CN110607342B - 一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法 - Google Patents

一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。本发明通过流式细胞术对产氢产乙酸菌中活细胞，凋亡早期细胞，凋亡晚期细胞和死细胞比例进行表征，并与产氢产乙酸菌活性恢复过程的特征指标进行关联性分析，建立了基于流式细胞术的确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法。运用此方法，可以省略产氢产乙酸菌活性恢复的步骤，有效帮助准备采用产氢产乙酸菌强化底物转化的高浓度有机废处理工程，并显著提升产氢产乙酸的生产效率，其中产氢气和乙酸产量均超过18.0％和620mg/L，且能够维持长期稳定运行，具有很高的可行性。

Description

一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法
技术领域
本发明涉及一种确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法，属于环境工程技术领域。
背景技术
随着高浓度有机废水厌氧生物处理技术的成熟，提高有机废水的资源化利用效率，最大限度生产资源化气体甲烷，减少二氧化碳等温室气体的排放成为国家战略需要。厌氧处理过程的关键微生物主要为产酸发酵菌群，产氢产乙酸菌群以及产甲烷菌群，其中产氢产乙酸菌群在营养生态位上位于产酸发酵菌群和产甲烷菌群之间，在功能生态位上发挥承上启下的作用，它将产酸发酵菌群代谢产生的丙酸、丁酸等有机挥发酸进一步降解转化为乙酸、CO2和H2，为后续的产甲烷菌群提供了可以直接利用的底物，是有机物甲烷发酵过程必不可少的重要环节。因此，强化产氢产乙酸菌群的功能作用，将有效地提高厌氧生物处理系统的效能。但是参与厌氧生物处理的各主要微生物类群在生理生化特性上差异悬殊，且产氢产乙酸细菌是一类严格厌氧细菌，生长周期长，且大部分产氢产乙酸细菌都是互营细菌，较难获得具有产氢产乙酸的纯培养菌，如果可以将分离得到的具有降解挥发性有机酸的产氢产乙酸菌培养成熟并予以保存，则可以有效促进高浓度有机废水的底物转化率，显著提升高浓度废水中的甲烷生产效率。温度是影响微生物活性最重要的参数，确定最适于产氢产乙酸菌的保存温度，有助于简化产氢产乙酸菌的活性恢复过程，缩短基于高浓度有机废水的高效甲烷产生时间。然而，菌群同时受到环境中多种因素的干扰，比如pH等，需求一种不受其他因素干扰，准备指示温度的方法是有非常重要的应用意义的。现有方法对于最适保存温度的确定需要将产氢产乙酸菌重新接种于厌氧生物反应器中，约需30d以上才能确定产氢产乙酸菌活性恢复的效果，成为制约基于产氢产乙酸菌强化产甲烷技术的工程化应用关键所在。
发明内容
技术问题：现有方法对于最适保存温度的确定需要将产氢产乙酸菌重新接种于厌氧生物反应器中，约需30d以上才能确定产氢产乙酸菌活性恢复的效果，成为制约基于产氢产乙酸菌强化产甲烷技术的工程化应用关键所在。
本发明技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种确定产氢产乙酸菌的最适保存温度的方法，所述方法是利用流式细胞术测定不同温度保存的产氢产乙酸菌的细胞活性状态，将其中细胞活性状态最接近厌氧颗粒污泥中试运行时的细胞活性状态时保存的温度确定为最适保存温度；所述利用流式细胞术测定细胞活性状态的方法包括如下步骤：
(1)产氢产乙酸菌测试样液的制备：用缓冲液稀释产氢产乙酸菌样品，并加入半胱氨酸，混合均匀后过滤，取沉淀物；再用缓冲液稀释，同时加入半胱氨酸混合均匀；过滤取沉淀物，使用添加了半胱氨酸的预冷缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin V Binding Buffer混匀制得；
(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态。
在本发明的一种实施方式中，半胱氨酸相对缓冲液的添加量不低于0.8-2.0mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，预冷缓冲液中半胱氨酸的浓度为0.8-2.0mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述产氢产乙酸菌的细胞活性状态的测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的pH为5.0-5.8的磷酸盐缓冲液。优选5.0。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液与产氢产乙酸菌的稀释体积比为8～15：1。
