CN102282248A - 用于分离细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定新细菌和来自所述细菌的代谢产物的组合物和方法。更具体地，本发明描述了一种从环境样品中分离产生目的代谢产物的细菌的新方法。特别是，本发明描述了一种选择产生新抗生素的细菌的方法。本发明可以应用于任何样品，并且能够分离具有例如药学或农业化学目的的细菌。

Description

用于分离细菌的方法
本发明涉及鉴定新细菌和来自所述细菌的代谢产物的组合物和方法。更具体地，本发明描述了一种从环境样品中分离产生目的代谢产物的细菌的新方法。特别是，本发明公开了一种选择产生新抗生素的细菌的方法。本发明可以应用于任何样品，并且能够分离具有例如药学或农业化学目的的细菌。
背景技术
自远古以来人类已开始寻求环境生物体用于治疗目的，并且大部分的商业化抗生素仍然具有天然起源。在最近的10年间，为了精简并加速抗菌剂发现过程，业界已从天然产物和分子导向的发现策略转移至合成分子和靶标导向的策略。
在数年的抗生素研发过程的统一化后，由于前所未有的高损耗率因而需要返回到天然资源上。实际上，天然产物库的筛选通常具有比化学库更高百分比的抗生素命中率，因而提供获得治疗剂的更高概率。其第一个原因可能在于抗生素的生态作用，保护植物、动物和微生物不受其它活生物体损害，所述生态作用经过进化过程而得到了优化。此外，天然产物通常与组合化合物具有同样的亲油性，但天然产物具有无比的结构多样性和化学空间分散性。这有助于发现稀有的亲水剂，可以对其进行优化而用于体内用途。
一般认为，从环境源，如土壤或水中分离的细菌的20％至30％是抗生素制造者(Bérdy，2005年)。由于显而易见的原因，最常分离的是更合适且最具代表性的细菌。这解释了为何对由芽孢杆菌属或假单胞菌属产生的很多抗生素已有许多文献记载、以及为何越来越难以发现由这些属产生的新分子实体。由于具有更大的基因组，更适于抗生素产生的其它科的未充分表征的细菌，可以容易地利用改进的技术进行分离。放线菌科就是这样的菌，目前为止它是最佳的抗生素产生菌(Bérdy，2005年)。在1950至1980之间制药工业对它们进行了广泛研究，现在难以鉴定产生非冗余分子的菌株。
在过去的十年间业界努力地分离稀有细菌，从而发现具有药用价值的新化学实体。例如，自从1940年代就发现了粘细菌(Myxobacteria)，但是由于在分离中遇到的困难，因此它们在菌种收藏中未充分表征。由于Reichenbach H及合作者所完成的广泛的收集活动，目前为止已对由粘细菌产生的大约80种不同化合物和450种结构变体进行了表征(Reichenbach，2001年)。这些化合物中的许多化合物是新化合物。其中有正在临床试验中进行评估的抗肿瘤药-埃博霉素(epothilones)。
然而，普遍认为微生物学家不能培养大部分的土壤微生物(Schoenborn等人，2005年)。土壤中的可培养细胞数量常常仅为存在的细胞总数的1％。难以用标准分离技术对这些细菌中的大部分进行检测和分离，其原因是它们在环境中是稀有的、或者它们与其它细菌，如假单胞菌属或芽孢杆菌属相比更不易适应环境条件并且快速地过度生长。已发表了旨在增加分离物多样性的数种分离技术。例如，系列液体稀释培养法已成功地用于提高可培养性(Schoenborn等人，2005年)并且有助于从不同环境中分离细菌。Yang等人(2008年)也描述了利用微波处理来分离稀有的放线菌类。WO02/059351描述了一种利用例如温泉水从自然环境中富集微生物群的方法。
然而，环境微生物仍然是新化合物及活性的丰富且未开发的资源，并且在本技术领域存在着对鉴定目的细菌的改进或替代方法的需求。
发明内容
本申请提供一种从环境样品中鉴定或分离细菌的新方法。更具体地，本发明公开了利用DNA损伤处理从环境样品中鉴定或分离稀有细菌的一种高效快速的方法。
因此，本发明的一个目的在于提供一种鉴定或分离产生(次生)代谢产物的细菌的方法，该方法包括对包含未表征细菌的样品进行细胞破坏DNA损伤处理，并且从所述经处理样品中鉴定或分离产生(次生)代谢产物的细菌。在优选的实施方案中，处理时反复的辐射处理。
在此方面，本发明的一个具体目的是一种鉴定或分离产生代谢产物的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行反复辐射处理；
c)从所述经处理样品中鉴定或分离活的或正在生长的细菌；以及
d)选择步骤c)中的产生代谢产物的细菌。
在一具体实施方式中，所述处理包括相继的紫外线辐射，例如，以基本上规则的间隔，重复至少2次优选3次或更多次辐射。
在一具体实施方式中，所述处理包括反复的紫外线辐射。
根据另一具体实施方式，本发明涉及一种鉴定或分离代谢产物产生菌产生代谢产物的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)向样品中加入博来霉素(bleomycin)家族的抗生素；
c)从所述处理的样品中鉴定或分离活的或正在生长的细菌；以及
d)选择步骤c)中的产生代谢产物的细菌。
优选的博来霉素家族的抗生素是bleocin。
