CN109182189A - 一株高产的氧化微杆菌及其应用 - Google Patents

一株高产的氧化微杆菌及其应用 Download PDF

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    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom

Abstract

本发明提供一株高产的氧化微杆菌及其应用，涉及生物防治植物病害领域。所述菌株为氧化微杆菌(microbacterium oxydans)菌株AL10206，保藏编号为CGMCC No.14678。发明还提供了一种含有所述氧化微杆菌菌株AL10206的生物防治制剂及其制备方法。本发明的氧化微杆菌菌株具有生长速度快、作用谱广、产生率大，抗逆性强，在小麦叶片、穗能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该氧化微杆菌菌株AL10206制备的生物防治制剂，可以作为防治小麦赤霉病的生物农药。

Description

一株高产的氧化微杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物防治植物病害领域，具体涉及一株高产的氧化微杆菌及其应用。
背景技术
近年来小麦赤霉病一直都呈现大爆发趋势，国内小麦主产区大致分作冬麦区和春麦区。数据显示，2016年秋冬河南、山东、安徽、河北、江苏五大小麦主产区播种面积约2.48亿亩。据悉，冬小麦面积约占国内小麦总面积的85％，五大主产区面积占比达68％左右、产量占比超过75％。五大小麦主产区赤霉病防控非常关键。
小麦赤霉病被称为小麦“癌症”，主要发生在长江中下游冬麦区、东北春麦区东部及华南冬麦区，近年来随着气候和耕作制度的变化，流行区域不断扩大。数据显示，国内小麦赤霉病2005～2010年年均发生面积6000万亩左右，2011～2016年均发生面积上升到8000万。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一株高产的氧化微杆菌及其应用，所述的氧化微杆菌菌株不仅生长速度快、作用谱广，储存时间长，且具有在小麦叶片能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
本发明氧化微杆菌菌株AL10206的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用NA培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL；
(2)实验室液体培养采用NB培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐溶液的质量比为1∶1.8；所述固料由质量比为60∶10∶30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，0.05％氯霉素，1.3％轻质碳酸钙，剩余为水；
(4)大量发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明所述生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将氧化微杆菌移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3-5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下恒温振荡培养3-5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-32℃、相对湿度80％以上的发酵室中发酵培养8-9d。
优选的，本发明所提供的菌株为氧化微杆菌(microbacterium oxydans)菌株AL10206，是从潍坊北部渤海滩涂潮间带的土壤上分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14678。其具有以下生物学特性：黄色菌落，表面光滑半透明，边缘整齐，对光看有光泽，革兰氏阳性杆状菌，且不能在厌氧条件下生长。
优选的，本发明所述的氧化微杆菌菌株AL10206分离方法为：
(1)氧化微杆菌株的分离：取潮间土壤，先用75％的酒精局部处理1min，再在超净工作台上用紫外灯处理20min后，用灭菌刀片切开处理部位，用接种针挑取少量土壤刮取物，在NA平板上划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化氧化微杆菌株，转至NA试管斜面保存备用；
(2)小麦赤霉病高效拮抗氧化微杆菌株的筛选：
①初筛：采用对峙培养法，制NA平板，用打孔器在氧化微杆菌、小麦赤霉病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，26℃恒温培养，逐日观察氧化微杆菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的氧化微杆菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的氧化微杆菌株，进行盆栽防治试验和田间试验，选取一株高产的氧化微杆菌。
优选的，所述对小麦赤霉病的生物防治方法包括向发病的小麦施用上述氧化微杆菌菌株AL10206或者上述生物防治粉剂或液体制剂。
本发明提供一株高产的氧化微杆菌及其应用，与现有技术相比优点在于：
(1)本发明所述的氧化微杆菌菌株AL10206，能够产生抗逆性很高的厚垣孢子，对小麦赤霉病具有很高防治效果。
(2)本发明的氧化微杆菌菌株具有生长速度快、作用谱广、抗逆性强，在小麦叶片能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
(3)由该氧化微杆菌菌株AL10206制备的生物防治制剂，可以作为防治小麦病害的生物农药，并且在防治小麦赤霉病的同时，对作物无不良影响，安全环保。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
对本发明氧化微杆菌菌株进行鉴定，其鉴定结果如下所示：
(1)微生物学特性：黄色菌落，表面光滑半透明，边缘整齐，对光看有光泽，革兰氏阳性杆状菌；媒介酶试验阳性，氧化酶试验阴性；淀粉水解试验阴性，V-P试验阴性，明胶液化试验阴性，硝酸盐还原试验阳性；糖醇类发酵试验：D-葡萄糖阴性、D-甘露醇阴性、甘露糖阳性、乳糖阴性、蔗糖阳性、阿拉伯糖阴性、山梨醇阴性、鼠李糖阴性；赖氨酸脱羧酶试验阴性，脲酶试验阴性。
(2)分子生物学特性
该菌株的rRNA基因序列测定结果如下：
