CN115677640A - 一种吡喃2酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吡喃2酮类化合物及其制备方法和应用，该化合物的具体名称为(7R)‑5‑(甲氧基甲基)‑3‑甲基‑6‑(戊烷‑2‑基)‑2H‑吡喃‑2‑酮，该化合物为新发现的天然产物，具有独特的广谱抗菌活性，为解决抗生素过度使用导致的抗药性问题提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及海洋活性物质生产技术领域，特别涉及一种吡喃2酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝，简称“基丝”，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝，简称“气丝”，并进一步分化产生孢子丝及孢子。
放线菌的次级代谢产物结构多样并且具有广泛的生物活性，是酶制剂、有机酸等多种活性物质的主要产生者。从微生物代谢产物得到的3万余种具有生物活性的物质中，约有40％以上来源于放线菌，是新颖生物活性次生代谢产物的重要来源，所产次生代谢产物涉及生物碱、蒽醌、内酯、黄酮及酚等，其中许多已广泛应用在医药、农业和畜牧业中并体现出重要价值；但是传统的放线菌代谢产物并没有抗菌抗病毒作用。
抗生素的长期广泛使用导致耐药性病原细菌种类增加，甚至出现“超级细菌”，新的感染性疾病也不断涌现，致使新型抗菌物质的研究与开发迫在眉睫。在对微生物资源的长期研究开发过程中发现，从微生物次生代谢产物中发现新抗菌物质的难度越来越大。放线菌是多种生物活性的新型化合物的生产者，因而对产生次生代谢物的潜在放线菌类群进行连续筛选对于发现新化合物是至关重要的。
放线菌广泛分布在各种生态系统中，土壤、淡水、湖泊和海洋环境都是其生存环境。过去的几十年，随着对普通环境中微生物资源的不断挖掘，从中发现新颖放线菌资源及生物活性物质的概率越来越低，菌种的大量重复发现和重复筛选导致了发现新的先导化合物的机率不断下降，难度越来越大。因此人们把研究逐渐转向其他一些特殊生境，例如，海洋。海洋中的微生物为了适应诸如低温、高盐、高压、无光等各种极端条件，其生长特性、营养需求、繁殖规律、细胞结构、膜结构、蛋白及酶的结构、核酸结构、基因表达调控等均与普通环境中的微生物有着巨大的差异。次生代谢是生物在长期的进化过程中对环境的适应机制之一，是自然选择的结果。生存于海洋这种特殊生境的放线菌，经过长期的进化选择，必然具有特殊的代谢类型，从而合成结构新颖、独特、生物活性广泛的次生代谢产物，这将极大地提高新颖生物活性化合物的发现机率，是发现具有生物活性的新结构天然产物的宝藏。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自海洋放线菌的吡喃2酮类化合物及其制备方法和应用，该化合物为新发现的天然产物，具有独特的广谱抗菌活性，为解决抗生素过度使用导致的抗药性问题提供了新的选择。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种吡喃2酮类化合物，该化合物的具体名称为(7R)-5-(甲氧基甲基)-3-甲基-6-(戊烷-2-基)-2H-吡喃-2-酮，其结构式如下所示：
作为优选，所述化合物是从海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001的发酵产物中分离获得。海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001由浙江海洋大学的蒋永俊提供，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M2022921，保藏日期：2022.6.20日。
作为优选，将海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001接种于液体培养基中进行发酵扩大培养，过滤收集菌液，菌液用乙酸乙酯提取，减压浓缩后得到粗提物，粗提物经硅胶柱层析分离，最后用半制备HPLC或制备HPLC纯化。
作为优选，发酵扩大培养是在28±2℃下旋转摇床养10-12天。
作为优选，硅胶柱层析分离采用二氯甲烷和甲醇的混合液进行洗脱。
作为优选，二氯甲烷和甲醇的体积比为15-20：1。
吡喃2酮类化合物在制备广谱抗菌药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明首次报道了由海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001的发酵产物中分离获得的吡喃2酮类化合物，具有独特的广谱抗菌活性，为解决抗生素过度使用导致的抗药性问题提供了新的选择。
附图说明
图1是化合物在氘代甲醇中的1H NMR谱；
图2是化合物在氘代甲醇中的13C NMR谱；
图3是化合物在氘代甲醇中的HSQC谱；
图4是化合物在氘代甲醇中的HMBC谱；
图5是化合物在氘代甲醇中的1H-1H COSY谱；
图6是化合物的HR-ESI-MS图谱；
图7是化合物的ECD计算图；
图8是海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001平板上的菌落图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001分离自采自舟山海域的海底沉积物样品。菌株ZHD001由TaKaRa生物技术(中国大连)有限公司采用16S rDNA序列分析方法进行鉴定，其DNA序列采用BLAST(核苷酸序列比较)方法与GenBank数据库进行比对。BLAST检索结果显示，该菌株序列与Nocardiopsis sp.AD16(登录号MF410670.1)的相似性为99.68％，证实该菌株属于Nocardiopsis sp.属。
实施例1：吡喃2酮类化合物的获得
(1)将生长在Gause琼脂平板(高氏1号琼脂培养基，市售)上的菌株Nocardiopsissp.ZHD001(图8)接种到500mL的烧瓶中，其中含有250mL的Gause液体培养基(高氏1号液体培养基，市售)，然后在28℃的旋转摇床上(180rpm)培养10天，产生发酵。
(2)发酵产物过滤收集菌液，菌液用乙酸乙酯提取3次，合并提取液，减压浓缩后得到粗提物(6.8g)，粗提物经硅胶柱(50cm×6.0cm)层析分离，采用二氯甲烷和甲醇的混合液(二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1)进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸干后用制备HPLC(15-100％甲醇,40min，流速为10mL/min)纯化，得到化合物(7R)-5-(甲氧基甲基)-3-甲基-6-(戊烷-2-基)-2H-吡喃-2-酮(6.2mg,tR＝30.5min)；其结构式如下所示：
