CN105950673A - 在提取发酵中用于醇移除的来源于油的提取溶剂 - Google Patents

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Abstract

在醇发酵方法中，将来源于生物质的油水解成提取剂，其可用于从发酵液体培养基中原位移除产物醇如丁醇。可将油中的甘油酯催化(例如酶催化)水解成游离脂肪酸，其形成发酵产物提取剂，所述发酵产物提取剂对于产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于产物醇的分配系数。来源于醇发酵过程的原料的油可通过以下方法水解：使所述包含油的原料与一种或多种酶接触，从而将所述油的至少一部分水解成游离脂肪酸以形成发酵产物提取剂，或在将原料输送进发酵容器之前，能够从所述原料中分离所述油，并且所述分离的油能够与所述酶接触以形成所述发酵产物提取剂。所述发酵产物提取剂可与发酵液体培养基接触以原位移除产物醇。

Description

在提取发酵中用于醇移除的来源于油的提取溶剂
本申请是申请日为2011年6月17日、申请号为201180035164.2、发明名称为“在提取发酵中用于醇移除的来源于油的提取溶剂”的PCT申请的分案申请。
本专利申请要求提交于2010年6月18日的美国临时申请61/356,290；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,451；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,436；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,444；提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,429；提交于2010年9月2日的美国临时申请61/379,546；以及提交于2011年2月7日的美国临时申请61/440,034；提交于2011年6月15日的美国专利公开申请13/160,766的权益，其全部内容全部以引用方式并入本文。
与本专利申请相关联的序列表经由EFS-Web以电子表格形式提交并全文以引用方式并入本说明书。
技术领域
本发明涉及发酵性醇如丁醇的生产，并且具体地讲，涉及用于提取发酵的提取溶剂和将来源于生物质的油转化成提取溶剂的方法。
背景技术
丁醇在工业和科学中具有多种用途，例如饮料(即，乙醇)、燃料、试剂、溶剂、和防腐败剂。例如丁醇是一种醇，它是重要的工业化学品，具有多种用途，包括用作燃料添加剂，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和风味剂工业中用作食品级的提取剂。因此，高度需求醇如丁醇以及高效环保的生产方法。
利用微生物发酵生产醇如丁醇是一种这样的环保生产方法。在丁醇生产中，具体地讲一些生产高产量丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性阀值。当丁醇产生时从发酵容器中将其移除是一种调控这些低丁醇毒性阀值的方法。
当生产丁醇时可使用原位产物移除(ISPR)(也称为提取发酵)从发酵容器中移除丁醇(或其他发酵性醇)，从而使得微生物以高产量生产丁醇。本领域已经描述过的一种用于移除发酵性醇的ISPR方法是液-液提取(美国专利公开申请公布2009/0305370)。为了技术和经济上的可行性，液-液提取需要充分接触提取剂和发酵液体培养基以高效传质产物醇到提取剂中；提取剂从发酵液体培养基中良好的相分离(在发酵期间和/或发酵之后)；高效地回收并再利用提取剂；最小化提取剂的劣化能力以提取产物醇(例如通过防止产物醇到提取剂中的分配系数降低)；以及在长期运行期间最小化脂质对提取剂的污染，所述脂质降低分配系数。
提取剂的分配系数会随着每次循环的时间而降低，例如生物质中存在的脂质的积聚会导致其降低，所述生物质作为可水解淀粉的原料被输送进发酵容器。例如，载入发酵容器的30重量％干玉米固体的液化玉米醪能够在葡萄糖向丁醇转化期间通过同步糖化和发酵(SSF)(在发酵期间通过加入葡糖淀粉酶以产生葡萄糖，糖化液化醪)产生包含约1.2重量％玉米油的发酵液体培养基。在ISPR期间用作提取剂的油醇(OA)中溶解的玉米油脂质能够引起脂质浓度随着每个OA循环的提高，降低OA中产物醇的分配系数，因为OA中的脂质浓度随着每个OA循环而提高。
