CN102159701A - 用于生物质发酵的改良的运动发酵单胞菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及获得更耐受一种或多种抑制剂或更能有效发酵一种或多种碳水化合物的运动发酵单胞菌突变菌株的方法。此抑制剂包括乙醇，脂肪酸，例如乙酸，甲酸；呋喃衍生物，例如2-糠醛，2-糠酸；及酚化合物，例如香兰素及羟基苯甲酸。此碳水化合物可包括木糖，阿拉伯糖，甘露糖及它们的混合物。这些突变菌株可用于，例如，有效从生物质制备乙醇。

Description

用于生物质发酵的改良的运动发酵单胞菌菌株
【相关申请】
本申请要求2008年4月23日提交的美国临时申请61/125,302(为美国审查实践，将其通过引用整体并入本文)的优先权。
【技术领域】
本文提供更耐受一种或多种生物质发酵中常面临的各种抑制剂的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)突变菌株，获得突变菌株的方法及使用突变菌株从生物质获得乙醇的方法。通过本发明的方法获得的运动发酵单胞菌突变菌株(1)更耐受一种或多种抑制剂包括但不限于乙醇，脂肪酸，例如乙酸，甲酸；呋喃衍生物，例如2-糠醛，2-糠酸；及酚化合物，例如香兰素及羟基苯甲酸及/或(2)更能发酵一种或多种碳水化合物，例如选自木糖，阿拉伯糖，甘露糖及它们的混合物的碳水化合物。
【背景技术】
随着国际上对能源的需求增加，化石燃料被快速耗尽。因此，需评估替代性能源，以满足全球的能源需求。甲烷，氢及乙醇被人为是化石燃料的潜在的替代品。在这3种候选物中，近期乙醇常被认为是替代性液体染料的好选择。
熟知使用生物质作为原料生产乙醇的方法(http://www.vermontbiofuels.org/biofuels/ethanol.shtml)。此方法中，葡萄糖及戊糖被微生物发酵为乙醇。目前，酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)常用于此方法，见Almeida，J.R.M.，et al.，J.of chem..tech.and biotech.，2007，82(4)：p.340-349。
当选择发酵用微生物时，可考虑几个重要特性，包括产率，乙醇抗性，产力，及生长需求，见Dien，B.S.，et al.，Applied microbiolbiotechnology，2003，63：p.258-266。这些特征中，乙醇产率已受到更多灌注，因为原料可占生产成本的大于1/3。如果乙醇产率高，产生相同量乙醇就需要更少原料。结果，生产成本降低，所以高乙醇产率是重要的。基于此需求，运动发酵单胞菌(已发现在含葡萄糖的糖复合物上具有最高乙醇产率，见Lee，K.J.，et al.，Biotechnology letters，1980.2(11)：p.487-492；Rogers，P.L.，et al.，Process Biochemistr，1980，15(6)：p.7-11；and Rogers，P.L.，et al.，Adv.Biotechnol.，[Proc.Int.Ferment.Sym p.]6th，1980)成为就乙醇产率方面具有代替酵母的能力的最有潜力的微生物之一。此微生物表现出具有达理论值的97％的乙醇产率。相比传统酵母发酵，其可达到5～10％的更高产率，见EI-Mansi，M.，Fermentation microbiology and biotechnology，2007：CRC Press；and Fraser-reid，B.，et al.，Glycosience：Chemistry and Chemical Biology.2001：Springer。运动发酵单胞菌的另一优点是其高乙醇产力。运动发酵单胞菌的容积乙醇产力可比酿酒酵母高5倍。运动发酵单胞菌的乙醇产率方面的其他优点被Rogers，P.L.，et al.，in Biotechnology letter，1979，1：p.165-170报道，及包括高糖抗性，低生产成本及以低pH发酵糖的能力。运动发酵单胞菌可于高浓度葡萄糖(10～25％)中生长。此微生物还耐受酸及可在3.5～7.5的pH范围内生长。所以发酵一般抗细菌污染。
尽管运动发酵单胞菌在一些方面优于酵母，但由于多种原因，其未被商业应用。首先，运动发酵单胞菌通常仅使用葡萄糖、果糖及蔗糖作为其底物。而因为戊糖(例如木糖)是大多数生物质原料中半纤维素的主要成分，为从生物质的良好产率，常必要发酵微生物以在乙醇生产中使用此糖。有幸代谢加工已被成功应用于开发发酵单胞菌菌株以发酵木糖(见Zhang，M.，Engineering Zymomonas mobilis for efficient ethanol production from lignocellulosic feedstocks.ACS national meeting，2003及美国专利No.7,223,575，将它们通过引用整体并入本文)以及阿拉伯糖(见Mohagheghi，A.，et al.，Applied biochemistry and biotechnology，2002，98-100：p.885-898)。通过基因工程改造技术，经改造的运动发酵单胞菌可有能力使用大多数生物质原料中存在的全部糖。其次，运动发酵单胞菌敏感于见于生物质的各种抑制剂，包括：乙醇，脂肪酸，例如乙酸，甲酸；呋喃衍生物，例如2-糠醛，2-糠酸；及酚化合物，例如香兰素及羟基苯甲酸，见Lawford，H.G.，et al.，Applied biochemistry and biotechnology，1993，39/40：p.687-699。如Jeon，Y.J.，et al.，Biotechnology letters，2002，25：p.819-824报道，乙酸毒性在木糖发酵期间加强。用稀释酸预处理生物质，由于半纤维素中的乙酰化的戊糖水解，常含达1.5％乙酸(w/v)。在工业使用运动发酵单胞菌之前，应解决此抑制问题。
几个研究人员已试着通过基因修饰来开发运动发酵单胞菌的乙酸耐受型菌株。其中，Rogers等人于1998年使用N-甲基N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理而开发了几个运动发酵单胞菌菌株。Baumler等人在Applied biochemistry and biotechnology，2006，134：p.15-26中建议了重组DNA技术，以增强运动发酵单胞菌(CP4)的酸耐受性。已被尝试解决运动发酵单胞菌的乙酸毒性的其他方法包括，通过用离子交换树脂及离子交换膜从预处理生物质除去乙酸来优化发酵条件(见Han，B.，et al.，Desalination，2006，193：p.361-366)及探索重组运动发酵单胞菌的最佳发酵条件。
此外，尽管已知许多修饰方法(见Foster，P.L.，Annual review of genetics，1999，33：p.57-88；Foster，P.L.，Annual reviews of microbiology，1993，47：p.467-504 and Rosenberg，S.M.，Evolving responsively：Adaptive mutation.Nature Reviews Genetics，2001.2(7)：p.504-515)，尚无人成功修饰运动发酵单胞菌来开发抑制剂耐受性及/或成本有效地消费戊糖。因此，仍需开发可用于从生物质生产乙醇的更抑制剂耐受型(例如乙酸耐受型)运动发酵单胞菌菌株。还仍需开发更能发酵戊糖的菌株。
【发明概述】
本文提供更耐受有时见于生物质的各种抑制剂及/或可发酵其他碳水化合物的运动发酵单胞菌突变菌株，获得突变菌株的方法，及使用突变菌株从生物质制备乙醇的方法。
本发明的一个实施方式针对适应性突变细菌(例如发酵单胞菌属的细菌)的方法。适应性突变细菌的方法包括：在一种或多种连续升高的的选择压力存在下逐步培养细菌。则分离出更适应于选择压力的突变菌株。
在另一实施方式中，本发明针对制备更耐受抑制剂的运动发酵单胞菌菌株。所述方法包括：首先在基本上无抑制剂的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株。接下来，在浓度连续升高的抑制剂存在下逐步培养运动发酵单胞菌菌株。则分离出适应于升高的抑制剂浓度的突变菌株。
在另一实施方式中，本发明针对制备能增加碳水化合物发酵的运动发酵单胞菌菌株的方法，所述碳水化合物是选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。所述方法包括：首先在含葡萄糖的培养基中生长运动发酵单胞菌原菌株。接下来，在浓度连续升高的选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物及量连续降低的葡萄糖存在下逐步培养运动发酵单胞菌菌株。则分离出能增加碳水化合物发酵的突变菌株，所述碳水化合物是选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。
在另一实施方式中，通过本发明的技术制备的突变体运动发酵单胞菌菌株(例如，乙酸抑制剂耐受型运动发酵单胞菌菌株)常具有多个独特的特征或所述独特的特征的组合。非天然、生物学纯的运动发酵单胞菌突变菌株的特征在于可基本上表现出下列特征中的一个或多个：(1)延迟期短于约1天，优选短于9小时；或(2)比生长速率为至少约0.15h-1，优选至少约0.3h-1或(3)乙醇产率为理论产率的至少约95％；其中所述特征是在有50g/L葡萄糖及1.6％乙酸浓度的RM培养基中以pH约6发酵时表现出的。一些实施方式中，菌株基本上表现出至少2个或甚至全部3个上述特征。
在另一实施方式中，通过本发明的技术制备的突变体运动发酵单胞菌菌株(例如，增强的碳水化合物发酵运动发酵单胞菌菌株)常具有多个独特的特征或所述独特特征的组合。非天然、生物学纯的运动发酵单胞菌突变菌株的特征在于可基本上表现出下列特征中的一个或多个：(1)乙醇产率为理论产率的至少约85％，优选至少约90％；或(2)容积乙醇产力为至少约0.5，优选至少约0.8g 乙醇/l反应器/小时(g/l/h)；或(3)比乙醇产力为至少约0.9，优选至少约0.95g/g干细胞团/小时(g/g/h)；或(4)木糖消耗速率为至少约1.8，优选至少约2.0g/g干细胞团/小时(g/g/h)；或(5)短于约40小时，优选短于约36小时内消耗5％(w/v)木糖的能力；其中所述特征是在有50g/L木糖、无葡萄糖的RM培养基中发酵时表现出的。
在另一实施方式中，本发明针对非天然、生物学纯的运动发酵单胞菌突变菌株，其特征在于基本上表现出下列特征中的一个或多个：
(1)延迟期短于约1天；或
(2)比生长速率为至少约0.15h-1；或
(3)乙醇产率为理论产率的至少约95％；
(4)乙醇产率为理论产率的至少约85％；或
(5)容积乙醇产力为至少约0.5g 乙醇/l反应器/小时；或
(6)比乙醇产力为至少约0.9g 乙醇/g干细胞团/小时；或