GCTCCTAAGGGTTAGGTACCGGCTTCGGGGGTTACCGACTTTCAGGAGTTGACGGGGGGT 60
GTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCACCGGTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACT 120
CCCACTTCATGAGGTCGAGTTGCAGACCTCAATCCAAAGTGGGACCGGCTTTTTGGGATT 180
CGCTCCACCTCGGGGTATTGCACCCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCA 240
AGACATAGGGGGCATGATGATTTGACGTCCTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCT 300
GTATCCCAAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACATAAAAGGAGGGTTGCGCTCGTTG 360
CGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACAACAACCATGCACCACCTGTTTAC 420
GAGTGTCCGAAGAGTTGACCATTTCTGGCCCGTTCACGTAGATATCAAGCCTTGGTGAGG 480
TTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTGGTGCGGGTCCCCGTCAAT 540
TCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTG 600
CGTCACGGAATCCGTGGAATGGACCCCACAACTAGTTCCCAACGTTTACTGGGGTGGACT 660
ACCAGGGTATCTAAGCCTGTTTGCTCCCCACCCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACGGCC 720
CAGAGATCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTCCACCGCTACACC 780
AGGAATTCCAATCTCCCCTACCGCACTCTAGTCTGCCCGTACCCACTGCAGGCCGGAGGT 840
TGAGCCTCCGGATTTCACAGCAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATA 900
ATTCCGGATAACGCTTGCGCCTTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGC 960
GCTTTTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTAAAAGAGGTTTACAACCCG 1020
AAGGCCGTCATCCCTCACGTGGCGTTGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTC 1080
CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACC 1140
CTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGACGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATA 1200
GGCCGCGAGCCCATCCCCAACCGAAATTCTTTCCAGACGCAGACCATGCGATCACGTCAC 1260
ATATCCAGTATTAGACGCCGTTTCCAGCGCTTATCCCAGAGTCAGGGGCAGGTTGCTCAC 1320
GTGTTACTCACCCGTTCGCCACTGACCCCACAGAGCAAGCTCCGTCTCA 1369
实施例2：
对本发明氧化微杆菌菌株AL10206进行发酵，发酵步骤包括：
(1)菌种种子液培养：将氧化微杆菌菌株AL10206从试管斜面中挑取少量孢子，移至NB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液；
(2)固体生产菌种的培养：将种子液按15％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；期间维持相对湿度80％以上；
(3)大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6体积比接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，期间要翻动3～5次，增加氧气量，即可得到氧化微杆菌菌原粉，菌活为300-500亿/克；
(4)可湿性粉剂：原菌粉(菌活400亿/克)5％，CMC 0.5％，拉开粉3％，十二烷基磺酸钠8％，葡萄糖2％，白炭黑1％，其余为凹凸棒土。
其中该可湿性粉剂的菌活为20亿/克。
NB培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。
固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.9的比例配制。其中所述固料的组分及重量比为：玉米面75％，豆粕10％，麸皮15％；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。
实施例3：
田间药效试验：
1试验目的
小麦赤霉病是小麦的主要病害，对农业生产影响很大。根据我们筛选的氧化微杆菌产生菌菌株AL10206参照实施例1进行原粉发酵后制成20亿活孢子/克氧化微杆菌可湿性粉剂防治小麦赤霉病田间药效试验，为确定药剂防治小麦赤霉病的最佳田间使用剂量、药剂药效、作用特点、持效期、药剂对作物及非靶标有益生物的影响和安全合理的使用技术提供数据。
2试验条件
2.1试验对象、作物和品种的选择
试验对象：小麦赤霉病。
试验作物：小麦，品种为农科2011。
2.2作物栽培及环境条件
试验田位于安徽省农科院基地，试验地水肥条件较好，栽培管理条件一致，符合试验要求。
3试验设计和安排
3.1药剂
3.1.1试验药剂
20亿/克氧化微杆菌(实施例2制备)可湿性粉剂。
3.1.2对照药剂
70％甲基硫菌灵，浙江威尔达化工有限公司；另设空白对照。
3.1.3药剂用量与处理编号
表1供试药剂试验设计
3.2小区安排
3.2.1小区面积和重复
小区面积(或植株数):10平方米。
重复次数:4次。
