CN102257129A - 用于在胁迫条件下制备乙醇的具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属 - Google Patents

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Abstract

使用适应方法获得在胁迫条件下在发酵期间具有改善的木糖利用率和乙醇产率的利用木糖的发酵单胞菌属菌株。所述适应涉及在包含高糖、乙酸、氨和乙醇的培养基中连续培养利用木糖的发酵单胞菌属。

Description

用于在胁迫条件下制备乙醇的具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属
条件
本专利申请要求2008年12月22日提交的美国临时申请61/139852的优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。
政府权利声明
本发明由美国政府支持，受与能源部签署的合同04-03-CA-70224和美国能源部与可持续能源联盟(the Alliance for Sustainable Energy，LLC)、国家可再生能源实验室(the National Renewable EnergyLaboratory)的管理人员和操作员之间的合同DE-AC36-08GO28308的约束。美国政府拥有本发明的必然权利。
发明领域
本发明涉及微生物学和发酵的领域。更具体地讲，描述了在胁迫发酵条件下具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属菌株的开发。
发明背景
通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望产生乙醇以及其它有用产品的微生物能够使用木糖作为碳源，因为木糖是水解的木质纤维质材料中主要的戊糖，并因此能够提供大量可用的、低成本碳底物。运动发酵单胞菌和其它天生不会利用木糖的产生乙醇的细菌可为了木糖的利用而通过编码1)木糖异构酶，其催化木糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，其磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；以及4)转醛醇酶的基因的导入而基因工程化。
用于木糖代谢的运动发酵单胞菌细胞(US 5514583，US 5712133，US 6566107，WO 95/28476，Feldmann等人的(1992)Appl MicrobiolBiotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240-243)，以及发酵细菌属棕榈科(Zymobacter palma)菌株(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)的工程化已经取得了成功。然而，工程化的菌株通常不像在葡萄糖上那样在木糖上生长并且产生乙醇。为利用木糖而工程化的菌株已经通过木糖培养基上的连续通道而适应，得到如美国专利申请20030162271和共同拥有且共同未决的美国专利申请公布号为US 2008-0286870 A1的专利中所述的具有改善的木糖利用率的菌株。已显示这些改善是为了pGAP启动子改善的表达而对改变序列的选择结果，所述启动子调控木糖异构酶基因的表达。由于它们在运动发酵单胞菌改善的转基因表达中的使用，这些序列和方法公开在共同拥有且共同未决的美国专利申请公布号为US2009-0246876 A1和US2009-0246846 A1的专利中。
期望使用纤维素水解产物作为用于通过生物催化剂制备乙醇的发酵培养基的糖的可再生来源。纤维素水解产物，其一般由生物质通过预处理和糖化产生，通常包含对生物催化剂的生长和产生有害的物质。例如，乙酸根是存在于纤维素水解产物中的常见产物，已发现其在水解产物中通常存在的浓度下对运动发酵单胞菌有抑制作用(Ranatunga等人(1997)Applied Biochemistry and Biotechnology67：185-198)。
仍然有对发酵单胞菌属的菌株和其它产生乙醇的细菌的需要，所述细菌在胁迫存在下具有最大化的木糖利用率，所述胁迫由糖化生物质时产生的不纯糖源所施加。
发明内容
本发明提供获取利用木糖的发酵单胞菌属菌株的方法，以及使用该方法制备的发酵单胞菌属的菌株，所述菌株在胁迫发酵条件下具有改善的木糖利用率。
因此，本发明提供制备改善的利用木糖的发酵单胞菌属菌株的方法，所述方法包括：
a)提供一个或多个利用木糖的发酵单胞菌属细胞；
b)使(a)的利用木糖的发酵单胞菌属细胞在包含至少约50g/L木糖的饲养生长培养基(feeding growth medium)中持续生长，从而产生包含乙醇的培养物；
c)向(b)的培养物添加一定量的铵和乙酸或乙酸铵，从而产生包含乙醇和乙酸铵的胁迫培养物；
d)使(c)的胁迫培养物持续生长，从而产生改善的利用木糖的发酵单胞菌属细胞；以及
