JP5723290B2 - ストレス状態下におけるキシロース利用が改善されたザイモモナス(zymomonas) - Google Patents
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Description
本明細書は、2008年12月22日に出願され、その全体を参照によって援用する米国仮特許出願第61/139852号明細書の優先権を主張する。
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第04−03−CA−70224号、および米国エネルギー省と国立再生可能エネルギー研究所を管理運営するアライアンス・フォー・サステーナブル・エナジー社(Alliance for Sustainable Energy,LLC)との間の契約番号第DE−AC36−08GO28308号の下、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
1)キシロースからキシルロースへの転換を触媒するキシロースイソメラーゼ;
2)キシルロースをリン酸化してキシルロース5−ホスフェートを形成するキシルロキナーゼ;
3)トランスケトラーゼ;および
4)トランスアルドラーゼ。
a)1つ以上のキシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)細胞を提供するステップと;
b)(a)のキシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)細胞を少なくとも約50g/Lのキシロースを含んでなる補給増殖培地中で連続的に成長させ、それによってエタノールを含んでなる培養物が生成するステップと;
c)(b)の培養物に一定量のアンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムを添加し、それによってエタノールおよび酢酸アンモニウムを含んでなるストレス培養物が生成するステップと;
d)(c)のストレス培養物を連続的に成長させ、それによってキシロース利用が改善されたザイモモナス(Zymomonas)細胞を生じさせるステップと;
e)(d)の培養物から1つ以上の細胞を単離するステップと
を含んでなり、少なくとも1つ以上の単離された細胞が酢酸アンモニウムおよびエタノールの存在下において、(a)で提供されるキシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)細胞との比較で改善されたキシロース利用を示し、改善された細胞が株として成長する、改善されたキシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株を生成する方法を提供する。
a)改善されたストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株を提供するステップと;
b)a)の株を適切な発酵条件下で発酵培地と接触させ、エタノールを生成させるステップと;
c)任意にエタノールを単離するステップと
を含んでなる、エタノールを生成する方法を提供する。
出願人らは、キシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株をストレス状態下における連続的成長を伴う過程を通じて株を適応させることで、ストレス発酵条件下で増大する量のキシロースを利用するようにできることを発見した。キシロース利用の増大は、本明細書に記載される適応過程を受けていないキシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株によるキシロース利用と比較される。本明細書でザイモモナス(Zymomonas)株の適応中に使用されるストレス状態は、生物由来資源の加水分解産物を含んでなる培地中でザイモモナス(Zymomonas)株を成長させる場合に存在するのと類似した、ストレス状態を提供する。したがって本適応株は、生物由来資源の加水分解産物を含んでなる培地中で成長する際にキシロース利用が増大していてもよく、それによってより効率的な成長と生成物の形成を提供する。
本方法では、ストレス発酵条件下において、キシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株(上述のような出発株または原株)を、キシロースを含んでなる培地中で連続的に成長させる。培地は唯一の糖としてキシロースを含有してもよく、またはそれはキシロースと、グルコースなどのその他の糖との混合物を含有してもよい。好ましいのは、例えばそれぞれ少なくとも約50g/Lのキシロースおよびグルコースなどの培地中の高い糖濃度である。片方または双方の糖がより多量にあってもよい。
本明細書で開示されるのは、キシロース利用が改善された、ストレス発酵適応キシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株である。これらの株は、発酵培地がエタノール、酢酸アンモニウム、および高い糖濃度を含有するストレス状態で成長した際に、対応する非適応株との比較で、少なくとも約12%のキシロース利用の増大によって特徴付けられてもよい。適応株は、少なくとも約12%、17%、20%、25%、または30%さらに多くのキシロースを利用してもよい。これらの特徴を有するキシロース利用ザイモモナス(Zymomonas)株は、開示される方法を使用して慣例的に単離してもよい。キシロース利用の量は、原株、発酵条件、および特定適応株それ自体をはじめとする要因に左右される。
エタノール生成のために、キシロースをはじめとする混合糖を含有する培地に、本発明のザイモモナス(Zymomonas)株を接触させる。成長が阻害される程に混合糖濃度が高い場合、培地はソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含んでもよい。ガラクチトールまたはリビトールがソルビトールまたはマンニトールを置換してもよく、またはそれと組み合わせられてもよい。ザイモモナス(Zymomonas)は、発酵が起きてエタノールが生成される培地中で成長する。(嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい)発酵は、空気、酸素、またはその他のガスの補給なしに少なくとも約24時間実施され、30時間以上実施されてもよい。最大のエタノール生成に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に阻害物質が存在する場合、より長時間の発酵期間が必要である。発酵はpH約4.5〜約7.5において、約30℃〜約37℃の温度で実施されてもよい。
HPLC法
分析は、Agilent 1100シリーズHPLCおよびLC 3D用Agilent ChemStationソフトウェアを用いて実施した。カラムは、BioRad
Micro−Guard Cartridge Cation−H(125−0129)を使用した、BioRad Aminex HPX−87H(HPLC Organic Analysis Column 125−0140)であった。操作条件は次のとおりであった。
流量:0.6mL/分
溶媒:0.01N H2SO4
停止時間:25分
注入量:5μL
