CN104583391A - 异常球菌细菌的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在适于允许异常球菌(Deinococcus)生长并降低至少一种其它微生物生长的条件下，使用氧化剂对异常球菌或其相关细菌进行培养的方法。

Description

异常球菌细菌的培养方法
技术领域
本发明涉及用于对异常球菌(Deinococcus)或相关细菌进行培养的改进方法。更具体地，本发明涉及使用氧化剂对异常球菌或其相关细菌进行培养(例如生长、发酵或维持)的方法，以及氧化剂在有利于其它微生物中生长异常球菌或其相关细菌的培养方法或培养介质中的用途。本发明可用于发酵方法(例如，用来制备感兴趣的化合物)。本发明还涉及适于实施发酵方法的设备，该设备通过联合使用氧化剂和异常球菌细菌得以优化。
背景技术
现有技术已经提出使用微生物进行发酵、生物生产或对复杂基质进行降解或修饰。
可使用发酵方法生产大量的微生物酶(例如过氧化氢酶、脂酶等)、代谢物(例如乙醇、氨基酸、维生素等)、重组产物(例如胰岛素、干扰素等)和/或对基质进行生物转变，生成的发酵产物应用于多种工业，包括化学、制药、生物技术和食品工业。
一般而言，在适于进行发酵方法的系统中引入选定微生物的纯培养物，该系统进一步含有灭菌的生长介质。
然而，发酵方法的一个主要限制仍在于污染所述培养物的微生物的存在和增加。
目前，在接种选定微生物之前，使用加热、辐射和/或酸/碱对设备进行除污(decontaminate)。然而，这样的除污是非选择性的，在发酵过程中不能实施。即使之前对设备和/或培养介质进行过灭菌，根除污染却常常不能令人满意，至少部分污染物与选定微生物和/或培养介质被共同接种于设备中。此外，如果发酵方法是连续的，培养介质的上游流供应至设备。由于上游流可能含有另外的污染物，该外源供应可能增加发酵方法污染的风险。
这些污染物对发酵方法的实施具有重要影响。污染微生物可与最初接种的选定微生物竞争和/或消除所述选定微生物。在重新用新鲜培养介质和选定微生物装载设备之前，常常需要中断发酵方法，排空并清理设备。
有时，在发酵器中加入抗生素以抑制部分污染物。然而，虽然这通常是有效的，但抗生素具有数个缺陷。除成本外，一个缺陷在于抗生素存在于整个发酵过程并最终处于副产物中。抗生素的第二个缺陷在于，随着时间流逝，一些细菌可变得耐受，导致抗生素的使用效果变弱。
目前，不能确定无疑地避免这些污染事件，该污染事件对设备的利润率和生产成本产生影响。
近几十年来，开发了使用异常球菌细菌进行生物燃料(例如乙醇)的发酵和提取的工业方法。这些工业方法具有的发酵生物质和从中生产有用代谢物的能力使其参与到改进方法的开发中，这些改进方法能够使得发酵产物更便宜并且更易于提高品质。
就这一点而言，异常球菌细菌在应用于工业方法或反应方面具有有价值的性质。具体而言，WO2009/063079描述了异常球菌属的细菌在由生物质生产生物能源产物和代谢物方面的用途。
WO2010/094665描述了异常球菌属的细菌具有在适于工业方法的条件下水解木质纤维素生物质的主成分的能力，所述木质纤维素生物质的主成分包括纤维素、半纤维素(主要是木聚糖)和木质素。WO2010/081899公开了异常球菌细菌生产有价值的药物(包括抗生素)的能力。
由于这些工业方法通常需要非常大量的细菌、大的发酵器、原料基质和/或使用高的灭菌条件，明确适于维持感兴趣的细菌的生长和活性、且在生产过程中污染低的、具有成本效益的条件和方法是重要的。
通过对异常球菌进行进一步的实验和研究，本发明人展示了与参照细菌和酵母(例如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)、大肠杆菌(E.Coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae))相比，异常球菌属的细菌表现出对氧化剂(例如过氧化氢)更高的耐受性。进一步地，本发明人显示可在存在氧化剂、适于对培养物进行充氧、防止、减少或遏制其它微生物污染、利于异常球菌生长并允许异常球菌生物活性最佳的条件下对异常球菌进行培养。
更具体地，可在发酵方法中有利地使用异常球菌，其中，氧化剂有助于减少耐受性较低的感染性微生物的污染。使用对异常球菌非致死的适量的氧化剂(例如H2O2)可根除大部分的微生物或至少对其产生影响。
发明内容
因此，本发明的一个方面涉及一种异常球菌或其相关细菌的培养物，所述培养物包含至少一种氧化剂。
本发明还涉及一种对异常球菌或其相关细菌进行培养的方法，所述方法包括：在氧化剂的存在下，对所述细菌进行培养。可在方法的任何时刻加入或供给所述氧化剂，所述时刻例如在加入所述细菌之前、同时和/或之后。还可反复或连续地将所述氧化剂供给或加入至所述培养物。