所述代谢产物可以是任何医药品，如抗生素、抑菌化合物、抗代谢物、化学治疗化合物、抗真菌剂、抗病毒化合物、细胞因子活性化合物或细胞生长因子。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或分离产生抗生素或抑菌化合物的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行反复辐射处理，优选反复的紫外线处理；
c)从所述经处理样品中鉴定或分离活的或正在生长的细菌；以及
d)使步骤c)中鉴定或分离的细菌或其提取物暴露于参照菌株，并且鉴定或分离显示抗生素或抑菌活性的细菌。
在一优选实施方式中，本发明的方法包括分离或纯化由所述细菌产生的代谢产物的进一步的步骤。
此外，本发明的方法任选包括利用本领域技术人员已知的任何技术方法以遗传学、生物学或化学方法对所鉴定或分离的细菌或其DNA进行修饰的进一步的步骤，所述修饰的目的是提高例如所述细菌的存活能力、生长或功能，例如从而改进抗生素活性或制造。所述方法包括但不限于细胞融合、加速进化、DNA重排技术、插入来自另一种菌株的真核生物、原核生物或合成核酸(例如，DNA)、或者任何基因工程技术。可以对分离的细菌进行所述修饰步骤，或者在该方法的任何较早阶段，例如在步骤a)的样品上进行修饰。
本发明的另一个目的在于通过如上所述方法获得的野生型或修饰的细菌或者其提取物。
本发明的又一个目的是提供一种产生代谢产物，特别是药用化合物的方法，该方法包括(i)利用如上所定义的方法鉴定或分离产生所述代谢产物的细菌、以及(ii)产生所述抗生素。
本发明的又一个目的是提供一种利用野生型或修饰的奇异球菌菌株来鉴定、分离或产生药用化合物，如抗生素的方法。
本发明的又一个目的是使用野生型或修饰的奇异球菌产生药用化合物，如抗生素的应用。
本发明的又一个目的是来自野生型或修饰的奇异球菌的抗生素。
本发明的又一个目的是一种产生重组宿主细胞的方法，该方法包括根据如上所定义的方法来鉴定或分离细菌，并且将一个或数个基因(或者相应的合成或重组核酸)从所述细菌中克隆至另一种宿主细胞，由此产生重组宿主细胞。
本发明的方法可以应用于各种样品，如环境样品，并且已成功地应用于分离具有有利的药学和/或农业化学特性的新细菌。
附图说明
图1：在(a)在0.4和17mJ/cm2的紫外线下暴露1次、以及(b)在4mJ/cm2的紫外线下反复暴露之后，获得细菌席(bacterial mat)。深色的菌落是耐辐射球菌。其它细菌属于土壤微生物群落。
具体实施方式
本申请描述了一种从样品中鉴定或分离细菌的新方法。更具体的，本发明公开了一种利用细胞破坏DNA损伤处理从环境样品中鉴定或分离稀有细菌的高效快速的方法。
业界已对细菌对紫外线或辐射的耐受性进行了广泛研究，以了解细菌是如何在这种侵袭性环境中存活的(Makarova等人，2001年)。Rainey等人(2005年)指出地嗜皮菌属(Geodermatophilus)和奇异球菌(Deinococcus)属是在从索诺兰沙漠土壤中收集的最耐辐射的细菌。业界还分离了其它细菌，即奇异球菌、薄层菌(Hymenobacter)、动球菌(Kineococcus)、考克氏菌(Kocuria)、和甲基杆菌(Methylobacterium)。
现在，本发明提出利用细胞破坏DNA损伤处理来分离产生代谢产物的新(未充分表征的)细菌。实际上，本发明显示这种通常将导致大量细胞死亡的处理，出乎意料地能够对具有产生有价值代谢产物的突出特性的未充分表征的细菌进行选择。
现在，本发明首次显示在细胞破坏DNA损伤处理后可以分离大量的能够产生有价值次生代谢产物的细菌。
因此，本发明的一个目的在于鉴定或分离产生代谢产物的细菌的方法，该方法包括对包含未表征细菌的样品进行细胞破坏DNA损伤处理，并且从所述处理样品中鉴定或分离产生代谢产物的细菌。
在一具体实施方式中，所述方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行细胞破坏DNA损伤处理；
c)从所述经处理的样品中鉴定或分离活的或者正在生长的细菌；以及
d)选择步骤c)中的产生代谢产物的细菌。
所述方法可以应用于包含未表征细菌的各种样品，特别是环境样品或来自环境样品的样品。在本发明的上下文中，环境样品包括任何包含(大量)未表征(微)生物的样品，特别是未经培养的微生物(例如，并未有目的地进行培养并以分离的形式扩增的微生物)。所述样品可获得自或来自自然环境或者人工环境或特别形成的环境。
如上所述，所述样品可以是任何环境样品，例如获自或来自土壤、水、植物提取物、生物材料、沉积物、泥炭地、工业废水或工业区、矿物提取物、沙子等。所述样品可从各种地区或者在各种状况下收集，例如但不限于热带地区、火山地区、森林、农田、工业区等。所述样品通常包含各种种属的(未表征的、未经培养的)微生物，如陆生微生物、海洋微生物、淡水微生物、共生微生物等。这种环境微生物的种属包括细菌、藻类、真菌、酵母菌、霉菌、病毒等。所述微生物可包括极端微生物(如嗜热菌)。所述样品通常包括各种种属的这种(未经培养的)微生物，并且包含其各种量。此外，所述样品可包含已知的和/或可培养的微生物(例如，原核微生物或者真核微生物)。
应该理解的是，本发明并不局限于任何特定类型的样品或环境微生物，但是可以使用任何包含未经培养的微生物的样品来实施本发明。
在一个优选实施方式中，所述样品是或来自土壤、水、温泉、海洋环境、淤泥、木材、石块、苔藓、植物提取物、地衣、生物材料、沉积物、生物膜、工业废水、气体、沙子、油、污水、或者动物或人排泄物。
