CN110229766B - 氧化微杆菌及其在降解有机污染物中的应用 - Google Patents

氧化微杆菌及其在降解有机污染物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株氧化微杆菌及其在降解有机污染物中的应用，所述的应用方法为：将氧化微杆菌接种至无机盐培养液中，加入有机污染物，在25‑35℃、160rpm、pH＝6‑8条件下进行降解反应，实现对有机物的降解；本发明氧化微杆菌能够降解氯苯。氧化微杆菌在好氧条件下可降解初始浓度500‑2000μmol/L的氯苯，去除率为100％，平均降解速度高达334.16549μmol/(L·h)。厌氧条件下，对初始浓度为500‑1500μmol/L的氯苯，去除率也为100％。本发明氧化微杆菌能实现工业废水废气中氯苯的高效净化，污染低，容易推广，净化成本低。

Description

氧化微杆菌及其在降解有机污染物中的应用
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株具有氯苯高效降解能力的氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)及其在降解有机污染物中的应用。
背景技术
氯苯是最简单的氯代芳烃，不溶于水，物理化学性质稳定，难以自然降解,广泛应用于工农业生产，基础有机溶剂及有机化合物的合成，同时也是医药、染料、农药和工程塑料等领域的重要中间体。氯苯对动物皮肤、结膜和呼吸器官会产生刺激作用，抑制神经中枢，损害肝脏和肾脏。氯苯还具“三致”效应。基于以上危害性，氯苯已被美国环境保护署(EPA)列为优先污染物。我国于1989年4月也将氯苯列入了优先污染物“黑名单”。
近年来，国内外研究者针对氯苯的去除做了大量的研究工作，探究出了一些具体的处理方法包括催化氧化、电化学、超声波降解、吸附等物理化学方法，但处理条件苛刻、投资高、很难规模处理，较适用于预处理或后处理。生物处理法因具有处理效果显著，易操作，成本低，无二次污染等优点，近年来被广泛应用。常见的生物处理工艺有生物过滤、生物滴滤、生物洗涤、膜生物反应器。这些生物技术解决了生物反应器的配置问题，但生物法处理氯苯的核心问题——高效氯苯降解微生物的筛选。从上世纪80年代至今，国内外大量学者从污泥、水体、土壤中筛选出一些氯苯降解微生物，包括Psudomonas sp.strain WR1306、P.putida&Bacillus sp.、Escherichiahermanii、Pseudomonas sp.strain JS150、Ralstonia sp.strain JS705、Aeromonas sp.、Pseudomonassp.strainFY01&FY04、Bacillussp.StrainFY02&FY03、Pseudononassp.Nov.LP01等，上述微生物可在好氧或厌氧条件下降解该污染物，但不能同时在好氧和厌氧条件下保持高效性，而且降解率低(好氧和厌氧条件下，18d内对氯苯的降解率分别为50％和37.2％)，不符合工业的高效率生产的要求。而厌氧降解又是氯苯类化合物重要的降解方式。许多在好氧条件下难以降解的化合物在厌氧条件下能变得容易降解。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一株可在好氧、厌氧及兼性条件下快速、高效、耐受能力强的氯苯降解氧化微杆菌并提供其在实际应用中的最优条件。本发明的氧化微杆菌在好氧条件下对氯苯的平均降解速度高达334.16549μmol/(L·h)；在微氧条件下对氯苯的平均降解速度高达157.496μmol/(L·h)。该细菌生长条件温和，易扩大培养，能在好氧、厌氧及兼性条件下降解氯苯，在含氯苯的工业废水废气的绿色高效净化中具有良好的应用前景。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一株具有兼性厌氧降解氯苯等有机污染物能力的新菌株--氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)ZJUTCB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018491，保藏日期2018年7月20日，地址：中国-武汉-武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述氧化微杆菌在降解有机污染物中的应用，所述的应用方法为：将氧化微杆菌接种至无机盐培养液中，加入有机污染物，在25-35℃(优选30℃)、160rpm、pH＝6-8(优选pH＝7)条件下进行降解反应，实现对有机物的降解；所述无机盐培养液组成：0.66g/L(NH4)2SO4，0.11g/L MgSO4，0.12g/L K2SO4，8.8g/L