在本发明的一种实施方式中，所述半胱氨酸相对缓冲液的浓度为1.0mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤是利用孔径为8～20μm的尼龙膜进行过滤。
在本发明的一种实施方式中，所述沉淀物是经过离心处理得到，其中离心速度5000～10000rpm/min。
在本发明的一种实施方式中，所述样品清液与10x Annexin V Binding Buffer的混合体积比例为1：2～4。
在本发明的一种实施方式中，所述流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态是在对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITC Annexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下进行避光孵育，之后于流式细胞仪上机检测。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育为10～20min。优选15min。
在本发明的一种实施方式中，所述流式细胞术测定细胞活性状态的方法具体包括如下步骤：
(1)取10ml产氢产乙酸菌混合物，用pH为5.0-5.8的磷酸盐缓冲液稀释至100ml，同时向此混合液中加入0.1g半胱氨酸，于涡旋仪漩涡震荡2min，使污泥破碎为絮体并保证均匀分布；
(2)用10μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，获得的样品重新用pH为5.0-5.8的磷酸盐缓冲液稀释至50ml，同时向此混合液中加入0.05g半胱氨酸；
(3)用10μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，取1.5ml置于1.5ml尖底离心管中；
(4)样品于8000rpm/min离心5min；
(5)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用添加了半胱氨酸的预冷磷酸盐缓冲液pH5.0-5.8(5℃)吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(6)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(7)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
本发明的第二个目的是提供一种快速启动产氢产乙酸菌工程的方法，是利用上述方法确定最适保存温度，在最适保存温度下，将培养成熟的产氢产乙酸菌污泥置于保存基质中进行保存，活性恢复后即可启动产氢产乙酸菌污泥工程。
在本发明的一种实施方式中，所述保存基质中的COD为2200-2500mg/L，pH为5.0-5.2，COD：N：P为200-500:5:1。
本发明的第三个目的是提供一种污水处理的方法，是利用上述方法快速启动产氢产乙酸菌工程。所述污水是高浓度有机废水。
本发明的有益效果：
本发明通过流式细胞术对产氢产乙酸菌中活细胞，凋亡早期细胞，凋亡晚期细胞和死细胞比例进行表征，并与产氢产乙酸菌活性恢复过程的特征指标进行关联性分析，建立了基于流式细胞术的确定产氢产乙酸菌最适保存温度的方法。运用此方法，可以省略产氢产乙酸菌活性恢复的步骤，有效帮助准备采用产氢产乙酸菌强化底物转化的高浓度有机废处理工程，并显著提升高浓度废水中的甲烷生产效率，维持厌氧生物处理工艺长期稳定运行，具有很高的可行性。
利用本发明方法确定的保存温度下保存的产氢产乙酸菌达到相同单位COD去除产氢率和单位COD去除产乙酸率分别需要16和13d；相现有的比ABR中驯化方法分别缩短了75％和70％的时间；且产氢气和乙酸产量均超过18.0％和620mg/L。
附图说明
图1为不同保存温度下氢气产量的变化趋势图；
图2为不同保存温度下乙酸产量的变化趋势图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1产氢产乙酸菌的保存条件和微生物细胞活性状态测试
产氢产乙酸菌的保存温度与保存基质：