3.3施药方法
3.3.1使用方法
均匀喷雾，先处理试验药剂，从低浓度到高浓度依次喷雾，然后处理对照药剂，换药剂时清洗喷雾器。
3.3.2施药器械
浙江台州市广丰塑业有限公司生产的3Wbs-16型手动喷雾器，工作压力为0.2-0.3mpa.。
3.3.3施药时间和次数
本试验于2016年6月4日、6月11日施药，共2次。
3.3.4使用容量
施药量为675公斤/公顷。
3.3.5防治其他病虫害的药剂资料
试验前10天及试验期间没有进行其他病虫草害的药剂防治。
4调查、记录和测量方法
4.1气象及土壤资料
4.1.1气象资料
第一次施药当日，阴，气温21.50℃-27.50℃，平均相对湿度92％；第二次施药当日，阴，气温24.10-29.60℃，平均相对湿度85％。
4.1.2土壤资料
试验地地势平坦，土壤类型：黄化青紫泥；有机质含量(％)：2.1；pH值：6.8。
4.2调查方法、时间和次数
4.2.1调查时间和次数
本试验共计调查3次，分别是2014年6月4日调查药前病情基数，6月11日调查一次药后7天试验结果，6月21日调查二次药后10天结果。
4.2.2调查方法
根据“农药田间药效试验准则(一)—杀菌剂防治小麦赤霉病”的规定进行，每试验小区采用随机五点取样，每点调查150穗，以感染穗面积占整个穗面积的百分率来分级，记录病害等级和病穗数。病害分级标准如下：
0级：全穗无病；
1级：感染病穗面积占全穗面积的四分之一以下；
3级：感染病穗面积占全穗面积的四分之一至二分之一；
5级：感染病穗面积占全穗面积的二分之一至四分之三；
7级：感染病穗面积占全穗面积的四分之三以上；
4.2.3药效计算方法
根据调查结果，按照下面(1)、(2)公式计算病情指数和防效。试验数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。
式中：
CK0——空白对照区施药前病情指数；
CKl——空白对照区施药后病情指数；
PT0——药剂处理区施药前病情指数；
PTl—药剂处理区施药后病情指数。
4.3对作物的直接影响
试验期间观察试验药剂对作物的有益或不良影响。
5结果与分析
表2为2亿活孢子/克氧化微杆菌可湿性粉剂防治小麦赤霉病田间药效试验结果(处理防效为各重复平均值；大写字母表示1％差异显著性，小写字母表示5％差异显著性)
表2
2.田间试验数据采用邓肯氏新复极差法(DMRT)进行统计分析。
结论：田间试验结果表明，2亿活孢子/克氧化微杆菌可湿性粉剂在每公顷制剂用量2812.5克和3750克下对小麦赤霉病具有较好的防治效果(与对照药剂400克/升嘧霉胺悬浮剂937.5毫升/公顷处理相当)，可以用来防治小麦赤霉病。
药剂防治技术要点：使用时应选在小麦赤霉病初发期、病情指数较低时使用，使用时应叶片和植株整株均匀喷雾(以湿润而不滴水为度)，建议制剂用量为2812.5-3750克/公顷，兑水675升。
试验期间未发现对作物和其他有益生物有不良影响。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
<110> 宁国市百立德生物科技有限公司
<120> 一株高产氧化微杆菌及其应用
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 614
<212> DNA
<213> 氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）菌株AL10206的rRNA基因序列
<400> 1
GCTCCTAAGGGTTAGGTACCGGCTTCGGGGGTTACCGACTTTCAGGAGTTGACGGGGGGT 60
GTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCACCGGTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACT 120
CCCACTTCATGAGGTCGAGTTGCAGACCTCAATCCAAAGTGGGACCGGCTTTTTGGGATT 180
CGCTCCACCTCGGGGTATTGCACCCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCA 240
AGACATAGGGGGCATGATGATTTGACGTCCTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCT 300
GTATCCCAAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACATAAAAGGAGGGTTGCGCTCGTTG 360
CGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACAACAACCATGCACCACCTGTTTAC 420
GAGTGTCCGAAGAGTTGACCATTTCTGGCCCGTTCACGTAGATATCAAGCCTTGGTGAGG 480
TTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTGGTGCGGGTCCCCGTCAAT 540
TCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTG 600
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ACCAGGGTATCTAAGCCTGTTTGCTCCCCACCCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACGGCC 720
CAGAGATCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTCCACCGCTACACC 780
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TGAGCCTCCGGATTTCACAGCAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATA 900
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AAGGCCGTCATCCCTCACGTGGCGTTGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTC 1080
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GTGTTACTCACCCGTTCGCCACTGACCCCACAGAGCAAGCTCCGTCTCA 1369