本发明还可用于在发酵或生物产物方法中对异常球菌或其相关细菌进行培养、生长或增加，有倾向性或选择性对这样的细胞进行增殖，对这样的细胞进行识别或选择，将生物质降解或转变，对基质或环境进行脱毒；更一般而言，本发明可用于包括使用异常球菌或其相关细菌的任何反应或方法中。
本发明还涉及包含发酵器或反应器的系统或设备，所述发酵器或反应器包含异常球菌或其相关细菌以及氧化剂源。
本发明进一步涉及至少一种氧化剂在异常球菌或其相关细菌的培养、维持或生长的方法方面的用途。
本发明还涉及对异常球菌或其相关细菌的培养物进行灭菌或除污的方法，所述方法包括将所述培养物暴露于氧化剂。
本发明还涉及使用异常球菌或其相关细菌并组合使用过氧化氢，由培养介质生产感兴趣的化合物的发酵方法。
在本发明中，优选在允许异常球菌或其相关细菌生长的条件下使用至少一种氧化剂，所述允许异常球菌或其相关细菌生长的条件例如：低于所述氧化剂对所述异常球菌或其相关细菌的抑制浓度(“ICD”)。优选地，在至少一种其它微生物(例如，如大肠杆菌)的生长受到抑制或减慢的条件下使用所述氧化剂。在典型的实施方式中，以0.05ICD-0.95ICD、更优选以0.25ICD-0.90ICD的浓度使用(例如加入或维持)所述氧化剂。
就这一点而言，在具体实施方式中，本发明涉及氧化剂在对培养介质进行选择性除污以及使异常球菌或其相关细菌免遭损失方面的用途。氧化剂作为潜在的抗菌剂，促进异常球菌的生长，并降低培养介质中污染物的风险。该选择性除污可用于在其它微生物中选出异常球菌，和/或使用异常球菌或其相关细菌改进发酵方法。
此外，在发酵方法(即降解步骤，其中生物质被降解为可发酵糖)早期使用氧化剂可利于培养介质的充氧，从而降低对外源氧的需求。
此外，可用H2O2对生物质(例如木质纤维素生物质)进行预处理。H2O2可部分降解木质素。这一去木质化作用增强了异常球菌使用木质纤维素生物质作为碳源的能力，进而改进发酵方法。此外，使用H2O2至少部分地替代加热预处理，可有利地减少抑制细菌生长的外源性化合物(例如羟甲基糠醛和糠醛)的形成。由于异常球菌对H2O2耐受，可在除污和对生物质的预处理中均使用H2O2，在微生物生产方法(例如发酵方法中)组合使用异常球菌和H2O2是特别令人感兴趣的。
因此，在优选实施方式中，本发明涉及异常球菌或其相关细菌的培养方法，其中，在允许异常球菌或其相关细菌生长、且减慢至少一种其它微生物生长的条件下使用至少一种氧化剂。
所述氧化剂优选选自于溴、溴酸盐、氯化异氰化物、氯酸盐、铬酸盐、重铬酸盐、氢过氧化物(hydroperoxides)、次氯酸盐、无机过氧化物、过氧化酮、硝酸盐、硝酸、过硼酸盐、高氯酸盐、高氯酸、高碘酸盐、高锰酸盐、过氧化氢、臭氧、过氧化物、过氧酸和过硫酸盐。更优选地，所述氧化剂为过氧化氢。
本发明可用于在至少一种其它微生物中对异常球菌或其相关细菌进行选择，所述至少一种其它微生物例如竞争性细菌(例如运动发酵单胞菌、大肠杆菌)、致病真菌、酵母(例如酿酒酵母)等。
本发明还可用于制备含有异常球菌或其提取物的发酵起始物。
可进一步将本发明用于对生长介质进行发酵，优选在发酵系统(例如发酵器、生物反应器或恒化器)中使用。
可进一步将本发明的方法用于将基质生物转化为感兴趣的物质，例如将脂肪族化合物转化为二元羧酸。
本发明进一步的目的涉及发酵器(例如发酵罐、生物反应器或恒化器)，所述发酵器含有生长介质、至少一种氧化剂或氧化剂源、异常球菌或其相关细菌或者所述异常球菌或其相关细菌的提取物。
本发明进一步的主题涉及氧化剂在发酵器中的用途，所述发酵器处于允许异常球菌或其相关细菌生长、且减慢至少一种其它微生物生长的条件下。
本发明还涉及在使用异常球菌细菌，减少微生物生产过程中发酵器内细菌污染的方法，其中，所述方法包括将H2O2加入所述发酵器。
本发明进一步的主题涉及使用细菌进行发酵的方法，其中，所述细菌是异常球菌或其相关细菌，所述方法在H2O2的存在下进行。
在对本发明进行更具体的描述后，本发明的上述主题和其它目的以及实施方式将变得更加清楚。
附图说明
图1显示出H2O2对于M36-7D_21生长随时间的影响的图。在M36-7D_21培养开始时或指数生长时供给H2O2。
具体实施方式
与其它微生物相比，异常球菌或其相关细菌对氧化剂具有更高的耐受性，可将这一点有利地用于促进异常球菌或其相关细菌的生长，并改进使用异常球菌细菌的方法。由于氧化剂的使用与允许异常球菌生长和生产发酵产物的条件均相容，适量的氧化剂不仅可作为初步的除污剂使用，还作为在整个发酵过程中的选择性除污剂使用。