淡黄色油状，[α]20D-78°(c 1.0,甲醇)；ECD(1mg/mL,甲醇)λmax(Δε)205(+3.08),225(-0.54),300(-30.97)；HRESIMS m/z 247.1313[M+Na]+(计算值C13H20NaO3 247.1310)。
实施例2：吡喃2酮类化合物的结构确认
化合物((7R)-5-(甲氧基甲基)-3-甲基-6-(戊烷-2-基)-2H-吡喃-2-酮)的相对构型通过高分辨质谱、核磁共振确定；绝对构型通过高斯计算ECD方法予以确定。
化合物(吡喃2酮类化合物)的HRESIMS(高分辨率电喷雾电离质谱)见图6，显示在m/z 247.1313处有一个[M+Na]+的离子峰，表明分子式为C13H20O3，有四个不饱和度。
图11H-NMR显示有一组甲基丁基氢[δH 0.90(3H,t,J＝7.5Hz,Me-10)，1.20(3H,d,J＝6.6Hz,Me-13)，1.30(1H,m,H-9)，1.21(1H,m,H-9)，2.97(1H,m,H-7)，1.68(1H,m,H-8)，1.52(1H,m,H-8)]，一组甲氧基氢δH 3.34(3H,s)，一组芳香甲基氢(δH 2.03,s,Me-12)，一组氧合亚甲基氢(δH 4.2,s,H-11)和一个芳香氢(δH 7.31,s,H-4)的典型信号。
13C-NMR(图2)与HSQC(图3)光谱结合显示13个碳原子，包括4个甲基、3个亚甲基、2个次甲基和4个季碳。根据δC 165.9(q,C-2)、123.2(q,C-3)、144.9(d,C-4)、114.2(q,C-5)和166.3(q,C-6)的吡喃-2-1核特征信号，化合物(吡喃2酮类化合物)应为吡喃-2-1衍生物。
1H-1H COSY谱(图5)揭示了两个自旋体系，即H-7/H-8/H-9/Me-10和H-7/Me-13。根据H-8、H-9和Me-13与C-6的HMBC(图4)相关性，1-甲基丁基连接在C-6上，而根据H-11与C-5、C-6、C-7和Me-14与C-11的HMBC相关性，甲氧基甲基连接在C-5上。通过H-4与C-2和C-6的HMBC相关性，建立了吡喃环。最后，根据Me-12与C-2、C-3和C-4的HMBC(图4)相关性推断，Me-12连接在C-3。因此，化合物的平面结构被确定为5-(甲氧基甲基)-3-甲基-6-(戊烷-2-基)-2H-吡喃-2-酮。
通过ECD计算确定了C-7的绝对构型，如图7所示。根据上述证据，将化合物的结构确定为(7R)-5-(甲氧基甲基)-3-甲基-6-(戊烷-2-基)-2H-吡喃-2-酮((7R)-5-(methoxymethyl)-3-methyl-6-(pentan-2-yl)-2H-pyran-2-one)，是吡喃-2-酮家族的新成员。
化合物的13C(150MHz)和1H(600MHz)NMR数据
实施例3：吡喃2酮类化合物的抗菌活性
用营养肉汤稀释法测定化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌生长的抑制活性。
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念球菌接种于含有营养琼脂培养基(NA)的培养皿中，置于37℃恒温培养箱培养24h。用接种环挑取单一菌落接种于含有营养肉汤培养基(NB)的500mL锥形瓶中，置于37℃摇床中180rpm振荡培养10h，以空白营养肉汤培养基(NB)作为对照，在550nm波长下检测菌落的OD值，并用空白NB培养基稀释调节OD值使其控制在0.08～0.1范围内，此时病原菌的浓度达到108CFU/mL。在无菌的96孔板内先加入待测样品和MHB培养基后用移液枪混匀，随后每孔加入3μL菌液，保证每孔的最终液体体积为200μL。以氯霉素和两性霉素B为阳性对照，以DMSO(体积浓度为5％)作为阴性对照。将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养12小时，随时观察。若孔内没有病原菌生长，则进一步缩小样品浓度，继续测定。直到得到其最小抑菌浓度(MIC)。
化合物对大肠杆菌(革兰氏阴性)的MIC值为25.0μg/mL，对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)的MIC值为25.0μg/mL，对白色念珠菌(真菌)的MIC值为25.0μg/mL；化合物对典型的人类致病菌革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均具有抑菌活性，表现出了广谱抗菌特性。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (7)
1.一种吡喃2酮类化合物，其特征在于，该化合物的具体名称为(7R)-5-(甲氧基甲基)-3-甲基-6-(戊烷-2-基)-2H-吡喃-2-酮，其结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的一种吡喃2酮类化合物，其特征在于，所述化合物是从海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001的发酵产物中分离获得。
3.如权利要求1所述吡喃2酮类化合物的制备方法，其特征在于，将海洋放线菌Nocardiopsis sp.ZHD001接种于液体培养基中进行发酵扩大培养，过滤收集菌液，菌液用乙酸乙酯提取，减压浓缩后得到粗提物，粗提物经硅胶柱层析分离，最后用半制备HPLC或制备HPLC纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵扩大培养是在28±2℃下旋转摇床养10-12天。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，硅胶柱层析分离采用二氯甲烷和甲醇的混合液进行洗脱。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，二氯甲烷和甲醇的体积比为15-20：1。
7.如权利要求1所述吡喃2酮类化合物在制备广谱抗菌药物中的应用。
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