CN105842315B - 一种用于生化需氧量检测的电极敏感层 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于生化需氧量检测的电极敏感层，其敏感层为以金电极为基底直接共价固定的单层枯草芽孢杆菌，无需透氧膜和微生物固定载体半透膜，结构更简单，微生物层与电极结合更紧密，能够有效缩短待测物质在溶液、微生物以及电极之间的传质距离，减小待测物质扩散的传质阻力，检测生化需氧量的时间大为缩短；以金电极为微生物的固定基底提高了电极敏感层的机械强度，羧基氨基共价成键的固定方式增加了微生物与电极固定的稳定性，不易脱落；制备方法工艺简单易行，操作简便，可控性强，仅使用了巯基丙酸、EDC和NHS三种试剂，不使用其它有毒化学试剂，且该三种试剂均仅作用于电极，对微生物的活性影响较小。

Description

一种用于生化需氧量检测的电极敏感层
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种用于生化需氧量检测的电极敏感层。
背景技术
生化需氧量(BOD)，是指在规定条件下，微生物分解水中某些可氧化性物质、特别是有机物所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量，单位为毫克/升。其值越高，表明水中有机污染物含量越多，污染越严重。生化需氧量能相对的表示出微生物可分解有机污染物的量，符合水体自净化的实际情况，因而在水质监测和评价方面更具有实际操作意义。
传统的BOD检测方法为五日培养法，耗时5日，存在测定精度低、重现性差、分析周期长、操作步骤繁琐等缺点。微生物传感器法以微生物为敏感元件，将水中可氧化有机物的生物化学氧化分解转换为物理或化学变化，再经转换元件转化为输出信号。微生物传感器法由于具有检测时间短和操作简便等优点，成为当前BOD快速检测中的研究热点。
微生物膜是微生物传感器中的重要组成部分，其性能直接决定了传感器的性能。微生物一般通过吸附、包埋或交联的方法固定于半透膜中，制备的微生物膜固定于氧电极表面，通过氧电极检测微生物代谢有机物的耗氧情况以测定BOD。微生物的固定基底半透膜以及氧电极表面的透氧膜的双层结构，不仅增大了氧化还原物质在溶液和电极表面之间的传质阻力，使微生物膜电极的响应时间较长，不利于BOD的快速测定，同时该双层膜需要定时更换，操作繁琐且会对传感器性能产生影响。因此，研究微生物固定化的方法及其简化设计十分重要。
微生物固定方法中，吸附法固定对微生物无毒害作用，细胞活性损失小，但存在长时间后微生物易脱落，影响使用寿命的问题。包埋法制备的微生物膜机械强度虽有提高，微生物活性也较交联法高，但该方法不适用于涉及大分子物质的反应，同时由于包埋材料的使用引入较大的传质阻力。交联法制备的微生物膜使用寿命提高，但固定微生物的成活率较低，制备过程较复杂，交联剂用量和微生物量相互制约。
例如，现有技术的一种包埋法制备微生物电极敏感层，首先混合海藻酸钠溶液和菌液，滴涂于工作电极表面，然后浸入氯化钙溶液中固化，为防止包埋细胞脱落，细胞凝胶表面覆盖聚酰胺膜，制备的传感器用于BOD快速检测，制备过程如图1所示。该方法使用直径为10μm的超微铂电极作为工作电极，使用的微生物是青紫色素杆菌(Chromobacteriumviolaceum R1)，为防止微生物脱落，采用聚酰胺膜覆盖，固定微生物的凝胶厚度范围为百微米量级，BOD检测的待测量为电子媒介体铁氰化钾，测定BOD的耗时为30min。由此可见，该方法存在的主要问题是，一是包埋凝胶厚度在百微米量级，不利于待测物质的传质，二是固定所用包埋材料和为防止包埋的微生物脱落而覆盖的聚酰胺膜会引入较大的传质阻力，不利于BOD的快速检测，固定过程中引入较多化学试剂，步骤较多，可能引入更多干扰，同时对微生物的活性可能产生影响。
由此可见，现有技术绝大部分使用了半透膜作为固定基底，增大了传质阻力，且没有利用微生物表面和固定基底的性质。因此，如何制备一种结构简单，传质阻力小，检测时间短、固定牢固、对微生物的活性影响较小的电极敏感层是本领域亟待研究的课题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用于生化需氧量检测的电极敏感层。
(二)技术方案
本发明提供了一种用于生化需氧量检测的电极敏感层，包括：作为微生物固定基底的电极和微生物，其中，该微生物直接交联固定于电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
优选地，该微生物表面的氨基与该电极表面的活化后的羧基共价成键，使得该微生物交联固定于该电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
优选地，该电极为金电极。
优选地，该微生物为枯草芽孢杆菌。
优选地，该枯草芽孢杆菌表面的氨基与金电极表面的活化后的羧基共价成键，使得该枯草芽孢杆菌固定于该金电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
本发明还提供了一种用于生化需氧量检测的微生物传感器，包括上述任一种用于生化需氧量检测的电极敏感层。
本发明还提供了一种用于制备上述任一种用于生化需氧量检测的电极敏感层的制备方法，其特征在于，包括：步骤A：电极预处理；步骤B：电极表面自组装化学基；以及步骤C：活化电极表面的化学基并交联固定微生物，形成单层微生物的电极敏感层。