如下是对于本发明的描述，包括以一般性术语给出对其优选实施方式的描述。在本公开文本中，标题为“实施例”下的内容给出对本发明进一步的示例性说明，所述实施例提供了支持本发明的实验数据、根据本发明的发酵方法的实例以及实施本发明的方式。
定义
参照以下定义，将最好地理解本公开文本。
在本发明的上下文中，术语“异常球菌”包括野生型异常球菌或异常球菌的天然变异株(例如通过加速进化、通过DNA改组技术(DNA-shuffling technologies)获得的菌株)，或者，通过插入真核的、原核的和/或合成的核酸获得的重组菌株。异常球菌细菌可以指异常球菌属的任何细菌，例如但不限于如下细菌：中度嗜热异常球菌(D.geothermalis)、解纤维异常球菌(D.cellulolysiticus)、耐辐射异常球菌(D.radiodurans)、解蛋白异常球菌(D.proteolyticus)、抗辐射异常球菌(D.radiopugnans)、嗜放射异常球菌(D.radiophilus)、大异常球菌(D.grandis)、印度异常球菌(D.indicus)、冻僵异常球菌(D.frigens)、岩生异常球菌(D.saxicola)、马里科帕部落异常球菌(D.maricopensis)、大理石异常球菌(D.marmoris)、沙漠异常球菌(D.deserti)、墨氏异常球菌(D.murrayi)、气生异常球菌(D.aerius)、网纹异常球菌(D.aerolatus)、嗜气异常球菌(D.aerophilus)、D.aetherius、D.alpinitundrae、高地异常球菌(D.altitudinis)、D.apachensis、水生异常球菌(D.aquaticus)、水产异常球菌(D.aquatilis)、D.aquiradiocola、水活异常球菌(D.aquivivus)、淤泥异常球菌(D.caeni)、D.claudionis、无花果异常球菌(D.ficus)、戈壁异常球菌(D.gobiensis)、D.hohokamensis、D.hopiensis、D.misasensis、纳瓦河部落异常球菌(D.navajonensis)、D.papagonensis、D.peraridilitoris、D.pimensis、鱼异常球菌(D.piscis)、D.radiomollis、蔷薇异常球菌(D.roseus)、索诺拉沙漠异常球菌(D.sonorensis)、乌鲁木齐异常球菌(D.wulumuqiensis)、西北异常球菌(D.xibeiensis)、新疆异常球菌(D.xinjiangensis)、低地异常球菌(D.yavapaiensis)或云微所异常球菌(D.yunweiensis)。优选的异常球菌细菌为中度嗜热异常球菌、解纤维异常球菌、沙漠异常球菌、墨氏异常球菌和耐辐射异常球菌。
与异常球菌“相关的”细菌是指具有如下特征的细菌：(i)含有的16S rDNA，在使用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA(SEQ ID NO：1)和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA(SEQ ID NO：2)扩增后，产生约158个碱基对的片段；和/或(ii)对4mJ/cm2的UV处理具有耐受性。在具体实施方式中，异常球菌相关细菌是具有16S rDNA分子的细菌，所述16S rDNA分子在序列上与异常球菌16S rDNA序列具有至少70％、优选至少80％的一致性。
“氧化剂(oxidizer)”或“氧化剂(oxidizing agent)”是指可将氧原子转移至基质和/或自发降解生成氧的物质。所述氧化剂可为液体、气体和/或固体形式。所述氧化剂优选为生物相容的，例如适于在微生物的培养方法中使用。优选地，所述氧化剂是过氧化氢。
在本发明的上下文中，术语“生长介质”或“培养介质”是指适于为微生物(例如异常球菌或其相关细菌)的生长提供支持的介质。所述生长介质典型地至少包含碳源、氮和氨基酸源以及磷源。所述生长介质可优选地包含化合物，例如选择性地抑制和/或选择性地增强特定微生物生长的抗生素。在具体实施方式中，所述生长介质可包含产生特定化合物所必须的基质，例如生物转变方法中使用的基质。在具体实施方式中，所述生长介质包含生物质或由生物质组成。