对于在本发明中的使用，所述样品可以是潮湿的、可溶的、干燥的，采用悬液、糊状物等形式。此外，在所述方法的步骤b)之前，可以对样品进行处理以改进过程，例如通过过滤、清洗、浓缩、稀释、操作(steering)、干燥等例如富集微生物。
在一具体实施方式中，所述样品是采用经过滤的悬液的形式。更具体地，在处理步骤b)之前，可以对所述样品进行无菌过滤和/或将其置于无菌水中。
所述过程的步骤b)包括对样品(即，样品中包含的微生物)进行细胞破坏DNA损伤处理。
细胞破坏DNA损伤处理是指与导入DNA修饰的仅仅致突变处理相反导致样品中的显著细胞死亡的处理。特别是，细胞破坏DNA损伤处理是足以导致大肠杆菌培养物中90％以上细胞死亡的处理。甚至更优选地，细胞破坏DNA损伤处理是足以使大肠杆菌培养物中的细菌滴度降低至少2个对数级的处理。令人惊讶地，本发明显示这种处理能够从多种类型的样品中高效快速地分离可产生有价值(次生)代谢产物的新微生物，所述处理通常对大部分细胞群会是致死性的。这个结果特别是令人惊讶的，因为预计对微生物进行细胞破坏DNA损伤处理会阻止分离活微生物。令人惊讶地，本发明能够从所述样品中选择稀有微生物，特别是具有重组其基因组或者耐DNA损伤的能力的微生物。
因此，本发明首次公开了将细胞破坏DNA损伤处理用于高效率地选择产生有价值(次生)代谢产物的未充分表征的细菌。如实施例中所示，本发明能够分离奇异球菌属、芽孢杆菌属、甲基杆菌属、鞘氨醇杆菌属(Sphinogobacterium)属、纤维菌(Cellulosimicrobium)属、Tepidimonas、特吕珀菌(Truepera)属、产卟啉杆菌(Porphyrobacter)属、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium)属、微小杆菌(Exiguobacterium)属、诺卡氏菌(Nocardia)属、节杆菌(Arthrobacter)属、红球菌(Rhodococcus)属、微杆菌(Microbacterium)属、Kineococcus属和威廉土氏菌(Williamsia)属的新菌株。
DNA损伤处理可包括对样品进行辐射和/或用一种或数种基因毒性剂进行处理。该处理在足以诱导存在于样品中的微生物的显著细胞死亡的条件和/或时段下进行。
在一具体实施方式中，DNA损伤处理包括对所述样品进行一次或数次辐射。优选的处理包括对所述样品(即，样品中的微生物)进行反复(例如，相继)的辐射处理。
辐射可以选自紫外线、γ射线和/或X射线辐射，可以单独或联合使用，最优选紫外线辐射。辐射处理通常包括对微生物进行一次或数次相继的辐射(例如，1次至5次)，辐射可以是相同或不同性质的辐射，优选相同性质的辐射。通常，反复的辐射是以1至8小时、优选3至5小时、更优选约4小时的间隔进行。
特别优选的处理包括对样品进行细胞破坏紫外线辐射。实际上，本发明表明这种处理能够高效率地从环境(例如，土壤或水)样品中分离产生(次生)代谢产物(如抗生素)的未充分表征的细菌菌种。细胞破坏紫外线处理通常为0.5至400mJ/cm2、更优选在1至200mJ/cm2之间、通常在1至100mJ/cm2之间，照射的时间段为约5秒至5分钟。优选的紫外线处理是4mJ/cm230秒。
在一具体实施方式中，细胞破坏DNA损伤处理包括：以1至8小时之间、优选3至5小时之间、更优选约4小时的间隔，以每次0.5至400mJ/cm2之间，优选每次约4mJ/cm2的剂量，对样品进行至少2次，优选至少3次紫外线处理。
在一替代方法中，细胞破坏DNA损伤处理包括使所述样品与基因毒性剂，如溶剂、丝裂霉素，博来霉素类抗生素或H2O2接触。应该理解的是，基因毒性剂也可以与辐射联合使用。在一具体实施方式中，处理步骤b)包括将有效量的博来霉素(bleocin)(博来霉素(bleomycin)类抗生素的一个成员)加入至所述样品中。如实施例中所示，加入博来霉素引起显著的细胞死亡，同时允许稀有的产生代谢产物的细菌生长。
在处理期间，优选地将所述样品置于适当的培养基，例如但不限于PGY培养基(10g/L细菌用白胨、5g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖)、或者LB培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨、2.5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)。应该理解的是，其它适当的培养基是本领域技术人员已知的(Buchanan等人，1974年，Difco，1995年))或者本领域技术人员可以从这样已知培养基中制备。
处理步骤b)通常是在固体或半固体培养基中进行，例如在凝胶(例如，琼脂)存在下。最优选的处理培养基包括琼脂培养基，如软琼脂培养基。在一具体实施方式中，将TGY琼脂培养基用于生长细菌。然而，也可以使用包含碳源、氮源和无机盐的不同的固体培养基。也可以采用根据Schoenborn等人(2004年)的系列稀释技术。
在步骤c)中，从经处理样品中鉴定或分离活的或者正在生长的细菌。可利用本领域本身已知的不同手段来鉴定活的或者正在生长的细菌。在一具体实施方式中，对在培养基中形成的菌落进行鉴定。可以分离活的或者正在生长的细菌，并将其置于新鲜培养基中进行进一步培养或扩增。
