JP4875367B2 - 硝化細菌固定化膜の保存液 - Google Patents

Description

本発明は、上下水道の各処理プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水を対象として、水中の化学成分をモニタリングすることを目的としたバイオセンサ応用水質計測器に用いられる硝化細菌固定化膜の保存液に関する。

バイオセンサは、溶液中の物質を測定対象とする水質計測器に用いられている。そして、測定対象を認識する分子識別素子として、酵素・抗体などの生体機能高分子、又は、微生物・細胞など生体そのものを利用している。バイオセンサは、これらの生体材料を多孔性高分子膜に包括又は共有結合させることにより固定化した膜と、電気化学的検出器などのトランスデューサとを組み合わせて試料液中の化学成分の測定を行う。バイオセンサでは、試料液を、上記生体材料を固定化した膜に接触させ、生化学反応を起こさせる。そして、生成又は消費される物質の濃度変化を、検出器の出力（電流、電圧など）変化に変換して測定する。一方、既知濃度の被測定物質の標準液によって検量線を予め準備する。このようにして、試料液に対し得られたセンサ出力から、試料液中の目的物質の濃度を算出することができる。

例えば、特許文献１には、生体材料として有害物質に極めて弱い微生物である硝化細菌をアルギン酸ゲルによってセルロース膜上に包括固定化した硝化細菌固定化膜を用い、トランスデューサとして溶存酸素電極を用いた水中の毒物検出用バイオセンサが開示されている。このバイオセンサでは、硝化細菌の呼吸速度を連続モニタリングして、検水中に毒物が混入したときの硝化細菌の呼吸速度低下率を基に毒物検出を行うことができる。

上記のような硝化細菌を用いたバイオセンサにおいては、センサ出力の安定性を確保するとともに、毒物に対する応答の変動を回避するため、硝化細菌固定化膜を１〜２ヶ月に１回交換する必要がある。そのため、特許文献２に記載されているように、新しい硝化細菌固定化膜は、使用するまでの間、通常硝化細菌固定化膜用の保存液とともにビニールパックの中に封入して５〜１０℃程度の低温で保存している。

硝化細菌固定化膜の供給体制及びセンサ保守頻度の観点から、硝化細菌固定化膜の保存期間は３ヶ月以上であることが望ましい。上記特許文献２のリン酸イオンを含むアンモニア酸化細菌固定化膜の保存期間についても、さらに保存期間を長くするように望まれていた。

特開平７-８５０７２号公報 特開２００３−３２９６６７号公報

本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、硝化細菌固定化膜を、３ヵ月以上の長期にわたって保存することを可能とした、新規な硝化細菌固定化膜の保存液を提供することを目的とする。

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、硝化細菌固定化膜の保存液に含まれるリン酸イオンに問題があることを見出し、本発明の硝化細菌固定化膜の保存液に至った。

すなわち、上記目的を達成するために、本発明は、硝化細菌固定化膜の保存液であって、固定化された硝化細菌の基質及び必須栄養素、並びにオキサル酢酸を含有したホウ酸緩衝液から成ることを特徴とする。
上記硝化細菌固定化膜は、一般的にバイオセンサに用いられ、該バイオセンサは、水質計測器に利用される。

上記水質計測器の計測対象水は、一般的には、流水であり、水道原水、下水、排水のいずれかである。
上記硝化細菌は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌からなる群から選択される少なくとも一の硝化細菌であることが好ましい。
上記硝化細菌が、アンモニア酸化細菌の場合には、上記基質としてアンモニウムイオンを含むことが好ましい。また、上記硝化細菌が、亜硝酸酸化細菌の場合には、上記基質として亜硝酸イオンを含むことが好ましい。

上記アンモニウムイオン源として、塩化アンモニウム及び硫酸アンモニウムのいずれか少なくとも一を含むことが好適である。上記亜硝酸イオン源として、亜硝酸ナトリウム及び亜硝酸カリウムのいずれか少なくとも一を含むことが好適である。
本発明に係る保存液は、一般的には、四ホウ酸ナトリウム十水和物を含む。

本発明によれば、硝化細菌固定化膜を、３ヵ月以上の長期にわたって保存することを可能とし、バイオセンサ応用水質計の実用性をより高めることのできる硝化細菌固定化膜の保存液が提供される。

以下に、本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液を、好適な実施の形態を参照してさらに詳細に説明する。
図１及び図２は、バイオセンサ及び硝化細菌固定化膜の一実施の形態を示す。

図1は、バイオセンサの一実施の形態を示す。図に示すように、バイオセンサ１０は、溶存酸素電極１１と、フローセル１２と、硝化細菌固定化膜２０とを備えている。
フローセル１２には試料液の流路１２ａが設けられている。硝化細菌固定化膜２０には、硝化細菌が固定化されている。固定化される硝化細菌としては、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌などを挙げることができる。
そして、硝化細菌固定化膜２０の一方の面は、流路１２ａ中の試料液と接し、もう一方の面は溶存酸素電極１１と接するように配置されている。