根据本发明的术语“生物质”典型地指来自于活的生物体或不久前还活着的生物体的任何生物材料。具体而言，术语“生物质”包括生物来源的未加工的材料，包括植物或动物生物质。生物质的实例包括但不限于林产品，包括不适用于制成木料(lumber)或造纸的成熟树木、纸浆、再生纸、有机废物、农产品(如草、稻草、作物)和厩肥、以及水产品(如藻类和海草)。生物质的实例包括来源于多种类型植物的植物材料或木材，所述植物包括芒草(miscanthus)、大麻、柳枝稷(switchgrass)、甜菜、小麦、大麦、玉米、水稻、大豆、油菜籽(包括芥花籽(canola))、高粱、甘蔗、花生、棉花、羽扇豆以及从桉树到油棕榈、白杨、柳树的各树种。生物质的具体来源包括但不限于植物残体、硬木茎干或软木茎干、玉米芯、稻草、草、叶、种子、纸等(参见例如Sun等，BioresourceTechnology，83(2002)，1-11)。术语“生物质”还涵盖主要包含水解预处理生物质产物的二次生物质或转变生物质。在优选实施方式中，根据本发明的生物质包括任何木质纤维素材料，例如纤维素、半纤维素和/或木聚糖。
根据本发明的术语“木质纤维素生物质”是指含有木质素、纤维素和/或木聚糖的原料生物质。术语“木质纤维素生物质”主要指未加工的生物来源的材料。术语“木质素生物质”应与转变生物质或二次生物质相区别，所述转变生物质或二次生物质主要包含水解预处理的生物质产物。木质纤维素生物质的实例包括但不限于来源于多种类型的植物的植物材料或木材，所述植物包括芒草、油菜籽、柳枝稷、大麻、甜菜、小麦、玉米、白杨、柳树、高粱、甘蔗以及从桉树到油棕榈的各树种。
在本发明的上下文中，术语“发酵方法”是指借助微生物，由碳源生产产物的任何方法。发酵方法包括化学反应(例如氧化、还原、聚合以及水解)以及生物合成；发酵方法可要求有空气存在或无空气存在。优选地，可在生成感兴趣的化合物的专用的设备或发酵器中进行所述发酵方法。
在本发明的上下文中，术语“生物转变”或“生物转化”是指细菌或其提取物介导的、将给定基质转化为感兴趣的物质的活动。所述基质与碳源相区别，且通常不被细菌同化。
术语“发酵器”包括发酵系统，所述发酵系统包含一个或多个容器和/或塔器或管线设置。如下文所述，在一些实施方式中，发酵器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。从而，当涉及到将氧化剂加入所述发酵器或发酵反应时，应理解为包括适当时，将所述氧化剂加入上述两个反应器或其中的任意一个。
在本发明的上下文中，“氧化剂对微生物的抑制浓度”(“IC”)是指在培养介质中使得所述微生物的生长受到抑制或减慢，从而在培养3天后、优选2天后没有可检测到的所述微生物生长的所述氧化剂的最小浓度。“氧化剂对异常球菌或其相关细菌的抑制浓度”(“ICD”)是指在培养介质中使得异常球菌的生长受到抑制或减慢的所述氧化剂的最小浓度。使用测试培养，易于对各微生物或微生物的各菌株、各氧化剂的IC进行确定。例如，可在数个平行培养中对感兴趣的菌株进行培养，每一培养物中含有浓度提高的氧化剂。在2天或3天后，对培养物进行观测，测量微生物生长，从而确定所述IC。
培养方法
本发明人发现，在培养介质中使用至少一种氧化剂可有助于维持有利于异常球菌或其相关细菌生长的条件，并减少其它微生物的生长。
本发明人还发现，氧化剂的存在可改善异常球菌的培养/发酵性能。因此，可将本发明用于异常球菌细菌的培养、生长、发酵和/或分离/选择的改进方法。
发酵方法
如上所表明的，微生物污染，例如细菌、病毒或真菌污染可对发酵方法造成严重破坏，导致在对发酵方法进行重复前，需要停止生产线、排空并清理设备。即使使用预先除污方案，在进行发酵前对设备进行灭菌，仍可在设备中留下微生物污染、和/或由生长介质造成微生物污染、和/或由含有必须接种的选定微生物的培养介质造成微生物污染。
因此，本发明的目的在于，提出使用异常球菌的改进发酵方法，其中，使用氧化剂减少或消除对所述氧化剂耐受性较低的感染性微生物的污染。
可将本发明的发酵方法用于生产大量的微生物酶(例如过氧化氢酶、脂酶等)、代谢物(例如乙醇、氨基酸、维生素等)、重组产物(例如胰岛素、干扰素等)和/或对基质进行生物转变，将生成的发酵产物应用于多种工业，包括化学、制药、生物技术和食品工业。
一方面，本发明提供了改进的发酵方法，所述发酵方法通过使用异常球菌或其相关细菌并组合使用氧化剂(更具体而言是使用H2O2)，适用于生产多种化合物。
更具体而言，本发明提供了改进的发酵方法，所述发酵方法通过使用异常球菌或其相关细菌并组合使用H2O2，用于由生物质生产感兴趣的化合物。
在发酵过程中，H2O2特别有用。事实上，加入的H2O2与允许异常球菌生长以及生产发酵产物的条件均相容。适量的H2O2不仅可用作最初的除污剂，还用作整个发酵方法中的选择性除污剂。
可在无抗生素或与目前的发酵方法相比减少量的抗生素存在下进行这样的发酵方法。在一个实施方式中，可用氧化剂代替抗生素，以减少发酵过程中污染性微生物的量。
在具体实施方式中，所述发酵方法包括如下步骤：
a)将包含碳源的生长介质与氧化剂接触；