优选地，该步骤A具体包括：对金电极进行表面清洁处理和电化学性能稳定处理。
优选地：将预处理后的金电极浸泡于巯基丙酸溶液中，金电极表面自组装羧基。
优选地，该步骤C具体包括：子步骤C1：采用EDC和NHS混合溶液活化金电极表面的羧基；以及子步骤C2：将表面羧基被活化后的金电极浸泡于枯草芽孢杆菌菌液中，枯草芽孢杆菌表面的氨基与金电极表面的活化后的羧基共价成键，单层枯草芽孢杆菌交联固定于金电极表面。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本发明的用于生化需氧量检测的电极敏感层具有以下有益效果：
(1)敏感层为固定的单层的枯草芽孢杆菌，无需透氧膜和微生物固定载体半透膜，结构更简单，微生物层与电极结合更紧密，能够有效缩短待测物质在溶液、微生物以及电极之间的传质距离，减小待测物质扩散的传质阻力，检测生化需氧量的时间大为缩短；
(2)以金电极为微生物的固定基底提高了电极敏感层的机械强度，羧基氨基共价成键的固定方式增加了微生物与电极固定的稳定性，不易脱落；
(3)制备方法工艺简单易行，操作简便，可控性强，仅使用了巯基丙酸、EDC和NHS三种试剂，不使用其它有毒化学试剂，且该三种试剂均仅作用于电极，对微生物的活性影响较小。
附图说明
图1为现有技术中的一种制备电极敏感层的方法；
图2为本发明第一实施例的用于生化需氧量检测的电极敏感层；
图3为本发明第一实施例的电极敏感层对BOD标准溶液的响应电流随时间变化曲线图，I0为电极敏感层刚接触待测液时的计时电流信号，I5为电极敏感层接触待测液5min后的计时电流信号；
图4为本发明第一实施例的电极敏感层对BOD标准溶液的响应电流与BOD标准溶液的标定曲线图；
图5为本发明第三实施例制备电极敏感层的制备方法流程图；
图6示出了经表面清洁处理和电化学性能稳定处理后的金电极；
图7示出了自组装羧基后的金电极；
图8示出了制成的电极敏感层。
【符号说明】
1-金电极；2-枯草芽孢杆菌。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
参见图2，本发明第一实施例的用于生化需氧量检测的电极敏感层，其包括：作为微生物固定基底的电极和微生物，其中，该微生物直接交联固定于电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
优选地，微生物表面与电极表面的活化后的羧基共价成键，使得微生物固定于电极表面，形成单层微生物的电极敏感层；微生物表面的氨基与电极表面共价成键，使得微生物固定于电极表面，形成单层微生物的电极敏感层；进一步地，微生物表面的氨基与电极表面的活化后的羧基共价成键，使得微生物固定于电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
优选地，该电极为金属电极，尤其是金电极1，其直径为0.5mm-2mm，优选1mm；该微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2；固定的单层微生物的厚度为μm量级；枯草芽孢杆菌表面的氨基与金电极表面的活化后的羧基共价成键，使得枯草芽孢杆菌2固定于金电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
本发明第一实施例的用于生化需氧量检测的电极敏感层，其敏感层为单层枯草芽孢杆菌2，该单层微生物结构相对于现有技术的将微生物固定于半透膜中、再覆盖于含透氧膜的溶氧电极表面的分立双层结构，无需半透膜和透氧膜，结构更简单，微生物层与电极结合更紧密，能够有效缩短待测物质在溶液、微生物以及电极之间的传质距离，减小待测物质扩散的传质阻力。
利用该电极敏感层检测生化需氧量所需的检测时间大为缩短，例如采用计时电流法，利用该电极敏感层分别对磷酸缓冲溶液(PBS)和待测溶液进行测试，其以溶解氧为待测量，所得差值即为生化需氧量的值，可在10min内完成检测，图3示出了电极敏感层对BOD标准溶液的响应电流随时间变化曲线，图4示出了响应电流对BOD标准溶液的标定曲线，BOD标准溶液为葡萄糖-谷氨酸溶液。不用于检测时，电极敏感层可置于PBS中4℃保存。
以金电极为微生物的固定基底提高了电极敏感层的机械强度，羧基氨基共价成键的固定方式增加了微生物与电极固定的稳定性，不易脱落。
本发明第二实施例提供了一种用于生化需氧量检测的微生物传感器，其包括上述第一实施例中的用于生化需氧量检测的电极敏感层。
参见图5，本发明第三实施例提供了一种用于制备上述电极敏感层的制备方法，其包括：
步骤A：电极预处理。
该步骤A具体包括：对金电极1进行表面清洁处理和电化学性能稳定处理。图6示出了经表面清洁处理和电化学性能稳定处理后的金电极1。
优选地，所述金电极1选用商用体电极，也可以采用基于磁控溅射技术制备的金电极，金电极1作为微生物固定基底，具有较好的机械强度。
所述表面清洁处理是分别在丙酮、乙醇、去离子水中对金电极表面做超声清洗。
步骤B：电极表面自组装化学基。
步骤B具体包括：将经步骤A预处理的金电极浸泡于巯基丙酸(MPA，HSCH2CH2COOH)溶液中，金电极表面自组装羧基。图7示出了自组装羧基后的金电极，其中表示自组装的羧基。