(7)木糖消耗速率为至少约1.8g木糖/g干细胞团/小时；或
(8)短于约40小时内消耗5％(w/v)木糖的能力；
其中一个或多个特征(1)～(3)是在有50g/L葡萄糖及1.6％乙酸浓度的RM培养基中以pH约6发酵时表现出的，及
其中一个或多个特征(4)～(8)是在有50g/L木糖、无葡萄糖的RM培养基中发酵时表现出的。
【附图说明】
图1例示适应性突变方法。
图2例示突变顺序。
图3提供从用0.2％乙酸适应性突变的12个集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的12个集落的平均值。)。
图4提供从用0.5％乙酸适应性突变的12个集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的12个集落的平均值。)。
图5提供从用1.0％乙酸适应性突变的13个集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的13个集落的平均值。)。
图6提供从用1.2％乙酸适应性突变的6个集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的6个集落的平均值。)。
图7提供从用1.4％乙酸适应性突变的6个集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的6个集落的平均值。)。
图8提供从在1.0％乙酸存在下，于pH5.5适应性突变的9个集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的9个集落的平均值。)。
图9提供从在1.0％乙酸存在下，于pH5.0适应性突变的8个单集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的8个集落的平均值。)。
图10提供从以pH6.0及在1.4％乙酸存在下NTG诱变的4个单集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的4个集落的平均值。)。
图11提供从以pH6.0及在存在下1.6％乙酸NTG诱变的4个单集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的4个集落的平均值。)。
图12提供从于pH5.5及在1.4％乙酸存在下NTG诱变的4个单集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的3个集落的平均值。)。
图13提供从于pH5.5及在存在下1.6％乙酸NTG诱变的4个单集落的(A)比生长速率(B)O.D.值及(C)乙醇浓度(水平横线表示所分析的4个集落的平均值。)。
图14显示无乙酸下以pH6.0的生长曲线。
图15显示在1.0％乙酸存在下以pH6.0的生长曲线。
图16显示在1.2％乙酸存在下以pH6.0的生长曲线。
图17显示在1.4％乙酸存在下以pH6.0的生长曲线。
图18显示无乙酸下于pH5.5的生长曲线。
图19显示在1.0％乙酸存在下于pH5.5的生长曲线。
图20显示在1.2％乙酸存在下于pH5.5的生长曲线。
图21显示在1.4％乙酸存在下于pH5.5的生长曲线。
图22显示无乙酸下于pH5.0的生长曲线。
图23显示在1.0％乙酸存在下于pH5.0的生长曲线。
图24显示在1.2％乙酸存在下于pH5.0的生长曲线。
图25显示在1.4％乙酸存在下于pH5.0的生长曲线。
图26显示在(A)1.4％及(B)1.6％乙酸存在下以pH6.0的生长曲线。
图27显示在(A)1.4％及(B)1.6％乙酸存在下于pH5.5的生长曲线。
图28显示在(A)1.4％及(B)1.6％乙酸存在下于pH5.0的生长曲线。
图29提供在1.6％乙酸存在下，以pH6.0的ZM5510的作为时间的函数的乙醇、葡萄糖、乙酸浓度及O.D.曲线。
图30提供在1.6％乙酸存在下，以pH6.0的ZM6014的作为时间的函数的乙醇、葡萄糖、乙酸浓度及O.D.曲线。
图31提供适应性突变的示意图。
图32提供pZMETX的质粒图。
图33提供螺旋盖瓶中5％木糖发酵数据。
图34提供比较ZM4/pZMETX A2及ZM4/pZMETX A3在厌氧氮气氛下pH控制于6的发酵罐中的发酵表现，在发酵罐中5％木糖发酵数据。
图35提供比较ZM4/pZMETX A2及ZM4/pZMETX A3在厌氧氮气氛下不控制pH的发酵罐中的发酵表现。
【发明详述】
本文中的“突变体”指相对于参照或原微生物经历了一种或多种突变的微生物。例如，本文中的突变体运动发酵单胞菌菌株，相对于初始或原运动发酵单胞菌菌株经历了一种或多种突变，从而突变菌株可在更高量(即浓度)的一种或多种抑制剂存在下生长及产生乙醇。此抑制剂包括，但不限于脂肪酸，例如乙酸，甲酸；呋喃衍生物，例如2-糠醛，2-糠酸；酚化合物，例如香兰素及羟基苯甲酸，氧，及它们的混合物。这些抑制剂可以纯净物形式存在，或存在于溶液中，例如，水溶液或气溶液。
术语“野生型”指不包括已知与目的表型相关的突变的参照微生物。野生型运动发酵单胞菌菌株可用作参照或原微生物。此外，不是野生型，而是包括部分开发的突变的运动发酵单胞菌菌株可用作参照微生物。例如，待至少部分抗抑制剂的已被突变的运动发酵单胞菌菌株(适应性地或其他方式)可用作参照微生物。本文所述的过程可用于待甚至更抗升高量的一种或多种抑制剂的更完全突变菌株。
本文中的“适应性突变”一般指产生特异于选择压力的突变的突变方法。异于随机突变，例如UV或化学诱变剂，本文所述的适应性突变方法旨在产生仅有用的突变。换言之，有防止一种或多种无用的基因变化的一种或多种机制。
本文中的术语“连续升高的浓度”指后续培养物的一般趋势是抑制剂浓度升高的的浓度梯度。与此类似，本文中的术语“连续降低的pH”指后续培养物的一般趋势是pH降低的的浓度梯度。例如，在本文所述的方法中，培养基中的乙酸浓度可一般以约0.05，0.1或0.2％的规则或不规则增量升高。说明书及权利要求书中，乙酸浓度表示为w/v百分比。因此，例如，0.1％乙酸指100ml培养基中有0.1g乙酸。
术语“可发酵糖”指发酵方法中可被运动发酵单胞菌用作碳源的寡糖及单糖。
本文中的“适宜培养基”指支持运动发酵单胞菌在各种条件下生长的培养基。在某些实施方式中，适宜培养基包括，例如，葡萄糖，酵母提取物，及磷酸二氢钾。
本文中的“基本上无”指不含可测到的量的特定抑制剂或抑制剂混合物的培养基。例如，基本上无乙酸的培养基指不含通过常规技术可测到的量的乙酸的培养基。在某些实施方式中，基本上无乙酸的培养基中的抑制剂(例如，乙酸)量少于约0.0001％或少于约0.001％。在某些实施方式中，培养基无任何抑制剂。在某些实施方式中，培养基无任何乙酸。
本文中的术语“木质纤维素的”指兼含木素及纤维素的组合物。木质材料还可包括半纤维素。
术语“纤维素的”指含纤维素及其他成分(包括半纤维素)的组合物。
术语“生物质”包括未处理的生物质或经处理的生物质，例如，在糖化作用之前以某些方式处理的生物质。一般而言，生物质包括任何纤维素或木质材料，及包括含纤维素，及任选还含半纤维素，木素，淀粉，寡糖及/或单糖的材料。生物质还可包括其他成分，例如蛋白及/或脂质。生物质可源于单一来源，或生物质可包括源于多于一种来源的混合物；例如，生物质可包括玉米轴及玉米秸秆的混合物，或草及叶的混合物。生物质包括，但不限于，生物能作物，农业废料，城市固体废物，工业固体废物，从造纸厂的污泥，场地废物，木业及林业废物。生物质之例包括，但不限于，玉米粒，玉米轴，作物废料，例如玉米壳，玉米秸秆，草，小麦，小麦秸，大麦，大麦秸，枯草，水稻秸，柳枝稷，废纸，甘蔗渣，高粱，大豆，获自将粒，树，枝，根，叶，木屑，锯屑，灌木及灌木，蔬菜，水果，花及动物粪便磨粉的成分。
本文中的“适宜发酵条件”指支持使用运动发酵单胞菌菌株生产乙醇的条件，例如本文所述的条件。此条件可包括适宜pH，营养素及其他培养基成分，温度，气氛，及其他环境因素。
【细菌的一般适应性突变方法】
一般而言，本发明针对适应性突变细菌(例如发酵单胞菌属的细菌)的方法。所述适应性突变细菌的方法包括：在一种或多种连续增加的选择压力存在下逐步培养细菌。则分离出更适应于选择压力的突变菌株。选择压力可为任何苛刻的条件，所述条件可包括生长抑制剂，例如脂肪酸，例如乙酸，甲酸；呋喃衍生物，例如2-糠醛，2-糠酸；及酚化合物，例如香兰素及羟基苯甲酸，如pH或温度的极端条件，或发酵单胞菌一般不发酵的一种或多种物质(例如木糖)的发酵。一般方法示于图31。
【更耐受抑制剂及/或能发酵木糖的运动发酵单胞菌突变菌株的适应性突变方法】
本文提供更耐受见于预处理的生物质的各种抑制剂的运动发酵单胞菌突变菌株，获得突变菌株的方法及使用突变菌株从生物质制备乙醇的方法。通过本发明的方法获得的运动发酵单胞菌突变菌株更耐受抑制剂，所述抑制剂包括但不限于脂肪酸，例如乙酸，甲酸；呋喃衍生物，例如2-糠醛，2-糠酸；及酚化合物，例如香兰素及羟基苯甲酸。
而且，本文提供更能发酵运动发酵单胞菌一般不发酵的物质的运动发酵单胞菌突变菌株，获得突变菌株的方法及使用突变菌株从生物质制备乙醇的方法。
一方面，本文提供制备更耐受抑制剂的运动发酵单胞菌菌株的方法，所述方法包括：(a)在基本上无抑制剂的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；(b)在浓度连续升高的抑制剂存在下逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及(c)分离适应于升高的抑制剂浓度的突变菌株。
另一方面，本文提供制备更能增加常规运动发酵单胞菌菌株(例如野生型菌株)不易发酵的一种或多种碳水化合物的碳水化合物发酵的运动发酵单胞菌菌株的方法。此碳水化合物可选自木糖，阿拉伯糖，甘露糖及它们的混合物。所述方法包括：(a)在含葡萄糖的培养基中生长运动发酵单胞菌原菌株(b)在浓度连续升高的选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物及量连续降低的葡萄糖存在下逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及(c)分离能增加碳水化合物发酵的突变菌株，所述碳水化合物是选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。
所述方法中的逐步培养量及长度依赖于所需结果，抑制剂，及/或待发酵的碳水化合物而不同。因此，所述方法一般持续尽可能久至达到所需结果。有时，在某些方面改良得至少持续逐步培养直到所需选择压力(例如，对抑制或木糖发酵的抗性)不再可测是有利的。与此类似，有时需要持续直到分离的突变体的下列一项或多项稳定：生长速率，细胞团浓度，从生物质的乙醇生产，或它们的组合。一般而言，所述方法中的步骤(b)及(c)重复至少一次。在某些实施方式中，步骤(b)及(c)重复2次，3次或多次。