b)在适于异常球菌或其相关细菌的培养和/或生长的条件下，将所述生长介质与所述异常球菌或其相关细菌接触；
c)对异常球菌进行培养，生产感兴趣的化合物；以及任选地，
d)收集由所述发酵获得的所述感兴趣的化合物。
根据本发明，根据所述培养介质、培养体积、化合物等，步骤a)和b)可同步进行或按次序进行。
可实施本发明的发酵方法以生产各种产物。本领域技术人员易于通过对培养介质的组成/性质、氧化剂和/或异常球菌等的量进行调节，将条件调整为有利于生产感兴趣的产物，从而回收最佳量的所述感兴趣的产物。
在具体实施方式中，使用发酵方法生产代谢物(例如氨基酸、蛋白(包括酶)、维生素、醇等，用于人类和/或动物的消耗或工业用途)、通过生物转变对化合物进行修饰、生产重组产物以及生产微生物自身(例如用作动物饲料)。
根据本发明，培养介质可含有生物质。
在具体实施方式中，培养介质还可包含有利于异常球菌生长和/或感兴趣的化合物的生产/生物转变的一种或多种物质(例如氨基酸、维生素或矿物盐)。
有利于异常球菌细菌生长的最佳条件由本领域技术人员设定。同样地，本领域技术人员知晓用于生产给定化合物所需的基质和/或碳源。可易于由本领域技术人员调整的发酵方法的实例在如下文献中公开：WO2009/063079有关产生生物能源产物，和/或WO2010/081899关于生产药物化合物；和/或WO2010/094665关于生产可发酵糖。
选择方法
在进一步的方面，本发明提供了从含有几种微生物的样品中选择性培养异常球菌的方法。
事实上，与其他微生物(包括细菌、真菌、病毒)相比，异常球菌属的细菌对氧化剂(例如过氧化物，例如H2O2)具有更高的耐受性，该更高的耐受性对于在其它非典型(uncharacterized)微生物中对异常球菌细菌进行分离/选择而言是有用的。
在一个实施方式中，在允许异常球菌或其相关细菌生长、并使得至少一种其它微生物的生长减慢的合适条件下，使包含非典型微生物的样品暴露于氧化剂。随后，可从处理后的样品分离活的、生长着的微生物，并进一步选择异常球菌或其相关细菌。
在具体实施方式中，可进一步调整培养参数以实现所述选择。例如，可将培养物的pH维持在4-10和/或将培养物的温度维持在4℃-70℃。
为了处理具体情况，本领域技术人员可易于对培养条件进行调整。
另一方面，本发明提供一种制备发酵起始物的方法，所述发酵起始物包含异常球菌或其相关细菌、或异常球菌或其相关细菌的提取物。所述起始物一般用于至少在发酵方法初期的引发和/或辅助。
除其它成分以外，本发明的发酵起始物优选包含异常球菌或其相关细菌的培养物、或者异常球菌或其相关细菌的提取物。例如，在对异常球菌或其相关细菌进行培养和/或选择后，将所述细菌转变为具有适当的培养介质和任选的添加成分(例如外源酶、抗生素等)的糊状物(paste)。
可将本发明的发酵起始物用于数种发酵方法，更具体而言，用于降解生物质的发酵方法。优选地，将合适量的发酵起始物与生物质混合以启动发酵方法。根据例如生物质和/或发酵产物，可易于对发酵起始物的量进行调整。
本发明方法的氧化剂供给
本发明中，根据发酵方法，可一次性、连续或定期加入氧化剂。并且，可使用合适的传感器，在整个方法中对氧化剂的浓度进行控制或监控。例如，通过加入更多量的氧化剂，或者相反地，通过进一步加入稀释剂和/或新鲜培养介质和/或新鲜微生物，可对所述浓度进行调节。
可对本发明的发酵方法进行调整以用于各种类型的发酵方法，包括分批处理、补料分批处理和连续处理。为了处理具体情况，本领域技术人员易于对培养条件进行调整。
在一个实施方式中，在发酵器中加入额外量的氧化剂并立即加入新鲜培养介质，从而将氧化剂的浓度保持在适于影响微生物污染物的生长而不抑制所述异常球菌的生长。
例如，当使用分批处理实施发酵方法时，可在提供新一批物料的各时间点使用单剂量的氧化剂，优选将所述氧化剂与该新一批物料混合。
当使用连续处理实施发酵方法时，其中，将新鲜培养介质连续加入恒化器，也可将氧化剂连续加入，优选将所述氧化剂与所述新鲜培养介质一起加入。
在另一实施方式中，对氧化剂的浓度进行定期检查，如有需要，将调整量的氧化剂加入。
在一个实施方式中，可将两个或更多恒化器串联，在后一恒化器中，对前一恒化器的溢流(overflow)进行回收。优选地，系统的各恒化器装有氧化剂的剂量，否则或另外，可将所述氧化剂与所述溢流一起供给以减少恒化器间交叉污染的风险。
在具体实施方式中，可仅在方法的降解步骤使用氧化剂。优选地，在发酵步骤本身进行过程中，不再使用氧化剂。在降解步骤进行过程中，优选通过在培养介质中供给氧化剂，其在培养物中产生氧，从而满足对氧的需求。例如，可在降解步骤进行过程中，使用过氧化氢作为氧化剂。过氧化氢对培养物进行除污，并自发分解为水和氧。由于在培养物中内源产生氧，不再需要外源氧。在方法的第二部分(即发酵步骤)进行过程中，不再进一步加入氧化剂。由于之前氧化剂已经分解，培养物中不含氧化剂，也不含氧。从而实现在无氧条件下实施发酵步骤。