ここで、図２に硝化細菌固定化膜２０の構成について、一実施の形態を示す。図に示すように、硝化細菌固定化膜２０は、円形の多孔質のセルロース膜２１、２２から成る。セルロース膜２１、２２は、両面テープ２３によって貼り合わされている。そして、硝化細菌が固定化された所定の大きさの円形状菌体固定化部２４を、中心部に供える。なお、両面テープ２３は、菌体固定化部２４と重ならないように、中心部が所定の大きさにくりぬかれたドーナツ状をなしている。
菌体固定化部２４の菌体固定化量は、２．５×１０⁶〜１．０×１０⁹個/ｍｍ²となるように調製することが好ましく、この範囲内に調整することにより、固定化膜の保存性の均質化を図ることができる

本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液は、図1及び図２について説明したような硝化細菌固定化膜を保存するために用いられる。なお、このような実施の形態に係る硝化細菌固定化膜に用途が限定されるものではない。
また、バイオセンサは、水質計測器に用いられ、このような水質計測器は、計測対象水中の化学物質を計測するために用いられる。計測対象水は、一般的には、流水であり、水道原水、下水、排水のいずれかである。

そして、本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液は、固定化された硝化細菌の基質及び必須栄養素、並びにオキサル酢酸を含有したホウ酸緩衝液から成る。すなわち、本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液は、リン酸イオンを含有しないホウ酸緩衝液から成る。

硝化細菌の固定化剤としては、アルギン酸ナトリウム水溶液（ゾル）が用いられている。アルギン酸ナトリウム水溶液（ゾル）は、一価陽イオンであるナトリウムイオンが、多価陽イオンであるカルシウムイオンと置換されて、アルギン酸分子が架橋され、ゲル転移が進行する。しかし、膜保存液中のリン酸イオンとアルギン酸ゲル内のカルシウムとが、化学反応によりリン酸カルシウムを形成して、カルシウムがアルギン酸ゲル外へ流出するため、架橋構造が破壊される。本発明者らは、鋭意検討した結果このようなことを突き止めた。

このようなことから、本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液は、ホウ酸緩衝液から成り、硝化細菌の基質及び必須栄養素、並びにオキサル酢酸を含有し、リン酸イオンを含有しない。

上記基質は、固定化される硝化細菌に対応して選択する。例えば、アンモニア酸化細菌を用いる場合には、アンモニウムイオン、亜硝酸酸化細菌を用いる場合には、亜硝酸イオンを用いる。

アンモニウムイオン源として、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムを含むこと好ましく、亜硝酸イオン源として、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウムを含むことが好ましい。

上記ホウ酸緩衝液は、一般的には、四ホウ酸ナトリウム十水和物を用いて調製する。上記ホウ酸緩衝液のホウ酸イオン濃度は、１．２５ｍＭであることが好ましい。

必須栄養素とは、基質以外の栄養素であって、鉄イオン、マグネシウムイオン、炭酸イオン、銅イオン、コバルトイオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、亜鉛イオン、カルシウムイオン、リン酸イオンを含むが、本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液では、銅イオン以下を添加せずとも良い。

ホウ酸緩衝液中のオキサル酢酸の濃度は、固定化された硝化細菌の活性及び菌体量に応じて調整する。オキサル酢酸の濃度としては、０．５〜２ｍＭであることが好ましいが、特に１〜２ｍＭとすることが好ましい。オキサル酢酸濃度を０．５〜２ｍＭに調整することにより、アンモニア酸化細菌の培養齢に左右されることのなく安定した高い保存性を得ることができる。

本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液は、リン酸イオンを含有しないので、硝化細菌固定化膜の固定化剤であるアルギン酸ゲル中のカルシウムイオンと反応して流出することがない。すなわち、硝化細菌の固定化剤であるアルギン酸ゲルを破壊しない。これによって、硝化細菌が菌体固定化部から流出することがなく、硝化細菌固定化膜を３ヶ月以上にわたって保存することが可能としている。

このように、本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液により、硝化細菌固定化膜の保存可能期間を３ヵ月以上とすることが可能となり、バイオセンサ応用水質計の実用性をより高めることができる。

次に、本発明に係る硝化細菌固定化膜の保存液を、実施例にさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

アンモニア酸化細菌Nitrosomonas europaea (ＡＴＣＣ２５９７８)を表１に示す高圧蒸気滅菌した培地を用いて培養した。培養条件は、前培養液１０％接種／温度３０℃／振とう機回転数１５０ｒｐｍとし、培養期間は６日間とした。