オートサンプラー:10℃または4℃で温度調節
カラム温度:55℃
検出器:屈折率(40℃)
外部標準較正曲線使用
ザイモモナス(Zymomonas)のストレス発酵への適応
Z.モビリス(Z.mobilis)株ZW801−4の培養物を次のようなストレス条件下で成長させた。ZW801−4は、参照によって本明細書に援用する同一譲受人の同時係属米国特許公開第2008/0286870−A1号明細書に記載されるZ.モビリス(Z.mobilis)の組み換えキシロース利用株である。株ZW801−4は株ZW800に由来し、それは株ZW658に由来し、それらは全て米国特許出願第11/862566号明細書に記載される。ZW658は、逐次遺伝子転位事象と、それに続くキシロースを含有する選択培地上での適応を通じて、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする4つのキシロース利用遺伝子を含有するPgapxylABおよびPgaptaltktの2つのオペロンをZW1(ATCC#31821)のゲノムに組み込んで構築された。ZW658はATCC#PTA−7858として寄託された。ZW658中で、宿主媒介二重交叉相同的組換えを使用し、スペクチノマイシン抵抗性を選択可能なマーカーとして、グルコース果糖酸化還元酵素をコードする遺伝子を挿入性に不活性化して、ZW800を作り出した。loxP部位によって結合するスペクチノマイシン抵抗性マーカーをCreリコンビナーゼを使用した部位特異的遺伝子組み換えによって除去し、ZW801−4を作り出した。
適応連続培養発酵槽に由来する培養物の評価
連続適応培養からのサンプルは、最初に発酵槽F1Cから74日目に、発酵槽F4Bから69日目に、発酵槽F6から78日目に採取し、また最初の試料採取後の様々な時点で採取した。全て−80℃で保存し、試験のためにRMG5培地中で復活させた。種培養物は、基礎培地+75g/Lグルコースおよび25g/Lキシロース中で、OD600が4.5になるまで33℃で生長させた。
単離された適応株の性能
グルコース含有プレート上に播種することで単一コロニーを単離し、表1に示す様々な段階の適応培養物からの純化株を成長させるのに使用した。160mMの酢酸アンモニウム中での培養物全体の試験について記載される培地および条件を使用して、単一コロニー由来株を試験した。
グルコース:62.3g/L
キシロース:40.2g/L
アラビノース:5.7g/L
セロビオース:9.6g/L
アセテート:6.4g/L
残る40%の試験培地は、次のような最終培地濃度に調節された。
5g/Lの酵母抽出物
2g/Lのリン酸水素カリウム
1g/Lの硫酸マグネシウム
100g/Lのグルコース
80g/Lのキシロース
7g/Lのアセテート
ZW705適応株の評価
150mlの撹拌されるpHおよび温度調節フラスコ内で、ZW705、および対照としてのZW801−4のバッチ培養物を成長させた。出発温度は30℃であり、27℃まで変動した。pHは5.8に保った。培地は、10g/Lの酵母抽出物、2g/LのKH2PO4、1g/LのMgSO4、1.8g/Lのソルビトールを含有するmRM3であった。表3に列挙されるように、アセテート、グルコース、およびキシロースを培地に添加した。
Claims (11)
- a)キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)細胞を備えるステップと;
b)(a)のキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)細胞をキシロースを含む流加増殖培地中で連続的に増殖させ、それによってエタノールを含む培養物を生産させるステップと;
c)(b)の培養物にアンモニアと酢酸、または酢酸アンモニウムを添加して、少なくとも24mMの酢酸アンモニウム濃度をもたらし、それによってエタノールおよび酢酸アンモニウムを含むストレス培養物を生産させるステップと;
d)(c)のストレス培養物を連続的に増殖させ、それによって改善されたキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)細胞を生産させるステップと;
e)(d)の培養物から1つまたはそれ以上の細胞を単離するステップと
を含み、ここで少なくとも1つまたはそれ以上の単離された細胞が酢酸アンモニウムおよびエタノールの存在下において、(a)の備えたキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)細胞と比較して改善されたキシロース資化性を示し、改善された細胞が株として成長する、改善されたキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株を生産する方法。 - ステップ(d)中に酢酸アンモニウム濃度を少なくとも1回増大させる、請求項1に記載の方法。
- (b)の部分において、培地中のキシロースが少なくとも50g/lの濃度である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって得られる、単離された改善キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株。
- 対応する非馴化株と比較して、少なくとも12%さらに多いキシロースが利用される、請求項4に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株。
- 対応する非馴化株と比較して、少なくとも20%さらに多いキシロースが利用される、請求項5に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株。
- 対応する非馴化株と比較して、少なくとも30%さらに多いキシロースが利用される、請求項6に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株。
- ストレス発酵馴化キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株であって、0.1OD 600nmの細胞密度で開始した場合に、60g/Lキシロース、80g/Lグルコース、および9.54g/L酢酸を含有し、pHが5.8に調節された培地で、少なくとも70%のキシロースを利用し、前記馴化とは請求項1に記載の方法によって生産されることを指す、ストレス発酵馴化キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株。
- キシロース資化性が85%である、請求項8に記載のストレス発酵馴化キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株。
- (b)においてエタノールが少なくとも18g/Lである、請求項1に記載の方法。
- a)請求項4〜9のいずれか一項に記載の単離された改善キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株を備えるステップと;
b)a)の株を適した発酵条件下で発酵培地と接触させ、エタノールを生産させるステップと、
c)場合によりエタノールを単離するステップと
を含む、エタノールを生産する方法。
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