e)从(d)的培养物分离一个或多个细胞，其中至少一个或多个分离的细胞与(a)提供的利用木糖的发酵单胞菌属细胞相比，在乙酸铵和乙醇的存在下表现出改善的木糖利用率，并且使所述改善的细胞生长为菌株。
在另一个实施方案中，本发明提供改善的利用木糖的发酵单胞菌属细胞和使用本文所公开方法获得的菌株。
在另一个实施方案中，本发明是适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，其使用在混合糖培养基中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％的可利用木糖，所述混合糖培养基例如pH调节至5.8的包含60g/L木糖、80g/L葡萄糖、9.54g/L乙酸盐的培养基，当开始时600nm处的细胞密度为0.1OD，并且在所述条件下相应的未适应菌株利用约5％、10％、15％、20％、25％、或至多约30％可获得的木糖。
在另一个实施方案中，本发明提供制备乙醇的方法，所述方法包括：
a)提供改善的适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株；
b)使a)的菌株与发酵培养基在合适的发酵条件下接触，其中产生乙醇；以及
c)任选地分离乙醇。
适应胁迫发酵的细胞或菌株可通过本文的适应步骤提供，具体涉及对包含乙醇和乙酸铵的培养基的适应。
发明详述
本发明描述了制备和分离发酵单胞菌属细胞(生长成为菌株)的方法，所述细胞在胁迫发酵条件下具有改善的木糖利用率。应用所述方法的发酵单胞菌属细胞是利用木糖的细胞，根据本发明，使其在乙酸铵和乙醇胁迫的条件下持续生长以制备适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株。本发明还涉及使用本发明方法分离的适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，并且当与持续生长过程之前的相同菌株的细胞相比，其在胁迫发酵条件下利用更高百分比的给料的木糖。为了通过发酵糖制备乙醇，可在工序中使用适应胁迫发酵的菌株。由本发明适应胁迫发酵的发酵单胞菌属菌株制备的乙醇可用作替代化石燃料的能源。
以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的判读。
如本文所用，术语“包含”、“由组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他的包含物。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真实的(或存在的)且B是虚假的(或不存在的)，A是虚假的(或不存在的)且B是真实的(或存在的)，以及A和B都是真实的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分实例(即出现的事物)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，“持续生长”是指随着新培养基的给料而生长并且排出流出物，使得细胞可持续生长并且产生产物。
如本文所用，“胁迫培养物”是指在培养基中包括物质的培养物，所述物质导致对用于培养物中的生物催化剂的胁迫。当与用于不具有导致胁迫的物质的发酵中的生物催化剂的功能相比，生物催化剂的胁迫可被认为是减慢的生长速率、降低的产品产率、降低的碳水化合物利用率、或者其它困难。特别要关注的是影响用于乙醇制备的糖利用率的对发酵单胞菌属菌株的胁迫。此类胁迫包括乙酸根、氨、以及乙醇的存在。还要关注的是此类胁迫对用于乙醇制备的糖利用率的影响。
如本文所用，“利用木糖的一个或多个发酵单胞菌属细胞”是指被遗传工程化以表达赋予使用木糖作为用于发酵的碳水化合物来源的能力的酶的一个或多个菌株细胞。
如本文所用，“相应的未适应的菌株”是指原始的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，其是使用本文所公开的胁迫适应方法由其制备改善的菌株的菌株。
如本文所用，“饲养生长培养基”是指添加到连续培养器皿中的培养基。
如本文所用，“生物质的水解产物”和“纤维素水解产物”是指通常通过预处理和糖化过程由生物质产生的产物，所述生物质是纤维素材料。可发酵的糖存在于水解产物中，也存在其它产物。
增加的木糖利用率
申请人已发现：可通过经由包括在胁迫条件下持续生长的方法使菌株适应而制备利用木糖的发酵单胞菌属菌株，以在胁迫发酵条件下利用增加量的木糖。将木糖利用率的增加与未经历如本文所述的适应过程的利用木糖的发酵单胞菌属菌株的木糖利用率比较。本文所用的在发酵单胞菌属菌株的适应期间的胁迫条件提供与当使发酵单胞菌属菌株在包含生物质的水解产物的培养基中生长时存在的那些类似的胁迫条件。因此本发明适应的菌株当在包含生物质的水解产物的培养基中生长时可具有增加的木糖利用率，从而提供更加有效的生长和产物形成。