如上所述，本发明的方法优选包括从经鉴定或分离的活的或者正在生长的细菌中选择一种或数种产生特定代谢产物的细菌的步骤d)。在这方面，应当指出的是，可以相继地，以任意顺序、或者同时地执行步骤c)和步骤d)。例如，在步骤b)或步骤c)中，可将样品中的细菌置于适于选择期望活性的条件下，以便在步骤c)中鉴定或分离正在生长的或者活的细菌显示期望的活性。可替代地，可将在步骤c)中鉴定或分离的细菌仅置于适于在步骤d)中选择期望的活性的条件下，以便首先在步骤c)中对正在生长的或活的细菌进行鉴定或分离，然后选择具有所期望的活性的细菌。
代谢产物可以是具有药学和/或农业化学意义的任何化合物。在一具体实施方式中，代谢产物是药用化合物(用于人用药或兽用药)，该代谢产物优选自抗生素、抑菌化合物、抗代谢物、化学治疗化合物、抗寄生虫剂、抗真菌剂、抗病毒化合物、细胞因子活性化合物或细胞生长因子。
代谢产物也可应用于例如化妆品或农业，如颜料、杀虫剂、农药、化学降解化合物等。
可以依照本领域本身已知的技术进行产生选择的代谢产物的细菌的选择和鉴定。在一具体实施方式中，步骤d)包括使步骤c)中的经鉴定或分离细菌或其提取物与一种或数种指示细胞接触，并且选择影响至少一种所述指示细胞的存活能力、生长、代谢、运动性、RNA表达、蛋白质表达、蛋白质分泌或病毒产生的细菌。
在抗生素或生物抑制剂的情况下，指示细胞通常是参照菌株，并且选择抑制生长或杀死所述参照菌株的测试细菌。
在例如抗病毒化合物的情况下，指示细胞通常是病毒产生细胞，并且选择影响病毒产生或病毒感染细胞的存活能力的细菌。
在这方面，在一具体实施方式中，本发明的方法还包括分离或纯化由所述细菌产生的代谢产物的步骤。
在一优选实施方式中，所述选择的活性是抗生素或抑菌活性的产生。本发明显示可以高效率地从依照本发明方法所处理的环境样品中分离产生抗生素的细菌。更具体地，如实施例中所述，已从不同的环境样品，包括水、土壤、动物排泄物、木材等中分离芽孢杆菌、甲基杆菌、鞘氨醇杆菌、纤维菌、Tepidimonas、诺卡氏菌、奇异球菌、特吕珀菌、产卟啉杆菌、新鞘氨醇杆菌、微小杆菌、色杆菌、节杆菌属、红球菌、微杆菌、Kineococcus sp.或威廉土氏菌的产生抗生素的细菌。
可以利用本技术领域本身已知的不同技术来进行对产生抗生素的细菌的选择(Singh，2008年，Janssen，2002年，Hamaki，2005年，Schoenborn L等人2005年)。在一具体实施方式中，将测试的细菌(或者其提取物)与一种或数种参照细菌株接触放置，并且测定测试细菌抑制参照菌株的生长或者杀死参照菌株的能力，作为抗生素活性的指征。参照菌株的实例包括但不限于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、或热带假丝酵母(Lorian，1996年)。
在这方面，本发明涉及一种鉴定或分离产生抗生素或抑菌剂的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行细胞破坏DNA损伤处理，优选反复的辐射处理，例如紫外线处理；
c)从所述经处理样品中鉴定或分离活的或正在生长的细菌；以及
d)使步骤c)中的经鉴定或分离的细菌或其提取物暴露于参照菌株，并且鉴定或分离显示抗生素或抑菌活性的细菌。
所述方法可以还包括分离或纯化由所述细菌所产生抗生素的步骤。
本发明的又一目的是一种鉴定或分离产生抗代谢物或化学治疗剂或抗真菌剂或细胞因子活性或细胞生长因子的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行细胞破坏DNA损伤处理，优选反复的辐射处理，例如紫外线处理；
c)从所述处理样品中鉴定或分离活的或者正在生长的细菌；以及
d)使步骤c)的经鉴定或分离的细菌或其提取物与一种或数种参照真核细胞接触，并且鉴定影响某些类型真核细胞的存活能力、生长、代谢、运动性、RNA表达、蛋白质表达、或蛋白质分泌的所选择细菌。
所述方法还可包括分离或纯化由所述细菌产生的抗代谢物或化学治疗剂或抗真菌剂或细胞因子活性剂或细胞生长因子的步骤。
本发明的又一目的在于一种鉴定或分离产生抗病毒化合物的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行细胞破坏DNA损伤处理，优选反复的辐射处理，例如紫外线处理；
c)从所述经处理样品中鉴定或分离活的或者正在生长的细菌；以及
d)使步骤c)的经鉴定或分离细菌或其提取物暴露于一种或数种产生病毒的细胞类型，以选择影响病毒产生或病毒感染细胞的存活能力的细菌。
所述方法还可包括分离或纯化由所述细菌产生的抗病毒剂的步骤。
本发明的方法还可包括确定所鉴定或分离的细菌的属/种的步骤。在此方面，本发明特别适合于鉴定或分离产生所选择的代谢产物的奇异球菌。
因此，在一具体实施方式中，本发明涉及一种用于鉴定或分离表现选择的活性(例如产生目的代谢产物)的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行细胞破坏DNA损伤处理，优选反复的辐射处理；
c)从所述经处理样品中鉴定或分离活的或者正在生长的奇异球菌；以及
d)选择步骤c)中表现所选择的活性的奇异球菌。