只要后续培养物的一般趋势是升高的抑制剂浓度(或降低的pH或升高的碳水化合物浓度)，浓度连续升高的抑制剂(及/或连续降低的pH及/或更高浓度的碳水化合物)的逐步培养不要求各及每个连续培养物具有高于之前的抑制剂的抑制剂浓度(及/或更低pH及/或更高浓度的碳水化合物)。例如，只要一般趋势是升高的，则升高的抑制剂浓度的培养物之间可间插具有相同或甚至低于之前的抑制剂浓度的抑制剂浓度的培养物。但是，在一实施方式中，浓度连续升高的抑制剂的逐步培养不间插具有相同或甚至低于之前的抑制剂浓度的抑制剂浓度的培养物。所述相同也符合连续降低的pH及/或浓度连续升高的碳水化合物。
在某些实施方式中，通过此方法获得的突变菌株更耐受乙酸，甲酸，2-糠醛，2-糠酸，香兰素或羟基苯甲酸或它们的组合。例示方法描述于母案临时申请及随后由Yun Wang于2008年4月24日为部分满足Georgia技术学院的化学及生物分子工程科学硕士学位的要求的题为“Development of Acetic-acid Tolerant Zymomonas mobilis Strains through Adaptation”的论文答辩，将它们根据美国专利实践整体并入本文。
有利地，本发明的方法可不应用诱变(如NTG诱变)地实施。同样，所述方法不要求连续反应器及/或长期时间。代之，所述方法可用于更小体积(如试管)来产生更快的结果。本发明的分离的突变菌株可甚至在苛刻的条件(例如，抑制剂或极端pH或温度)存在下能有更短的延迟时间，更高的比生长速率，及/或从多种生物质糖转变高乙醇。
任何本领域已知的适宜培养基可用于生长运动发酵单胞菌菌株。在某些实施方式中，所述方法中使用的培养基是接种培养基或含葡萄糖，酵母提取物及磷酸二氢钾的RM培养基。在某些实施方式中，培养基含20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L磷酸二氢钾。此培养基有时被称为RM培养基及可经修饰而含其他量的葡萄糖或其他碳水化合物。
乙酸耐受型突变菌株是通过在浓度连续升高的乙酸存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株开发的。在某些实施方式中，运动发酵单胞菌菌株的逐步培养是在含小于约2％的浓度的乙酸的培养基中进行的。其他实施方式中，逐步培养用的乙酸浓度可在从约0.1％w/v～约2％w/v的范围内。在某些实施方式中，乙酸浓度为从约0.2％～1.6％w/v。在一实施方式中，乙酸浓度为约0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1.0％，1.1％，1.2％，1.3％，1.4％，1.5％，1.6％，1.7％，1.8％，1.9％或2.0％。
培养基的pH可通过氢氧化钠(50％w/v)调节。在某些实施方式中，pH为约6～6.5。
就抑制剂的适应性突变过程示于图1，使用第一轮适应为例。第一步，将运动发酵单胞菌(ZM4)菌株在无乙酸下，以pH6.0及30℃，不经振摇生长在RM培养基上。过夜生长后，将运动发酵单胞菌接种于含补充了乙酸浓度的RM-乙酸盐培养基的新培养管中。在一实施方式中，乙酸浓度为约0.05％，0.1％，0.15％或0.2％。
在一实施方式中，初始O.D.值为0.01。然后将培养物在与上述相同条件下温育直到O.D.值达到0.1。将等量培养物接种于含相同但新鲜的RM-乙酸盐培养基的新培养管中至0.01的O.D.，及使细胞生长。一旦O.D.达到0.1，开始新培养。循环可重复几次直到24小时培养物的O.D.达到恒定值。然后将从最后的循环的培养物平铺于含与所述液体培养基相同乙酸浓度的琼脂平板。
可基于各种参数筛选琼脂平板上的单集落。在一实施方式中，这些参数是：比生长速率，生物质浓度(24小时)及乙醇浓度(24小时)。
比生长速率可通过本领域技术人员已知的方法测定。在一实施方式中，比生长速率由光密度(OD)对时间曲线测定，如实施例部分所述。
将适应于所述轮的最高乙酸浓度(此例中，0.2％)的突变体作为亲本菌株用于有乙酸浓度增加的增量的下一轮适应。以浓度连续升高的乙酸的逐步培养方法可重复至少一次。在某些实施方式中，方法可重复至少2，3，4，5或更多次。培养基中的乙酸浓度可增加至少约0.05％的增量。在某些实施方式中，乙酸浓度增加约0.05，0.1，0.15，0.2，0.25或0.3％。
可进行多轮适应突变，产生几个有用的耐受菌株。在某些实施方式中，通过适应升高乙酸浓度来开发乙酸耐受型突变菌株还可通过连续降低培养基pH；及分离适应于最低pH的突变菌株来在含乙酸的培养基中逐步培养突变菌株来优化。在某些实施方式中，还可通过连续降低培养基pH至约5.5，5，4.5或4来开发如上获得的乙酸耐受型突变菌株。
在某些实施方式中，还通过化学诱变，重组DNA技术或它们的组合来改良乙酸耐受型突变体。
可使用本领域技术人员已知的任何化学诱变剂。在某些实施方式中，N-甲基N’-硝基N-亚硝基胍(NTG)用于还改良突变体的乙酸耐受性。本领域技术人员已知NTG诱变的适宜过程。例示过程描述于Rogers等人。此过程中，首先，用NTG处理运动发酵单胞菌菌株培养物。NTG诱变后，将培养物平铺于含不同乙酸浓度(例如，1.0％，1.2％，1.4％及1.6％)及不同pH(例如，5.0，5.5及6.0)的琼脂平板。最后，平铺培养物以分离乙酸耐受型突变体。
例示突变顺序及获得的突变体的相互关系示于图2。图中，获得的突变体使用字母及数字的组合命名。字母组合“ZM”取自微生物“运动发酵单胞菌”的名称。紧随“ZM”的前两个数字表示适应中所用pH，及后两个数字表示百分比乙酸浓度。例如，ZM6002是使用适应条件，pH6.0，及0.2％乙酸浓度获得的菌株。
在某些实施方式中，乙酸耐受型突变体还通过重组DNA技术改良。本领域已知的重组DNA技术的方法。例示方法由Baumler等人在Applied biochemistry and biotechnology，2006.134：p.15-26中描述。
使用类似过程，可制备耐受其他抑制剂的突变菌株。逐步培养中各种抑制剂浓度，适应轮数及优化适应用条件可由本领域技术人员参照本申请经验测定。可通过基于各种参数(包括，比生长速率，生物质浓度及乙醇浓度)筛选琼脂平板上的单集落来分离最适应的突变菌株。
因此，在某些实施方式中，本文提供获得更甲酸耐受型运动发酵单胞菌突变菌株的方法，所述方法包括：在基本上无甲酸的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的甲酸存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高甲酸浓度的突变菌株。
本文还提供使用类似过程获得更香兰素耐受型运动发酵单胞菌突变菌株的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：在基本上无香兰素的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的香兰素存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高香兰素浓度的突变菌株。
本文还提供获得更羟基苯甲酸耐受型运动发酵单胞菌突变菌株的方法，所述方法包括：在基本上无羟基苯甲酸的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的羟基苯甲酸存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高羟基苯甲酸浓度的突变菌株。
在某些实施方式中，本文提供获得更2-糠醛耐受型运动发酵单胞菌突变菌株的方法，所述方法包括：在基本上无2-糠醛的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的2-糠醛存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高2-糠醛浓度的突变菌株。
在某些实施方式中，本文提供获得更2-糠酸耐受型运动发酵单胞菌突变菌株的方法，所述方法包括：在基本上无2-糠酸的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的2-糠酸存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高2-糠酸浓度的突变菌株。
本文还提供获得更乙醇耐受型运动发酵单胞菌突变菌株的方法，所述方法包括：在基本上无乙醇培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的乙醇存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高乙醇浓度的突变菌株。
在另一实施方式中，本文提供获得更羟基甲基糠醛耐受型运动发酵单胞菌突变菌株的方法，所述方法包括：在基本上无羟基甲基糠醛培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的羟基甲基糠醛存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高羟基甲基糠醛浓度的突变菌株。
在某些实施方式中，本文提供如下获得的更乙酸耐受型运动发酵单胞菌突变菌株：在基本上无乙酸的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；在浓度连续升高的乙酸存在下在培养基中逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及分离适应于最高乙酸浓度的突变菌株。
本发明还针对制备能增加碳水化合物发酵的运动发酵单胞菌菌株的方法，所述碳水化合物是选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物，所述方法包括：(a)在含葡萄糖的培养基中生长运动发酵单胞菌原菌株；(b)在浓度连续升高的选自木糖，阿拉伯糖，甘露糖，及它们的混合物的一种或多种碳水化合物及量连续降低的葡萄糖存在下逐步培养运动发酵单胞菌菌株；及(c)分离能增加碳水化合物发酵的突变菌株，所述碳水化合物是选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。
一些实施方式中除了升高选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物的量与降低葡萄糖的量或根本无葡萄糖联用之外，所述步骤就升高的抑制剂耐受性而言，类似于上述步骤。更低的葡萄糖量可精确对应或不对应增加的选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的碳水化合物量。优选，葡萄糖降低一般对应或基本上类似于选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物的增加量。例如，葡萄糖浓度降低在选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的碳水化合物的增加量的约20，优选约10，更优选5％之内。作为一例，葡萄糖及选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物的总量是5％(w/v)，例如，逐步培养可包括始于5％葡萄糖及0％木糖，阿拉伯糖，甘露糖，之后4.75％葡萄糖及0.25％木糖，阿拉伯糖，甘露糖，或混合物，之后4.5％葡萄糖及0.5％木糖，阿拉伯糖，甘露糖，或混合物，等等。