能够利用木糖作为碳源的任何发酵单胞菌属菌株可以是被提供用于适应的原始或起始的菌株，并且用于本发明方法中以根据本发明制备适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，其表现出改善的木糖利用率。已为木糖发酵成乙醇而工程化的发酵单胞菌属的菌株如运动发酵单胞菌是尤其有用的。内源性基因可提供部分代谢途径，或者可以通过任何已知的基因操纵技术进行改变以提供具有酶活性的蛋白用于木糖代谢。例如，内源转酮醇酶可在建立木糖代谢途径时补充其它导入的酶活性。通常为了木糖代谢中所涉及的四种酶的表达，可如US 5514583(将其以引用方式并入本文)中所述将四个基因导入到发酵单胞菌属菌株如运动发酵单胞菌中。这些基因包括编码木糖异构酶(该酶催化木糖转化成木酮糖)的基因，以及编码木酮糖激酶的基因，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。此外，转酮醇酶和转醛醇酶，戊糖磷酸化途径中的两种酶，将5-磷酸木酮糖转化成连接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢成乙醇。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源包括黄单胞菌属、克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、红细菌属、黄杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、根瘤菌属、农杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、以及发酵单胞菌属。尤其有用的是大肠杆菌的编码区。
编码DNA序列可操作地连接至运动发酵单胞菌细胞中表达的启动子，如运动发酵单胞菌的启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP启动子)，以及运动发酵单胞菌烯醇酶(ENO启动子)。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更多个编码区可接合到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得的嵌合基因导入发酵单胞菌属并保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合的方法整合进基因组中。具体使用的利用木糖的菌株包括ZM4(pZB5)(描述在US 5514583、US 6566107、以及US55712133中，并且以引用方式并入本文)，8b(US 20030162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)，以及ZW658(ATTCC # PTA-7858)、ZW800、ZW801-4、ZW801-5和ZW801-6(描述在共同拥有且共同未决的美国专利申请公布号为US 2008-0286870 A1的专利中，将其以引用方式并入本文)。
还可将附加工程化的以利用其他非天然基质糖的发酵单胞菌属菌株用于本发明方法中。一个实例是如US 5843760中所述的为利用阿拉伯糖而工程化的运动发酵单胞菌的菌株，将其以引用方式并入本文。
适应方法
在本发明方法中，使利用木糖的发酵单胞菌属的菌株(如上所述的起始或原始的菌株)在胁迫发酵条件下在包含木糖的培养基中持续生长。所述培养基可包含木糖作为仅有的糖，或者其可包含木糖与其它糖如葡萄糖的混合物。优选的是所述培养基中高的糖浓度，例如木糖和葡萄糖每种至少约50g/L。可能存在更多的一种或者两种糖。
使原始的利用木糖的发酵单胞菌属菌株首先在无胁迫条件下持续生长，并且产生乙醇。以一定的稀释速率添加饲养生长培养基以维持连续的培养。通常使培养稳定，其可能需要约9-12天，虽然一些培养可能需要更长的时间来稳定。稳定是针对OD600、糖利用率、以及乙醇生产而言的(当在来自发酵罐的流出物中测量时)。稳定化的发酵中的乙醇可产生至约18g/L、22g/L、40g/L或更高的含量。然后将另外的组分添加到发酵培养基中，其导致用于发酵单胞菌属细胞代谢的胁迫条件。这些组分可在培养稳定之后立即添加，或者在稳定条件下开始发酵再过一段时间之后添加。可作为胁迫添加的组分包括氨和乙酸，其得到包含乙酸铵的培养基或者乙酸铵。发酵培养基中乙酸铵和乙醇的存在向发酵单胞菌属细胞施加胁迫，其通常导致OD600降低、木糖利用率降低、以及乙醇产率降低。可增加或降低稀释速率以控制OD600、木糖利用率、以及乙醇浓度。使胁迫条件下的培养物持续生长。在胁迫培养的连续发酵期间，可添加更多的氨和乙酸或乙酸铵至少一次或更多次。添加可不止一次；例如在多个阶段添加以逐渐增加发酵培养基中的乙酸铵浓度。
最初可添加氨和乙酸作为乙酸铵以达到约24mM乙酸铵或约48mM乙酸铵的浓度。可以一次或多次增量添加氨和乙酸或乙酸铵以达到介于约64mM至210mM乙酸铵之间的浓度。通常，随时间以四步或更多步添加氨和乙酸或乙酸铵以逐渐增加胁迫培养的发酵培养基中的浓度。胁迫培养物中的乙醇由发酵单胞菌属细胞产生，并且可根据产生速率而变化，乙醇通常介于约13g/L和54g/L之间。OD600可变化，并且通常介于约1.5和约4.8之间。