优选地，巯基丙酸溶液的浓度为10-200mM，浸泡时间为2-12h；巯基丙酸溶液的浓度也可适当扩大，金电极浸泡于巯基丙酸溶液中的时间也可适当延长。虽然巯基丙酸会增加一定的传质阻力，但由于其碳链较短，引入的传质阻力较小，对于生化需氧量检测时间的影响可忽略不计。
步骤C：活化电极表面的化学基并交联固定单层微生物。
步骤C具体包括：
子步骤C1：采用EDC(1-(3-二甲氨基丙酸)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合溶液活化金电极表面的羧基；
子步骤C2：将表面羧基被活化后的金电极浸泡于枯草芽孢杆菌菌液中，枯草芽孢杆菌表面的氨基与金电极表面的活化后的羧基共价成键，枯草芽孢杆菌2交联固定于金电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。图8示出了制成的电极敏感层，其中表示活化后的羧基，-NH-表示枯草芽孢杆菌表面的、与羧基连接后的氨基的状态。
优选地，选用培养到稳定期的枯草芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌菌液浓度为6×107～6×109CFU/ml，浸泡时间为2-12h。
该交联固定方式利用了共价成键，稳定性好，固定牢固，同时由于只有金电极表面的羧基被活化，所以金电极表面仅固定了单层枯草芽孢杆菌，促进了有机物和溶氧在溶液、微生物和电极之间的扩散，减小了传质阻力。
本发明第三实施例的制备方法，工艺简单易行，操作简便，可控性强，仅使用了巯基丙酸、EDC和NHS三种试剂，不使用其它有毒化学试剂，且该三种试剂均仅作用于电极，对微生物的活性影响较小。
至此，已对本发明的用于生化需氧量检测的电极敏感层进行了详细描述。需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构和形状，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如：
(1)微生物层还可采用其他菌类，只要能实现相同的功能即可；
(2)本文可提供包含特定值的参数的示范，但这些参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应值；
(3)实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向，并非用来限制本发明的保护范围；
(4)上述实施例可基于设计及可靠度的考虑，彼此混合搭配使用或与其他实施例混合搭配使用，即不同实施例中的技术特征可以自由组合形成更多的实施例。
综上所述，本发明的用于生化需氧量检测的电极敏感层，其敏感层为以金电极为基底直接共价固定的单层枯草芽孢杆菌，无需透氧膜和微生物固定基底半透膜，结构更简单，微生物层与电极结合更紧密，能够有效缩短待测物质在溶液、微生物以及电极之间的传质距离，减小待测物质扩散的传质阻力，检测生化需氧量的时间大为缩短；以金电极为微生物的固定基底提高了电极敏感层的机械强度，羧基氨基共价成键的固定方式增加了微生物与电极固定的稳定性，不易脱落；其制备方法工艺简单易行，操作简便，可控性强，仅使用了巯基丙酸、EDC和NHS三种试剂，不使用其它有毒化学试剂，且该三种试剂均仅作用于电极，对微生物的活性影响较小。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于生化需氧量检测的电极敏感层，其特征在于，包括：作为微生物固定基底的电极和微生物，其中，
该微生物表面的氨基与该电极表面的活化后的羧基共价成键，使得该微生物交联固定于该电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
2.如权利要求1所述的电极敏感层，其特征在于，该电极为金电极。
3.如权利要求2所述的电极敏感层，其特征在于，该微生物为枯草芽孢杆菌。
4.如权利要求3所述的电极敏感层，其特征在于，该枯草芽孢杆菌表面的氨基与金电极表面的活化后的羧基共价成键，使得该枯草芽孢杆菌固定于该金电极表面，形成单层微生物的电极敏感层。
5.一种用于生化需氧量检测的微生物传感器，其特征在于，包括权利要求1-4中任一项权利要求所述的用于生化需氧量检测的电极敏感层。
6.一种用于制备权利要求1-4中任一项权利要求所述的电极敏感层的制备方法，其特征在于，包括：
步骤A：电极预处理；
步骤B：电极表面自组装化学基；以及
步骤C：活化电极表面的化学基并交联固定微生物，形成单层微生物的电极敏感层。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，该步骤A具体包括：对金电极进行表面清洁处理和电化学性能稳定处理。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，该步骤B具体包括：将预处理后的金电极浸泡于巯基丙酸溶液中，金电极表面自组装羧基。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，该步骤C具体包括：
子步骤C1：采用EDC和NHS混合溶液活化金电极表面的羧基；以及
子步骤C2：将表面羧基被活化后的金电极浸泡于枯草芽孢杆菌菌液中，枯草芽孢杆菌表面的氨基与金电极表面的活化后的羧基共价成键，单层枯草芽孢杆菌交联固定于金电极表面。
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