在进一步的实施方式中，在用培养介质填装所述发酵器之前、填装发酵器时或填装发酵器之后，将氧化剂与微生物的混合物接种于发酵器中。氧化剂是作为从微生物的混合物中去除非耐受性微生物的选择剂，使用这样的方式选择至少一种异常球菌或其相关细菌。例如，为抑制除异常球菌外的大部分微生物的生长，可使用最多200mM、优选最多180mM的H2O2。
此外，通过改变培养条件(例如温度、pH、浓度、反应时间、存在/不存在催化剂等)，增加氧化剂的选择性致死效果。例如，与不生长的细菌相比，指数生长的细菌对H2O2更敏感。
同样地，为致力于针对选定微生物的致死性，可将助剂与氧化剂共同使用。例如，通过将H2O2与抗坏血酸组合，可选择性地消除革兰氏阴性细菌。否则或另外，可同时使用两种或更多种氧化剂。
在本发明中，优选在允许异常球菌或其相关细菌生长的条件下(例如低于所述ICD)，使用所述至少一种氧化剂。优选地，在使得至少一种其它微生物(例如大肠杆菌)的生长受到抑制或减慢的条件下，使用所述至少一种氧化剂。
在典型的实施方式中，在0.05ICD-0.95ICD(即所述ICD的5％-95％)的浓度(例如最多0.1ICD、0.2ICD、0.3ICD、0.4ICD、0.5ICD、0.6ICD、0.7ICD、0.8ICD或0.90ICD)使用(例如加入或维持)所述至少一种氧化剂。根据所使用的细菌、方法条件、氧化剂和/或培养系统的性质，本领域技术人员可对该浓度进行调节。
作为实例，为至少去除大肠杆菌、酿酒酵母和/或运动发酵单胞菌，可在10mM-300mM、优选30mM-180mM的浓度使用或维持H2O2。
对木质纤维素生物质的预处理
自20世纪70年代以来，木质纤维素生物质的转化一直就是深入研究工作的课题(Blumer-Schuette等，2008，“Extremely thermophilicmicroorganisms for biomass conversion:status and prospects”，CurrOpinion Biotechnol，19，第210-217页；Perez等，2002，Int Microbiol，5，第53-63页)。如Mosier等所报道的(Bioresource Technology 96(2005)673-686)，对木质纤维素生物质的预处理需要改变纤维素生物质的结构，从而使得纤维素更易于接近酶，该酶将所述碳水化合物聚合物转化为可发酵糖。
在该上下文中，本发明的方法提议使用氧化剂通过部分降解木质素以对木质纤维素生物质进行预处理。该去木质化增加了异常球菌使用木质纤维素生物质作为碳源的能力，并改进了发酵方法。
例如，可在1mM-1M的浓度范围使用氧化剂对木质纤维素生物质进行预处理，使得木质素被部分消化或增溶(solubilisation)。
可在足以降解至少10％、优选20％-80％的木质素的时间段内进行预处理步骤。随后，如果需要，在接种细菌前，可加入水或其它合适的稀释剂对获得的混合物进行稀释，从而将氧化剂的浓度降至允许异常球菌细菌生长的范围内。
发酵器
本发明的一个目的在于提供发酵器，所述发酵器含有实施本发明的发酵方法专用的装置。
根据本发明，可在发酵器中实施发酵方法，所述发酵器的容量/体积可为数升至数千升之间变化。
优选地，发酵器包含专用的装置，例如注射装置，适于将所需量的氧化剂递送至发酵器。
在具体实施方式中，发酵器包含分布器(例如Sartorius的环形分布器)，所述分布器用于将氧化剂递送并扩散到发酵器中。
在具体实施方式中，可在发酵部位上直接产生氧化剂。所述在发酵部位上产生氧化剂对于避免不稳定氧化剂的传送和储存而言是有用的。例如，如Rusty Pittman等(“On site production of Hydrogen peroxide”，UOP LLC-2003)所述的，可通过氢和氧的直接合成而产生H2O2。
此外，可进一步提供将氧化剂输送至容器的装置，例如管线。例如，所述管线可为仅运输氧化剂的专用管线。或者，所述管线可为将培养介质和/或微生物和氧化剂交替或同时输送至发酵器的通用管线。
发酵器可进一步包含用于保持温度恒定的热交换器或恒温器。更具体而言，为了对氧化剂分解为氧造成的温度升高进行平衡，可设置制冷装置。
在具体实施方式中，发酵器不含充气装置，由氧化剂供给所需氧。
在一个实施方式中，发酵器包含在发酵过程中对氧化剂的浓度进行测量/控制的传感器和/或控制系统。
更一般而言，本领域技术人员为实施发酵方法，易于对发酵器的设计进行调整。