例如可以依照Hirsch(2004年)和Kampfer(2008年)的方法，对细菌进行表征和分类。生理学特性包括例如：对脂肪酸、呼吸醌类、极性脂和聚胺分布的测定，不同碳源的代谢谱分析和/或16S rDNA基因序列的确定。
此外，本发明的方法可以包括一个或数个选择具有特定特性的细菌的附加步骤。更具体地，在一优选实施方式中，所述方法还包括选择在所选择培养条件，如培养基、温度、pH值、盐度、营养素、氧合或碳源下可存活或生长的细菌的一个或数个步骤。为了此目的，可以在b)、c)或d)任一步骤中或者在之前或后继步骤中将样品或细菌置于适当的选择条件下，并且在这些步骤中的任一步骤中选择所产生的特性。
在本发明的一个具体方面中，在特定温度条件下培养细菌，以鉴定或分离可以在约4至70℃的温度范围内存活或生长的细菌。更具体地，在步骤b)、c)和/或d)期间和/或在附加的步骤(e)期间，在选择的温度下维持细菌，以鉴定或分离可以在期望的温度下存活或生长的细菌。
在本发明的另一具体方面中，在特定的盐水条件下培养细菌，以鉴定或分离可以在有可能达到约5％重量/体积的NaCl或等效盐的浓度条件下存活或生长的细菌。更具体地，在步骤b)、c)和/或d)和/或在附加的步骤(e)期间在选择的盐度下维持细菌，以鉴定或分离可以在期望的盐度下存活或生长的细菌。
在本发明的又一具体优选实施方式中，在特定的pH条件下培养细菌，以鉴定或分离可以在约3至9.5、优选4至8的pH值区间内存活或生长的细菌。更具体地，在选择的pH值下，在步骤b)、c)和/或d)期间；和/或在附加的步骤(e)期间维持细菌，以鉴定或分离可以在期望的pH值下存活或生长的细菌。
在本发明的又一具体实施方式中，在特定的氧合条件下培养细菌，以鉴定或分离可以在需氧和/或厌氧条件下存活或生长的细菌。更具体地，在步骤b)、c)和/或d)期间；和/或在附加的步骤(e)期间在所选择的氧合条件下维持细菌，以鉴定或分离可以在期望的条件下存活或生长的细菌。
在本发明的又一具体实施方式中，将细菌在特定培养基中培养，以鉴定或分离可以在所选择的碳源存在下存活或生长的细菌。更具体地，在步骤b)、c)和/或d)期间；和/或在附加的步骤(e)期间在培养基中维持细菌，以鉴定或分离可以使用期望的碳源存活或生长的细菌。
应该理解的是，可以单独地或者以任何组合来选择上述特性。例如，所述方法可用于鉴定可以在期望的温度和盐度下、或者在期望的温度和pH值下、或者在期望的温度、pH值和氧合条件下存活或生长的细菌。
此外，本发明的方法可包括利用在本技术领域任何本身已知的方法，例如生物学、基因学和/或化学对所鉴定或分离的细菌或其DNA进行修饰的步骤，所述修改的目的是例如提高所述细菌的存活能力、生长或功能，例如以便提高抗生素活性。这种修饰步骤包括但不限于细胞融合、加速进化、DNA重排、诱变、插入源自另一菌株的真核生物、原核生物或合成的核酸(例如DNA)，或者任何基因工程技术。所述修饰还可以包括将标记基因(例如耐卡那霉素)导入细菌中的步骤。
许多(市售的)抗细菌药物是天然产物的半合成类似物，经对初始发酵产物加以修饰而获得。例如酮内酯类、β-内酰胺类抗生素。因此，半合成或者甚至对抗生素生物合成中所涉及酶的操纵，可以用来提高初期的命中率(Von Nusssbaum，2006年，Marsden，1998年)。
因此，在一具体实施方式中，本发明涉及一种产生具有所选择活性的细菌的方法，该方法包括依照上述方法中的任一方法分离细菌，并且例如通过遗传学、生物学或化学处理来修饰所述细菌，以提高所述活性。
如实施例中所述，本发明的方法能够高效快速地分离产生次生代谢产物(例如，抗生素)的耐紫外线细菌。这些细菌以前不是已知的，并且可以扩展用于治疗用途或其它工业用途的抗生素活性(或者其它次生代谢产物)的多样性和谱。
因此，本发明的另一方面还在于一种可通过上述方法获得的细菌或者其提取物。所述提取物可以是从细胞培养物，如培养上清液、溶菌液、细胞膜中获得的任何制剂，或者由其衍生的富集/纯化的制剂，优选含有次生代谢产物。
所述细菌可属于不同的属，例如芽孢杆菌属、甲基杆菌属、鞘氨醇杆菌属、纤维菌属、Tepidimonas、诺卡氏菌属、奇异球菌属、特吕珀菌属、产卟啉杆菌、新鞘氨醇杆菌、微小杆菌、色杆菌、节杆菌、红球菌、微杆菌、Kineococcus、或威廉土氏菌。
本发明还涉及一种产生重组宿主细胞的方法，该方法包括按照如上定义的方法中的任一方法鉴定或分离或生产细菌并且将基因(或者基因簇或操纵子、或者相应的合成或重组核酸)从所述细菌中克隆入另一种宿主细胞，由此产生重组宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核的宿主细胞，优选原核的宿主细胞。依据在本技术领域本身已知的技术进行克隆，例如使用克隆载体(例如，质粒、噬菌体、细菌染色体等)。在一具体实施方式中，从经鉴定的细菌中分离编码所有或部分生物合成途径的基因或基因簇(例如，编码参与这种途径的酶的基因)，将其克隆入适当的载体，并插入所选择的宿主细胞，来建立新的生物合成途径。
本发明还涉及一种产生药剂(如抗生素)的方法，该方法包括依照上述方法中的任一方法鉴定或分离或产生细菌，其中所述细菌产生药剂并产生所述抗生素。药剂的生产可包括在适当条件下培养细菌(或其后代或衍生物)并且选择或纯化该药剂。该药剂的生产也可包括人工合成(例如，化学法、重组法、酶法等)。
本发明的另一目的是一种利用野生型奇异球菌株来鉴定、分离或生产药剂(如抗生素)的方法。