在总共约两个月或更长时间的连续发酵期之后，可将适应的发酵单胞菌属菌株从胁迫培养物分离出。可从所述培养物取样品并且平板划线以分离菌落，或者使其在培养物中生长，然后平板划线以分离菌落。测试来自各个菌落的细胞，测试分离的细胞或由细胞长成的菌株在包含高的糖浓度、氨和乙酸根的培养基中利用木糖并且产生乙醇的能力。在培养物中由适应的发酵单胞菌属细胞产生乙醇。在所测试的分离的菌株中，鉴定出与适应之前的原始或起始的利用木糖的菌株相比显示出增加的木糖利用率和增加的乙醇产率的菌株。本领域的技术人员熟知的是不同的分离的菌株中利用的木糖和产生的乙醇的量将变化。然而，具有增加的木糖利用率和乙醇产率的菌株将可容易地从来自胁迫发酵培养物的分离物中鉴定并识别出。
适应的菌株
本文所公开的是具有改善的木糖利用率的适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株。这些菌株的特征可在于：当在胁迫条件下(其中发酵培养基包含乙醇、乙酸铵和高的糖浓度)生长时，与相应的但未适应的菌株相比，有至少约12％的木糖利用率的增加。适应的菌株可多使用至少约12％、17％、20％、25％、或30％的木糖。具有这些特征的利用木糖的发酵单胞菌属菌株可使用公开的方法常规地分离。木糖利用的量将取决于以下因素，包括原始的菌株、发酵的条件、以及具体的适应的菌株本身。
在本文实施例3中所述的一组条件下，其中当在600nm下0.1OD的细胞密度下起始时培养基包含60g/L木糖、80g/L葡萄糖、9.54g/L乙酸盐、以及160mM NH4OH，改善的适应的菌株可使用至少约70％、80％、85％、或89％的木糖，而原始的菌株使用约17％的木糖。在不同的条件下，适应的菌株可使用至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的木糖，相比之下，未适应如本文所述的胁迫发酵的菌株使用30％或更少的木糖。
本发明适应的菌株可用于发酵糖以制备发酵产物如乙醇。所述菌株尤其可用于包含生物质水解产物的培养基中的发酵，所述培养基包含提供胁迫发酵条件的组分。通常使木质纤维质的生物质经历某些工序以制备可发酵的糖。这些工序可包括预加工、预处理、以及糖化。预加工是使生物质对预处理更加敏感的任何动作。预处理是使生物质对糖化更加敏感的任何处理。糖化包括水解生物质碳水化合物至可发酵的糖的任何工序。可发酵的糖包括能够通过生物催化剂发酵而利用的单糖和低聚糖。任何普通的已知方法可用于预加工和预处理生物质，包括无预加工和/或无预处理。可采用通常已知的糖化技术以制备用于发酵的水解产物，使得糖可被利用，包括酶水解和/或自动水解或化学水解。例如，可如共同拥有且共同未决的美国专利公布号为US20070031918A1的专利中所述预处理和糖化生物质。
用于乙醇制备的发酵
为了制备乙醇，将本发明的发酵单胞菌属菌株与包含混合糖(包括木糖)的培养基接触。当混合糖的浓度高的抑制生长时，所述培养基可能包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物。半乳糖醇或核糖醇可代替或与山梨醇或甘露糖醇组合。发酵单胞菌在其中进行发酵并且产生乙醇的培养基中培养。发酵在不补充空气、氧气、或其它气体(这可包括各种条件如厌氧、微氧、或微需氧发酵)的情况下运行至少约24小时，并且可运行30小时或更长时间。达到最大乙醇产量的时间是不确定的，取决于发酵条件。如果抑制剂存在于培养基中，通常需要更长的发酵时间。发酵可在介于约30℃和约37℃之间的温度、约4.5至约7.5的pH下进行。
利用木糖的发酵单胞菌(如运动发酵单胞菌)可在实验室规模的发酵罐中和扩大规模的发酵中(其中生产商业规模量的乙醇)，在包含混合糖(包括木糖)的培养基中培养。在期望商业生产乙醇的地方，可利用本文所述的适应的菌株应用多种培养方法来制备乙醇。例如，可通过分批和连续培养方法进行大规模生产。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向系统中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。分批补料培养方法也适用于本发明菌株的培养，并且包括典型的分批系统，不同的是：底物随着培养进行以递增方式添加。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可测量因素例如pH和废气如CO2的分压的改变来评估。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且实例可见于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger，和Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，将其以引用方式并入本文。
乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器里，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养物质，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其它系统中，影响生长的许多因素能够连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基取出的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养物质和生长因子的方法以及用于使产物形成速率达到最大的技术是工业微生物学领域熟知的，并且各种方法由上面Brock所述。
尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。期望的适应的菌株在约30℃至约37℃下在摇瓶中在半复合培养基中生长，在回旋振荡器中以约150rpm振荡，然后将其转移到包含相似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长直至OD600介于3和6之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在约2％至约20％v/v的范围内。典型的发酵培养基包含基本培养基组分如磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合氮源如酵母提取物或大豆基产物(0-10g/l)。培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括木糖和至少一种附加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源。当初始批次碳源(50-200g/l)耗尽时，将混合糖持续加入发酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源进料速率进行动态调节以确保培养物不过度积聚葡萄糖，过多的葡萄糖会导致积聚毒性副产物如乙酸盐。为了最大化从利用的底物中生产的乙醇产量，通过磷酸盐的量来限制生物量增长，磷酸盐是初始时成批加入的或在发酵期间加入的。使用苛性碱溶液(如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)和硫酸或磷酸将发酵控制在pH 5.0-6.0。将发酵罐的温度控制在30℃至约35℃。为了最小化泡沫，按需加入消泡剂(任何种类-硅氧烷基的、有机物基的等)到罐中。可任选地使用抗生素(菌株中有该抗生素的抗性标记)如卡那霉素以最小化污染。
上述任何一组条件和这些条件中的附加变化是本领域技术人员熟知的，它们是通过本发明适应的利用木糖的发酵单胞菌属菌株生产乙醇的适用条件。
发酵中产生的乙醇可使用本领域已知的各种方法回收。作为一个具体实例，可使用用于ABE发酵的本领域已知的方法，将生物制备的乙醇从发酵培养基中分离出(参加例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及其中的参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中移除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离乙醇。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
缩写的含义如下：“hr”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“L”是指升，“ml”是指毫升，“μL”是指微升，“g”是指克，“μg”是指微克，“ng”是指纳克，“g/L”是指克/升，“mM”是指毫摩尔每升，“μM”是指微摩尔每升，“nm”是指纳米，“μmol”是指微摩尔，“pmol”是指皮摩尔，“OD600”是指在600nm测得的光密度。
一般方法
HPLC方法
分析用Agilent 1100系列HPLC和用于LC 3D的AgilentChemStation软件进行。柱子为具有BioRad Micro-Guard CartridgeCation-H(125-0129)的BioRad Aminex HPX-87H(HPLC OrganicAnalysis Column 125-0140)。操作条件是：
Figure BPA00001390665200121
实施例
实施例1
发酵单胞菌属对胁迫发酵的适应