此外，在提取发酵期间存在的不溶解的固体能够对醇生产的效率产生负面影响。例如，存在的不溶解的固体可降低发酵容器中的传质系数，阻止发酵容器中的相分离，可引起来自提取剂中的不溶解的固体的玉米油积聚，导致提取效率随时间降低，可提高溶剂损失，因为它与固体一起最后作为干酒糟可溶物(Dried Distillers′Grains withSolubles，DDGS)被移除，可减缓提取剂液滴从发酵液体培养基中的分离，和/或可导致较低的发酵容器体积效率。
用于减少脂质造成提取发酵中使用的提取剂劣化的多个方法已经包括生物质湿磨法、分级和移除固体。湿磨法是一种昂贵的多步方法，其将生物质(例如玉米)分离成它的主要组分(胚芽、果皮纤维、淀粉、和谷蛋白)以分别从每个共产物获取价值。这个方法提供纯化的淀粉流；然而，它是昂贵的并且包括将生物质分离成它的非淀粉组分，这对醇的发酵生产是不必要的。分级移除纤维和胚芽，其包含存在于碾磨过的完整玉米中的大部分脂质，产生具有较高淀粉(胚乳)含量的玉米。干燥分级不会从纤维中分离胚芽，因此它比湿磨法更便宜。然而，分级不会移除全部纤维或胚芽，并且不移除全部固体。此外，在分级过程中存在一些淀粉损失。湿磨玉米比干燥分级更昂贵，但是干燥分级比干磨未分级的玉米更昂贵。如例如提交于2010年6月18日的共同未决的共有美国临时申请序列61/356,290所述，在用于发酵之前从液化醪中移除包括含有脂质的胚芽的固体能够基本上移除不溶解的固体。然而，如果提取剂分配系数的降低能够甚至在不分级或移除不溶解的固体的情况下被减小，这将是有利的。因此，一直需要通过其中提取剂分配系数的降低被减小的提取发酵开发用于生产产物醇如丁醇的较高效的方法和体系。
此外，通常将提取剂(例如油醇)加到发酵过程中，而不是在过程的某个步骤中产生，因此所述提取剂是一种原材料成本。因为提取剂可能被不可发酵的固体吸收和/或被加入发酵过程的脂质吸收而导致损失，醇生产方法的经济性可能受到提取剂回收和再利用效率的影响。因此，一直需要ISPR的可供选择的提取剂，其能够通过降低资金和/或运行成本带来较经济的方法。
发明内容
本发明通过提供生产产物醇如丁醇的方法满足上述需要，其中生物质中的脂质被转化成可用于ISPR的提取剂，并且其中降低了与原料一起被输送进发酵容器和/或在提取剂循环时的脂质的量。本发明提供对用于提取产物醇(例如丁醇)的提取剂劣化能力的解决方法，该方法通过防止产物醇进入提取剂中的分配系数的降低来解决这一问题。本专利申请提供对提取剂受甘油三酯污染的解决方法，所述甘油三酯降低提取剂对于产物醇的分配系数。本发明还提供相关的优点，所述优点将通过下文所述的实施方案变得显而易见。
将来源于生物质的脂质催化(例如酶催化)水解成脂肪酸能够降低ISPR提取剂中的不可取脂质积聚的速率。所述脂肪酸可从存在于生物质中的脂质水解获得，所述生物质提供用于发酵的可发酵碳。将不期望脂肪酸降低产物醇如丁醇进入提取剂相的分配系数的程度与脂质相同，因为已经测定出丁醇从水到脂肪酸的分配系数显著大于丁醇从水到脂肪酸酯或甘油三酯的分配系数。此外，脂肪酸提取剂可用作ISPR提取剂，其可在醇生产工艺的一个步骤中产生，并可用于替代、或添加到供应的不在所述工艺中生产的外源ISPR提取剂(例如但不限于油醇或油酸)中，从而降低用于ISPR提取剂的原材料费用。
在一个实施方案中，本发明涉及的方法包括使包含水、可发酵碳源和油的生物质与一种或多种催化剂接触，从而通过一种或多种催化剂水解所述油的至少一部分以形成提取剂，其中所述可发酵碳源和所述油均来源于所述生物质。所述生物质可包括玉米粒、玉米棒、作物残余物、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。在另一个实施方案中，所述油可包含甘油酯，并且一种或多种催化剂可水解所述甘油酯以形成脂肪酸。在另一个实施方案中，所述一种或多种催化剂可选自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。
在另一个实施方案中，所述提取剂可包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、或它们的混合物。在另一个实施方案中，所述提取剂可包括脂肪酸的混合物或脂肪酸和脂肪酰胺的混合物。在另一个实施方案中，所述提取剂对于产物醇的分配系数可大于所述生物质的油对于产物醇的分配系数。