以浓度连续升高的选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物逐步培养的方法可重复至少一次。在某些实施方式中，方法可重复至少2，3，4，5或更多次。培养基中木糖，阿拉伯糖，甘露糖，及它们的混合物的浓度可以至少约0.05％的增量增加。在某些实施方式中，所述浓度以基本上类似葡萄糖浓度降低增加约0.1，0.2，0.25，或0.3％。
原菌株可原来就能或不是原来就能发酵选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。如果原菌株不能，其需要基因修饰，从而使其能发酵选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。
基因修饰的特定性质可依赖于菌株及所需结果而不同，但不关键，只要原菌株变得能发酵选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。一种适宜方法包括：首先构建适宜质粒，然后将所述质粒转化进原菌株。例如，为将不能发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株基因修饰为能发酵木糖的运动发酵单胞菌原菌株，可构建质粒pZMETX，然后将其转化进不能发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株。
【使用适应的运动发酵单胞菌菌株产生乙醇】
另一方面，本文提供生产乙醇的方法，包括：在通过本文所述的方法获得的适应的运动发酵单胞菌突变菌株存在下，在生物质中发酵碳水化合物。在某些实施方式中，突变菌株更耐受抑制剂，例如乙醇，脂肪酸，例如乙酸，甲酸；呋喃衍生物，例如2-糠醛，2-糠酸；及酚化合物，例如香兰素及羟基苯甲酸。在某些实施方式中，突变菌株更能增加常规运动发酵单胞菌菌株(例如野生型菌株)不易发酵的一种或多种碳水化合物的碳水化合物发酵。此碳水化合物可选自木糖，阿拉伯糖，甘露糖及它们的混合物。在某些实施方式中，突变菌株可兼更耐受，例如，上述抑制剂及更能增加碳水化合物发酵。
任何生物质可用于通过本发明的方法生产乙醇。纤维素是生物质中碳的最常见形式，占生物质重量的40％～60％，依赖于生物质来源。它是由6碳糖，葡萄糖组成的复合糖聚合物或多糖。半纤维素也是生物质中碳的主要来源，在以重量计20％及40％之间的水平。它是由多种5碳及6碳糖组成的复合多糖。
通过用蒸汽，酸，碱，纤维素酶或它们的组合处理，通过水解将生物质中的复合多糖转变为可发酵糖。然后通过用本文提供的抑制剂抗型或抑制剂耐受型运动发酵单胞菌菌株发酵来将糖转变为乙醇。在某些实施方式中，糖包括葡萄糖，果糖，蔗糖，木糖，阿拉伯糖，甘露糖或它们的混合物。
本领域已知适宜发酵条件。可使用达约25％(基于葡萄糖)，及在某些条件下甚至更高的底物浓度。不同于其他产生乙醇的微生物，就运动发酵单胞菌生存而言，任何时期不需氧。还不同于酵母，氧不显著降低乙醇产力或显著增加细胞生长。不需搅拌，但可增强底物利用度及乙醇扩散。因此，发酵条件的范围可相当宽。同样，任何许多已知类型的设备可用于通过所述方法生产乙醇。
发酵可在生物反应器(例如恒化期，塔式发酵罐或固定的细胞生物反应器)中进行。在某些实施方式中，发酵在连续流搅拌箱反应器中进行。可通过叶轮，搅动器或其他适宜手段提供混合，及应足够剧烈至容器内容物基本上是均匀组成，但不至于剧烈到骚扰微生物或抑制代谢。
发酵方法可以分批方法进行，或可连续进行部分或全部整体方法。为将微生物保持在发酵罐中，可从流体分离固体颗粒。此可通过离心，絮凝，沉淀，过滤等来进行。或者，可固定微生物用于保持在发酵罐中，或提供更容易的分离。
可将通过本发明的方法获得的运动发酵单胞菌突变菌株用作生物学纯的培养物，或可在与其他产生乙醇的微生物的混合培养中使用。在某些实施方式中，在向底物加入突变菌株之前，去除底物中已有的有害微生物，或使所述有害微生物丧失功能。在某些实施方式中，将酶加入发酵罐，以辅助底物降解或增强乙醇产生。例如，可加入纤维素酶，以将纤维素降解为葡萄糖，同时在相同发酵罐中用微生物将葡萄糖发酵为乙醇。同样，可加入半纤维素酶来降解半纤维素。
在某些实施方式中，为最大乙醇产率通过各种本领域技术人员已知的技术来优化生产乙醇的方法，所述技术包括，但不限于：从预处理的生物质除去抑制剂(例如乙酸，甲酸，2-糠醛，2-糠酸，香兰素及羟基苯甲酸)，探索选定突变菌株及其他菌株的最佳发酵条件。从预处理的生物质除去乙酸的例示技术包括，但不限于使用离子交换树脂及离子交换膜。
在某些实施方式中，通过探索突变菌株的最佳发酵条件来优化乙醇产生。在一实施方式中，此可通过改变发酵条件降低工业规模的乙酸抑制来达到，尤其是木糖发酵，所述木糖发酵比葡萄糖发酵更敏感于乙酸。可通过兼考虑生物质及糖利用来优化发酵条件。
发酵后，通过任何许多已知从水溶液分离乙醇的常规技术将乙醇(其可达到约13％的浓度)从发酵肉汤中分离。这些方法包括：蒸发，蒸馏，溶剂提取及膜分离。分离乙醇之前，可除去底物或微生物颗粒，以增强有效分离。
一旦发酵完全，过量微生物及未发酵的底物可整体或部分回收或除去。如果除去，可杀，干燥或以其他方式处理微生物。此混合物可用作动物饲料，肥料，作为燃料焚烧或废弃。
【适应增强的乙酸抑制的运动发酵单胞菌突变菌株】
在一实施方式中，通过本发明的技术制备的突变体运动发酵单胞菌菌株(例如，乙酸抑制剂耐受型运动发酵单胞菌菌株)常具有多个独特的特征或所述独特特征的组合。非天然、生物学纯的运动发酵单胞菌突变菌株的特征在于可基本上表现出下列特征中的一个或多个：
(1)延迟期短于约1天，优选短于9小时；或(2)比生长速率为至少约0.15h-1，优选至少约0.3h-1或(3)乙醇产率为理论产率的至少约95％；其中所述特征是在有50g/L葡萄糖及1.6％乙酸浓度的RM培养基中以pH约6发酵时表现出的。即，显著集落生长及/或相关发酵开始之前的初始RM培养基含：50g/L葡萄糖及1.6％乙酸浓度及pH保持在约6。有利地，在许多例中，所述一个或多个特征会在各种其他培养基中表现出。这些可包括含20g/L葡萄糖(或甚至超过从约20～约50g/L葡萄糖的范围)及从约0或从约1.0达约1.6％乙酸浓度的范围的初始RM培养基。一些实施方式中，菌株基本上表现出至少2或甚至全部3个上述特征。
上述特征可通过任何便利手段测到，所述手段包括：显示及描述于特定下述实施例及参照包括的图。延迟期，例如，一旦置于培养基中至可识别的细胞生长之前所用时间可通过以光密度作为可比生长速率便利测定。
有利地，一些例中，对存在一种抑制剂(例如乙酸)适应性突变的还可在多个所述特征之一产生突变体改良，甚至在一种或多种其他抑制剂存在下。即，本发明的技术可产生不仅表现出增加的乙酸耐受性，而且表现出增加的甲酸耐受性的突变体。
【适应增强的碳水化合物发酵的运动发酵单胞菌突变菌株】
在一实施方式中，通过本发明的技术制备的突变体运动发酵单胞菌菌株(例如，增强的碳水化合物发酵运动发酵单胞菌菌株)常具有多个独特的特征或所述独特特征的组合。非天然、生物学纯的运动发酵单胞菌突变菌株的特征在于可基本上表现出下列特征中的一个或多个：(1)乙醇产率为理论产率的至少约85％，优选至少约90％；或(2)容积乙醇产力为至少约0.5，优选至少约0.8g乙醇/l反应器/小时(g/l/h)；或(3)比乙醇产力为至少约0.9，优选至少约0.95g/g干细胞团/小时(g/g/h)；或(4)木糖消耗速率为至少约1.8，优选至少约2.0g/g干细胞团/小时(g/g/h)；或(5)短于约40小时，优选短于约36小时内消耗5％(w/v)木糖的能力；其中所述特征是在有50g/L木糖、无葡萄糖的RM培养基中发酵时表现出的。即，显著集落生长及/或相关发酵开始之前的初始RM培养基含：50g/L木糖，无显著量的葡萄糖。一些实施方式中，菌株基本上表现出至少2，3，4，或甚至全部5个上述特征。
上述特征可通过任何便利手段测到，所述手段包括：显示及描述于特定下述实施例及通过参照包括的图。常从将菌株初始接种到培养基测量木糖消耗。
有利地，一些实施方式中，一个或多个上述特征可在无任何pH控制下发酵时表现出。有利地，一些实施方式中，一个或多个上述特征可在以pH控制至约6发酵时表现出。
除非以其他方式特殊定义，本文所用的全部技术或科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。尽管在本发明的实践和测试中可使用任何类似于本发明所述方法和材料的任何材料和方法，通过下列非限制性实施例例示本发明优选的材料和方法，其仅作为例示提供，不旨在限制本发明的范围。
【实施例】
提供下列实施例来说明和解释权利要求书的主题，但这些实施例不应被理解为以任何方式限制权利要求书的范围。
【微生物及培养维持】
运动发酵单胞菌ZM4(ATCC31821)获自ATCC(American TypeCulture Collection)。突变体从菌株通过适应性突变开发。
通过适应性突变从菌株开发突变体。这些突变体中，选择ZM6010，ZM6012，ZM6014，ZM5510及ZM5010而进行更进一步表征。通过以高乙酸浓度适应获得突变体ZM6010，ZM6012，ZM6014。通过以低pH适应获得突变体ZM5510及ZM5010。通过NTG诱变从ZM5510开发了突变体ZMNTG5514，ZMNTG5516，ZMNTG6014及ZMNTG6014。
对于长期保存，通过在1ml瓶中混合500μl含培养物(过夜培养)的无菌培养基与500μl 60％(w/v)甘油溶液来在30％(w/v)甘油溶液中将全部菌株保持在-80℃。通过混合甘油及去离子水来制备甘油溶液。将60％甘油溶液于120℃高压灭菌20分钟。
不同实验需要不同培养基。接种培养基用于适应性突变。固体培养基用于单集落筛选。发酵培养基用于突变体表征。
【接种培养基】
接种培养基含20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L磷酸二氢钾。此培养基已知为RM培养基。根据需要加入乙酸(0.2％～1.6％w/v)。氢氧化钠(50％w/v)用于调节液体培养基pH。此培养基使用0.22μm过滤器过滤灭菌。
【发酵培养基】
发酵培养基是基于增加的葡萄糖浓度至50g/L的RM培养基。乙酸浓度从0.2％～1.6％变化。用氢氧化钠(50％w/v)调节培养基pH。使用0.22μm过滤器对培养基过滤灭菌。
【其他抑制剂实验用的培养基】