运动发酵单胞菌菌株ZW801-4的培养物在如下的胁迫条件下生长。ZW801-4是重组的利用木糖的运动发酵单胞菌菌株，其描述于共同拥有且共同未决的美国专利申请公布号为US 2008-0286870 A1的专利中，将其以引用方式并入本文。菌株ZW801-4衍生自菌株ZW800，其衍生自菌株ZW658，全部如美国专利申请号为11/862566的专利所述。ZW658通过将两个操纵子PgapxylAB和Pgaptaltkt(包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的四个利用木糖的基因)经由序列转座事件整合到ZW1(ATCC号31821)的基因组中，并且随后在包含木糖的选择性的培养基上适应而构建。ZW658以ATCC号PTA-7858存放。在ZW658中，使用宿主媒介的基因双交换同源重组和作为选择性标记的壮观霉素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因插入失活以产生ZW800。由loxP位点束缚的壮观霉素抗性标记使用Cre重组酶通过位点特异性重组移除以产生ZW801-4。
ZW801-4的连续培养在250mL pH和温度受控的搅拌发酵罐(Sixfors；Bottmingen，Switzerland)中进行。用于生长的基础培养基为5g/L酵母提取物、15mM磷酸铵、1g/L硫酸镁、以及10mM山梨醇。为了启动培养，将温度控制在33℃并且pH为5.8。开始四个培养：两个具有基础培养基加50g/L的葡萄糖和木糖中的每一种(发酵罐F1C和F4B)，一个具有基础培养基加100g/L葡萄糖和80g/L木糖(发酵罐F2B)，并且一个具有基础培养基加50g/L木糖并且稍后增加至80g/L木糖(F6)。所有的培养在未添加乙酸铵并且在0.1的OD600下开始。如一般方法中所述，通过HPLC在以下记录的时间点处分析培养物的乙醇、木糖和葡萄糖。将添加了乙酸铵的基础培养基用作胁迫培养基，并且存在于基础培养基中的以上乙酸铵的浓度用于以下叙述中。
以0.065h-1的稀释速率连续运行F6发酵罐。在培养12天时，流出物稳定在约18g/L乙醇、接近完全的木糖利用率和约3.8的OD600，并且继续稳定直至第21天，同时将稀释速率增加至0.9h-1。在第21天，添加乙酸铵以在基础培养基加木糖原料中得到24mM的浓度。木糖的出口浓度增加至10g/L，OD600降低至1.5，而乙醇浓度降低至14g/L。稀释速率降低至0.045h-1。在稀释速率降低之后，流出物中的木糖跌至接近0，乙醇增加至20g/L并且OD600增加至2.4。在30天时，将乙酸铵浓度增加至32mM。流出物中的木糖和乙醇浓度保持恒定，但OD600降低至1.8。在培养35天时，将乙酸铵浓度增加至40mM。当木糖浓度增加至80g/L时，将培养条件保持到第50天。在木糖浓度增加时，乙醇浓度增加至30g/L+/-4g/L并且稀释速率增加至0.08h-1以将OD600保持在4。在第71和78天，在两个相当的步骤中增加乙酸铵浓度以得到48mM的乙酸铵。伴随着乙酸铵的增加，稀释速率或木糖和乙醇的出口浓度的不变。在第92天，在两个相当的步骤中将铵和乙酸根浓度进一步增加至64mM。稀释速率和乙醇浓度保持恒定，但是在第98天OD600下降至1.5。细胞开始聚集。将培养物移至干净的发酵罐中。OD600升至3.8。在第104天，在两个相当的步骤中，将乙酸铵浓度增加至80mM。残余的木糖浓度增加至3g/L。运行连续培养直至第205天，同时在10个相当的步骤中将乙酸铵浓度增加至160mM，达到160mM的最终浓度。将pH保持在5.8。OD600停留在1.4和4之间，而残余的木糖浓度在2和7g/L之间变化。
F2B发酵罐难以控制25天，并且在约3和8的OD600、0和30g/L葡萄糖、20和50g/L木糖以及22至70g/L乙醇之间振荡。在第25天后，葡萄糖的振荡减轻并且稳定在5-6g/L。该葡萄糖浓度和0.04h-1的稀释速率保持到第40天。在第43天，将培养物移至干净的发酵罐中，并且以0.065h-1的稀释速率，在回到4g/L葡萄糖、30g/L+/-3g/L木糖和60g/L乙醇之前，葡萄糖返回振荡8天，直至76天的培养。
到培养10天时，发酵罐F1C在非常低的葡萄糖和木糖；40g/L乙醇、6的OD600和0.07h-1的稀释速率下稳定。添加乙酸铵至48mM。木糖浓度增加至6g/L并且稀释液速率增加至0.08h-1。在第15天和第23天之间，在4个相当的步骤中将乙酸铵增加至80mM。在第41天和第69天，将培养物移至干净的发酵罐中。将稀释速率保持在0.08和0.1h-1之间，同时到第97天逐步增加乙酸铵浓度至160mM。在乙酸铵浓度增加期间，OD600介于3.6和5.3之间，乙醇浓度介于39和45g/L之间，而木糖浓度介于0和8g/L之间。到第139天，通过添加氢氧化铵到包含乙酸铵的培养基中，同时加入磷酸以将pH保持在5.8，进一步逐渐增加铵浓度至210mM。在这期间，OD600下降至约3.2，乙醇浓度增加至约51g/L，而残余的木糖浓度为2.2g/L。