本发明的方法还可包括在水解所述油的至少一部分之后使所述催化剂失活的步骤。在另一个实施方案中，所述方法还可包括在通过一种或多种催化剂水解之前从所述生物质中分离所述油的步骤。受权利要求书保护的方法还可包括以下步骤：在发酵容器中使所述生物质与发酵液体培养基接触；发酵所述生物质的碳源以产生产物醇；以及通过使所述液体培养基与所述提取剂接触，从所述发酵液体培养基中原位移除所述产物醇。所述产物醇可以是丁醇。
在另一个实施方案中，本发明涉及生产醇的方法，所述方法包括(a)提供包含水、可发酵碳源和油的生物质；(b)液化所述生物质以产生液化的生物质；(c)使所述液化的生物质与一种或多种催化剂接触，从而水解所述油的至少一部分以形成提取剂；(d)使所述液化的生物质与能够将低聚糖转化成可发酵糖的糖化酶接触；(e)在发酵容器中使所述液化的生物质与发酵液体培养基接触；(f)发酵所述液化的生物质的碳源以产生产物醇；(g)通过使所述液体培养基与所述提取剂接触，从所述发酵液体培养基中原位移除所述产物醇；并且任选地，步骤(c)和(d)同时发生。所述生物质可包括玉米粒、玉米棒、作物残余物、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。在另一个实施方案中，所述油可包含甘油酯，并且一种或多种催化剂可水解所述甘油酯以形成脂肪酸。在另一个实施方案中，所述一种或多种催化剂可选自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。在另一个实施方案中，所述提取剂可包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、或它们的混合物。在另一个实施方案中，所述提取剂可包括脂肪酸的混合物或脂肪酸或脂肪酰胺的混合物。在另一个实施方案中，所述提取剂对于产物醇的分配系数可大于所述生物质的油对于产物醇的分配系数。本发明的方法还可包括在水解所述油的至少一部分之后使所述催化剂失活的步骤。所述产物醇可以是丁醇。
本发明也涉及组合物，所述组合物包含：能够产生醇的重组微生物；可发酵碳源；一种或多种能够将甘油酯水解成脂肪酸的催化剂；包含甘油酯的油；和脂肪酸。所述一种或多种催化剂可选自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶，并且所述油可为玉米油、牛脂油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油和植物油共混物。在另一个实施方案中，所述可发酵碳源和所述油来源于生物质。所述生物质可包括玉米粒、玉米棒、作物残余物、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。所述组合物还可包含糖化酶和/或不溶解的固体。所述组合物还可包含甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、甘油、单糖、低聚糖或醇中的至少一种或多种。此外，所述醇可以是丁醇。
在一些实施方案中，从发酵工艺中除去来源于生物质的油的方法包括：使含水生物质原料流与催化剂接触。所述原料流包括水、可发酵碳和一定量的油，并且所述可发酵碳和所述油均来源于生物质。根据本发明所述的方法将所述油的至少一部分水解成脂肪酸以形成催化剂处理的生物质原料流，其包括脂肪酸。
在一些实施方案中，产生用于原位移除产物醇的提取剂的方法包括：提供包含糖和油的生物质，所述油具有一定量的甘油三酯，以及使所述油与包含一种或多种酶的组合物接触，所述酶能够将所述甘油三酯水解成脂肪酸。水解所述油中的甘油三酯以形成发酵产物提取剂，所述发酵产物提取剂对于产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于产物醇的分配系数。
在一些实施方案中，生产丁醇的方法包括：(a)提供具有淀粉和油的生物质，所述油包含一定量的甘油酯；(b)液化所述生物质以产生液化的生物质，所述液化的生物质包括从所述淀粉水解得到的低聚糖；(c)使步骤(a)的生物质或步骤(b)的液化的生物质与具有一种或多种酶的组合物接触，所述酶能够将所述甘油酯转化成游离脂肪酸，从而所述游离脂肪酸形成发酵产物提取剂；(d)使所述液化的生物质与能够将低聚糖转化成可发酵糖的糖化酶接触，所述可发酵糖包括单体葡萄糖；(e)使所述液化的生物质与生物催化剂接触，所述生物催化剂能够将所述可发酵糖转化成丁醇，从而产生包含丁醇的发酵产物；以及(f)使所述发酵产物与所述发酵产物提取剂接触，从而从所述发酵产物中分离出所述丁醇，所述发酵产物提取剂对于丁醇的分配系数大于所述生物质的油对于丁醇的分配系数。