产氢产乙酸菌的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将基于高浓度糖蜜废水的厌氧折流板反应器(ABR)第三格室中的产氢产乙酸菌泥水混合物1500ml取出，平均三等份分别置于装有750ml保存基质的2000ml血清瓶中，保存基质为ABR第二格室出水，其主要组分为丙酸和丁酸(浓度比约为1：2)，COD为2200-2500mg/L，pH为5.0-5.2，同时利用尿素和磷酸二氢钾控制COD：N：P为200-500:5:1。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
流式细胞术细胞状态测试方法：
于-20℃，4℃和20℃保存的产氢产乙酸菌在保存超过6个月后，用于测定产氢产乙酸菌细胞状态，具体步骤如下：
(1)取10ml产氢产乙酸菌混合物，用pH为5.0的磷酸盐缓冲液稀释至100ml，同时向此混合液中加入0.1g半胱氨酸，于涡旋仪漩涡震荡2min，使产氢产乙酸菌泥水混合物破碎为絮体并保证均匀分布；
(2)用10μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，获得的样品重新用pH为5.0的磷酸盐缓冲液稀释至50ml，同时向此混合液中加入0.05g半胱氨酸；
(3)用10μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，取1.5ml置于1.5ml尖底离心管中；
(4)样品于8000rpm/min离心5min；
(5)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用添加了半胱氨酸的预冷磷酸盐缓冲液(5℃)吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(6)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(7)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
保存的产氢产乙酸菌细胞状态结果：
于-20℃，4℃和20℃保存的产氢产乙酸菌在保存超过700d后，用于测定产氢产乙酸菌细胞状态，结果如表1所示。ABR第三格室中产氢产乙酸菌活细胞比例较高，表明ABR系统运行效果良好。保存于-20℃的产氢产乙酸菌活细胞含量最低，死细胞含量最高，表明-20℃不适宜保存产氢产乙酸菌。保存于20℃的产氢产乙酸菌活细胞数量稍高，但其凋亡晚期细胞和死细胞比例约为42.7％，同样不适于产氢产乙酸菌的保存。保存温度为4℃时，产氢产乙酸菌活细胞比例高达55.8％，且凋亡晚期细胞和死细胞比例较-20℃和20℃保存时分别低21.5％和19.5％，表明4℃的保存条件更加适合保存产氢产乙酸菌，因此，初步确定4℃为保存产氢产乙酸菌的最适温度。
表1保存700d后产氢产乙酸菌细胞状态结果(％)
产氢产乙酸菌 活细胞 凋亡早期细胞 凋亡晚期细胞 死细胞
ABR第三格室 90.3±6.0 2.9±0.2 2.9±0.2 3.9±0.3
保存于-20℃ 40.1±3.8 12.4±1.1 27.9±3.0 19.6±1.8
保存于4℃ 55.8±4.2 10.7±1.1 20.1±2.5 13.4±1.3
保存于20℃ 46.5±4.0 11.9±1.1 22.7±2.9 18.9±1.7
实施例2产氢产乙酸菌最适保存温度的验证
保存的产氢产乙酸菌的活性恢复：
取源于不同血清瓶产氢产乙酸菌，接种于三个ABR第三格室中用以对产氢产乙酸菌进行活性恢复，于-20℃，4℃和20℃保存的产氢产乙酸菌分别置于R1，R2和R3中。ABR有效容积28.0L，第三格室有效容积为7.0L，水力停留时间24h。
活性恢复后产氢产乙酸菌特性：
经过60d的活性恢复，R1，R2和R3中的产氢产乙酸菌均具有较好的性能，如表2所示。通常产氢产乙酸菌单位COD去除产氢率和单位COD去除产乙酸率分别为0.42和0.37mol/mol，ABR中驯化达到相同产氢产乙酸菌单位COD去除产氢率和单位COD去除产乙酸率分别需要65和43d。将保存的产氢产乙酸菌进行活性恢复后，R1中产氢产乙酸菌达到相同单位COD去除产氢率和单位COD去除产乙酸率分别需要37和29d，R2中产氢产乙酸菌达到相同单位COD去除产氢率和单位COD去除产乙酸率分别需要16和13d，R3中产氢产乙酸菌达到相同单位COD去除产氢率和单位COD去除产乙酸率的时间分别需要30和21d。说明经活性恢复后的产氢产乙酸菌均具有较好的COD转化能力，其中保存于4℃条件的产氢产乙酸菌具有最短的微生物活性恢复时间，较为适宜保存产氢产乙酸菌。