本发明的另一目的是利用修饰的奇异球菌株来鉴定、分离或产生药剂(如抗生素)的方法。
本发明的另一目的在于利用奇异球菌来生产药剂(如抗生素)。
本发明的另一目的是从奇异球菌中获得抗生素。
此外，本发明可用于选择细菌以及用于产生宏基因组文库。通常，从这种细菌中提取出基因组DNA并将DNA的大片段直接克隆入穿梭载体，以建立代表所述细菌的宏基因组文库。可以将这个宏基因组文库转移到不同的宿主细菌中，以鉴定产生次生代谢产物的菌株。作为一个实例，可以依照Ginolhac(2007年)来筛选用于产生聚酮化合物的酶。
此外，本发明还涉及利用微生物的改进的工业方法。实际上，本发明还提出将一种或数种细胞破坏DNA损伤处理应用于工业方法中，以除去可能的污染细菌。实际上，因为本发明的细菌能够在这种细胞破坏处理的情况下生长和生存，所以细胞破坏处理可用于例如任何工业发酵或培养装置或设备中，以避免污染。在此方面，本发明的一个具体目的也在于可利用如上所述的方法将细菌用于发酵或连续培养的方法，其中所述方法包括在开始发酵或连续培养之前或之后对细菌进行辐射的步骤，以限制其它细菌或细胞的污染。本发明的另一目的是一种将奇异球菌应用于发酵或连续培养的方法；其中该方法包括在开始发酵或连续培养之前或之后对细菌进行辐射的步骤，以限制其它细菌或细胞的污染。通常在上述条件下反复进行辐射。
将在以下实施例中公开本发明的其它方面和优点，这些实施例应当被认为是说明性的而不是限制性的。本申请中引用的所有参考文献(专利申请、专利、科技出版物)并入本文作为参考。
实施例
实施例1用于选择产生代谢产物的细菌的改进条件的确定
在预备步骤中，测试了5种菌株的耐紫外线性。这些菌株是大肠杆菌、Deinococccus radiopugnans、耐辐射奇异球菌(Deinococcusradiodurans)、奇异球菌和Deinococcus geothermalis。
依次以100至10-8稀释5种测试菌株的固定相培养物。将所有稀释液(5μL)点在富含琼脂的培养基TGY(10g/L胰蛋白胨、2.5g/L葡萄糖和5g/L的酵母提取物)上，在使用BioLink交联剂下施加不同的紫外线处理：0mJ/cm2、4mJ/cm2、17mJ/cm2、42mJ/cm2和167mJ/cm2。
以下的表1显示在不同的紫外线处理后的细菌密度
表1
Figure BPA00001406540200181
如表中所示，4mJ/cm2的处理降低大肠杆菌培养物中的细菌滴度达3个对数级。17mJ/cm2的处理在大肠杆菌和奇异球菌之间有差异。
在第二步，基于表1的结果对土壤悬液进行不同的辐射处理。以如下方法制备土壤悬液：将5g潮湿的土壤稀释在20mL蒸馏水中。在涡旋及超声处理(1分钟)后，收集土壤上清液，与350μL处于稳定生长期的Deinococccus radiopugnans培养物混合。将等分部分(50μL)散布于含抗真菌剂(环己酰亚胺，100μg/mL)的TGY琼脂上，并且测试不同的重复相继辐射处理：1次处理、2次处理和3次处理。在各紫外线处理之间设置4小时的间隔。
图1a显示一次暴露于0mJ/cm2、4mJ/cm2和17mJ/cm2后所获得的结果。图1b显示1、2和3次暴露于4mJ/cm2后所获得的结果。
如表中所示，最佳测试条件是3次暴露于每次4mJ/cm2的紫外线辐射。这种条件从经处理的土壤样品提供最高量的生长的奇异球菌。在将样品暴露于17mJ/cm2的紫外线辐射1次后，也获得了显著量的奇异球菌。
实施例2从水样品中分离耐紫外线细菌
经0.22μm硝化纤维素滤器(Millipore，法国)过滤对水样品进行浓缩，然后置于10ml无菌水的悬液中。然后对滤液进行约60秒的超声处理，使细菌再悬浮。
在超声处理后，将体积为150μl至2ml的悬液散布于固体富含PGY琼脂的培养基上，该培养基经高压蒸汽灭菌法(20分钟，120℃)灭菌，含有1g/l葡萄糖(Sigma-Aldrich，法国)、10g/l蛋白胨(Fluka，法国)和5g/l酵母提取物(Fluka，法国)。然后，以每次4mJ/cm2，以4小时为间隔，使用BLX-E254 biolink(Vilber-Lourmat，法国)对接种的培养物进行3次紫外线处理。在30至50℃下温育3至4天后，可看见目的活菌落。
将经鉴定的菌落的实例列于表2中。
实施例3从木材和卵石样品中分离耐紫外线细菌
将木材和卵石样品浸泡于无菌水中，然后进行约60秒的涡旋和超声处理。
在超声处理后，将150μl至2ml的悬液散布于固体富含PGY琼脂的培养基上，该培养基经高压蒸汽灭菌法(20分钟，120℃)灭菌，含有1g/l葡萄糖(Sigma-Aldrich，法国)、10g/l蛋白胨(Fluka，法国)和5g/l酵母提取物(Fluka，法国)。然后，使用BLX-E254 biolink(Vilber-Lourmat，法国)以每次4mJ/cm2，4小时间隔对接种的培养基进行3次紫外线处理。在30至50℃下温育3至4天后，可看见目的活菌落。
将经鉴定的菌落的实例列于下表2中。
实施例4从石块、苔藓、地衣、淤泥、沉积物、生物膜、土壤和动物排泄物中分离耐紫外线细菌
将苔藓、地衣、淤泥、土壤和动物排泄物的样品置于无菌水(V/V)的悬液中，并进行涡旋。然后对样品进行约60秒的超声处理。