在一些实施方案中，方法在从原料生产产物醇的工艺期间的步骤中包括：使所述产物醇与提取剂接触，所述提取剂包含获取自天然油酶促水解的游离脂肪酸，其中所述油包含甘油酯。所述提取剂对于产物醇的分配系数大于所述天然油对于产物醇的分配系数。
在一些实施方案中，从原料生产产物醇的方法包括：(a)液化所述原料以产生原料浆液；(b)离心(a)的原料浆液以产生离心产物，其包括(i)包含糖的含水层，(ii)植物来源的油层，和(iii)固体层；(c)将(b)的含水层输送进发酵容器；以及(d)发酵所述含水层的糖以产生所述产物醇。
在一些实施方案中，从原料生产产物醇的方法还包括将所述提取剂加到所述发酵容器中以形成包含水相和含有产物醇的有机相的两相混合物。
在一些实施方案中，天然油是植物来源的油，并且在一些实施方案中，从原料生产产物醇的方法还包括：从植物来源的油层中获取所述植物来源的油；以及通过使油与一种或多种将甘油酯水解成游离脂肪酸的酶接触将所述植物来源的油转化成所述提取剂。
在一些实施方案中，从原料生产产物醇的方法还包括在将所述甘油酯的至少一部分水解成游离脂肪酸之后使所述一种或多种酶失活。
在一些实施方案中，从原料生产产物醇的方法还包括在将所述植物来源的油转化成所述提取剂的步骤之前将植物来源的油输送进发酵容器。
在一些实施方案中，从原料生产产物醇的方法还包括将第二提取剂加到所述发酵容器中以形成包含水相和含有产物醇的有机相的两相混合物。
在一些实施方案中，在加入第二提取剂的步骤之后将植物来源的油转化成提取剂。
在一些实施方案中，从发酵工艺中移除来源于生物质的油的方法包括：(a)提供包含产物醇和来源于生物质的油的发酵液体培养基，所述油包含甘油酯；(b)使所述发酵液体培养基与第一提取剂接触以形成包含水相和有机相的两相混合物，其中所述产物醇和所述油进入所述有机相以形成含有产物醇的有机相；(c)将所述含有产物醇的有机相与所述水相分离；(d)从所述有机相中分离所述产物醇以产生贫有机相；以及(e)使所述贫有机相与包含一种或多种催化剂的组合物接触，所述催化剂能够将所述甘油酯水解成游离脂肪酸以产生第二提取剂，其包含所述第一提取剂和游离脂肪酸的至少一部分。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与步骤(e)的第二提取剂接触来重复步骤(b)。
在一些实施方案中，原位发酵提取剂形成组合物包含：(a)由生物质形成且包含水、淀粉和油的醪，(b)能够将所述甘油三酯的至少一部分水解成游离脂肪酸的催化剂，和(c)游离脂肪酸。所述淀粉和油均来源于生物质，并且所述油包含一定量的甘油三酯。
在一些实施方案中，发酵液体培养基包含：(a)能够产生丁醇的重组微生物，(b)低聚糖，(c)将甘油酯水解成游离脂肪酸的催化剂，(d)甘油酯，和(e)游离脂肪酸。
附图说明
并入本文并成为说明书的一部分的附图示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。
图1示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中在发酵前使液化生物质与催化剂接触以水解脂质。
图2示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中在发酵前使液化并糖化的生物质与催化剂接触以水解脂质。
图3示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中在生物质原料流中的脂质在液化之前或期间与催化剂接触以水解脂质。
图4示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中在发酵前从液化的生物质中除去了不溶解的固体和脂质，并且其中使用催化剂将除去的脂质水解成游离脂肪酸并将游离脂肪酸供应发酵容器。
图5示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中使用催化剂将来源于天然油的脂质水解成游离脂肪酸并将游离脂肪酸供应发酵容器。
图6示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中将存在于流出发酵容器的第一提取剂中的生物质脂质转化成作为第二提取剂供应发酵容器的游离脂肪酸。