实施例
实施例1：确定过氧化氢对野生型和重组型异常球菌细菌的抑制浓度(IC)方案
参照菌株
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)DSM424，30℃；
大肠杆菌(Escherichia coli)K12，30℃；
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2640，30℃；
待测菌株
耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1，30℃；
M36-7Dwt，45℃。
预培养
在1％CMG中预培养3天。在对培养物的纯度进行检查后，在灭菌水中将细胞沉淀洗涤3次，将光密度(DO)调节为2。
过氧化氢
过氧化氢储液：H2O2(30wt％溶液，SIGMA ref.216763，在4℃储存)。
测试的浓度：0、50mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、300mM、400mM。
溶液1：1M，2.3mL H2O2储液处于20mL CMG介质中。
溶液2：100mM，340μL H2O2储液处于30mL CMG介质中。
制备H2O2范围：
微孔板的制备
将180μl介质分散于培养孔中(将200μl加入空白孔)
将20μl洗涤后的、光密度为2(600nm)的细胞沉淀加入至待接种的孔中。
在孔表面轻轻加入50μl矿物油，以限制蒸发。
按照第一部分示出的最佳生长温度，在30℃或45℃对微孔板孵育3天。通过吸光测量对生长进行监控。
结果
结果总结于下表中。
IC：从该浓度起3天的孵育后无生长的过氧化氢浓度。
与参照微生物(运动发酵单胞菌、大肠杆菌和酿酒酵母)相比，耐辐射异常球菌R1和中度嗜热异常球菌M36-7Dwt及其修饰细菌能够在高浓度的过氧化氢(最多190mM)的存在下生长。
实施例2：确定在不同温度下过氧化氢对两种重组异常球菌细菌的抑制浓度(IC)
方案
在pH为5的含有15mM NH4Cl和5.30mM K2HPO4的20％淀粉废水(starch effluent)中，对中度嗜热异常球菌M36-7D_21和MX6-1E_04进行培养。
在室温或45℃下使用不同浓度的H2O2(20mM、50mM、100mM、150mM和200mM)对5ml培养物处理1小时。
对照样品对应于未处理样品(0mM H2O2)。
随后将对照样品和处理样品涂布于含有10％淀粉废水的琼脂板上，在45℃孵育24小时和96小时。
抑制浓度(以mM表示的IC)为：从该过氧化氢浓度开始，在24h或96h后没有生长的过氧化氢浓度。
结果
M36-7D_21 MX6-1E_04
室温 >200mM 100mM
45℃ 200mM 50mM
结论
与参照微生物(如实施例1示出)相比，中度嗜热异常球菌的两个菌株均显示出对过氧化氢的良好耐受性。此外，当培养物在室温下孵育时，中度嗜热异常球菌对过氧化氢的耐受性更高。
实施例3：过氧化氢的加入对中度嗜热异常球菌生长的影响
方案
在含有如下成分的CMG介质的微孔板中进行中度嗜热异常球菌M36-7D_21的生长：蛋白胨2g/L；酵母提取物5g/L；葡萄糖55mM(10g/L)；3-吗啉丙磺酸(MOPS acid)40mM；NH4Cl 20mM；NaOH 10mM；KOH10mM；CaCl2·2H2O 0.5μM；Na2SO4·10H2O 0.276mM；MgCl2·6H2O0.528mM；(NH4)6(Mo7)O24·4H2O 3nM；H3BO30.4μM；CoCl2·6H2O 30nM；CuSO4·5H2O 10nM；MnCl20.25μM；ZnSO47H2O 10nM；D-生物素1μg/L；烟酸(尼克酸)1μg/L；吡哆素(吡哆醛盐酸盐或维生素B6)1μg/L；硫胺素盐酸盐(维生素B1)；FeCl320μM；柠檬酸钠·2H2O 20μM；K2HPO45.7mM。
在T0(开始生长)或指数期加入100mM过氧化氢。
通过测量OD600nm对生长进行监控。
结果
无论是在T0或是在指数生长期加入，过氧化氢的加入均不影响M36-7D_21的生长。
实施例4：在生物反应器中使用H2O2对异常球菌的培养
在如下实验中，使用表达丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因的重组中度嗜热异常球菌，所述丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因来自于运动发酵单胞菌。
4.1不经过对生物质的预处理生产乙醇