Na2HPO4，4.56g/LNaH2PO4，1.25mL/L微量元素溶液，0.62mL/L维生素溶液，溶剂为去离子水，pH＝7；所述微量元素溶液配方：1.5g/L氨基三乙酸，3g/L MgSO4，0.5g/L MnSO4·H2O，1g/L NaCl，0.1g/LFeSO4·7H2O，0.1g/L CaCl2·2H2O，0.1g/L CoCl2·6H2O，0.13g/L ZnCl2，0.01g/L CuSO4·5H2O，0.01g/L AlK(SO4)2·12H2O，0.01g/L H3BO3，0.025g/L Na2MoO4，0.024g/L NiCl2·6H2O，0.025g/L Na2WO4·2H2O，溶剂为去离子水；所述维生素溶液配方：0.2g/L生物素，0.2g/L叶酸，1g/L盐酸吡哆辛，0.5g/L核黄素，0.5g/L硫胺，0.5g/L烟酸，0.5g/L泛酸，0.01g/LB-12，0.5g/L对氨基苯甲酸，0.5g/L硫辛酸，溶剂为去离子水。所述有机污染物为氯苯。进一步，所述氧化微杆菌ZJUTCB-2接种量为OD600＝0.03，所述有机污染物加入终浓度为500～2000μmol/L，优选1000μmol/L。
本发明所述氧化微杆菌接种至无机盐培养液前先进行扩大培养，然后以种子液的形式接种至无机盐培养液进行驯化培养；将驯化后的菌液再接种至无机盐培养液至OD600＝0.03进行降解反应。所述扩大培养方法为：将氧化微杆菌ZJUTCB-2接种至LB培养基，30℃，160rpm培养至对数期，将培养液离心，沉淀用无菌无机盐培养液洗涤3次后重悬，即为种子液；将种子液接种至含无机盐培养液的血清瓶中至OD600＝0.03，加入终浓度1000μmol/L氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化168h，获得驯化后的菌液。
进一步，所述无机盐培养液先通氮气30min制成微氧无机盐培养液，所述氮气通入速率为40mL/min。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明氧化微杆菌ZJUTCB-2能够降解氯苯等有机污染物。氧化微杆菌ZJUTCB-2在好氧条件下可降解初始浓度500-2000μmol/L的氯苯，去除率为100％，平均降解速度高达334.16549μmol/(L·h)。微氧条件下，对初始浓度为500-1500μmol/L的氯苯，去除率也为100％。本发明氧化微杆菌ZJUTCB-2能实现工业废水废气中氯苯的高效净化，污染低，容易推广，净化成本低。
附图说明
图1为Microbacterium oxydans.ZJUTCB-2的透射电镜图。
图2为Microbacterium oxydansZJUTCB-2在驯化期降解氯苯的浓度变化图。
图3为Microbacterium oxydansZJUTCB-2的生长曲线图。
图4为好氧条件下Microbacterium oxydansZJUTCB-2降解不同浓度氯苯图。
图5为微氧条件下Microbacterium oxydansZJUTCB-2降解不同浓度氯苯图。
图6为好氧和微氧条件对ZJUTCB-2降解不同浓度氯苯的最终OD对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：Microbacterium oxydans ZJUTCB-2的分离纯化、鉴定及保藏
1.菌株ZJUTCB-2的筛选
菌株ZJUTCB-2是从杭州七格污水处理厂的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阳性菌。具体步骤如下：
在340mL血清瓶中加入200ml无机盐培养液，通入高纯氮气(40mL/min)30min，以去除无机盐培养液中的溶解氧和血清瓶顶部的空气，加入20mL活性污泥和987μmol/L的氯苯，在30℃，160rpm进行富集培养。待氯苯的浓度为初始浓度的50％时，从中取出20mL富集液加至200mL新鲜的无机盐培养液中，再加入987μmol/L氯苯，30℃，160rpm厌氧培养至氯苯的浓度为初始浓度的50％。重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液梯度稀释涂布至无机盐固体培养基，加入1000μmol/L氯苯作为唯一碳源。选择单菌落在LB固体培养基中划线分离纯化至有明显的单一纯种菌落。将单菌落接种至LB培养基，30℃，160rpm培养至对数期，将培养液离心，沉淀用无菌无机盐培养液洗涤3次后重悬，即为种子液；将种子液以细胞干重计39mg/L的接种量接种至以终浓度987μmol/L氯苯作为唯一碳源及能源的无机盐培养基中，在30℃，160rpm培养，培养过程中通过气相测培养液中的氯苯浓度，得到目的菌株ZJUTCB-2，通过透射电镜确定其外部形态(图1)。
无机盐培养液配方：(NH4)2SO40.66g/L，MgSO40.11g/L，K2SO40.12g/L，Na2HPO48.8g/L，NaH2PO44.56g/L，微量元素溶液1.25mL/L，维生素溶液0.62mL/L，溶剂为去离子水，pH＝7。
