CN106011002A - 一种巨大芽孢杆菌t317及其菌剂和菌剂制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法，所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。所述菌剂制备方法包括以下步骤：（1）分离、筛选；（2）纯化、保存；（3）固体发酵培养时；（4）菌剂制备，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。本发明以巨大芽孢杆菌T317为出发菌株，对其固氮酶活性以及分泌生长素能力进行测定，发现菌株T317具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800‑900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300‑400mg/L。

Description

一种巨大芽孢杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法。
背景技术
农业生产长期过分依赖化学肥料和农药，已经造成了农田土质和肥力下降，农作物品质降低，食品和地下水等环境污染也日趋严重。随着生态农业和绿色食品生产的兴起和发展，加之我国大多数土壤中速效磷、钾及其他一些养分的缺乏，微生物肥料作为生物技术发展和农业生产的一类重要肥源逐渐引起了人们的关注。
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是一种好氧产孢革兰氏阳性细菌，至今已有一百多年的研究历史。近年来，随着微生物肥料的研究，巨大芽孢杆菌作为解磷菌被广泛应用于解磷细菌肥料生产。目前，国内对巨大芽孢杆菌在微生物肥料上的研究主要集中在菌株选育、解磷效果、发酵条件优化及与解钾菌相互作用等方面，而对巨大芽孢杆菌的固氮作用却不多见。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T317，其具有固氮酶活性和分泌生长素吲哚乙酸的功能。
本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T317菌剂，该具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，农业应用范围广，经济效益高。
本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T317菌剂制备方法，工艺简单成熟，可规模化生产。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种巨大芽孢杆菌T317，所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Collection)，地址为中国武汉大学，分类命名为巨大芽孢杆菌T317 Bacillus megaterium T317，保藏号为CCTCCM 2015753，保藏日期：2015年12月15日。
所述巨大芽孢杆菌T317具有序列表NO.1的DNA序列。
所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800-900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。
固氮酶活性测定
1、试验方法
采用乙炔还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定。将保存的各菌株用VM-Ethanol固体培养基活化，用接种环挑取1环菌体于1.5mL的无菌离心管中，用无菌水稀释，按相同接种量接入装有5mL半固体培养基的10mL试管中，用反口橡胶塞密封。37℃培养24h后，注入1/10体积的10％乙炔气体，继续培养24h，从试管中抽取0.5mL气体注入气相色谱仪(北京天普分析仪器厂SP-2100)中，测定乙炔、乙烯的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小(北京农业大学微生物专业编，1986)：
C＝(hx×c×V)/(24.9×hs×t) (2.1)
其中，hx为样品峰面积值；hs为标准C2H4峰面积值；c为标准C2H4浓度(nmol/mL)；
V为培养容器体积(mL)；t为样品培养时间(h)；C为产生的C2H4浓度[nmol/(mL·h)]。
2、试验结果
结合公式(2.1)和固氮酶活性测定图4得知，固氮酶活性为800-900nmol/(mL·h)。由此可以说明，巨大芽孢杆菌T317在代谢过程中可以产生特定的固氮酶，可以自生固定大气中的氮气。
生长素定性含量测定
(1)挑取菌株分别接种(OD600＝1.0，0.5mL菌悬液)到盛有50mL King液体培养基的250mL三角瓶中，每组3个重复。
(2)接种完毕后，将三角瓶置于摇床上，28℃，125rpm，培养3d，待测。
(3)将上述在King液体培养基上生长3d的菌悬液50μL置于透明离心管中，同时加50μL比色液。
(4)设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入50μL浓度为10mg/L的植物生长激素(IAA)，同时加50μL比色液。阴性对照中加50μLKing液体培养基，同时加50μL比色液。
(5)将阳性对照液、阴形对照液和测定液置于白陶瓷板并置于室温下15min，观察其颜色变化，颜色变红者为阳性，表示能够分泌IAA，且颜色越深表示分泌IAA的能力越强；若不变色则为阴性，表示该菌株不能分泌IAA，由此作为判断依据进行判断分析。
培养基为King培养基(1L)；试剂配方为：蛋白胨20g，K2HPO4 1.725g，MgSO4·7H2O1.5g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g，蒸馏水1000mL。
生长素定量测定
参照Riberio等的方法略加改动。菌株T317接种到含有1g/L色氨酸的LB液体培养基中，30℃，180r/min，振荡培养48h。将培养液10000r/min离心5min，取100mL上清液加到96孔板中，与100mL Salkowski’s试剂(1mL 0.5mol/L FeCl3和49mL 35％ 高氯酸)混匀，室温静置30min，在波长530nm下用酶标仪测定吸光度。用不同浓度的IAA标准品制作标准曲线，测定结果见表1。
表1 菌株T317 IAA测定结果
从表1和图5可以看出，巨大芽孢杆菌T317的生长素浓度(分泌量)为312.48mg/L，因此，可以判断巨大芽孢杆菌T317在生长代谢过程中可以产生IAA，具有促进作物生长的功能。
一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，包括以下步骤：
(1)分离、筛选
选取含有巨大芽孢杆菌T317的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；
(2)纯化、保存
在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌T317单菌落，保存该单菌落备用；巨大芽孢杆菌T317单菌落如图1所示。
具体地，在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到巨大芽孢杆菌T317单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。
(3)固体发酵培养
选取上述巨大芽孢杆菌T317，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4，接种量0.5-1.0％，培养温度为30-37℃，培养时间为48-60小时。
