CN103091145B - 微生物的染色方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物的染色方法。该方法包括将待染色的微生物在色素培养基中培养对所述待染色的微生物进行活细胞染色的步骤，所述色素培养基由食用色素和用于培养所述待染色的微生物的培养基组成，所述食用色素在所述色素培养基中的浓度为0.5g/L-20g/L。本发明的微生物细胞染色方法操作简单，染色效果明显，成本低廉，无毒性染色不伤害菌体。

Description

微生物的染色方法
技术领域
本发明涉及微生物的染色方法。
背景技术
目前，细菌的染色方法有很多，细菌的染色分为活菌染色和死菌染色。微生物学中常用的细菌染色法有革兰染色，抗酸染色，芽孢染色和荚膜染色等。其中，革兰染色：传统的革兰染色四步法中脱色这一步骤，对初学者来说不易掌握，过度脱色会把革兰阳性菌染成红色，脱色不够会把革兰阴性菌染成阳性菌。抗酸染色：传统方法为先加石炭酸于菌膜后再加温，此法染液易干涸，需不断添加染料，染料的用量较大。芽孢染色：常用的芽孢染色法为染液覆盖菌膜后加热，造成染料的用量大，且容易流到玻片外，玷污桌面和实验室等。荚膜染色：传统的荚膜染色法容易把荚膜染成淡紫色，菌体染成紫色，对比度不高，不容易观察，甚至初学者易于把空泡误认为是荚膜（假荚膜）。而且这些方法都涉及菌体裂解的步骤，对菌体产生较大的毒性甚至导致菌体死亡，进而表现出染色方案是不温和性质。食用色素，是色素的一种，（食用色素是色素家族的一类）即能被人适量食用的可使食物在一定程度上改变原有颜色的食品添加剂。食用色素有觅菜红、胭脂红、赤藓红、大红、果绿、日落黄、亮兰等。目前，还没有将食用色素用于微生物染色的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对微生物活细胞进行染色的方法。
本发明所提供的微生物细胞的染色方法，包括将待染色的微生物在色素培养基中培养对所述待染色的微生物进行活细胞染色的步骤，所述色素培养基由食用色素和用于培养所述待染色的微生物的培养基组成，所述食用色素在所述色素培养基中的浓度为0.5g/L-20g/L（如1-5g/L或5g/L或1g/L）。
上述方法中，所述食用色素可为水溶性色素，如日落黄、赤藓红、胭脂红、果绿或大红。
其中，日落黄的分子式为C16H10N2Na2O7S2，化学名称为1－（4'－磺基－1'－苯偶氮）－2－萘酚－6－磺酸二钠；胭脂红的化学名称为1-(4-磺酸-1-萘偶氮)-2-羟基-6,8-萘二磺酸三钠盐，分子式为C20H11N2O10S3Na3。
上述方法中，所述色素培养基中，用于培养所述待染色的微生物的培养基可为适宜所述待染色的微生物生长、分化和/或代谢的培养基。
上述方法中，所述微生物细胞可为原核细胞（如大肠杆菌细胞）或真核细胞。在所述大肠杆菌细胞可为大肠杆菌DH5α细胞或大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞，所述色素培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，色素5g，余量的水。所述色素培养基的pH可为适宜所述待染色的微生物生长的pH。
上述方法中，所述将待染色的微生物在色素培养基中培养可进行3-8小时（如6小时）。
上述食用色素在制备微生物活细胞染色剂中的应用也属于本发明的保护范围。
上述色素培养基也属于本发明的保护范围。
本发明的微生物细胞染色方法与目前通用的革兰氏染色、抗酸性染色等染色方法相比，其优势在于：1.微生物共培养染色，染色伴随细菌培养的始终。2.染色非特异性，原核、真核细胞均可以通过该种方法染色。3.能够在不影响或者极少影响菌体生长的情况下温和染色，并不影响任何微生物生理状态，在不影响菌体任何生理状态下可以进行形态学观察。4.低毒、无公害无污染。5.色素水溶性高，对实验器材无着色，洗涤轻松方便，器材利用可循环。本发明可为实验室微生物安全和工业生产中的微生物安全提供保障，在实验操作的过程中向微生物培养基中掺入色素，这样可以及时发现和清除遗漏的微生物培养液，保障实验室环境的安全；工业生产中，各种微生物操作过程中都有泄露的可能性，加入色素后，任何泄露和仪器故障出现的问题将直接显示出来，便于查找工业发酵罐污染泄露源头。本发明的微生物细胞染色方法操作简单，染色效果明显，成本低廉，无毒性染色不伤害菌体。
附图说明
图1为赤藓红色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h的照片。
图2为日落黄色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h的照片。