微量元素溶液配方：1.5g/L氨基三乙酸，3g/L MgSO4，0.5g/L MnSO4·H2O，1g/LNaCl，0.1g/L FeSO4·7H2O，0.1g/L CaCl2·2H2O，0.1g/L CoCl2·6H2O，0.13g/L ZnCl2，0.01g/L CuSO4·5H2O，0.01g/L AlK(SO4)2·12H2O，0.01g/L H3BO3，0.025g/L Na2MoO4，0.024g/L NiCl2·6H2O，0.025g/L Na2WO4·2H2O，溶剂为去离子水。
维生素溶液配方：0.2g/L Biotin(生物素)，0.2g/L Folic acid(叶酸)，1g/LPyridoxine HCl(盐酸吡哆辛)，0.5g/L Riboflavin(核黄素)，0.5g/L Thiamine(硫胺)，0.5g/L Nicotinic acid(烟酸)，0.5g/L Panthotenic acid(泛酸)，0.01g/L B-12，0.5g/LP-aminobenzoic acid(对氨基苯甲酸)，0.5g/L Thioctic acid(硫辛酸)，溶剂为去离子水。先将无机盐培养液110℃灭菌40min后，在超净台中加入微量元素溶液和维生素溶液，于室温放置2天，确定无杂菌生长。
无机盐固体培养基是在无机盐培养液中添加18g/L琼脂。
LB固体培养基配方：5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨，18g/L琼脂，溶剂为去离子水，pH＝7。
上述所有培养液需要经高温高压灭菌后使用，微量元素溶液和维生素溶液使用前经0.22μm滤膜过滤后于超净工作台内转移到无菌无机盐培养液中。
分离纯化并鉴定的菌株ZJUTCB-2有三种保藏形式：(1)4℃LB斜面，每3个月需进行转接；(2)-80℃，30％甘油与LB菌液1:1混合；(3)菌种保藏中心冷冻干燥长期保存。
该菌在应用于氯苯废水/废气处理之前需活化，活化方法为：将低温保存的菌样常温解冻，涂布/划线于LB固态培养基中，挑单菌落转接2-3次。
2.菌株ZJUTCB-2的鉴定
通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株ZJUTCB-2为Microbacterium oxydans，具体步骤如下：
采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司)提取和纯化菌株的DNA，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的DNA进行PCR扩增，引物分别为7F(CAGAGTTTGATCCTGGCT)和1540R(AGGAGGTGATCCAGCCGCA)，PCR反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将PCR产物纯化回收后进行测序(上海生物工程股份有限公司)，测序结果(见SEQ IDNO.1所示)上传至NCBI，获得登录号MK57118，同时同NCBI中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Microbacterium属，将该菌株ZJUTCB-2命名为氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans)ZJUTCB-2，并于2018年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M 2018491。
实施例2：Microbacterium oxydansZJUTCB-2在驯化阶段降解氯苯的浓度变化
在最佳环境因子条件(培养液pH＝7，培养温度30℃)下，考察了菌株ZJUTCB-2在好氧条件下，对初始浓度1000μmol/L氯苯的降解性能和细菌生长情况。结果表明，菌株能完全降解1000μmol/L的氯苯，氯苯被完全降解后，细菌ZJUTCB-2的质量也明显增加，此时菌液呈浑浊状。具体实施步骤如下：
配制无机盐培养液(同实施例1)，用氢氧化钠或稀盐酸溶液调试pH至7，分装于平均体积为340mL的血清瓶中，每瓶50mL。
将菌株ZJUTCB-2接种至LB培养基，在30℃，160rpm的摇床中培养至对数期，将培养液离心，沉淀用无菌无机盐培养液洗涤3次后重悬，即为种子液。
取种子液接种至含无机盐培养液的血清瓶中至OD600＝0.03，分别加入1000μmol/L氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化144h。定时测定血清瓶中氯苯浓度(同实例1)，绘制降解曲线，结果见图2，生长曲线见图3。
实施例3：Microbacterium oxydansZJUTCB-2在好氧条件下对不同浓度氯苯的降解