(4)菌剂制备
将发酵后产物于50℃烘干后用小型粉碎机打碎，设定最终产品活菌数为5亿/g，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-10亿/g，产品活菌数完全符合国家标准《微生物菌剂》GB20287-2006要求2亿/g以上，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。
固体发酵培养中固体培养基的配方优化实验
(3.1)菌种由实验室自行分离，经鉴定为芽孢杆菌属中的Bacillus megaterium，编号为T317。
(3.2)固体培养基为
培养基一：LB培养基(Lysogeny Broth，即溶菌肉汤培养基，是培养细菌最基础最常见的培养基)；
培养基二：种子培养基配方(g/L)：淀粉16，酵母抽提粉4，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，培养基二的pH为7.0；
培养基三：发酵培养基配方(g/L)：淀粉15，豆粕25，KH2PO4 2，Na2HPO4 0.5，CaCO30.5，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5，培养基三的pH为7.0。
上述发酵培养基配方一和三的缺陷是发酵成本高，不适宜生产。培养基二的种子培养基配方发酵用量少，发酵效果好。
(3.3)固体发酵产孢条件的单因素试验
①淀粉原料对产孢量的影响：选用小麦粉、面粉和麸皮为淀粉原料，按照豆粕∶淀粉原料＝4:1(m:m)的比例，在料水比为1.0:0.3(m:m)，接种量为1.0％(V:m)，37℃条件下发酵48h，测定产孢量如表2所示。
表2淀粉原料对产孢量的影响
原料 小麦粉 面粉 麸皮
产孢量(亿/g) 5.2 4.8 6.4
②发酵温度对产孢量的影响：将豆粕和小麦粉以4:1(m:m)的比例混合，按照料水比1.0:0.3(m:m)制作固体培养基，种子液添加量为1.0％(V:m)，在不同的发酵温度下(30、35、37、40、45℃)发酵48h，测定产孢量如表3所示。
表3发酵温度对产孢量的影响
③发酵时间对产孢量的影响：将豆粕和麸皮以4:1(m:m)的比例混合，按照料水比1.0:0.3(m:m)制作固体培养基，种子液添加量为1.0％(V:m)，在37℃下发酵不同时间(24、48、72、96h)，测定产孢量如表4所示。
表4发酵时间对产孢量的影响
发酵时间(h) 24 48 72 96
产孢量(亿/g) 2.2 6.2 6.0 4.8
④接种量对产孢量影响：将豆粕和麸皮以4:1(m:m)的比例混合，以料水比1.0:0.3(m:m)制作固体培养基，分别添加以0.5％，1.0％，2.0％，3.0％，5.0％(V/m)的比例往培养基中添加种子液，37℃条件下发酵48h，测定产孢量如表5所示。
表5接种量对产孢量影响
⑤料水比对产孢量影响：将豆粕和麸皮以4:1(m:m)的比例混合，按照不同的料水比(1.0:0.1，1.0:0.2，1.0:0.3，1.0:0.4，1.0:0.5，m:m)制作发酵培养基，固定种子液接种量为1.0％(V:m)，在37℃下发酵48h，测定产孢量如表6所示。
表6料水比对产孢量影响
(3.4)利用响应面法分析确定最佳配方及发酵环境参数
(3.5)培养基优化结果验证试验用优化后的培养基组分配制发酵培养基，以5％接种量接入装液量为20mL的500mL三角瓶中，于30℃、180r/min条件下培养30h。发酵结束后测定发酵液中的芽孢量。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮65-75％，豆粕20-28％，NaCl 4-5％，CaCO3 1-2％，MnSO4·H2O 0.01-0.05％，MgSO4·7H2O 0.03-0.08％，培养基的pH为7.1-7.4。该培养基的优势是可显著地增加产孢量，减少生产成本。
发酵培养基配方及环境参数
结合单因素试验，响应面法分析和培养基优化结果验证得出巨大芽孢杆菌最佳发酵培养基配方及环境参数：
①培养基
优选为，麸皮70％，豆粕24％，NaCl 4.3％，CaCO3 1.6％，MnSO4·H2O 0.04％，MgSO4·7H2O0.06％。
②发酵环境参数pH7.1-7.4，接种量0.5-1.0％，培养温度30-37℃，培养时间48-60小时。
所述步骤(1)分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水，悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；在上述样品液中加入磷酸缓冲液，悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。
更具体地，分离、筛选的方法为：
从广东省东莞市常平镇黄泥塘农场采取500g土样，加入3L含0.01％吐温80的无菌水，震荡10min，静置半个小时，取上清液于20℃下4820rpm离心20min。弃上清液，保留沉淀物，加入30-50mL含0.01％吐温80的无菌水悬浮，液体于20℃下5000rpm离心5秒钟，去沉淀，将上清液倒入一个干无菌离心管中于20℃下4820rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用10mL的pH7.0磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取1mL上述样品液与9mL磷酸缓冲液悬浮混合，即为10倍稀释菌悬液。将稀释菌悬液置于75℃水浴加热15min，自然冷却后吸取100μL涂布于无氮培养基，30℃培养36-48小时获得含巨大芽孢杆菌T317的固氮菌菌落。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.0-1.4g，MgSO4·7H2O 0.6-1.2g，K2HPO4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeSO4·7H2O 0.001-0.005g，NaMO4·2H2O 0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.1-7.4。本发明的分离筛选培养基属于改良无氮培养基。
所述纯化保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到枯草芽孢杆菌T317单菌落。将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Col lection)，保藏号码为：CCTCCM2015753。
(2)纯化保存培养基的配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000ml，纯化保存培养基的pH为7.0-7.4。
所述步骤(3)培养基培养中，培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.0-1.4g，MgSO4·7H2O 0.6-1.2g，K2HPO4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeSO4·7H2O 0.001-0.005g，NaMO4·2H2O 0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，培养基的pH为7.1-7.4。
所述步骤(2)和步骤(3)之间还包括有以下步骤：
(S1)革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；
(S2)芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。