图3为果绿色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h的照片。
图4为大红色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h的照片。
图5为胭脂红色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h的照片。
图6为日落黄色素培养基培养大肠杆菌DH5α的菌体沉淀照片。
图7为赤藓红色素培养基培养大肠杆菌DH5α的菌体沉淀照片。
图8为果绿色素培养基培养大肠杆菌DH5α的菌体沉淀照片。
图9为大红色素培养基培养大肠杆菌DH5α的菌体沉淀照片。
图10为胭脂红色素培养基培养大肠杆菌DH5α的菌体沉淀照片。
图11为赤藓红色素培养基培养的大肠杆菌DH5α的油镜图。
图12为日落黄色素培养基培养的大肠杆菌DH5α的油镜图。
图13为果绿色素培养基培养的大肠杆菌DH5α的油镜图。
图14为大红色素培养基培养的大肠杆菌DH5α的油镜图。
图15为胭脂红色素培养基培养的大肠杆菌DH5α的油镜图。
图16为色素液体培养基培养的菌体菌落计数结果。
图17为色素液体培养基传代培养的菌体菌落计数结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，胭脂红（化学名称为1-(4-磺酸-1-萘偶氮)-2-羟基-6,8-萘二磺酸三钠盐，分子式为C20H11N2O10S3Na3），购自东莞市鲜田食品贸易行，产品标准号Q/TZC0001S-2010；赤藓红（分子式C20H6I4Na2O5），购自上海金穗生物科技有限公司JS11454-25g；大红:含日落黄、胭脂红，购自广东省东莞市添之彩食品厂GB26687-2011；果绿：含柠檬黄、亮蓝，购自广东省东莞市添之彩食品厂产品标准号Q/TZC0001S-2010；日落黄（分子式：C16H10N2Na2O7S2，化学名称为1－（4'－磺基－1'－苯偶氮）－2－萘酚－6－磺酸二钠）购自广东省东莞市添之彩食品厂，产品标准号GB26687-2011。大肠杆菌DH5αTakara，商品目录号D9057A。大肠杆菌Rosetta(DE3)Biovector，008。
实施例1、利用食用色素对大肠杆菌进行染色
1、色素培养基的制备
色素培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，色素，加水定容至1L。该色素培养基的pH=7。其配制方法如下：取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，色素5g，加水定容至1升，将该培养基于121℃湿热灭菌半小时。其中色素为日落黄、赤藓红、胭脂红、果绿或大红。
色素为日落黄的色素培养基名称为日落黄色素培养基，日落黄色素培养基中，日落黄的含量是5g/L。
色素为赤藓红的色素培养基名称为赤藓红色素培养基，赤藓红色素培养基中，赤藓红的含量是1g/L。
色素为胭脂红的色素培养基名称为胭脂红色素培养基，胭脂红的色素培养基中，胭脂红的含量是5g/L。
色素为果绿的色素培养基名称为果绿色素培养基，果绿色素培养基中，果绿的含量是5g/L。
色素为大红的色素培养基名称为大红色素培养基，大红色素培养基中，大红的含量是5g/L。
不含色素的对照培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，加水定容至1L。该对照培养基的pH=7。按照上述方法配制对照培养基。
2、微生物染色
大肠杆菌DH5α活化：采用大肠杆菌DH5α-20℃的冻存甘油菌。用大试管分装5mlLB培养基进行接种培养，接种量为10ul。至于37℃200r/min摇床培养过夜。
A:培养的现象观察：
染色培养：将步骤1的色素培养基分装于大试管中，每只大试管5ml，接种大肠杆菌DH5α菌悬液100ul在37℃200r/min摇床培养6h。同时，以未接种大肠杆菌DH5α的相应色素培养基作为对照。
用赤藓红色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h后，菌液浑浊、红色，大肠杆菌正常生长（图1中左侧试管）；对照组（未接种大肠杆菌DH5α的赤藓红色素培养基在37℃200r/min摇床培养6h）无菌体生长，培养基红色透明（图1中右侧试管）。
用日落黄色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h后，菌液浑浊、橙黄色，大肠杆菌正常生长（图2中左侧试管）；对照组（未接种大肠杆菌DH5α的日落黄色素培养基在37℃200r/min摇床培养6h）无菌体生长，培养基橙黄色透明（图2中右侧试管）。
