CN108026546A - 微杆菌属菌株用于生产抗菌剂的用途 - Google Patents

微杆菌属菌株用于生产抗菌剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微杆菌属(Microbacterium)细菌用于生产具有抗菌活性的化合物的用途。

Description

微杆菌属菌株用于生产抗菌剂的用途
背景技术
抗菌耐药性使微生物有能力找到旨在规避用于治疗由这种微生物引起的感染的药物的作用的方法，所述抗菌耐药性被认为是当前的公共健康问题，这不仅是因为耐药细菌不断增长的趋势，而且也由于缺乏新的抗生素。
因此，对抗生素的需求不断增长，这不仅是因为耐药性问题，而且也由于人群预期寿命的延长。
例如，多药耐药性革兰氏阳性细菌(MDRGP)仍然继续对科学界提出挑战，其涉及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，所述金黄色葡萄球菌的第一个青霉素耐药菌株出现在50多年前。另外，多药耐药性革兰氏阴性细菌(MDRGN)也已成为关注的问题，尤其是大肠杆菌(E.coli)耐药菌株。
文献中从未证实属于微杆菌属(Microbacterium)的菌株能够生产抗菌化合物。
Learn-Han Lee等筛选了放线菌分离株，以及微杆菌属某些种(Microbacteriumspp.)和链霉菌属某些种(Streptomyces spp.)，目的是鉴定能够生产抗微生物次级代谢产物的那些(Learn-Han Lee等,The Scientific World Journal,Vol.6,No.1,1 January2014,p.12-14)。只有链霉菌属某些种的分离株表现出针对测试的致病细菌的活性。所测试的微杆菌属某些种的分离株在所实施的分离和发酵条件下并未表现出抗菌活性。
文件WO2010/081899和US2014/017724描述了使用细胞破坏性DNA损伤处理来分离生产活性次级代谢产物的新细菌菌株。据显示，在所分离的菌株中，微杆菌属菌株MA3-7G表现出抗真菌活性，但未观察到针对致病细菌的活性。此外，可以注意到，所使用的微杆菌属菌株MA3-7G是在照射相应的天然菌株后获得的，没有其他注解。
因此，寻找具有抗菌特性并且其结构不同于在常规抗生素中所见的结构的新化学实体被认为是一项紧迫的需求，以开发抑制这些耐药性感染的新方法。申请人已发现，微杆菌属能够且特别可用于生产具有抗菌活性的新的化合物。目前为止文献中描述的所有微杆菌属菌株均从环境来源分离得到。最初，这些黄色或橙色着色的发酵性革兰氏阳性杆菌(GPR)被鉴定为CDC棒状杆菌群A-4和A-5细菌，但其他研究揭示它们属于微杆菌属(临床样本中遇到的微杆菌属某些种最初鉴定为CDC棒状杆菌群A-4和A-5细菌(PrimaryIdentification of Microbacterium spp.encountered in Clinical Specimens as CDCCoryneform Group A-4 and A-5 Bacteria),Guido FUNKE,JOURNAL OF CLINICALMICROBIOLOGY,Jan.1995,p.188–192)。
发明简述
本发明涉及微杆菌属(Microbacterium)细菌用于生产具有抗菌活性的化合物的用途。
据显示，微杆菌属基因组编码生产生物活性次级代谢产物的酶通路。
发明内容
本发明的主要目的是微杆菌属细菌用于生产具有抗菌活性的化合物的用途。
根据一个实施方式，所述细菌选自微杆菌(Microbacterium sp.)、树状微杆菌(Microbacterium arborescens)、液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)、甜菜内生微杆菌(Microbacterium maritypicum)和氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。
优选地，所述细菌为树状微杆菌(Microbacterium arborescens)，更特别为树状微杆菌(Microbacterium arborescens)CIP 55.81T。
根据本发明，在培养所述细菌后提取所述具有抗菌活性的化合物。
根据一个实施方式，在包含碳源、氮源和酵母提取物的营养培养基中培养所述细菌。