除了以不同浓度加入抑制剂外，使用相同发酵培养基，所述抑制剂浓度为：香兰素(0.5g/L，1g/L)，甲酸(2.68g/L，5.37g/L)，羟基苯甲酸(3.4g/L，6.8g/L)及糠醇(3.89g/L，7.7g/L)。用氢氧化钠(50％w/v)调节培养基pH至6.0。使用0.22μm过滤器过滤灭菌培养基。
【琼脂平板用固体培养基】
固体培养基是100ml经高压灭菌的含1.5％琼脂的RM培养基及100ml灭菌的含各种量的乙酸的RM培养基及pH调节用氢氧化钠(50％w/v)的混合物。然后将此混合物铺在琼脂平板上。各琼脂平板具有约25ml液体培养基。
【集落筛选】
平铺后，2天后琼脂平板上形成单集落。这些单集落有不同尺寸。但随着乙酸浓度增加或pH降低，尺寸差异变得更小。随着乙酸浓度增加或pH降低，琼脂平板上单集落数还减少。
将有更大尺寸的单集落接种于10ml培养管中的发酵培养基。将全部培养管放入温育器，及细胞于30℃不经振摇温育。培养物光密度(O.D.)值达到0.1后，每2小时挑选样品(1ml)用于O.D.测量。发酵1天后，取1ml样品用于乙醇测量。
【突变体表征】
通过分批发酵研究菌株生长。菌株生长于20ml玻璃瓶中的有3个不同pH(5.0，5.5，及6.0)及几个乙酸浓度(0.0％，1.0％，1.4％，及1.6％)的发酵培养基中。玻璃瓶填满培养基，以厌氧培养。将玻璃瓶放入生物学温育器。温度保持在30℃。此方法中无振摇。初始O.D.值总是0.01。每4个小时挑选1ml样品用于O.D.测量及乙醇，葡萄糖测量。
【分析方法】
【光密度(O.D.)】
用Beckman分光光度计DU530测量600nm处的样品O.D.值。从光密度(OD)对时间曲线测定比生长速率。
【乙醇测量】
使用HPLC法(Agilent 1100HPLC)测量乙醇，葡萄糖及乙酸的浓度。
【实施例1】通过升高乙酸浓度的适应性突变
适应性突变过程以第一轮适应为例示于图1。第一步，将运动发酵单胞菌(ZM4)菌株在无乙酸下以pH6.0及30℃不经振摇生长于RM培养基中。过夜生长后，将运动发酵单胞菌接种于含补充了乙酸浓度(0.05％，0.1％，0.15％，及0.2％)的RM-乙酸盐培养基的新培养管中。初始O.D.值为0.01。然后将培养物在与上述相同条件下温育，直到O.D.值达到0.1。将等量培养物接种于含相同但新鲜的RM-乙酸盐培养基的新培养管中，至O.D.为0.01，及使细胞生长。一旦O.D.达到0.1，开始新培养。循环重复几次，直到24小时培养物O.D.达到恒定。然后将从最后的循环的培养物平铺于含RM培养基(pH＝6.0)及0.2％乙酸的琼脂平板上。选定12个最大集落用于进一步研究。基于生长速率，细胞团浓度(24小时培养后获得的O.D.)，及乙醇浓度(5％葡萄糖及24小时培养)筛选选定的12个集落。
图3显示各集落的比生长速率、O.D.及乙醇浓度。水平横线表示12个集落的平均值。对于比生长速率，平均值是0.38h-1。数据显示集落1，2，3，5具有稍高于平均值的比生长速率。
集落1，2，3，5的生物质浓度(以24小时培养后的O.D.表示)全部在1.21～1.44的相对窄的范围，因此还进行研究以选择更佳集落。
1天发酵后，12个不同集落的乙醇浓度显示集落1及集落2具有高于其他集落的乙醇浓度。制备2个集落的甘油浓储液及保存于-80℃冰箱。因为相比集落1，集落2的O.D.值及乙醇浓度更高。选定集落2用于进一步适应性突变。将此突变体命名为ZM6002。
下一轮，用ZM6002作为亲本菌株，使用0.3％，0.4％，及0.5％的连续升高的乙酸浓度。增加从0.05％～0.1％的增量。步前一轮的相同适应过程。适应末，将培养物平铺于含相应乙酸浓度的琼脂平板。
多个集落呈现在含0.5％乙酸的琼脂平板上，表示成功适应于此乙酸浓度。从琼脂平板选12个最大集落用于基于生长速率，细胞团浓度(24小时培养后获得的O.D.)，及乙醇浓度(5％葡萄糖及24小时培养)筛选。
图4显示各集落的比生长速率，O.D.及乙醇浓度。对于比生长速率，平均值是0.38h-1。数据显示集落1，3，5具有稍高于平均值的比生长速率。
但是，集落5的乙醇浓度低于集落1及3，及集落3的生物质浓度稍高于集落1。因此选定集落3用于进一步适应性突变，将此突变体命名为ZM6005。制备此突变体的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。
第3轮，在有0.6％，0.7％，0.8％，0.9％及1.0％乙酸的RM-乙酸盐培养基中适应突变体ZM6005。保持0.1％的增量，因为其在最后一轮中工作量好。步相同适应过程。将培养物平铺在有相应乙酸浓度的琼脂平板上后，在含1.0％乙酸的琼脂平板上形成单集落，表示成功适应于1.0％乙酸。从琼脂平板(1.0％乙酸)选13个最大集落用于基于生长速率，细胞团浓度(24小时培养后获得的O.D.)，及乙醇浓度(5％葡萄糖及24小时培养)筛选。
图5显示各集落的比生长速率，O.D.及乙醇浓度。基于这3个参数，挑选集落5用于进一步适应性突变。将此突变体命名为ZM6010。制备此集落的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。
第4轮，突变体ZM6010分别适应于乙酸浓度1.2％，1.4％及1.6％。使用0.2％乙酸浓度增量。其他适应条件保持不变。平铺后，仅在含1.2％及1.4％乙酸的琼脂平板上形成单集落，表示成功适应于1.2％及1.4％乙酸浓度，而非1.6％乙酸。从含1.2％及1.4％的平板筛选单集落，因为它们呈现耐受高于文献中报道的ZM4的乙酸浓度，其为仅1.17％。随着乙酸增加，适应的菌株变得更难以生长在琼脂平板上。含1.2％及1.4％乙酸的平板上仅有6个大集落。这些集落经历与前一轮相同的筛选过程。
图6显示选自含1.2％乙酸的平板的6个集落的筛选结果。基于3个参数(比生长速率，O.D.及乙醇浓度)，选定集落4用于进一步研究。将此突变体命名为ZM6012。制备此菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。
图7显示选自含1.4％乙酸的平板的6个集落的筛选结果。基于筛选结果，挑选集落3用于进一步研究。将此突变体命名为ZM6014。制备此菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。
总之，开发了适应过程。成功进行4轮适应突变。使用适应方法成功开发了乙酸耐受型突变体。最适应的突变体耐受14g/L乙酸。
观察到随着乙酸浓度增加，比生长速率及最终O.D.降低，反映乙酸对细胞生长，及最终细胞产率的抑制效果。
但是，乙醇产率恒定，接近于理论产率。观察到变化，有时超过100％理论产率，最可能由于初始葡萄糖浓度变化。
【实施例2】通过降低pH的适应性突变
以pH6.0进行实施例1中的前一轮适应。为产生更佳突变体，还以更低pH进行适应。选择突变体ZM6010作为起点，因为其经1.0％乙酸适应，其为中间乙酸浓度。
以与实施例1中所述前一轮适应基本相同的方式进行此适应，除pH降至5.5外。适应后，获得单集落，及经历与前一轮相同的筛选过程。
图8显示选自含1.0％乙酸，pH5.5的平板的9个集落的筛选结果。基于图8所示的数据，选定集落7用于进一步适应性突变。将此突变体命名为ZM5510。制备此菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。
将突变体ZM5510在含1.0％乙酸，pH5.0的培养基中进一步适应。图9显示24小时发酵后从pH5.0、存在1.0％乙酸的琼脂平板挑选的8个单集落的比生长速率，O.D.值及乙醇浓度。选择集落3用于进一步研究，将其命名为ZM5010。制备此菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。
还旨在将ZM5510适应于更高乙酸浓度(1.2％，1.4％)，及2个pH(pH5.0及pH5.5)。但是在这些条件下琼脂平板上无单集落生长。表明pH5.0及pH5.5，1.0％乙酸浓度是极限。
表2.1总结了目前获得的突变体。“+”指此条件下成功开发了突变体。“-”指此条件下无突变体开发。“x”指此条件下未进行实验。
表2.1通过适应性突变开发的突变体的总结
  乙酸浓度   0.2％   0.5％   1.0％   1.2％   1.4％  1.6％
  pH＝6.0   +   +   +   +   +  -
  pH＝5.5   x   x   +   -   -  -
  pH＝5.0   X   x   +   -   -  -
【实施例3】NTG诱变
之前其他研究人员为开发乙酸耐受性使用了NTG诱变。为改良本发明的突变体的乙酸耐受性，选定突变体还经NTG诱变处理。种菌株是突变体ZM5510。如第4章所述NTG诱变后，将培养物平铺于含不同乙酸浓度(1.0％，1.2％，1.4％及1.6％)及不同pH(5.0，5.5及6.0)的琼脂平板。在各乙酸浓度于pH5.5及6.0的琼脂平板上形成单集落。但是，仅在有1.0％乙酸浓度、pH5.0的固体培养基上形成单集落。集落小且裸眼难以分辨哪个更大。各平板上仅有少数集落，因此，挑选仅3或4个单集落用于筛选。
图10显示4个单集落的比生长速率，O.D.值及乙醇浓度。这4个候选物之间的差异显著。这是因为NTG诱变是随机突变。菌株内的改变复杂，所以一种菌株可与另一种显著不同。使用相同参数来筛选集落。集落4具有高于平均值的比生长速率及乙醇浓度。及其O.D.值约是平均值，所以选择其用于进一步研究。制备此菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。将此突变体命名为ZMNTG6014。
图11显示从在1.6％乙酸存在下，以pH6.0经NTG诱变的4个单集落的特征。这4个单集落的表现不同。集落4具有高于平均值的比生长速率。但此集落的其他2个参数(O.D.及乙醇浓度)约是平均值。集落3具有最高O.D.值，其为平均值以上。及此集落的乙醇浓度也在平均值以上。但其比生长速率约在平均区。集落2具有最高乙醇浓度，其高于平均值，但其比生长速率及O.D.值均约为平均值。因为比生长速率总被认为是最重要参数，集落4选择用于进一步研究。制备此菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。将此突变体命名为ZMNTG6016。
图12显示从于pH5.5、在1.4％乙酸存在下经NTG诱变的3个集落的比生长速率及O.D.值。集落1的比生长速率低于平均值，所以此菌株为再被考虑。集落2及集落3具有几乎相同的比生长速率。及这2个集落的O.D.值均为约平均值。因为集落3具有略高于集落2的O.D.值，选择集落3用于进一步研究及命名为ZMNTG5514。但是制备2种菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。
图13显示从于pH5.5、在1.6％乙酸存在下经NTG诱变的4个单集落的参数。因为低pH及高乙酸浓度，这4个单集落表现出显著差异。选择集落3用于进一步研究。制备此菌株的甘油浓储液，及保存于-80℃冰箱。将此突变体命名为ZMNTG5516。