芽孢染色及其革兰氏染色
革兰氏染色和芽孢染色是两种细菌鉴定的常规方法，染色可以缩小鉴定范围。未经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，在显微镜下极难观察。革兰氏染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些菌种属于革兰氏阳性(G+)或者革兰氏阴性菌(G-)，用以分类鉴定。革兰氏阴性菌普遍存在安全隐患，在农业微生物应用过程中直接高温灭菌后舍弃结构特征。芽孢染色将菌体内的芽孢进行染色，可以直观观察芽孢的大小、位置、形状等特点，进一步缩小其鉴定范围。芽孢杆菌具有保质期长，易于存放的特点，在农业微生物产品具有广泛的应用基础。
1、革兰氏染色
(1)涂片：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。
(2)初染：滴加2-5滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
(3)媒染：先用新配的碘液(碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL)冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min，后水洗。
(4)脱色：除去残水后，滴加95％酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗。
(5)复染：滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干。
(6)镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。
2、芽孢染色
在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1～2滴石碳酸碱性复红染液，染色3min。用蒸馏水冲洗掉染液，风干后，将载玻片置于光学显微镜下观察。
如图2和图3所示，通过革兰氏染色和芽孢染色结果可以看出，巨大芽孢杆菌T317为革兰氏阳性菌，杆状，含有芽孢。
一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂，由所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法制备而成。
本发明的有益效果：
(1)本发明以巨大芽孢杆菌T317为出发菌株，对其固氮酶活性以及分泌生长素能力进行测定，发现菌株T317具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800-900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。
(2)通过单因素和正交试验进行固体发酵的培养基和培养条件的优化，以提高巨大芽孢杆菌T317产孢量。优化后的固体配料，能直接应用于巨大孢杆菌T317发酵，大大提高生产的优质化。作为一种新的微生物菌剂，巨大芽孢杆菌T317在未来的农业生产中，将有良好的应用前景。
(3)本发明针对巨大芽孢杆菌T317的发酵配方进行优化从而制备巨大芽孢杆菌T317菌剂，大大提高了产孢量，增强了巨大芽孢杆菌T317的应用效果，且能够有效地降低生产成本。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为分离得到的巨大芽孢杆菌T317单菌落在显微镜下放大10×100倍的菌落图。
图2为巨大芽孢杆菌T317革兰氏染色结果图。
图3为巨大芽孢杆菌T317芽孢染色结果图。
图4为巨大芽孢杆菌T317固氮酶活性测定结果图。
图5为巨大芽孢杆菌T317IAA比色效果图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本实施例的一种巨大芽孢杆菌T317，所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。所述巨大芽孢杆菌T317具有序列表NO.1的DNA序列。
所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为312.48mg/L。
一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，包括以下步骤：
(1)分离、筛选
选取含有巨大芽孢杆菌T317的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；
(2)纯化、保存
在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌T317单菌落，保存该单菌落备用；
(3)固体发酵培养
选取上述巨大芽孢杆菌T317，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1，接种量0.5％，培养温度为30℃，培养时间为60小时；
(4)菌剂制备
将发酵后产物烘干后打碎，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4亿/g，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮70％，豆粕24％，NaCl 4.3％，CaCO3 1.6％，MnSO4·H2O 0.04％，MgSO4·7H2O 0.06％，培养基的pH为7.1。
所述步骤(1)分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水，悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；在上述样品液中加入磷酸缓冲液，悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4 1.0g，NaCl 0.1g，FeSO4·7H2O 0.001g，NaMO4·2H2O 0.05g，蔗糖5g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.1。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例的所述步骤(2)和步骤(3)之间还包括有以下步骤：
(S1)革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；
(S2)芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。
具体地，革兰氏染色方法为：
(1)涂片：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。
(2)初染：滴加2-5滴草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
(3)媒染：先用新配的碘液(碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL)冲去残水，再用碘液覆盖涂面1min，后水洗。
(4)脱色：除去残水后，滴加95％酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗。
(5)复染：滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干。
(6)镜检：将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。
具体地，芽孢染色方法为：