发酵罐F4B也启动，其具有基础培养基和50g/L的葡萄糖和木糖的每一种，同时pH保持在5.8。到第9天，在40g/L乙醇、0.1h-1的稀释速率和非常低的葡萄糖和木糖下稳定。在第12天，使乙酸铵浓度达到48mM。到第22天，将稀释速率降低至0.07h-1以维持OD和糖利用率，并且在两个相当的步骤中将乙酸铵增加至64mM。稀释速率随剩余的木糖而变化直至第28天。稀释速率保持恒定在0.082，同时到第43天在4个相当的步骤中将乙酸铵增加至96mM。在该期间，乙醇浓度略微增加至约42g/L，并且OD600由约4.8降低至3.5。在第51天，改变进料使基础培养基具有80g/L葡萄糖和60g/L木糖，同时具有96mM乙酸铵。随着每天的变化，乙醇浓度增加至41至51g/L。到第70天，剩余的木糖增加至16g/L，而稀释速率稳定在0.09h-1，并且OD600为约4.9。到第126天，在8个相当的步骤中添加乙酸铵至160mM的浓度。乙醇浓度增加至63g/L，而稀释速率和OD600保持恒定。
当用发酵罐F1C时，到第168天，再逐步增加铵浓度至210mM，同时加入磷酸以将pH保持在5.8。将稀释速率保持在0.08h-1。在这期间，OD600在3.7和5.6之间变化，乙醇浓度增加至约63g/L，而残余的木糖浓度为18g/L。在该条件下保持培养8天，然后将pH保持在5.65下再7天。OD600下降至3.5，而乙醇和木糖浓度保持相对恒定。
实施例2
来源于适应连续培养发酵罐的培养物的评估
在第74天从发酵罐F1C，在第69天从发酵罐F4B并且在第78天从发酵罐F6首次取得连续适应培养的样品，并且在首次取样后在多个时间点取样。全部保存在-80℃并且在RMG5培养基中复活以用于测试。在33℃下，将种子培养物在基础培养基加75g/L葡萄糖和25g/L木糖中培养至4.5的OD600。
用于测试的基础培养基为：5g/L酵母提取物、15mM磷酸氢二铵、1g/L硫酸镁、10mM山梨醇、以及4g/L碳酸氢钾。碳源为80g/L葡萄糖和60g/L木糖。对于低胁迫对照物将所述培养基按原样使用，或者添加80mM、120mM或160mM的乙酸铵，同时用磷酸将pH调节至5.8。
发酵体积为100ml，并且发酵在120rpm的振荡下在33℃下运行。通过添加由种子生长培养基制备的细胞至0.1的起始OD600开始生长。通过离心收取来自种子生长培养基的细胞并且用测试培养基洗涤。通过在600nm的OD监测生长。乙醇、木糖和葡萄糖全部通过HPLC监测。将用于开始适应培养的ZW801-4菌株用作对照物。
全部三份适应的培养物生长并以与未添加乙酸铵的培养基上的ZW801-4相同的速率使用葡萄糖。在160mM乙酸铵时，ZW801-4在延长的延迟期后生长，而全部3份适应的培养物在42小时内用完全部葡萄糖。
虽然全部的培养物在未添加乙酸铵的培养基中以相似的速率使用60g/L的木糖，但是在具有120mM乙酸铵的培养基中，三份适应的培养物在46小时内用完全部的木糖，但是ZW801-4需要60小时。
以更长的连续发酵罐适应时间重复批量测试步骤。
实施例3
分离的适应的菌株性能
单一的菌落通过在包含葡萄糖的板上平板接种而分离，并且如表1中所示用来培养来自各个阶段的适应的培养物的纯化过的菌株。使用用于整个培养物测试所述的培养基和条件在160mM的乙酸铵中测试单一菌落衍生的菌株。
种子培养物在具有75g/L葡萄糖和25g/L木糖的上述DP1培养基中生长。混合糖测试发酵通过添加种子培养物至0.1的初始OD600nm而开始。初始pH为5.8；温度为33℃并且在振荡培养箱中将100mL培养物以120rpm搅拌。
在由连续适应培养分离的不同菌株测试的一组发酵的每一个中，将ZW801-4用作未适应的培养对照物。第二菌株命名为NS1302-2，其在最初的测试循环中由F4B发酵罐分离，并且在高含量乙酸铵的存在下当与ZW8014未适应的菌株比较测试时，其重复利用更多的木糖并产生更多的乙醇，在每一组测试发酵组中用作阳性对照物。
到第44小时，全部的菌株使用混合糖发酵中所有的葡萄糖，但是全部有不同量的木糖剩余，因此将第44小时发酵剩余的木糖用作对胁迫条件适应的量度。结果在表1中给出。
表1：由连续培养适应分离的菌株的描述和当它们已在80g/L葡 萄糖和60g/L木糖加160mM乙酸铵的起始培养基中发酵44小时时剩 余的木糖的量。
Figure BPA00001390665200161
Figure BPA00001390665200171
菌株NS1369、NS1370、NS1372、NS1373和NS1375全部留下比ZW801更少的木糖，并且表现得差不多和阳性对照物NS1302一样好。选择它们用于在按体积计包含60％的水解产物的培养基中进一步评估，所述水解产物由玉米芯粉末制备，所述玉米芯粉末已通过稀释的氨和热加工预处理，然后用纤维素酶和半纤维素酶的酶制剂混合物以25％百分比的预处理过的玉米芯固体在pH 5.3和48℃下酶解96小时，全部如共同拥有且共同未决的美国专利公布号为US20070031918A1的专利中所述，将其以引用方式并入本文。所得的水解产物中主要的糖和乙酸盐浓度为：
Figure BPA00001390665200181
制备剩余的40％的测试培养基以将最终培养基浓度调节至以下浓度：
5g/L酵母提取物
2g/L磷酸氢钾
1g/L硫酸镁
100g/L葡萄糖
80g/L木糖
7g/L乙酸盐
在33℃下同时通过加入KOH将pH控制在5.8时进行发酵。当由种子接种体的OD计算时起始的接种为0.2，所述种子接种体在如用于以上定义的培养基中测试发酵所述的具有75g/L葡萄糖和25g/L木糖的基础培养基中产生。