用果绿色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h后，菌液浑浊、绿色，大肠杆菌正常生长（图3中左侧试管）；对照组（未接种大肠杆菌DH5α的果绿色素培养基在37℃200r/min摇床培养6h）无菌体生长，培养基绿色透明（图3中右侧试管）。
用大红色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h后，菌液浑浊、红色，大肠杆菌正常生长（图4中左侧试管）；对照组（未接种大肠杆菌DH5α的大红色素培养基在37℃200r/min摇床培养6h）无菌体生长，培养基红色透明（图4中右侧试管）。
用胭脂红色素培养基培养大肠杆菌DH5α6h后，菌液浑浊、红色，大肠杆菌正常生长（图5中左侧试管）；对照组（未接种大肠杆菌DH5α的胭脂红色素培养基在37℃200r/min摇床培养6h）无菌体生长，培养基红色透明（图5中右侧试管）。
B:染色培养菌体颜色观察
染色培养：将步骤1的色素培养基分装于大试管中，每只大试管5ml，接种大肠杆菌DH5α菌悬液100ul在37℃200r/min摇床培养6h。同时，将对照培养基分装于大试管中，每只大试管5ml，接种大肠杆菌DH5α菌悬液100ul在37℃200r/min摇床培养6h，作为对照组。
取3ml菌液在10000r/min离心1min后,收集菌体，观察菌体颜色。结果表明，用日落黄色素培养基培养的菌体沉淀（图6中左）带有日落黄的颜色，而对照组则为正常乳白色的菌体（图6中右）。用赤藓红色素培养基培养的菌体沉淀（图7中左）带有红色，而对照组则为正常乳白色的菌体（图7中右）。用果绿色素培养基培养的菌体沉淀（图8中左）带有绿色，而对照组则为正常乳白色的菌体（图8中右）。绿色菌体沉淀可以辨别，染色效果一般。用大红色素培养基培养的菌体沉淀带有红色（图9中左），而对照组则为正常乳白色的菌体（图9中右）。红色菌体沉淀可以辨别，染色效果一般。用胭脂红色素培养基培养的菌体沉淀带有红色（图10中左），而对照组则为正常乳白色的菌体（图10中右）。红色菌体沉淀可以辨别，染色效果一般。
C、制片进行显微镜观察染色效果
染色培养：将步骤1的色素培养基分装于大试管中，每只大试管5ml，接种大肠杆菌DH5α菌悬液100ul在37℃200r/min摇床培养6h。取菌液制片。其中，制片方法如下：
1）制片
在干净的载玻片上，取10ul菌液直接涂布于载玻片上。
2）自然干燥
涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3）固定
标本干燥后即进行固定，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行水洗。
4）水洗
用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。
5）干燥
着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。
6）镜检
干燥后的标本可用显微镜观察。显微镜（油镜）观察，结果表明用赤藓红色素培养基培养的菌体为红色，图中杆状的细菌清晰可见（图11）；用日落黄色素培养基培养的菌体为黄色，图中杆状的细菌清晰可见（图12）；用果绿色素培养基培养的菌体为绿色，图中细菌清晰可见有凹凸感（图13）；用大红色素培养基培养的细菌染色不明显，较难辨别（图14）；用胭脂红色素培养基培养的细菌染色效果一般，较难辨别（图15）。
上述实验结果表明染色效果日落黄、赤藓红较为清晰，而果绿、大红和胭脂红在着色效果上较差一些，尤其大红色素着色的菌体在油镜下较难分辨，果绿和胭脂红着色效果一般。说明不同的食用色素着色的效果有所区别。但是色素共培养在菌体最初生长时标记上颜色，并且对菌体各种生理指标的检测影响较小，此温和型染色的方法在实验室，工业生产等生物安全问题应用上，凸显优势。
3、色素培养基对菌体生长的影响
A、培养基
1）液体培养基
色素液体培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，色素，加水定容至1L。该色素培养基的pH=7。其配制方法如下：取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，色素，加水定容至1升，将该培养基于121℃湿热灭菌半小时。其中色素为日落黄或赤藓红。色素为日落黄的色素液体培养基名称为日落黄色素液体培养基，日落黄色素液体培养基中，日落黄的含量是5g/L。色素为赤藓红的色素液体培养基名称为赤藓红色素液体培养基，赤藓红色素液体培养基中，赤藓红的含量是1g/L。