Claims (8)

1.一株高产的氧化微杆菌，其特征在于，所述高产的氧化微杆菌菌株AL10206，菌株的保藏编号为CGMCC No.14678。
2.根据权利要求2所述的一株高产的氧化微杆菌，其特征在于：所述氧化微杆菌为革兰氏阳性杆状菌，其菌落为黄色，表面光滑半透明，边缘整齐，对光看有光泽，且厌氧条件下不生长。
3.一株高产的氧化微杆菌的应用，其特征在于：所述高产的氧化微杆菌主要用于小麦赤霉病的防治。
4.根据权利要求3所述的一株高产的氧化微杆菌的应用，其特征在于：所述氧化微杆菌可将其制备成生物防治制剂作用于小麦。
5.根据权利要求3所述的一株高产的氧化微杆菌的应用，其特征在于：所述生物防治方法包括向发病的小麦施用上述氧化微杆菌菌株AL10206或者上述生物防治粉剂或液体制剂。
6.根据权利要求3所述的一株高产的氧化微杆菌的应用，其特征在于，所述生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将氧化微杆菌移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3-5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下恒温振荡培养3-5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-32℃、相对湿度80％以上的发酵室中发酵培养8-9d。
7.根据权利要求3所述的一株高产的氧化微杆菌的应用，其特征在于，所述固体培养基配方为：固料和无机盐溶液质量比1∶1.8组成，所述固料由质量比为60∶10∶30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，0.05％氯霉素，1.3％轻质碳酸钙，剩余为水。
8.根据权利要求3所述的一株高产的氧化微杆菌的应用，其特征在于，所述大量发酵培养基同固体培养基相同。
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