在最佳环境因子条件(培养液pH＝7，培养温度30℃)下，考察了菌株ZJUTCB-2在好氧条件下，对初始浓度700-1500μmol/L氯苯的降解性能和细菌生长情况。结果表明，菌株能完全降解700-1500μmol/L的氯苯，氯苯被完全降解后，细菌ZJUTCB-2的质量也明显增加，此时菌液呈浑浊状。具体实施步骤如下：
配制无机盐培养液(同实施例1)，用氢氧化钠或稀盐酸溶液调试pH至7，分装于平均体积为340mL的血清瓶中，每瓶50mL。
种子液的制备同实施例2。取种子液接种至含无机盐培养液的血清瓶中至OD600＝0.03，加入1000μmol/L氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化144h至氯苯完全降解。取驯化后的菌液分装于含有50mL无机盐培养液的340mL血清瓶中，菌液接种量以OD600＝0.03为标准，加入氯苯作为唯一碳源，并使其浓度分别达到700，1000，1500μmol/L，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后置于30℃，160rpm摇床中培养，以相同条件下不加菌株ZJUTCB-2为对照。定时测定血清瓶中氯苯浓度，绘制降解曲线，结果见图4。
图4为好氧条件下，菌株对不同初始浓度氯苯的降解。结果表明，当氯苯浓度低于(包括)1000μmol/L时，ZJUTCB-2可以在9h内快速降解完添加的底物，同时细菌质量也明显增加，底物的浓度逐渐降低和细菌的大量繁殖。随着底物浓度的增加，完全降解底物所需要的时间越长；当氯苯的浓度增高至1500μmol/L时，该菌初始6h对底物的降解较慢，这是因为高浓度的底物抑制了微生物的生长，使其生长受到限制，ZJUTCB-2不能在这段时间内大量繁殖，随后底物对细菌的抑制作用逐渐解除，菌快速降解氯苯。氯苯降解过程中大部分底物被用于微生物自身生长。
实施例5：Microbacterium oxydansZJUTCB-2在微氧条件下对不同浓度氯苯的降解
在最佳环境因子条件(培养液pH＝7，培养温度30℃)下，考察了菌株ZJUTCB-2在微氧条件下，对初始浓度700～1500μmol/L氯苯的降解性能和细菌生长情况。结果表明，菌株能完全降解700～1500μmol/L氯苯。氯苯被完全利用后，细菌ZJUTCB-2的质量也明显增加，具体实施步骤如下：
种子液的制备同实施例2。在50mL无机盐培养液中通入以40mL/min的速度氮气30min，即为微氧无机盐培养液。取种子液接种至微氧无机盐培养液中至OD600＝0.03，加入1000μmol/L氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160rpm摇床驯化至完全降解。取驯化后的菌液分装于含有50mL微氧无机盐培养液的340ml的血清瓶中，使得OD600＝0.03，加入氯苯作为唯一碳源，并使其浓度分别达到700，1000，1500μmol/L，置于30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定血清瓶中的氯苯浓度，绘制菌株对于不同初始浓度氯苯的降解曲线，结果见图5所示。
图5为微氧条件下，菌株对不同初始浓度氯苯的降解。结果表明，当氯苯浓度低于(包括)1000μmol/L时，ZJUTCB-2可以在16h内快速降解所添加的底物，同时细菌的质量也明显增加。随着底物浓度的增加，完全降解底物所需要的时间越长。
实施例6：好氧和微氧条件对Microbacterium oxydansZJUTCB-2降解不同浓度氯苯最终OD对比
在好氧和微氧条件对不同浓度的氯苯的降解时，对比菌液最终OD值的变化。
在最佳环境因子条件(培养液pH＝7，培养温度30℃)下，考察了OD初始＝0.03的ZJUTCB-2在好氧和微氧条件下分别在浓度为700、1000、1500μmol/L的氯苯的降解完全后测得的菌液OD值。具体实施如下：
种子液的制备和驯化过程同实施例2，将驯化后的菌液在无菌条件下加入到无机盐培养液中使其OD初始＝0.03，随后加入浓度为700、1000、1500μmol/L氯苯作为唯一碳源，按实施例3和4所述好氧和微好氧条件培养，定时检测细菌对氯苯的降解情况直至氯苯被完全降解后，用分光光度计测得最终OD，结果见图6所示。
在初始OD保持一致的情况下，厌氧条件下菌液的最终OD比好氧条件下小，且厌氧条件下低浓度底物中细菌的增长量并不明显。这是由于厌氧条件相对于好氧条件，菌种生长受到抑制，降解速度比较缓慢，且在厌氧条件下，ZJUTCB-2受到高浓度氯苯的抑制作用更为明显。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 氧化微杆菌及其在降解有机污染物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1468
<212> DNA
<213> 氧化微杆菌(Microbacteriumoxydanssp.)