在超声处理后，将150μl至2ml之间的悬液散布于固体富含PGY琼脂的培养基上，该培养基经高压蒸汽灭菌法(20分钟，120℃)灭菌，含有1g/l葡萄糖(Sigma-Aldrich，法国)、10g/l蛋白胨(Fluka，法国)和5g/l酵母提取物(Fluka，法国)。然后，使用BLX-E254biolink(Vilber-Lourmat，法国)以每次4mJ/cm2的剂量，以4小时间隔对接种的培养基进行3次紫外线处理。在30至50℃下温育3至4天后，可看见目的活菌落。
将经鉴定菌落的实例列于下表2中。
表2
  群落生境   属   分离温度(℃)
  卵石   芽孢杆菌属   30℃
  石块   甲基杆菌属   30℃
  动物排泄物   鞘氨醇杆菌属   30℃
  石块   纤维菌   30℃
  水   Tepidimonas   45℃
  水   奇异球菌属   45℃
  卵石   奇异球菌属   30℃
  腐殖土、卵石、土壤   色杆菌属   30℃
实施例5从博莱霉素处理的样品中分离细菌
在类似于实施例2的条件下，将含有Deinococccus radiopugnans菌株DRH40的土壤样品置于悬液中。代替辐射，在50μg/ml或100μg/ml博来霉素不存在(对照)或存在下维持该悬液。
在博来霉素不存在下，未观察到生长的粉红色菌落(奇异球菌)，但仅观察到土著菌群。在50μg/ml博来霉素存在下，土著菌群大幅减少，并存在粉红色菌落。在100μg/ml博来霉素存在下观察到相同现象。
实施例6产生抗生素细菌的鉴定
对于表2中所公开的耐紫外线菌株，测试其抑制细菌的数种参照菌株的生长的能力。简言之，在通气和搅拌下，在30至50℃，在含有5g/L蛋白胨、2.5g/L酵母提取物和0.5g/L葡萄糖的10ml PGY培养基中进行发酵。3天后，经琼脂扩散试验对抗在LB培养基中培养的数种参照菌株，对测试菌株的抗生素的产生进行控制和定量。
LB：10g/L细菌用胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠
PGY：5g/L蛋白胨、2.5g/L酵母提取物、0.5g/L葡萄糖
参照菌株：
金黄色葡萄球菌CIP 76.25
大肠杆菌CIP 76.24
热带假丝酵母CIP 1275
将结果描述于下表3中。
表3
Figure BPA00001406540200221
0：未见抗菌作用；+：可见抗菌作用
结果显示已分离了显示抗生素活性的数种菌株。这些菌株产生有效对抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和/或热带假丝酵母的抗生素活性。所述产生菌株耐紫外线并且可以在高温下生长，因此说明了本发明方法的功效。
实施例7抗生素产生筛选分析
7.2材料和方法
培养基
制备用于测试抗生素生产的不同培养基。
由0.1g MnCl2.4H2O、0.1g ZnSO4.7H2O和0.1g FeCl3组成100mL溶液A。
由来自5g/L酪蛋白的细菌用蛋白胨、3g/L细菌用酵母提取物组成培养基1，并调节至pH 7.1。
由10g/L纤维二糖、1g/L K2HPO4、1g/L MgSO4.7H2O、1g/L NaCl、2g/L(NH4)2SO4、2g/L CaCO3组成培养基2，并调整至pH 7.2。以1ml/L加入溶液A。
由20g/L燕麦片和1mL/L溶液A组成培养基3。
测试菌株的培养制备物
在5mL PGY液体培养基中对菌株进行温育。然后，在150rpm的振摇下，在30℃或45℃下对预培养物进行48小时温育。
在15mL玻璃管中，在5mL的培养基1至培养基3中对100μL预培养物进行温育。然后，在150rpm的振摇下，在30℃或45℃下对于培养物进行48小时、96小时、168小时和336小时的温育。
靶菌株的培养制备物
靶菌株是金黄色葡萄球菌CIP76.25、大肠杆菌CIP 76.24、绿脓假单胞菌CIP 76.110、肺炎链球菌CIP 104485和热带假丝酵母DSM 1346。
在37℃下将他们在LB培养基上培养18小时。然后，以2％(v/v)将10mL软琼脂(带7g/L琼脂的Luria Bertani培养基)与靶菌株的预培养物一起接种于有盖培养皿中。
抗生素生产的评价
在30℃和45℃下温育培养48、96、168和336小时后，以13000rpm将1mL测试培养物离心3分钟。然后，在0.22μm滤器过滤上清液。将10μL经过滤的培养物上清液接种于含目标菌株的软琼脂上。在37℃下温育18小时后，可观察到溶菌斑。
7.2结果
表4显示了所获得的不同抗生素谱的实例。Kineococcus菌株M10-5H产生对抗革兰氏阳性试验菌株和大肠杆菌CIP 76.24的抗生素。奇异球菌菌株MC5-7F产生对抗金黄色葡萄球菌CIP 76.25的抗生素。微杆菌菌株MA3-7G产生对抗热带假丝酵母CIP 1275的抗生素，威廉土氏菌株MA3-6B产生对抗革兰氏阳性试验菌株和绿脓假单胞菌CIP76.110的抗生素。
表4抗生素生产试验的结果
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Claims (22)

1.一种鉴定或分离产生代谢产物的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行反复的辐射处理；
c)从所述经处理样品中鉴定或分离活的或者正在生长的细菌；以及