包括ZW801-4的全部菌株能够在这些条件下使用所述培养基中的所有葡萄糖。下表2中给出了关于以下项目的结果：当使用全部葡萄糖时在所述点(第43小时)附近剩余的木糖，在该点时的乙醇和那时剩余的木糖，以及在木糖利用速率已降至零(第67小时)之后产生的乙醇。
表2：剩余的木糖和由分离培养物产生的乙醇(以g/L计)。
在高糖高乙酸盐的培养条件下，在第67小时，除NS-1375之外的所有分离物使用更多的木糖，并且除NS-1375和NS-1369之外的所有分离物产生比起始菌株ZW801-4更多的乙醇。菌株NS-1302-2、NS-1370、NS-1372、NS-1373-1和NS-1373-5各自使用比ZW801-4至少多约10g/L的木糖。将菌株NS 1373-1重命名为ZW705，并且使用该相同的规程测试若干次，用ZW801-4作为比较菌株。ZW705由补充糖的玉米芯水解产物起始，持续地产生较多的乙醇。更好的乙醇生产的主要原因是可用的木糖更完全的利用率。ZW705持续地利用99％至100％的葡萄糖，利用87％至90％可用的木糖，并且产生80至85g/L的乙醇滴度。在相同的条件下，ZW801-4利用约98％的葡萄糖，59％至70％的木糖，并且产生66至70g/L的乙醇滴度。
实施例4
ZW705适应的菌株的评估
ZW705和ZW801-4的分批培养物，作为对照物，在150ml搅拌的pH和温度受控的烧瓶中培养。起始温度为30℃，然后改变至27℃。将pH保持在5.8。培养基为mRM3，其包含10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4、1.8g/L山梨醇。用如表3中所列出的乙酸盐、葡萄糖和木糖补充所述培养基。
在65.5小时后，分析所述培养物的木糖、葡萄糖和乙醇。表3中给出的结果显示：与原始的ZW801-4菌株相比，适应的ZW705菌株的木糖利用率增加了28％并且乙醇产量增加了18％。
表3：最佳适应的菌株和对照菌株中的葡萄糖和木糖利用率，以 及乙醇产量。

Claims (12)

1.制备改善的利用木糖的发酵单胞菌属菌株的方法，所述方法包括：
a)提供利用木糖的发酵单胞菌属细胞；
b)使(a)的利用木糖的发酵单胞菌属细胞在包含木糖的饲养生长培养基中持续生长，从而产生包含乙醇的培养物；
c)向(b)的培养物添加一定量的氨和乙酸或乙酸铵，从而产生包含乙醇和乙酸铵的胁迫培养物；
d)使(c)的胁迫培养物持续生长，从而制备改善的利用木糖的发酵单胞菌属细胞；以及
e)从(d)的培养物分离一个或多个细胞，其中至少一个或多个分离的细胞与(a)提供的利用木糖的发酵单胞菌属细胞相比，在乙酸铵和乙醇的存在下表现出改善的木糖利用率，并且使所述改善的细胞生长为菌株。
2.根据权利要求1的方法，其中在(c)中，所述添加产生至少约24mM的乙酸铵浓度。
3.根据权利要求1的方法，其中在步骤(d)期间增加乙酸铵的浓度至少一次。
4.权利要求1的方法，其中(b)部分中的培养基中的木糖为至少约50g/L的浓度。
5.分离的改善的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，所述菌株通过权利要求1的方法获得。
6.权利要求5的分离的改善的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，其中与相应的未适应的菌株相比，多使用至少约12％的木糖。
7.权利要求6的分离的改善的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，其中与相应的未适应的菌株相比，多使用至少约20％的木糖。
8.权利要求7的分离的改善的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，其中与相应的未适应的菌株相比，多使用至少约30％的木糖。
9.适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，当以0.1OD600nm的细胞密度开始时，在包含60g/L木糖、80g/L葡萄糖和9.54g/L乙酸盐同时pH调节至5.8的培养基中，与相应的未适应的菌株约18％的可用木糖的利用率相比，所述适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株使用至少约70％的木糖。
10.权利要求9的适应胁迫发酵的利用木糖的发酵单胞菌属菌株，其中木糖利用率为约85％。
11.根据权利要求1的方法，其中在(b)中所述乙醇为至少约18g/L。
12.用于制备乙醇的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求5、6、7、8、9或10的任何一项的分离的改善的利用木糖的发酵单胞菌属菌株；
b)使a)的菌株与发酵培养基在合适的发酵条件下接触，其中产生乙醇；以及
c)任选地分离乙醇。
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