【实施例4】原菌株及通过适应性突变获得的突变体的特征
将突变体ZM6010，ZM6014，ZM5510及ZM5010的比生长速率，最终细胞浓度(表示为O.D.)，及延迟期与菌株的那些进行比较。ZM6010及ZM6014是以高乙酸浓度适应的突变体，及ZM5510及ZM5010是以低pH适应的突变体。这5种菌株在不同乙酸浓度及pH的生长曲线示于图14～15。在不同条件下这些菌株的延迟期及比生长速率总结于表4.1及4.2。
图14显示以pH6.0、无乙酸下这些菌株作为时间的函数的O.D.值。此条件下，全部5种菌株的表现相当接近。延迟期为约4.1小时；比生长速率为约0.52h-1；及最终O.D.值为约1.5。全部菌株在1天内完成发酵。
在乙酸存在下，突变体及菌株之间有显著差异。在1.0％乙酸存在下(图15)，全部菌株相比无乙酸条件，具有更长延迟期及更低比生长速率。原菌株相比突变体具有更长期，及更低比生长速率。突变体之间的差异小。此条件下，全部突变体的延迟期为约5.0小时，但原菌株为7.8小时。全部突变体的比生长速率为约0.43h-1，但原菌株的比生长速率仅为0.31h-1。全部突变体的O.D.仍为1.1以上，但原菌株的此值低于1.0。突变体及原菌株均可仍在1天内完成发酵。
随着升高乙酸浓度至1.2％(图16)，全部菌株的比生长速率降低及延迟期进一步增加。突变体及原菌株之间的差异变得更大。此条件下，原菌株无法在2天内完成发酵。原菌株的延迟期增至15.2小时。原菌株的比生长速率降至0.151h-1。另外，全部突变体在1天内完成发酵。全部突变体的延迟期约为5.5小时。ZM6014及ZM5510具有稍更高比生长速率，其为约0.43h-1，高于ZM5010及ZM6010，其为约0.36h-1。ZM6014及ZM5510的O.D.还稍高于ZM5010及ZM6010。
在1.4％乙酸存在下(图17)，乙酸对细胞生长的影响增加。原菌株在2天内罕有生长。48小时时原菌株的O.D.仅为0.142，及原菌株的延迟期长达40小时。全部突变体的延迟期相当接近(约7.8小时)，突变体之间的差异变得甚更大。ZM6014具有最高比生长速率，之后是ZM5510，ZM5010。ZM5510具有最高O.D，之后是ZM6014及ZM5010。ZM6010具有最低比生长速率及最低O.D.值。
以上显示的实验结果清楚地显示，通过适应性突变获得的突变体，在高乙酸浓度存在下，具有更高比生长速率，更短的延迟期及更高O.D.，表明原菌株突变体的更高乙酸耐受性。
图18～21显示原菌株及突变体于pH5.5，在不同乙酸浓度下的生长曲线。
无乙酸下，原菌株及突变体的表现接近。它们的表现还类似于以pH6.0的表现。此条件下，全部菌株的比生长速率约为0.52h-1；O.D.约为1.5；及延迟期约为4.1小时。
随着升高乙酸浓度，最终O.D.及比生长速率降低，及延迟期增加。相比以pH6.0的结果，比生长速率及最终O.D.以相同乙酸量降低及延迟期以相同乙酸量增加。就原菌株而言，在1.0％乙酸存在下延迟期为8.25小时。此条件下比生长速率为0.306h-1及最终O.D.约为0.9。4种突变体具有类似延迟期(5.0小时)，及类似最终O.D.。但ZM6010具有最低比生长速率0.354h-1，而其他3种突变体的比生长速率均为约0.42h-1。
在1.2％乙酸存在下，野生菌株的延迟期增至16小时。比生长速率降至0.103h-1及其无法在2天内完成发酵。4种突变体中，ZM6010具有最长延迟期及最低比生长速率。ZM5010具有低于ZM6014及ZM5510的比生长速率，尽管这些3种突变体的延迟期接近。
在1.4％乙酸存在下，原菌株在2天内根本不生长。突变体之间的差异变得甚更大。ZM6014具有最高O.D.及比生长速率，两个都稍高于ZM5510。ZM5010的O.D.及比生长速率低于ZM6014及ZM5510。ZM6010具有最低O.D.及比生长速率，与上述结果一致。
于pH5.5的实验结果还证明，突变体具有高于原菌株的乙酸耐受性。从于pH5.5、在1.4％乙酸存在下进行的实验获得的结果证实，ZM6010在4种突变体中具有最低乙酸耐受性。ZM5010具有低于ZM6014及ZM5510的乙酸耐受性。尽管其可耐受乙酸，其可不保持与ZM5510相同的比生长速率。
还于pH5.0评估了菌株(图22～25)。于pH5.0，突变体及野生菌株的表现类似于于pH5.5及pH6.0，无乙酸下的表现。比生长速率约为0.52h-1；延迟期约为4.2小时；O.D.约为1.5。
在1.0％乙酸存在下，原菌株具有最长延迟期，最低比生长速率及最低O.D.值。此条件下，尽管4种突变体的延迟期接近，ZM6010的比生长速率甚低于其他突变体的比生长速率，0.21h-1对比0.32h-1。
在1.2％乙酸存在下，ZM6010或野生菌株均不可在2天内完成发酵。在ZM5010，ZM5510及ZM6014中，ZM5010具有最低比生长速率，及O.D.值。ZM6014具有最高比生长速率，但ZM5510具有最高O.D.值。
在1.4％乙酸存在下，无菌株在2天内完成发酵。原菌株在2天内不显示任何生长，及ZM6010罕有生长。在此严重的生长限制条件下，突变体具有比原菌株更短的延迟期，更高比生长速率及最终O.D.。ZM5510，ZM6014及ZM5010开始生长约14小时，及它们表现出0.1h-1以上的比生长速率。
总之，于此pH，随着升高乙酸浓度，延迟期增加。随着升高乙酸浓度，比生长速率及O.D.降低。在相同量的乙酸存在下，相比以更高pH的任何菌株，O.D.及比生长速率更低，及延迟期更长。
表4.1及4.2总结了不同实验条件下全部菌株的延迟期及比生长。
表4.1不同pH及乙酸浓度下5种菌株的延迟期(小时)
表4.2不同pH及乙酸浓度下5种菌株的比生长速率(h-1)
Figure BPA00001258587500302
如数据所示，全部通过适应性突变获得的突变体具有高于原菌株的乙酸耐受性。突变体中，ZM5510及ZM6014具有最高乙酸耐受性，之后是ZM5010及ZM6010。
【实施例5】通过适应性及NTG诱变开发的突变体的比较
比较了仅通过适应性突变开发的突变体的生长行为与通过适应性突变之后NTG诱变的生长行为。将有1.4％及1.6％乙酸及5.0，5.5及6.0pH的接种培养基用于此实验。选择突变体ZM5510及ZM6014，从适应性突变的2种更适应的突变体，以比较还通过NTG诱变开发的突变体。
图26～28显示不同突变体在1.4％(A)及1.6％(B)乙酸存在下以不同pH的生长曲线。
以pH6.0，在1.4％乙酸存在下，基于O.D.，比生长速率(0.33h-1)及延迟期(7.8小时)，全部突变体的表现类似。但是，在1.6％乙酸存在下，ZM5510比其他突变体(0.3h-1)具有更低O.D.及比生长速率(0.249h-1)。
于pH5.5(图28)，在1.4％乙酸存在下，基于最终O.D.，比生长速率(0.25h-1)，及延迟期(10.2小时)，全部突变体的表现类似。在1.6％乙酸存在下，ZM5510具有最低比生长速率(0.17h-1)及O.D.值。此突变体还具有最长延迟期(14.3小时)。其他突变体具有类似延迟期(12.5小时)，但ZMNTG5514及ZMNTG6016还显示比ZM6014，ZMNTG5516及ZMNTG6014稍更低O.D.。ZMNTG5514，ZMNTG5516及ZMNTG6016具有最高比生长速率(0.23h-1)。
如所期望，相比以pH6.0获得的实验结果，以相同乙酸量的各菌株的延迟期变得更长及比生长速率降低。
于pH5.0，无菌株在2天内完成发酵(图29)。在1.4％乙酸存在下，ZM5510及ZM6014比其他突变体(14.5小时)具有稍更短的延迟期(14.1小时)。ZMNTG5516及ZMNTG6014比其他突变体(0.132及0.164h-1之间)具有稍更高比生长速率(0.19h-1)。在1.6％乙酸存在下，ZM5510，ZM6014及ZMNTG6016比其他突变体(22.8小时)具有更长延迟期(27.1小时)。ZMNTG6014比其他突变体具有稍更高比生长速率(0.18h-1)。ZMNTG5514，ZMNTG5516及ZMNTG6016(于pH5.5在1.6％乙酸存在下显示最高比生长速率)比ZM6610具有更低比生长速率。ZMNTG5516及ZMNTG6016比ZM5510具有更低比生长速率。这是因为，NTG诱变是随机突变，所以通过NTG诱变获得的突变体的行为有些无法预测。
表5.1及5.2总结了不同实验条件下全部突变体的延迟期及比生长速率。
表5.1不同pH及乙酸浓度下6种菌株的延迟期(小时)
Figure BPA00001258587500321
表5.2不同pH及乙酸浓度下6种菌株的比生长速率(h-1)
总之，难以比较这些突变体之间的乙酸耐受性。尽管某些实验条件下，基于研究的3个参数之一，一些ZMNTG突变体比ZM5510或ZM6014显示更佳表现，但这些突变体在其他实验条件下，还可显示更差表现。在全部实验条件下，无ZMNTG突变体比ZM6014显示更佳表现。
【实施例6】突变体的乙醇产生特征
此实验中，研究了突变体的乙醇产生特征。
基于化学计量学，理论乙醇产率应为约0.51g乙醇/g葡萄糖或约51％。这指，如果初始葡萄糖浓度是5％(w/v)，乙醇浓度应为约2.55％。
C6H12O6→2C2H5OH+2CO2
图29显示在1.6％乙酸存在下，以pH6.0的ZM5510的作为时间的函数的乙醇产率，葡萄糖消耗及乙酸盐浓度，以及生长曲线的实施例。“Δ”曲线代表葡萄糖浓度。初始葡萄糖浓度约为5％。菌株不立即开始发酵葡萄糖，这对应于生长曲线(“x”曲线)的延迟期。最终葡萄糖浓度为0，表示葡萄糖完全消耗。
乙醇浓度曲线
Figure BPA00001258587500341
显示，只要菌株开始消耗葡萄糖，其便开始产生乙醇。最终乙醇浓度约为2.5％，这是理论产率。此证明突变体可保持有效乙醇发酵的能力。
图30显示作为时间的函数的乙醇产率，葡萄糖消耗及乙酸盐浓度，以及生长曲线的另一实施例。所使用的菌株是ZM6014，及在1.6％乙酸存在下，以pH6.0进行实验。ZM6014的乙醇产生特征类似于ZM5510的乙醇产生特征。葡萄糖消耗具有延迟期。葡萄糖完全被消耗。最终乙醇浓度为2.5％，乙醇产率约为50％。
还在其他条件下评估了这2种突变体的乙醇产生特征。结果总结于表6.1。选择这2种突变体，因为它们在通过适应性突变获得的全部突变体中具有最高乙酸耐受性。实验结果显示，一旦发酵完全，乙醇产率总是约理论值，其为50％。于pH5.0、在1.6％乙酸存在下获得的发酵乙醇产率仅为理论值的约66％。这是由于在2天内不完全发酵。但是在其他条件下进行实验的在2天内全部完成，最终产率均为理论值的约100％。这意味着突变体ZM5510及ZM6014，保持高乙醇产率的优点。
表6.1不同发酵条件下2种突变体的乙醇产生特征(理论数的％)
  ZM5510   ZM6014
  5014   102.0±1.99   100.1±0.73
  5514   99.6±1.37   99.5±1.04
