化菌对污染物的去除效能：
经过活性恢复过程后，不同保存温度下的好氧反硝化菌对硝态氮和总氮的去除率均逐渐升高(图1和图2)，其对硝态氮和总氮的去除率分别超过90％和88％。在活性恢复的第18d，R3中的好氧反硝化菌对硝态氮和总氮的去除效果最好，并一直呈现硝态氮和总氮去除率稳定升高的趋势，此结果也同表2中R3内好氧反硝化菌最快恢复较高的反硝化速率和同步硝化反硝化速率相对应，说明20℃的条件较为适宜保存好氧反硝化菌，在实际应用中具有很高的可行性。
活性恢复后好氧反硝化菌特性与细胞状态相关性
在好氧反硝化菌活性恢复30d后，采用流式细胞术对好氧反硝化菌细胞状态进行分析，结果如表3所示。不同保存温度下的好氧反硝化菌中活细胞含量与中试运行系统中好氧反硝化菌中活细胞含量基本接近，说明经过活性恢复后，好氧反硝化菌均可发挥稳定的硝态氮和总氮去除效果。其中R3内好氧反硝化菌活细胞比例(80.3％±4.2％)最高，且凋亡晚期细胞比例(7.5％±0.3％)和死细胞比例(6.7％±0.1％)最低，说明20℃的保存条件下好氧反硝化菌细胞活性最高，较为适宜作为保存好氧反硝化菌的条件。
表3活性恢复后(30d)好氧反硝化菌细胞活性状态(％)
| 好氧反硝化菌 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 中试运行系统 | 87.0±4.5 | 4.5±0.1 | 3.6±0.1 | 4.9±0.2 |
| 保存于-20℃ | 78.0±4.3 | 6.0±0.1 | 7.1±0.1 | 8.9±0.3 |
| 保存于4℃ | 78.5±4.3 | 6.0±0.1 | 7.5±0.3 | 9.0±0.3 |
| 保存于20℃ | 80.3±4.2 | 5.5±0.1 | 7.5±0.3 | 6.7±0.1 |
依据Correl相关性分析发现，好氧反硝化菌的反硝化速率和同步硝化反硝化速率和好氧反硝化菌活细胞比例具有较高的相关性(如表4所示)，相关系数分别为0.9088和0.9507，表明利用好氧反硝化菌活细胞比例作为评价好氧反硝化菌活性的方法具有较高可行性。同时，由于保存的好氧反硝化菌中，20℃的保存条件下好氧反硝化菌活细胞比例最高，与活性恢复后R3中好氧反硝化菌活细胞比例结果相吻合。
表4活性恢复后(30d)好氧反硝化菌特性与细胞活性状态关联性
因此，确定20℃是保存好氧反硝化菌的最适温度，利用流式细胞术可以作为确定好氧反硝化菌最适保存温度的依据。流式细胞术操作简便，数据快速易得且准确可靠，亦可省略好氧反硝化菌活性恢复过程，对于好氧反硝化菌的保存与活性恢复意义重大。
对比例1
好氧反硝化菌的保存：
好氧反硝化菌的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将中试反应装置(处理规模100t/d)中好氧反硝化菌聚氨酯悬浮填料约180个取出，平均三等份分别置于装有600ml保存基质的1000ml血清瓶中，保存基质为污水处理厂缺氧池出水(即好氧池进水，COD浓度为100-150mg/L,NH4 +-N浓度为27.5-38.5mg/L，NO3 --N浓度为4.5-8.0mg/L。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
流式细胞术测试好氧反硝化菌微生物细胞状态：
于-20℃，4℃和20℃保存的好氧反硝化菌在保存超过60d后，用于测定好氧反硝化菌细胞状态，具体步骤如下：
(1)取好氧反硝化菌聚氨酯悬浮填料约20个(体积约200-300ml)，分别用pH为7.2和7.8的磷酸盐缓冲液稀释至1L，采用超声波破碎仪(超声能量密度90kJ/g)，使聚氨酯悬浮填料中的好氧反硝化菌释放到磷酸盐缓冲液中并保证其均匀分布；
(2)用10μm孔径的尼龙膜过滤絮体样品，并于8000rpm/min离心5min；
(3)取沉淀置于50ml离心管中，样品于8000rpm/min离心5min；
(4)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用预冷磷酸盐缓冲液(pH为7.8)吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(5)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(6)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
细胞状态测试结果如表5和表6所示。
表5保存的好氧反硝化菌细胞活性状态(pH为7.2的磷酸盐缓冲液)
| 好氧反硝化菌 | 活细胞 | 凋亡早期细胞 | 凋亡晚期细胞 | 死细胞 |
| 中试运行系统 | 88.5±4.9 | 4.7±0.1 | 3.3±0.1 | 3.5±0.1 |
| 保存于-20℃ | 52.5±3.1 | 6.3±0.5 | 11.7±0.8 | 29.5±1.4 |
| 保存于4℃ | 57.0±3.0 | 3.2±0.2 | 13.8±0.8 | 26.0±1.3 |
| 保存于20℃ | 59.7±3.1 | 3.1±0.2 | 17.9±1.0 | 19.3±1.0 |
由表5结果发现，保存于20℃的好氧反硝化菌活细胞比例最高，但是三种温度下的好氧反硝化菌，其活细胞含量较为接近，且凋亡晚期细胞和死细胞的总含量亦较为接近，因此当pH为7.2时，流式细胞分析结果的显著性较差，不适合作为确定好氧反硝化菌最适保存温度的适宜pH。
表6保存的好氧反硝化菌细胞活性状态(pH为7.8的磷酸盐缓冲液)
由表6结果发现，保存于三种温度下的好氧反硝化菌不仅活细胞含量较为接近，且凋亡晚期细胞和死细胞的含量亦较为接近，同时，基于凋亡早期细胞检测的结果偏低，表明当pH为7.8时，流式细胞分析结果无法有效确定好氧反硝化菌的最适保存温度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种确定好氧反硝化菌最适保存温度的方法，其特征在于，所述方法是利用流式细胞术测定不同温度保存的好氧反硝化菌的细胞活性状态，将最接近好氧反硝化菌在中试运行中的细胞活性状态的保存温度确定为最适保存温度；所述好氧反硝化菌细胞活性状态的测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定；
所述利用流式细胞术确认最适温度的方法包括：
(1)好氧反硝化菌测试样液的制备：用缓冲液稀释好氧反硝化菌样品，混合均匀后过滤取沉淀，离心，留用上清液，使用预冷缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗两次，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin V Binding Buffer混匀制得；
(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态；
所述流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态是在对照FITC Annexin V组加入0.5μlPI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITC Annexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育10～20min，之后于流式细胞仪上机检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为7.3～7.6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括(8～28)％v/v磷酸二氢钠和(72～92)％v/v磷酸氢二钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液与好氧反硝化菌的稀释体积比为4～10：1。
6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述过滤是利用孔径6～15μm的尼龙膜。
7.一种快速启动好氧反硝化菌的方法，其特征在于，是利用权利要求1～5任一所述方法确定最适保存温度，在最适保存温度下，将培养成熟的好氧反硝化菌置于保存基质中进行保存，活性恢复后即可启动好氧反硝化菌工程。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述保存基质的COD浓度为100～150mg/L,NH4 +-N浓度为27.5～38.5mg/L，NO3 --N浓度为4.5～8.0mg/L。
9.一种污水处理的方法，其特征在于，是利用权利要求7或8所述方法快速启动好氧反硝化菌工程。
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