优选地，在约20℃到约40℃的温度范围下培养所述细菌。
优选地，在约6到约8的pH下培养所述细菌。
优选地，将所述细菌培养约10个小时到约144个小时的时间段。
根据一个实施方式，通过与极性或非极性溶剂或其混合物接触进行液-液提取或固-液提取来提取所述具有抗菌活性的化合物。
本发明的另一目的是由微杆菌属(Microbacterium)生产的次级代谢产物用作具有抗菌活性的化合物的用途。
本发明显示，微杆菌属微生物能够生产具有抗菌活性的化合物，因此本发明的另一目的是提供一种高效和有效地生产这种具有抗菌活性的化合物的方法，所述方法包括上述技术步骤。
根据本发明的教导，如本文中所公开的，鉴定和利用了可用于生产具有抗菌活性的化合物的微杆菌属的细菌菌株。
进一步根据本发明的教导，本文中公开了具有抗菌活性的化合物的生产方法。该方法包含培养微杆菌属菌株，从而由此生产具有抗菌活性的化合物。
优选地，本发明的方法包含培养下列微杆菌属菌株中的一种：微杆菌(Microbacterium sp.)、树状微杆菌(Microbacterium arborescens)、液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)、甜菜内生微杆菌(Microbacterium maritypicum)和氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。
优选地，本发明的方法包含培养树状微杆菌(Microbacterium arborescens)菌株，更特别是树状微杆菌(Microbacterium arborescens)菌株CIP 55.81T。
在本发明的另一相关方面，本文中公开了由微杆菌属菌株生产的具有抗菌活性的化合物的生产方法。该方法包括培养微杆菌属菌株的步骤，由此生产并回收具有抗菌活性的化合物。
具体实施方式
本发明的一个实施方式在于提供具有抗菌活性的化合物的生产方法，其包括在营养培养基上培养微杆菌属的细菌菌株，以在营养培养基中和所述细菌中积聚所述具有抗菌活性的化合物。
微杆菌属的微生物可以以允许其生长且同时生产具有抗菌活性的化合物的任何方式培养，正如本领域技术人员很容易理解的。在这一方面，本文中考虑的是这种培养将在还包含碳源(例如葡萄糖、淀粉、甘油、蔗糖和糖蜜)、氮源(例如蛋白胨，酪蛋白、肉或大豆的水解衍生物，硝酸铵或硝酸钠，硫酸铵或磷酸铵，玉米浆，麦芽提取物等)以及如有需要包含无机盐的培养基中进行。通过缓冲剂例如MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、磷酸盐或TRIS缓冲剂或通过连续受控添加氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵或无机酸例如盐酸或硫酸来控制水性培养基的pH。pH维持在约5到约10之间，优选在约7到约9之间。
这种培养的温度可以在约20℃到约40℃、优选约30℃到约35℃的温度范围内进行约10到约144个小时、更优选约72到96个小时的时间段，这取决于所培养的具体菌株。培养基的pH可以为约pH 5到约pH 10，优选pH为约7到约9。
然后可以在培养结束时回收微杆菌属的微生物。这种回收可通过任何合适的手段来进行，这对本领域技术人员来说是熟知的。正如本文中公开的，这种回收通过如下进行：对培养液进行离心以形成含有细胞的沉淀物(pellet)，接着倾析上清液或以其它方式回收细胞。尽管微生物可以以游离形式的细菌细胞使用，但可以将细菌细胞固定。在这种情况下，细菌细胞可以在整个发酵中时(在从所述整个发酵中移除之前)被固定。在这种固定后，通过本领域技术人员熟知的任何方法，例如通过简单的倾析，可以容易地从中移除发酵液。
细菌细胞的固定可以通过适合允许根据本发明的方法的使用的本领域技术人员熟知的任何常规方法进行。这样的方法包括固定在藻酸盐或角叉菜胶凝胶或高聚合物膜中。
当培养结束时，分离上清液与沉淀物。使用极性溶剂或非极性溶剂或其混合物对沉淀物或上清液或两者进行由微杆菌属菌株生产的具有抗菌活性的化合物的提取，任选地接着进行纯化过程，所述纯化过程将具有抗菌活性的化合物从极性溶剂或非极性溶剂中富集出来。
在本发明该方面的一个实施方式中，用于提取或纯化的极性溶剂独立地包括(单独或混合物)但不限于C1-C4醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇)、二甲亚砜、四氢呋喃、丙酮、乙腈、或其混合物。