  6014   97.9±1.48   100.7±0.72
  5016   65.8±1.74   67.2±0.97
  5516   99.3±0.84   98.6±1.29
  6016   99.6±1.16   100.1±0.60
还贯穿发酵测量了乙酸浓度。图29及30中的乙酸浓度曲线(标记的“乙酸”)显示其经时恒定。此显示乙酸消耗不是耐受机制。发酵末期测量的pH同于初始值，表示发酵期间pH恒定。恒定pH及乙酸提示耐受性不是由于发酵期间环境条件改变所致。
【实施例7】对其他抑制剂的抗性
为测试就乙酸耐受性开发的突变体是否可交叉保护细胞免于其他抑制剂，用源自生物质的4种常见抑制剂(香兰素，甲酸，羟基苯甲酸，及糠醇)进行其他实验。以2个浓度评估各抑制剂。
选择突变体ZM6014用于研究。2天发酵后的O.D.值及比生长速率总结于表7.1。2天发酵后的乙醇产率总结于表7.2。
突变体ZM6014比原菌株显示更高甲酸耐受性。在2.68g/L甲酸存在下，ZM6014比原菌株生长至甚更高O.D.及比生长速率。
不受任何特定理论束缚，相信甲酸(其为弱酸)耐受性机制类似于乙酸(其也为弱酸)。
基于比生长速率，突变体ZM6014还显示更高香兰素耐受性，尤其是在高浓度香兰素(1g/L)存在下。
糠醇是己糖脱水形成的呋喃衍生物。在进行的实验浓度范围内未观察到抑制。
表7.1在不同抑制剂存在下的发酵的O.D.值及比生长速率
Figure BPA00001258587500351
乙醇产率不受抑制剂影响。一旦发酵结束，及菌株达到最大O.D.，乙醇产率总是类似于理论数。在5.37g/L甲酸存在下，乙醇产率仅为理论值的5％。这是因为实验期间菌株仅少生长。
表7.2在不同抑制剂存在下2种菌株的乙醇产率(理论产率的％)
  抑制剂   原ZM4   ZM6014
  香兰素(0.5g/L)   101.0±1.20   99.2±1.65
  香兰素(1g/L)   99.5±2.25   102±1.44
  甲酸(2.68g/L)   98.9±2.30   97.0±1.79
  甲酸(5.37g/L)   5.1±0.000   5.2±0.000
  羟基苯甲酸(3.4g/L)   97.7±1.03   98.5±1.65
  羟基苯甲酸(6.8g/L)   98.0±2.34   99.4±1.89
  糠醇(3.89g/L)   98.7±2.46   99.6±2.63
  糠醇(7.79g/L)   98.3±1.70   99.9±2.39
如数据所示，无关于pH，更高乙酸浓度导致更低比生长速率及更低产生的生物质及更长延迟期。以低pH，乙酸效果变得甚更严重。
通过适应性突变，开发了几种有用的乙酸耐受型菌株。相比原菌株，在乙酸存在下，这些突变体表现出更高比生长速率，更高最终O.D.，及具有显著更短的延迟期，表示突变体的更优耐受性。例如，最适应的突变体可在所测最抑制性条件(pH5.0及1.4％乙酸浓度)下生长，比生长速率为0.16h-1，然而原菌株在相同条件下根本无法生长。
突变体保持高乙醇发酵能力，乙醇产率达到理论产率。乙醇发酵时间表及延迟期对应于细胞生长，表示乙醇产率与细胞生长的紧密相关。
实施例还显示增强的乙酸耐受性可导致增强的其他抑制剂耐受性，所述其他抑制剂包括：甲酸，羟基苯甲酸，及香兰素。此交叉保护使得乙酸耐受型菌株更有吸引力，使其可用于从可更新的来源生物生产乙醇。
总之，通过适应性突变，成功开发了乙酸耐受型运动发酵单胞菌菌株。这些菌株已被证实具有高于原菌株的乙酸耐受性及仍具有高乙醇产率。这些突变体还被证实具有更高其他抑制剂(例如甲酸及香兰素)耐受性，同时保持如羟基苯甲酸之类的抑制剂耐受性。
【实施例8】用于利用木糖的适应性突变
使用的菌株是运动发酵单胞菌ZM4及大肠杆菌JM109，JM110及SZ63如描述于例如，Shengde Zhou，T.B.C.，A.Hasona，K.T.Shanm ugam，and L.O.Ingram，Production of Optically Pure D-Lactic Acid in Mineral Salts Medium by Metabolically Engineered Escherichia coli W3110.Applied and Environmental Microbiology，2003.69(1)：p.399-407。ZM4生长于富含10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖及2g/L KH2PO4的培养基(RM)。当仅在木糖上生长时，RM中的葡萄糖被木糖代替。将大肠杆菌细胞常规生长于LB培养基。根据需要，培养基中补充了抗生素至100μg/ml氯霉素及100μg/ml氨苄西林的最终浓度。使用的发酵罐来自Infors HT Multifors，Bottmingen，Switzerland。
通过将从大肠杆菌SZ63及运动发酵单胞菌的元件(1)，(2)，及(3)亚克隆到市售的载体pSTV28中来构建如图32所示的质粒pZMETX，如描述于例如，Inc，T.B.pSTV28/29DNA.2008；可从以下网址访问：http://catalog.takara-bio.co.jp/en/product/basic_info.asp？unitid＝U100005674。
元件(1)Ppdc-xylA-xylB-Ppdc是运动发酵单胞菌ZM4的天然的丙酮酸脱羧酶启动子(描述于例如，Seo，J.S.，et al.，The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4.Nature Biotechnology，2005.23(1)：p.63-68.)。xylA-xylB是大肠杆菌SZ63中的操纵子(描述于例如，引用的200903-13-2009；可从此网址访问：http://ecocyc.org/)，分别编码木糖异构酶及木酮糖激酶的基因。
元件(2)Peno-talB-tktA-Peno是运动发酵单胞菌ZM4的天然的烯醇酶启动子(描述于例如，Seo，J.S.，et al.，The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4.Nature Biotechnology，2005.23(1)：p.63-68.)。已从大肠杆菌SZ63克隆talB及tktA(描述于例如，引用的200903-13-2009；可从以下网址访问：http://ecocyc.org/)，它们分别编码转醛醇酶及转酮醇酶的基因。
元件(3)ZM27-其是含复制原点及在运动发酵单胞菌细胞内维持质粒pZMETX必要的基因信息的区。已从运动发酵单胞菌ATCC10988的2.7kb天然的质粒pZMO3克隆ZM27(描述于例如，Afendra，A.S.，et al.，Characterization of the mobilization region of the Zymomonas mobilis ATCC10988 plasmid pZMO3.Plasmid，1999.41(1)：p.73-77，通过引用并入本文)。
如下进行质粒pZMETX转化入运动发酵单胞菌ZM4：将JM109或JM110用作收获质粒pZMETX的中间宿主。从JM109/pZMETX或JM110/pZMETX，使用质粒miniprep试剂盒生产商的流程(Fermentas GeneJet and Zymoresearch，通过引用并入本文)进行质粒提取。将提取的质粒电穿孔到运动发酵单胞菌ZM4的感受态细胞。
使用集落PCR及酶测定，就4种克隆的基因产物(木糖异构酶，木酮糖激酶，转醛醇酶及转酮醇酶)进行确认质粒pZMETX存在于ZM4/pZMETX中。酶测定描述于例如，Callens，M.，et al.，CATALYTIC PROPERTIES OF D-XYLOSE ISOMERASE FROM STREPTOMYCES-VIOLACEORUBER.Enzyme and Microbial Technology，1986.8(11)：p.696-700and Feldmann，S.D.，H.Sahm，and G.A.Sprenger，Pentose metabolism in Zymomonas mobilis wild-type and recombinant strains.Applied Microbiology and Biotechnology，1992.38(3)：p.354-361。
利用木糖的适应性突变-ZM4/pZMETX开始不能在木糖上生长。因此首先生长在葡萄糖及木糖的混合物上。因此，根据图31，将木糖选择压力施加于菌株，而将它们在RM中培养。RM中葡萄糖及木糖的总量设为浓度5％。开始时，木糖量为0.25％而葡萄糖量为4.75％。适应性突变方法期间，木糖量逐渐升高，从0.25％～5％，同时葡萄糖浓度降低，从4.75％～0。适应性突变产生适应的突变菌株ZM4/pZMETX A1，其可在5％木糖上生长。
在补充了5％木糖的RM中进行升高比生长速率及从木糖的容积乙醇产力的适应性突变-下一轮的适应性突变，以获得具有更高比生长速率及容积乙醇产力的菌株。获得2种改良的菌株，名为ZM4/pZMETX A2及ZM4/pZMETX A3。后缀1，2及3分别表示第一，第二及第三组适应性突变后获得的菌株。ZM4/pZMETX A3是目前获得的最适应的木糖利用菌株及ZM4/pZMETX A1是适应性突变的第一代。
ZM4/pZMETX A2的旋盖瓶发酵-在用补充了5％木糖的RM填充到总容积60％的静态旋盖瓶中进行此实验。不进行pH控制。以规则间隔抽出样品来测定培养肉汤中的细胞团，木糖及乙醇浓度。此实验结果总结于图33及表8.1。旋盖瓶中分批发酵获得的乙醇产率及容积乙醇产力高于文献报道。
在发酵罐中，以pH6用ZM4/pZMETX A2及ZM4/pZMETX A3发酵-以150rpm，有5％木糖下评估发酵罐中ZM4/pZMETX A2及ZM4/pZMETX A3。通过添加2N NaOH碱及1N H3PO4酸将发酵罐pH控制于6。通过以0.2lpm的速率、1巴压力喷射氮气通过培养物来保持厌氧条件。发酵结果总结于图34，35及表8.1及8.3，而文献报道的结果示于表8.2。ZM4/pZMETX A3的比生长速率，体积及比乙醇产力及特定木糖消耗速率高于ZM4/pZMETX A2及文献中报道的菌株。因此，适应性突变体表现出令人惊讶的及预料不到的结果，例如乙醇产率。
不控制pH，在发酵罐中用ZM4/pZMETX A2及ZM4/pZMETXA3发酵-除了不控制pH之外，保持类似于上述发酵的发酵罐中的全部条件。就兼用ZM4/pZMETX A2及ZM4/pZMETX A3发酵而言，pH从5.9的初始值降至4.7的最终值。相比之前的发酵，其中pH保持恒定在6，如表8.1所示，各种发酵速率及产率方面未观察到显著差异。这证实了，相对于文献中报道，菌株ZM4/pZMETX A3不用控制pH而以令人惊讶的及预料不到的速率进行发酵的能力。
表8.1：适应的菌株实验数据