培養期間を６日経過した後、上記のアンモニア酸化細菌Nitrosomonas europaea (ＡＴＣＣ２５９７８)の培養液を遠心分離して上澄みを除去した。
回収した菌体に１．０％アルギン酸ナトリウム水溶液を適量加えて懸濁し、所定の生菌個数濃度に調整した菌体濃縮液を得た。
そして、図２について説明したようなセルロース膜２２の中心部に、菌体濃縮液を滴下して菌体固定化量を４×１０⁷個/ｍｍ²となるように調整し、余剰のアルギン酸ナトリウム水溶液を吸引除去した。
さらに、塩化カルシウム水溶液（３０ｇ／Ｌ）を適量滴下して、余剰の塩化カルシウム水溶液を吸引除去し、菌体を固定化した側を内側にして、ドーナツ状の両面テープ２３を介してセルロース膜２１と貼り合わせた。
そして、最後に塩化カルシウム水溶液（３０ｇ／Ｌ）に１５分間浸漬し、アルギン酸ナトリウムを完全にゲル化させて菌体を固定化させた。

上記のようにして得られたアンモニア酸化細菌固定化膜を、保存液とともにビニールパックの中に封入して５〜１０℃で保存した。

保存性の良否判定
硝化細菌固定化膜の保存性良否判定では、任意の期間、冷蔵保存後の硝化細菌固定化膜をバイオセンサに装着し、センサ立上り時間（評価開始時点からセンサ出力が０．３５ｍＶ以下になるまでの経過時間）が２４時間以内の場合を「良」とし、２４時間以上の場合を「不良」としていた。

しかしながら、センサ保守時間の観点からは、センサ立上り時間による良否判定を４時間以内に行えれば好適である。すなわち、センサ立上り時間の判定基準を、実施例では２４時間から４時間以内、すなわち３時間として判定した。
表２に保存液組成とセンサ立上り時間との関係を示す。

アンモニア酸化細菌固定化膜の保存液として、リン酸緩衝液を主体とした保存液（表３）と、本発明のホウ酸緩衝液を主体とした保存液（表４）を用いて、バイオセンサ立上り時間を評価した。

菌体固定化量を４×１０⁷個/ｍｍ²に調整した硝化細菌固定化膜を冷蔵保存し、２、３、４ヶ月冷蔵保存後に硝化細菌固定化膜をバイオセンサに装着して、センサ立上り時間を評価した。また、ロット間でのデータ再現性を比較検討するため、３ロットについて、上記評価試験を行った。なお、両保存液の基質濃度（６０ｍｇ／Ｌ）及びオキサル酢酸濃度（１ｍＭ）は同一とし、センサ立上り時間の良否判定基準は３時間とした。

表５に両保存液を用いた場合のセンサ立上り時間比較結果を示す。センサ立上り時間を３時間とした厳しい判定基準下でも、リン酸緩衝液を主体とした保存液を用いた場合の膜保存可能期間は２ヶ月であったのに対し、ホウ酸緩衝液を主体とした保存液を用いた場合のそれは３ヶ月であった。

本発明の保存液を用いて３ヶ月冷蔵保存し、バイオセンサによる評価試験を行った後の硝化細菌固定化膜の染色状態を調べた。菌体固定化部からの菌体の流出は認められず、固定化剤であるアルギン酸ゲルの破壊が起きなかったことから、保存可能期間が伸長したものと考えられる。

以上の結果から、本発明の保存液を用いることにより、硝化細菌固定化膜の保存可能期間を、センサ立上り時間を３時間とした厳しい判定基準下でも３ヶ月以上とすることが可能となった。

バイオセンサ（微生物センサ）の一実施の形態を示す模式図である。 硝化細菌固定化膜の一実施の形態を示す模式図である。

符号の説明

１０ バイオセンサ
１１ 溶存酸素電極
１２ フローセル
１２ａ 試料液流路
２０ 硝化細菌固定化膜
２１ セルロース膜
２２ セルロース膜
２３ ドーナツ状両面テープ
２４ 菌体固定化部

Claims (10)

1. 硝化細菌固定化膜の保存液であって、固定化された硝化細菌の基質及び必須栄養素、並びにオキサル酢酸を含有したホウ酸緩衝液から成ることを特徴とする硝化細菌固定化膜の保存液。
2. 上記硝化細菌固定化膜がバイオセンサに用いられるものであり、該バイオセンサが水質計測器に利用されるものであることを特徴とする請求項１に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
3. 上記水質計測器の計測対象水が流水であり、水道原水、下水、排水のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
4. 上記硝化細菌が、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌からなる群から選択される少なくとも一の硝化細菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
5. 上記硝化細菌が、アンモニア酸化細菌であり、上記基質としてアンモニウムイオンを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
6. 上記硝化細菌が、亜硝酸酸化細菌であり、上記基質として亜硝酸イオンを含む請求項１〜４のいずれか一に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
7. 上記アンモニウムイオン源として、塩化アンモニウム及び硫酸アンモニウムのいずれか少なくとも一を含むことを特徴とする請求項５に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
8. 上記亜硝酸イオン源として、亜硝酸ナトリウム及び亜硝酸カリウムのいずれか少なくとも一を含むことを特徴とする請求項６に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
9. 四ホウ酸ナトリウム十水和物を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
10. ホウ酸イオン濃度が、１．２５ｍＭであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一に記載の硝化細菌固定化膜の保存液。
    

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