图7图示了在发酵容器中存在的脂肪酸对产丁醇菌株NGCI-047的葡萄糖消耗的效应。
图8图示了在发酵容器中存在的脂肪酸对产丁醇菌株NGCI-049的葡萄糖消耗的效应。
图9图示了在发酵容器中存在的脂肪酸对产丁醇菌株NYLA84的葡萄糖消耗的效应。
具体实施方式
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施方案。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，或者在报告数值的5％范围内。
如本文所用，“生物质”指包含可水解多糖的天然产物，所述多糖提供可发酵糖，所述可发酵糖包括来源于天然来源如玉米、甘蔗、小麦、纤维素或木质纤维素材料以及包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖和/或单糖、以及它们的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物。例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于：玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、从谷物的研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。例如，可通过本领域已知的任何加工方法，利用发酵加工生物质以从生物质中形成麦芽浆、果汁、糖蜜或水解产物，所述方法例如研磨、处理和/或液化，并且它们包含可发酵糖并可包含水。例如，可通过本领域技术人员已知的任何方法来加工纤维素和/或木质纤维素生物质以获得包含可发酵糖的水解产物。在美国专利公开申请公布2007/0031918A1中公开了低氨预处理，该专利申请以引用方式并入本文。纤维素和/或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶聚生体来降解纤维素和半纤维素以产生包含糖的水解产物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(适用于纤维素和/或木质纤维素生物质的糖化酶参见Lynd等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.66：506-577，2002)。
麦芽浆、果汁、糖蜜或水解产物可包括如本文所述的原料12和原料浆液16。含水原料流可通过本领域已知的任何加工方法，利用发酵加工生物质来源于生物质或从生物质中形成，所述方法例如研磨、处理和/或液化，并且它们包含可发酵碳源(例如糖)并可包含水。含水原料流可包括如本文所述的原料12和原料浆液16。
如本文所用，“原料”是指发酵过程中的原料，所述原料包含具有或不具有不溶固体的可发酵碳源，并且如果适用，所述原料在通过进一步加工(例如通过液化、糖化、或其它方法)已经从淀粉中释放可发酵碳源或从复糖降解中获取可发酵碳源之前或之后包含可发酵碳源。原料包括或来源于生物质。合适的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、或它们的混合物。
如本文所用，“发酵液体培养基”是指水、糖、溶解固体、任选的微生物产生的醇、产物醇及发酵容器内具有的所有其它物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物的存在下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养基”和“发酵混合物”可与“发酵液体培养基”同义使用。
如本文所用，“可发酵碳源”或“可发酵碳底物”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的碳源。适宜的可发酵碳源包括但不限于单糖，如葡萄糖或果糖；二糖如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖如淀粉或纤维素；C5糖如木糖和阿拉伯糖；包括甲烷的一碳底物；以及它们的混合物。
如本文所用，“可发酵糖”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的一种或多种糖。