表2保存和活性恢复后产氢产乙酸菌的特性
Figure BDA0002249849480000061
活性恢复后产氢产乙酸菌的产氢、产乙酸效能：
经过活性恢复过程后，不同保存温度下的产氢产乙酸菌，其产氢气和产乙酸浓度均逐渐升高(图1和图2)，其氢气浓度和乙酸产量均超过18.0％和620mg/L，其中产氢气浓度为产生的气体当中氢气的体积浓度(mL/mL)，R2中的产氢产乙酸菌获得较稳定的产氢产乙酸效果，此结果也同表2中R2内产氢产乙酸菌最快恢复较高的产氢气和产乙酸能力相对应，说明4℃的条件较为适宜保存产氢产乙酸菌，在实际应用中具有较高的可行性。
活性恢复后产氢产乙酸菌特性与污泥细胞状态相关性：
在产氢产乙酸菌活性恢复60d后，采用流式细胞术对产氢产乙酸菌细胞状态进行分析，结果如表3所示。不同保存温度下的产氢产乙酸菌中活细胞含量与ABR第三格室中产氢产乙酸菌中活细胞含量较为接近，说明经过活性恢复后，产氢产乙酸菌均可发挥较高的促进甲烷生产的效能。其中R2内产氢产乙酸菌活细胞比例(82.2％±5.8％)最高，且死细胞比例(9.3％±0.6％)最低，说明4℃的保存条件下产氢产乙酸菌细胞活性最高，较为适宜作为保存产氢产乙酸菌的条件。
表3活性恢复后(60d)产氢产乙酸菌细胞活性状态(％)
产氢产乙酸菌 活细胞 凋亡早期细胞 凋亡晚期细胞 死细胞
ABR第三格室 82.9±5.9 3.8±0.3 5.7±0.5 7.6±0.7
保存于-20℃ 79.5±5.1 3.7±0.3 6.0±0.8 10.8±0.8
保存于4℃ 82.2±5.8 2.7±0.2 5.8±0.4 9.3±0.6
保存于20℃ 80.0±5.4 2.9±0.2 5.4±0.5 11.7±0.7
依据Correl相关性分析发现，产氢产乙酸菌单位COD去除产氢率和单位COD去除产乙酸率和产氢产乙酸菌活细胞比例具有极高的相关性(见表4)，相关系数分别为0.9398和0.9907，表明利用产氢产乙酸菌活细胞比例作为评价产氢产乙酸菌活性的方法具有极高的可行性。同时，由于保存的产氢产乙酸菌中，4℃的保存条件下产氢产乙酸菌活细胞比例最高，与活性恢复后R2中产氢产乙酸菌活细胞比例结果相吻合。
表4活性恢复后(60d)产氢产乙酸菌特性与细胞活性状态关联性
Figure BDA0002249849480000071
因此，确定4℃是保存产氢产乙酸菌的最适条件，利用流式细胞术可以作为确定产氢产乙酸菌最适保存温度的依据。流式细胞术操作简便，数据快速易得且准确可靠，亦可省略产氢产乙酸菌活性恢复过程，对于产氢产乙酸菌的保存与活性恢复具有重要意义。
对比例1
产氢产乙酸菌的保存温度与保存基质：
产氢产乙酸菌的保存温度设置为-20℃，4℃和20℃。将基于高浓度糖蜜废水的ABR第三格室中的产氢产乙酸菌泥水混合物1500ml取出，平均三等份分别置于装有750ml保存基质的2000ml血清瓶中，保存基质为ABR第二格室出水，其主要组分为丙酸和丁酸(浓度比约为1：2)，COD为2200-2500mg/L，pH为5.0-5.2，同时利用尿素和磷酸二氢钾控制COD：N：P为200-500:5:1。将血清瓶(每个保存温度下设置3个平行样)分别置于-20℃，4℃和20℃，静止遮光保存。
流式细胞术细胞状态测试方法：
于-20℃，4℃和20℃保存的产氢产乙酸菌在保存超过6个月后，用于测定产氢产乙酸菌细胞状态，具体步骤如下：
(1)取10ml产氢产乙酸菌混合物，用pH为5.0的磷酸盐缓冲液稀释至100ml，不添加半胱氨酸，于涡旋仪漩涡震荡2min，使产氢产乙酸菌泥水混合物破碎为絮体并保证均匀分布；
(2)用10μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，获得的样品重新用pH为5.0的磷酸盐缓冲液稀释至50ml；
(3)用10μm孔径的尼龙膜过滤破碎后的样品，取1.5ml置于1.5ml尖底离心管中；
(4)样品于8000rpm/min离心5min；
(5)用移液枪吸取离心后的样品上清液，留下约0.1ml样品，使用添加了半胱氨酸的预冷磷酸盐缓冲液(5℃)吹洗细胞，重复离心和清洗两次；
(6)离心后的样品用移液枪吸取上清液，留下约0.1ml样品，使用0.3ml 10xAnnexin V Binding Buffer混匀；
(7)对照FITC Annexin V组加入0.5μl PI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITCAnnexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下避光孵育15min，之后于流式细胞仪上机检测。