在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在火灯上方来回过3次，以固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1～2滴石碳酸碱性复红染液，染色3min。
本实施例的其余内容与实施例1相同，这里不再赘述。
实施例3
本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为830nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为340mg/L。
步骤(3)固体发酵培养
选取上述巨大芽孢杆菌T317，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.2，接种量0.6％，培养温度为32℃，培养时间为58小时。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮70％，豆粕24％，NaCl 4.3％，CaCO3 1.6％，MnSO4·H2O 0.04％，MgSO4·7H2O 0.06％，培养基的pH为7.2。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.2g，MgSO4·7H2O 0.8g，K2HPO4 1.5g，NaCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.002g，NaMO4·2H2O 0.06g，蔗糖6g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.2。
本实施例的其余内容与实施例1或2相同，这里不再赘述。
实施例4
本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为885nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为375mg/L。
步骤(3)固体发酵培养
选取上述巨大芽孢杆菌T317，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.3，接种量0.8％，培养温度为35℃，培养时间为54小时。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮65％，豆粕28％，NaCl 4％，CaCO3 1％，MnSO4·H2O 0.01％，MgSO4·7H2O 0.03％，养基的pH为7.3。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.3g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO4 1.8g，NaCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.004g，NaMO4·2H2O 0.09g，蔗糖8g，琼脂19g，蒸馏水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.3。
实施例5
本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为400mg/L。
步骤(3)固体发酵培养
选取上述巨大芽孢杆菌T317，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.4，接种量1.0％，培养温度为37℃，培养时间为48小时。
所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮75％，豆粕20％，NaCl 5％，CaCO3 2％，MnSO4·H2O 0.05％，MgSO4·7H2O 0.08％，培养基的pH为7.4。
所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.4g，MgSO4·7H2O 1.2g，K2HPO4 2.0g，NaCl 0.4g，FeSO4·7H2O 0.005g，NaMO4·2H2O 0.1g，蔗糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.4。
本发明的巨大芽孢杆菌T317的16S rDNA序列菌种鉴定
细菌的个体微小，形态简单，传统方法鉴定细菌常根据它们在生理生化上的不同反应作为分类鉴定的主要依据。20世纪70年代后期以来，国际上通用的“正式的”或“官方的”细菌分类方法是以《伯杰氏鉴定细菌学手册》为依据。在生理生化鉴定中，通常会出现一个或者几个生理指标不符合该菌种所具有的独特性质，难以明确对该菌株进行鉴定。目前，细菌鉴定的方法通常将菌株的生理生化指标与分子生物学特性相结合，得出较为可靠地结论。其中DNA序列分析的16S rRNA基因进化发育系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴定常用的技术手段(Kim et al，2004；Prap et al，1997)。
核糖体16S rDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成。利用保守区域设计的通用引物，可以扩增出所有细菌的16S rDNA片段。16S rDNA序列分析技术的基本原理是从微生物样本中提取16S rDNA片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16S rDNA的序列信息，再与16S rDNA数据库的序列数据或者其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。利用16S rDNA片段保守区域设计的通用引物，不会对非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区 分不同的菌。因此通过对某菌株16S rDNA序列测定来获得最终鉴定证明的做法是被普遍认可的。
1、方法：
(1)PCR反应体系(25μL)：
(2)PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环，72℃延伸10min。使用ABI 3730xl DNA分析仪(应用生物系统公司)进行DNA测序。
2、测序结果
3、同源性分析
鉴定本细菌为Bacillus megaterium，巨大芽孢杆菌。
本发明由广东省引进创新创业团队项目资助研发，制得的巨大芽孢杆菌T317及其菌剂具有广阔的市场前景，经济效益高。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
<0001>
SEQUENCE LISTING
<110>东莞市保得生物工程有限公司
<120>一种巨大芽孢杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法
<130>0
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1405
<212>DNA
<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)T317的16s rDNA基因序列
<400>1
tgcaagtcga gcgaactgat tagaagcttg cttctatgac gttagcggcg gacgggtgag 60
taacacgtgg gcaacctgcc tgtaagactg ggataacttc gggaaaccga agctaatacc 120