在本发明该方面的一个实施方式中，用于提取或纯化的非极性溶剂独立地包括(单独或混合物)但不限于己烷、庚烷、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、氯仿、甲苯、甲基叔丁基醚、甲基异丁基酮或其混合物。也可使用极性和非极性溶剂的混合物，例如氯化溶剂和醇的混合物如二氯甲烷/甲醇(DCM)。
本发明的另一种实施方式在于提供具有抗菌活性的化合物的生产方法，所述方法包括在营养培养基上培养微杆菌属菌株，以在所述营养培养基中和细菌中积聚所述具有抗菌活性的化合物。
微杆菌属，优选树状微杆菌是可以最有效地用于本发明的实例。该菌株的生理特性如下。
各种生理特性
最佳生长条件：该菌株的最合适的生长条件为pH 5到9，温度20℃到35℃。
首先将树状微杆菌菌株培养在合适的营养培养基中或上以生产具有抗菌活性的化合物。在本发明的这种菌株的培养中，通常使用普通的培养方法。对于培养基来说，适当地使用含有微生物能够同化的碳源、微生物能够消化的氮源以及根据需要还含有无机盐的营养培养基。
葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖、糖蜜、淀粉、糊精、纤维素、甘油、有机酸、蛋白胨可以单独或组合用作上文提及的可同化的碳源。有机氮源例如蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、干酵母、大豆粉、玉米浆、棉籽粉、酪蛋白、大豆蛋白水解物、氨基酸和尿素，无机氮化合物例如硝酸盐和铵盐可以单独或组合用作可消化的氮源。
此外，可以根据需要添加无机盐例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和磷酸盐、重金属盐。另外，促进本发明的微生物生长和/或具有抗菌活性的化合物物质生产的微量营养素、生长促进剂和前体也可以根据需要合适地添加到培养基中。
通常优选在好氧条件下进行培养，例如振摇培养或曝气搅拌培养。工业上来说，浸没式曝气培养是优选的。培养基的pH优选在中性附近。培养温度可以在20℃到40℃的范围内，但温度通常维持在24℃到30℃的范围内，优选约30℃。对于培养时间，通常在培养进行3到6天时生产并积聚具有抗菌活性的化合物，因此，培养优选可以在积聚的具有抗菌活性的化合物达到最大水平时完成。
无需多说的是，这些培养条件例如培养组合物、培养基的pH、培养温度、搅拌速率和曝气率可以进行适当调整和/或选择，使得可以根据使用的菌株种类和/或外部条件而获得所需结果。当在液体培养中出现起泡时，可以适当地使用消泡剂例如硅油、植物油和表面活性剂。
为了从培养物中取出具有抗菌活性的化合物，将培养物滤液或沉淀物用有机溶剂例如丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇、二氯甲烷、甲醇和氯仿或这些溶剂的混合物进行提取，并且在减压下浓缩提取物以获得具有抗菌活性的化合物粗品。所述具有抗菌活性的化合物粗品还可经受通常用于纯化的已知方法例如使用载体如硅胶的柱层析或反相柱层析，以分离和纯化具有抗菌活性的化合物。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行具体描述，但本发明不仅限于这些实施例。
A)液相和固相中活性的定性评价
已经在固相和液相中定性评价了微杆菌属不同菌株针对金黄色葡萄球菌ATCC13709的活性(表1)。菌株1至8属于树状微杆菌种类，菌株9至19属于微杆菌属的不同种类，但所述种类无法被鉴定。
表1
菌株 液相 固相
1 X X
2 X X
3 X X
4 X X
5 X X
6 X X
7 X X
8 X X
9 X X
10 X X
11 X
12 X
13 X
14 X
15 X
16 X
17 X
18 X
19 X
现已发现，根据在其中进行微杆菌属菌株培养的相的性质观察到了活性。
B)由树状微杆菌菌株CIP 55.81T生产的化合物的抗菌活性的测定
1)预培养物