不含色素的对照液体培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加水定容至1L。该对照液体培养基的pH=7。按照上述方法配制对照液体培养基。
2）固体培养基
固体培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g/L，加水定容至1L，将该培养基于121℃湿热灭菌半小时。加入1‰（质量含量）氨苄霉素后，倒平板，得到固体培养基。
B、色素培养基对菌体生长的影响
用步骤1）制备的液体培养基分别在37℃200r/min摇床培养大肠杆菌Rosetta(DE3)6小时后，菌体生长曲线大约在对数生长期左右，取10ul的菌液进行稀释达到10-6,10-7,10-8，取50-100ul菌液加入步骤2）的固体培养基平板，用涂布棒涂布均匀。放入37℃恒温培养箱中进行培养12h，对长出的菌落进行计数。
结果表明：日落黄色素和赤藓红色素在培养菌体过程中，几乎不影响菌体生长（图16）。图16中，对照组表示液体培养在不含色素的对照液体培养基中培养；日落黄表示液体培养在日落黄色素液体培养基培养，赤藓红表示液体培养在赤藓红色素液体培养基中培养，稀释度表示涂平板的菌液稀释度。
上述结果说明菌体在色素培养基环境中正常生长并温和着色
4、色素培养基对菌体传代的影响
A、培养基
1）液体培养基
色素液体培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，色素，加水定容至1L。该色素培养基的pH=7。其配制方法如下：取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，色素，加水定容至1升，将该培养基于121℃湿热灭菌半小时。其中色素为日落黄或赤藓红。色素为日落黄的色素液体培养基名称为日落黄色素液体培养基，日落黄色素液体培养基中，日落黄的含量是5g/L。色素为赤藓红的色素液体培养基名称为赤藓红色素液体培养基，赤藓红色素液体培养基中，赤藓红的含量是1g/L。
不含色素的对照液体培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加水定容至1L。该对照液体培养基的pH=7。按照上述方法配制对照液体培养基。
2）固体培养基
固体培养基每升由如下原料制成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g/L，加水定容至1L，将该培养基于121℃湿热灭菌半小时。加入1‰（质量含量）氨苄霉素后，倒平板，得到固体培养基。
B、色素培养基对菌体传代的影响
用步骤1）制备的液体培养基分别在37℃200r/min摇床培养大肠杆菌Rosetta(DE3)6小时后，取菌液按1‰（体积比）的接种量接入相应液体培养基在37℃200r/min摇床培养10小时后，取菌液按照1%（体积比）的接种量接入相应液体培养基在37℃200r/min摇床培养6小时，菌体生长曲线大约在对数生长期左右，取10ul的菌液进行稀释达到10-6,10-7,10-8，取50-100ul菌液加入步骤2）的固体培养基平板，用涂布棒涂布均匀。放入37℃恒温培养箱中进行培养12h，对长出的菌落进行计数。其中，接入相应液体培养基是指日落黄色素液体培养基的菌液接入日落黄色素液体培养基，赤藓红色素液体培养基的菌液接入赤藓红色素液体培养基,对照液体培养基的菌液接入对照液体培养基。结果如图17所示，表明日落黄色素液体培养基传代培养的大肠杆菌数目和对照液体培养基没有差异，赤藓红色素液体培养基传代培养的大肠杆菌数目低于对照液体培养基。说明日落黄色素和赤藓红色素在培养菌体过程中，日落黄几乎不影响菌体生长，而赤藓红有一定的影响，使得菌体生长受到一定的抑制。

Claims (5)

1.微生物细胞的染色方法，包括将待染色的微生物在色素培养基中培养对所述待染色的微生物进行活细胞染色的步骤，所述色素培养基由日落黄和用于培养所述待染色的微生物的培养基组成，所述日落黄在所述色素培养基中的浓度为0.5g/L-20g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微生物细胞为原核细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述将待染色的微生物在色素培养基中培养进行3-8小时。
4.给微生物活细胞染色的染色培养基，由日落黄和微生物培养基组成，所述日落黄在所述染色培养基中的浓度为0.5g/L-20g/L。
5.根据权利要求4所述的染色培养基，其特征在于：所述微生物细胞为原核细胞。
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