在1L生物反应器(Biostat Q+Sartorius)的40g/L干小麦上，对1g干重/L的菌株进行培养。将温度保持在40℃，pH保持在8。
使用H2O2满足异常球菌细菌生长和乙醇的生物合成所需的氧。为了这一目的，使用泵递送0.0015vvm(每培养体积每分钟的氧化剂体积)，向生物反应器中连续加入3M H2O2溶液，从而将生物反应器中H2O2的浓度维持在170mM-180mM。
获得连续生产数天的乙醇。
4.2经过生物质的预处理生产乙醇
预处理步骤：在24小时的时间段内，使用泵递送0.0025vvm，将5MH2O2溶液连续加入1L生物反应器(Biostat Q+Sartorius)的干小麦中。
随后，在生物反应器中加入纯水以降低H2O2的浓度。
发酵步骤：使用传感器监控生物反应器中H2O2的浓度，当H2O2浓度低于150mM时，在生物反应器中供给2g干重/L的异常球菌。将温度保持在55℃，pH保持在7。
为将生物反应器中H2O2浓度维持在170mM-180mM，使用泵递送0.0025vvm，将2M H2O2溶液连续加入生物反应器。
获得连续生产数天的乙醇，表明通过氧化剂进行预处理增加了木质素的降解，同时提高了乙醇的生物合成。
实施例5：使用过氧化氢对培养物进行除污和充氧的异常球菌培养的工业方法
在1L生物反应器(Biostat Q+Sartorius)的40g/L干小麦上，对中度嗜热奇球菌进行培养。将温度保持在45℃，pH保持在6。
可使用H2O2满足生长的氧需求。为了这一目的，使用泵以每分钟2.5-0.15mL H2O2输送，连续向生物反应器中加入1M-5M H2O2浓缩溶液。

Claims (14)

1.一种使用异常球菌或其相关细菌并组合使用过氧化氢(H2O2)，由培养介质生产感兴趣的化合物的发酵方法。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
a)将包含碳源的培养介质与过氧化氢(H2O2)接触；
b)在适于所述异常球菌或其相关细菌的培养和/或生长的条件下，将所述培养介质与所述异常球菌或其相关细菌接触；
c)对所述异常球菌进行培养以生产感兴趣的化合物；以及任选地，
d)收集由所述发酵获得的所述感兴趣的化合物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，培养物中H2O2的浓度为该氧化剂对所述异常球菌或其相关细菌的抑制浓度(ICD)的5％-95％，优选为所述ICD的25％-90％。
4.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中，在将所述异常球菌或其相关细菌加入至所述培养物之前和/或同时和/或之后，将H2O2加入或供给至所述培养物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，连续或按次序地将H2O2加入所述培养物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，对所述H2O2的浓度进行监控并维持在低于所述ICD的95％。
7.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中，所述培养介质包含生物质，例如木质纤维素生物质。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述方法用于对所述生物质进行转变、转化或降解。
9.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法用于生产醇、优选乙醇。
10.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法用于生产可发酵糖、代谢物和/或感兴趣的药物。
11.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法用于将基质转化为感兴趣的物质。
12.一种发酵器，例如生物反应器或恒化器，其中，所述发酵器含有生长介质、H2O2或H2O2源、异常球菌或其相关细菌或者异常球菌或其相关细菌的提取物；以及将H2O2输送到所述发酵器中的装置和/或产生H2O2的装置和/或监控H2O2浓度的装置。
13.一种使用异常球菌细菌或相关细菌在微生物生产方法中降低发酵器内细菌污染的方法，其中，所述方法包括将H2O2加入所述发酵器。
14.一种使用细菌进行发酵的方法，其中，所述细菌为异常球菌或其相关细菌，所述方法在H2O2的存在下进行。
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