ggataggatc ttctccttca tgggagatga ttgaaagatg gtttcggcta tcacttacag 180
atgggcccgc ggtgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcat 240
agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300
gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga 360
gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg aagaacaagt acaagagtaa 420
ctgcttgtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg 540
gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg 600
gaacttgagt gcagaagaga aaagcggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660
gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt tttggtctgt aactgacgct gaggcgcgaa 720
agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780
aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg 840
ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca 960
actctagaga tagagcgttc cccttcgggg gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg 1020
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag 1080
ttgccagcat ttagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140
ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg 1200
gtacaaaggg ctgcaagacc gcgaggtcaa gccaatccca taaaaccatt ctcagttcgg 1260
attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta 1380
acacccgaag tcggtggagt aaccg 1405

Claims (10)

1.一种巨大芽孢杆菌T317，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。
2.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T317，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T317具有序列表NO.1的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T317，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800-900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L。
4.权利要求1-3任意一项所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）分离、筛选
选取含有巨大芽孢杆菌T317的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；
（2）纯化、保存
在培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌T317单菌落，保存该单菌落备用；
（3）固体发酵培养
选取上述巨大芽孢杆菌T317单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4，接种量0.5-1.0%，培养温度为30-37℃，培养时间为48-60小时；
（4）菌剂制备
将发酵后产物烘干后打碎，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-10亿/g，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。
5.根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（3）固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮65-75份，豆粕20-28份，NaCl4-5份，CaCO3 1-2份，MnSO4·H2O 0.01-0.05份，MgSO4·7H2O 0.03-0.08份，培养基的pH为7.1-7.4。
6.根据权利要求5所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（3）固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮70份，豆粕24份，NaCl 4.3份，CaCO3 1.6份，MnSO4·H2O 0.04份，MgSO4·7H2O 0.06份。
7.根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（1）分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水，悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；在上述样品液中加入磷酸缓冲液，悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。
8.根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.0-1.4g，MgSO4·7H2O 0.6-1.2g，K2HPO4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeSO4·7H2O 0.001-0.005g，NaMO4·2H2O 0. 05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.1-7.4。
9.根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）之间还包括有以下步骤：
（S1）革兰氏染色：将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；
（S2）芽孢染色：将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。
10.一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂，其特征在于：由权利要求4-9任意一项所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法制备而成。
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