d)选择步骤c)中产生代谢产物的细菌。
2.权利要求1的方法，其中所述样品是环境样品或者来自环境样品，优选获自或来自土壤、水、温泉、海洋环境、淤泥、木材、石块、苔藓、植物提取物、地衣、生物材料、沉积物、泥炭地、生物膜、工业废水、气体、沙子、油、污水、动物或人排泄物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述反复辐射处理是将大肠杆菌培养物中的细菌滴度降低至少2个对数级的处理。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述处理包括反复的辐射，所述辐射选自紫外线、γ射线和/或X射线辐射，单独地或者组合进行辐射，最优选反复的紫外线辐射。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述处理包括反复辐射，间隔为1至8小时之间、优选为3至5小时之间、最优选为约4小时。
6.权利要求4或5的方法，其中所述处理包括以1至8小时的间隔，对所述样品进行至少2次优选至少3次的紫外线处理，每次紫外线处理在0.5至400mJ/cm2之间、优选在1至200mJ/cm2之间、通常在1至100mJ/cm2之间。
7.权利要求1至6任一项的方法，还包括选择奇异球菌的步骤。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤b)在固体培养基中进行。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤c)中鉴定或分离菌落。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)和d)是以任意顺序顺序地进行、或者同时进行。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤d)包括使步骤c)中鉴定或分离的细菌或其提取物暴露于一种或数种指示细胞，并且选择影响至少一种所述指示细胞的存活能力、生长、代谢、运动性、RNA表达、蛋白质表达、蛋白质分泌或病毒产生的细菌。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中该方法包括分离或纯化所述代谢产物的进一步的步骤。
13.前述权利要求任一项的方法，其中所述代谢产物是药用化合物，优选自抗生素、抑菌化合物、抗代谢药、化学治疗化合物、抗寄生虫剂、抗真菌剂、抗病毒化合物、细胞因子活性化合物或细胞生长因子。
14.一种鉴定或分离产生抗生素或抑菌化合物的细菌的方法，该方法包括：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对所述样品进行反复的辐射处理，优选反复的紫外线处理；
c)从所述经处理样品中鉴定或分离活的或正在生长的细菌；以及
d)使步骤c)中鉴定或分离的细菌或其提取物暴露于参照菌株，并且鉴定或分离显示抗生素或抑菌活性的细菌。
15.权利要求14的方法，还包括分离或纯化由所述细菌产生的抗生素或抑菌化合物的步骤。
16.前述权利要求中任一项的方法，其还包括选择在选择的培养条件，如培养基、营养素、温度、pH值、盐度、氧合、共培养、生物反应器或碳源下存活或生长的细菌的步骤。
17.前述权利要求中任一项的方法，其还包括以生物学、遗传学和/或化学方法对鉴定或分离的细菌或它们的DNA进行修饰以提高所述细菌的存活能力、生长或功能的步骤。
18.一种可通过权利要求1至17中任一项的方法获得的细菌，或其提取物。
19.权利要求18的细菌，其属于芽孢杆菌属(Bacillus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、纤维菌属(Cellulosimicrobium)、Tepidimonas、诺卡氏菌属(Nocardia)、奇异球菌属(Deinococcus)、特吕珀菌属(Truepera)、产卟啉杆菌(Porphyrobacter sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)、微小杆菌(Exiguobacterium sp.)、色杆菌(Chromobacterium sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)、微杆菌(Microbacteriumsp.)、Kineococcus sp.或威廉土氏菌(Williamsia sp.)。
20.一种产生优选自抗生素或抑菌剂或抗真菌剂或抗寄生虫剂或抗病毒剂或抗代谢药剂或化学治疗剂或细胞因子活性化合物或细胞生长因子的药用化合物的方法，该方法包括根据权利要求1至17中任一项的方法鉴定或分离产生药用化合物的细菌，并且产生所述药用化合物。
21.奇异球菌在产生优选自抗生素或抑菌剂或抗寄生虫剂或抗真菌剂或抗病毒剂或抗代谢药剂或化学治疗剂或细胞因子活性化合物或细胞生长因子的药用化合物中的应用。
22.一种生产重组宿主细胞的方法，该方法包括鉴定或分离根据权利要求1至17中任一项的细菌，并且将一个或数个基因或者相应的合成或重组核酸从所述细菌克隆至另一种宿主细胞中，由此产生重组宿主细胞。
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