<400> 1
ctggctcagg atgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg gtgaacacgg 60
agcttgctct gtgggatcag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagcaac ctgcccctga 120
ctctgggata agcgctggaa acggcgtcta atactggata tgtgacgtga tcgcatggtc 180
tgcgtctgga aagaatttcg gttggggatg ggctcgcggc ctatcagctt gttggtgagg 240
taatggctca ccaaggcgtc gacgggtagc cggcctgaga gggtgaccgg ccacactggg 300
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg 360
caagcctgat gcagcaacgc cgcgtgaggg acgacggcct tcgggttgta aacctctttt 420
agcagggaag aagcgaaagt gacggtacct gcagaaaaag cgccggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagagctc 540
gtaggcggtt tgtcgcgtct gctgtgaaat ccggaggctc aacctccggc ctgcagtggg 600
tacgggcaga ctagagtgcg gtaggggaga ttggaattcc tggtgtagcg gtggaatgcg 660
cagatatcag gaggaacacc gatggcgaag gcagatctct gggccgtaac tgacgctgag 720
gagcgaaagg gtggggagca aacaggctta gataccctgg tagtccaccc cgtaaacgtt 780
gggaactagt tgtggggtcc attccacgga ttccgtgacg cagctaacgc attaagttcc 840
ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa 900
gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata 960
tacgagaacg ggccagaaat ggtcaactct ttggacactc gtaaacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgtt 1080
ctatgttgcc agcacgtaat ggtgggaact catgggatac tgccggggtc aactcggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtct tgggcttcac gcatgctaca 1200
atggccggta caaagggctg caataccgtg aggtggagcg aatcccaaaa agccggtccc 1260
agttcggatt gaggtctgca actcgacctc atgaagtcgg agtcgctagt aatcgcagat 1320
cagcaacgct gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc aagtcatgaa 1380
agtcggtaac acctgaagcc ggtggcctaa cccttgtgga gggagccgtc gaaggtggga 1440
tcggtaatta ggactaagtc gtaacaag 1468

Claims (8)

1.氧化微杆菌（Microbacterium oxydans）ZJUTCB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018491，保藏日期2018年7月20日，地址：中国-武汉-武汉大学，430072。
2.如权利要求1所述氧化微杆菌ZJUTCB-2在降解有机污染物中的应用，其特征在于所述有机污染物为氯苯。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将氧化微杆菌ZJUTCB-2接种至无机盐培养液中，加入有机污染物，在30℃、160rpm、pH=6-8条件下进行降解反应，实现对有机污染物的降解；所述无机盐培养液组成：0.66g/L (NH4)2SO4，0.11 g/L MgSO4，0.12 g/LK2SO4，8.8 g/L Na2HPO4，4.56 g/L NaH2PO4，1.25 mL/L微量元素溶液，0.62 mL/L维生素溶液，溶剂为去离子水，pH=7；所述微量元素溶液配方：1.5 g/L氨基三乙酸，3 g/L MgSO4，0.5g/L MnSO4•H2O，1 g/L NaCl，0.1g/L FeSO4•7H2O，0.1 g/L CaCl2•2H2O，0.1 g/L CoCl2•6H2O，0.13 g/L ZnCl2，0.01 g/L CuSO4•5H2O，0.01 g/L AlK(SO4)2•12H2O，0.01 g/L H3BO3，0.025 g/L Na2MoO4，0.024 g/L NiCl2•6H2O，0.025 g/L Na2WO4•2H2O，溶剂为去离子水；维生素溶液配方：0.2 g/L生物素，0.2 g/L叶酸，1 g/L盐酸吡哆辛，0.5 g/L核黄素，0.5 g/L硫胺，0.5 g/L烟酸，0.5 g/L泛酸，0.01 g/L B-12，0.5 g/L对氨基苯甲酸，0.5 g/L硫辛酸，溶剂为去离子水。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述氧化微杆菌ZJUTCB-2接种至无机盐培养液中培养至OD600=0.03后，加入有机污染物。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述有机污染物加入终浓度为500~2000μmol/L。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述氧化微杆菌ZJUTCB-2先进行扩大培养，然后以种子液的形式接种至无机盐培养液进行驯化培养，将驯化后的菌液接种至无机盐培养液至OD600=0.03进行降解反应，所述扩大培养和驯化培养方法为：将氧化微杆菌ZJUTCB-2接种至LB培养基，30℃培养至对数期，将培养液离心，沉淀用无菌无机盐培养液洗涤后重悬，即为种子液；取种子液接种含无机盐培养液的血清瓶中至OD600=0.03，加入终浓度1000 μmol/L氯苯作为唯一碳源，血清瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，于30℃，160 rpm摇床驯化168h，获得驯化后的菌液。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于无机盐培养液先通氮气30min制成微氧无机盐培养液。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述氮气通入速率为40mL/min。
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