Figure BPA00001258587500391
当在用氮气泡通过培养基的生物反应器中进行发酵时，显著的乙醇量存在于外排气流中。产率计算不计外排气流中的乙醇损失。因此，显示的产率代表低的评估值。当将相同菌株用于盖了盖子的瓶中的发酵时，产率高达90％。
DCW-干细胞重量；MR-最大报道值。作者未报道平均值；ND-未测定；NR-未报道
表8.2：文献数据
Figure BPA00001258587500401
1Zhang et al，Science，1995，267，(5195)，240-243
2Kim et al，App Env Microbio，2000，66(1)，186-93
3Lawford et al，App Biochem Biotech，2002，98-100，429-448
DCW-干细胞重量；MR-最大报道值。作者未报道平均值；ND-未测定；NR-未报道
表8.3：由ZM4/pZMETX A3及A2在发酵罐中，以pH6，于厌氧条件下发酵木糖。发酵数据表示为时间的函数。
Figure BPA00001258587500411
上述ZM4/pZMETX A3被保藏于American Type Culture Collection，其具有保藏号：PTA-9991；及保藏日：2009年5月1日。
上述ZM6014被保藏于American Type Culture Collection，其具有保藏号：PTA-9992；及保藏日：2009年5月1日。
权利要求要求保护的范围不受本文所述的特定实施方式的限制。相反，本领域技术人员从说明书的教导中明晰其他对本文所述的发明所做的各种修饰。这些修饰也旨在落入权利要求书的范围内。
如本文引用的各专利申请公开、专利及专利申请被指通过引用整体并入本文一样，将本文引用的全部参考文献通过引用整体并入本文。
通过现有发明的精神，所引用的任何早于本申请的申请日的出版物的公开内容不被认为承认本发明不被确定居先此类出版物。

Claims (15)

1.制备更耐受抑制剂的运动发酵单胞菌菌株的方法，包括：
(a)在基本上无抑制剂的培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；
(b)在浓度连续升高的所述抑制剂存在下逐步培养所述运动发酵单胞菌菌株；及
(c)分离适应于升高的抑制剂浓度的突变菌株。
2.权利要求1的方法，其中所述抑制剂是：乙酸、甲酸、2-糠醛、2-糠酸、香兰素、羟基苯甲酸、乙醇或它们的混合物。
3.权利要求1的方法，
·其中所述抑制剂包括乙酸；及
·其中所述分离的运动发酵单胞菌突变菌株的特征在于基本上表现出下列特征中的一个或多个：
(1)延迟期短于约1天；或
(2)比生长速率为至少约0.15h-1；或
(3)乙醇产率为理论产率的至少约95％；
其中所述一个或多个特征是在有50g/L葡萄糖及1.6％乙酸浓度的RM培养基中以pH约6发酵时表现出的。
4.权利要求1的方法，其还包括：
(a)在适宜培养基中生长运动发酵单胞菌菌株；
(b)在pH连续降低的培养基中逐步培养所述运动发酵单胞菌菌株；及
(c)分离适应于降低的pH的突变菌株。
5.制备能增加碳水化合物发酵的运动发酵单胞菌菌株的方法，所述碳水化合物是选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物，所述方法包括：
(a)在含葡萄糖的培养基中生长运动发酵单胞菌原菌株；
(b)在浓度连续升高的选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物及量连续降低的葡萄糖存在下逐步培养所述运动发酵单胞菌菌株；及
(c)分离能增加碳水化合物发酵的突变菌株，所述碳水化合物是选自木糖、阿拉伯糖、甘露糖及它们的混合物的一种或多种碳水化合物。
6.权利要求5的方法，其还在步骤(a)之前包括：将不能发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株基因修饰为能发酵木糖的运动发酵单胞菌原菌株。
7.权利要求5的方法，其中所述分离的运动发酵单胞菌突变菌株的特征在于基本上表现出下列特征中的一个或多个：
(1)乙醇产率为理论产率的至少约85％；或
(2)容积乙醇产力为至少约0.5g乙醇/l反应器/小时；或
(3)比乙醇产力为至少约0.9g乙醇/g干细胞团/小时；或
(4)木糖消耗速率为至少约1.8g木糖/g干细胞团/小时；或
(5)短于约40小时内消耗5％(w/v)木糖的能力；
其中所述一个或多个特征是在有50g/L木糖、无葡萄糖的RM培养基中发酵时表现出的。
8.权利要求1或5的方法，其还包括在所述适应的突变菌株存在下发酵碳水化合物，其中所述碳水化合物源自生物质，或是生物质的一部分。
9.权利要求1或5的方法，其还包括基于生长速率、细胞团浓度、乙醇产率或它们的组合筛选所述分离的突变菌株。
10.权利要求1或5的方法，其中所述逐步培养持续至所述分离的突变体的生长速率、细胞团浓度、乙醇产率、或它们的组合稳定。
11.非天然、生物学纯的运动发酵单胞菌突变菌株，其特征在于，基本上表现出下列特征中的一个或多个：
(1)延迟期短于约1天；或
(2)比生长速率为至少约0.15h-1；或
(3)乙醇产率为理论产率的至少约95％；
(4)乙醇产率为理论产率的至少约85％；或
(5)容积乙醇产力为至少约0.5g乙醇/l反应器/小时；或
(6)比乙醇产力为至少约0.9g乙醇/g干细胞团/小时；或
(7)木糖消耗速率为至少约1.8g木糖/g干细胞团/小时；或
(8)短于约40小时内消耗5％(w/v)木糖的能力；
·其中所述一个或多个特征(1)～(3)是在有50g/L葡萄糖及1.6％乙酸浓度的RM培养基中以pH约6发酵时表现出的，及
·其中所述一个或多个特征(4)～(8)是在有50g/L木糖、无葡萄糖的RM培养基中发酵时表现出的。
12.权利要求11的菌株，其中所述菌株基本上表现出所述特征中的至少2个或多个。
13.权利要求11的菌株，其中所述菌株基本上表现出所述特征中的至少3个或多个。
14.权利要求11的菌株，其中所述菌株基本上表现出所述特征中的至少4个或多个。
15.权利要求11的菌株，其中所述菌株基本上表现出所述特征中的至少5个或多个。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666555A (zh) * 2019-02-20 2019-04-23 湖北大学 一种转化高糖产品为酒精饮品的方法及应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8247208B2 (en) 2008-12-22 2012-08-21 Alliance For Sustainable Energy Llc Zymomonas with improved xylose utilization in stress conditions
US9115376B2 (en) 2010-11-15 2015-08-25 Scandinavian Technology Group Ab Saccharomyces cerevisiae strains
US8476048B2 (en) 2010-12-17 2013-07-02 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium
US20120196342A1 (en) 2011-02-01 2012-08-02 Rachel Ruizhen Chen Industrial Applications of A Novel Aldo/Keto Reductase Of Zymomonas Mobilis
US20130157332A1 (en) * 2011-12-20 2013-06-20 E I Du Pont De Nemours And Company Gene inactivation allowing immediate growth on xylose medium by engineered zymomonas
CN104673737B (zh) * 2015-04-01 2017-07-28 农业部沼气科学研究所 一株耐乙醇运动发酵单胞菌及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4900670A (en) * 1988-02-23 1990-02-13 Cornell Research Foundation, Inc. Microbiological production of acetaldeyde

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7223575B2 (en) 2000-05-01 2007-05-29 Midwest Research Institute Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof
WO2009058927A1 (en) * 2007-10-30 2009-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Zymomonas with improved ethanol production in medium containing concentrated sugars and acetate

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4900670A (en) * 1988-02-23 1990-02-13 Cornell Research Foundation, Inc. Microbiological production of acetaldeyde

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EVA JOACHIMSTHAL: "A mutant of Zymomonas mobilis ZM4 capable of ethanol production from glucose in the presence of high acetate concentrations", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *
傅云霞: "运动发酵单胞耐酸菌株的诱变筛选及发酵条件的优化", 《福建农林大学学报(自然科学版)》 *
陶飞: "副产物对运动发酵单胞菌酒精发酵的影响", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666555A (zh) * 2019-02-20 2019-04-23 湖北大学 一种转化高糖产品为酒精饮品的方法及应用

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