细胞状态测试结果如表5所示。
表5保存的产氢产乙酸菌细胞活性状态(％)
产氢产乙酸菌 活细胞 凋亡早期细胞 凋亡晚期细胞 死细胞
ABR第三格室 82.9±5.9 3.8±0.3 5.7±0.5 7.6±0.7
保存于-20℃ 65.1±4.7 8.6±0.8 7.8±0.8 18.5±1.8
保存于4℃ 65.8±4.5 8.5±0.7 7.7±0.6 18.0±2.0
保存于20℃ 65.5±4.5 8.5±0.9 7.3±0.8 18.7±1.6
由表5结果发现，当在磷酸盐缓冲液中不添加半胱氨酸时，各保存温度状态下的细胞状态比例较为接近，无法获得有益结果用于分析，数据不可靠。
对照例2
参照实施例1，将步骤(1)、(2)中的磷酸盐缓冲液的pH分别替换为4.4、6.0时，细胞状态测试结果如表6所示。
表6保存的产氢产乙酸菌细胞活性状态(％)
Figure BDA0002249849480000081
由表6结果发现，当在磷酸盐缓冲液pH为4.4或6.0时，各保存温度生存下的细胞状态比例较为接近，无法获得有益结果用于分析，数据不可靠。可见，pH对保存活性的影响是非常敏感且明显的，只有在pH 5时，才能较好的判断出最适保存温度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种确定产氢产乙酸菌的最适保存温度的方法，其特征在于，所述方法是利用流式细胞术测定不同温度保存的产氢产乙酸菌的细胞活性状态，将其中细胞活性状态最接近厌氧颗粒污泥中试运行时的细胞活性状态时保存的温度确定为最适保存温度；
产氢产乙酸菌的细胞活性状态的测定包括活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞和死细胞的含量测定；
所述利用流式细胞术测定细胞活性状态的方法包括如下步骤：
(1)产氢产乙酸菌测试样液的制备：用pH为5.0的缓冲液稀释产氢产乙酸菌样品，并加入半胱氨酸，混合均匀后过滤，取沉淀物；再用pH为5.0的缓冲液稀释，同时加入半胱氨酸混合均匀；过滤取沉淀物，使用添加了半胱氨酸的pH 5.0预冷缓冲液吹洗细胞，重复离心和清洗，再取上清液作为样品，使用适量10x Annexin V Binding Buffer混匀制得；所述过滤是利用孔径为10μm的尼龙膜进行过滤；
(2)置于流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态；
所述流式细胞仪测定各样液的细胞活性状态是在对照FITC Annexin V组加入0.5μlPI染色剂，对照PI组加入0.5μl FITC Annexin V，检测组加入0.5μl FITC Annexin V和0.5μl PI，混匀后室温下进行避光孵育，之后于流式细胞仪上机检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸相对缓冲液的添加量为0.8-2.0mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液与产氢产乙酸菌的稀释体积比为8～15：1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液与产氢产乙酸菌的稀释体积比为8～15：1。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸相对缓冲液的浓度为1.0mg/mL。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述沉淀物是经过离心处理得到，其中离心速度5000～10000rpm/min。
7.一种快速启动产氢产乙酸菌工程的方法，其特征在于，是利用权利要求1-6任一所述的方法确定最适保存温度，在最适保存温度下，将培养成熟的产氢产乙酸菌污泥置于保存基质中进行保存，活性恢复后即可启动产氢产乙酸菌污泥工程。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述保存基质中的COD为2200-2500mg/L，pH为5.0-5.2，COD：N：P为200-500:5:1。
9.一种污水处理的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求7所述的方法快速启动产氢产乙酸菌工程。
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