将100ml含有10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物的部分酵母-蛋白胨-葡萄糖(YPG)培养基在121℃下高压灭菌20分钟。在冷却后，培养基由无菌的MOPS溶液(最终浓度：150mM)和无菌的葡萄糖溶液(最终浓度：1g/L)补充完整。用KOH或HCl无菌溶液将pH调节至pH 7.2。向培养基接种巴斯德研究所生物资源中心(Biological Resource Center of InstitutPasteur)的巴斯德研究所菌种保藏中心(Collection de l'Institut Pasteur)(CIP)中保藏的原代树状微杆菌菌株CIP 55.81T的菌落，并在30℃、160rpm搅拌下温育24小时。然后通过分光光度计测量600nm下的光密度(OD)，直至树状微杆菌菌株处于其指数生长期的开始/中间处(1<600nm下的OD<3)。通过接种在YPG琼脂上来监测预培养物的纯度。将培养板在30℃下温育48小时。
2)在锥形烧瓶中的培养物
向含有最终体积为1000ml无菌YPG培养基的5000ml烧瓶中接种100ml段落1)中描述的预培养物，并在30℃、160rpm搅拌下温育96小时。600nm下的初始OD在0.1至0.3之间的范围内。在96小时结束时通过接种YPG琼脂来监测发酵纯度。将培养板在30℃下温育48小时。将培养物在10,000g、25℃下离心45分钟。将上清液和沉淀物保持在4℃下。
3)固相培养物
将含有最终体积为30ml的含15g/L琼脂的无菌YPG培养基的陪替氏培养皿(10x10cm)用10ml段落1)中描述的预培养物淹没而进行接种。然后除去过量的预培养物。然后将陪替氏培养皿在30℃下温育96小时。
4)具有抗菌活性的化合物(抗菌剂)的提取
通过用80:20比例的二氯甲烷/甲醇提取而进行从上清液中提取具有抗菌活性的化合物。该操作被执行5次。将溶剂在减压下蒸发以得到粗提取物。
通过用溶剂例如丁醇或丙酮覆盖琼脂片16小时而进行从固相中提取具有抗菌活性的化合物。收集溶剂并在减压下浓缩至干以得到粗提取物。
5)根据本发明的抗菌化合物的抗菌活性
按照由临床和实验室标准研究所(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)(CLSI)-临床和实验室标准研究所(CLSI,原名NCCLS)推荐的方案对粗提取物进行活性测量：用于好氧生长细菌的稀释抗微生物敏感性测试法(Dilution AntimicrobialSusceptibility Methods for Tests for Bacteria That Grow Aerobically)；获批标准(Approved Standard)–第十版(2015)。临床和实验室标准研究所(Clinical andLaboratory Standards Institute)文件M07-A10。
表2中给出了溶解在DMSO中的粗提取物的最小抑制浓度(MIC)。
表2

Claims (9)

1.微杆菌属(Microbacterium)细菌用于生产具有抗菌活性的化合物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述细菌选自微杆菌(Microbacterium sp.)、树状微杆菌(Microbacterium arborescens)、液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)、甜菜内生微杆菌(Microbacterium maritypicum)和氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述细菌为树状微杆菌，更特别为树状微杆菌CIP 55.81T。
4.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中在培养所述细菌后提取所述化合物。
5.根据权利要求1至4任一项所述的用途，其中在含有碳源、氮源和酵母提取物的营养培养基中培养所述细菌。
6.根据权利要求1至5任一项所述的用途，其中在约20℃到约40℃的温度范围下培养所述细菌。
7.根据权利要求1至6任一项所述的用途，其中在约6到约8的pH下培养所述细菌。
8.根据权利要求1至7任一项所述的用途，其中将所述细菌培养约10个小时到约144个小时的时间段。
9.根据权利要求1至8任一项所述的用途，其中通过与极性或非极性溶剂或其混合物接触进行液-液提取或固-液提取来提取所述具有抗菌活性的化合物。
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