如本文所用，“发酵容器”是指其中进行发酵反应的容器，产物醇如丁醇通过发酵反应由糖制备。
如本文所用，“液化容器”指其中进行液化的容器。液化是其中低聚糖从原料中释放出来的过程。在其中原料是玉米的一些实施方案中，低聚糖在液化期间从玉米淀粉内容物中释放出来。
如本文所用，“糖化容器”指其中进行糖化(即，将低聚糖降解成单糖)的容器。在发酵和糖化同时发生的情况下，所述糖化容器和发酵容器可为相同容器。
如本文所用，“糖”指低聚糖、二糖、单糖、和/或它们的混合物。术语“糖类”也包括碳水化合物，包括淀粉、右旋糖苷、糖原、纤维素、戊聚糖、以及糖。
如本文所用，“糖化酶”指能够水解多糖和/或低聚糖例如糖原或淀粉的α-1，4-糖苷键的一种或多种酶。糖化酶也可包括能够水解纤维素或木质纤维素材料的酶。
如本文所用，“不溶解的固体”指原料的不可发酵部分，例如胚芽、纤维和谷蛋白。
如本文所用，“产物醇”指在发酵过程中能够由微生物产生的任何醇，所述微生物利用生物质作为可发酵碳底物的来源。产物醇包括但不限于C1-C8烷醇。在一些实施方案中，产物醇是C2-C8烷醇。在其他实施方案中，产物醇是C2-C5烷醇。应当理解，C1-C8烷醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。同样地，C2-C8烷醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”在本文中也用于指产物醇。
如本文所用，“丁醇”特指以单独或其混合物形式的丁醇异构体1-丁醇(1-BuOH)、2-丁醇(2-BuOH)、叔丁醇、和/或异丁醇(iBuOH或i-BuOH或I-BUOH，也称为2-甲基-1-丙醇)。当涉及丁醇酯时，术语“丁酯”和“丁醇酯”常可互换使用。
如本文所用，“丙醇”指丙醇异构体异丙醇或1-丙醇。
如本文所用，“戊醇”指戊醇异构体1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、2，2-二甲基-1-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇、或2-甲基-2-丁醇。
如本文所用，术语“当量醇”指通过完全水解醇酯并随后从一定量醇酯中回收所述醇将获得的醇重量。
如本文所用，术语“水相滴度”是指发酵液体培养基中特定醇(例如丁醇)的浓度。
如本文所用，术语“有效滴度”指每升发酵培养基发酵产生的特定醇(例如丁醇)总量或醇酯化产生的醇酯的当量醇。例如，在单位体积发酵中的丁醇的有效滴度包括：(i)发酵培养基中的丁醇量；(ii)由有机提取剂回收的丁醇量；(iii)如果利用汽提，由气相回收的丁醇量；和(iv)在有机相或水相中的丁酯的当量醇。
如本文所用，“原位产物移除(ISPR)”是指当产物产生时，从诸如发酵的生物过程中选择性移除具体的发酵产物以控制生物过程中的产物浓度。
如本文所用，“提取剂”或“ISPR提取剂”指用于提取任何产物醇如丁醇或用于提取任何醇酯产物的有机溶剂，所述醇酯由催化剂从产物醇和羧酸或脂质中产生。有时，如本文所用，术语“溶剂”可与“提取剂”同义使用。对于本文所述的方法，提取剂是与水不混溶的。
术语“与水不混溶的”或“不溶解的”是指化学组分如提取剂或溶剂不能够以形成单一液相的形式与水溶液如发酵液体培养基混合。
如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述包括发酵提取的方法的一个实施方案中，术语“发酵液体培养基”具体地指在双相发酵提取中的水相。
如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的非水相。
如本文所用，术语“羧酸”指具有一般化学式-COOH的任何有机化合物，其中碳原子通过双键与氧原子结合形成羰基(-C＝O)，并且通过单键与羟基(-OH)结合。羧酸可为质子化羧酸的形式、羧酸盐形式(例如铵、钠、或钾盐)、或质子化羧酸与羧酸盐混合物的形式。术语羧酸可描述单独的化学物质(例如油酸)或羧酸的混合物，其可通过例如水解生物质来源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和磷脂产生。
如本文所用，术语“脂肪酸”指具有C4-C28碳原子(最常见地为C12-C24碳原子)的羧酸(例如脂族一元羧酸)，其是饱和或不饱和的。脂肪酸也可为支化或非支化的。脂肪酸在动物或植物的脂肪、油或蜡中可来源于或包含于酯化的形式。脂肪酸可以甘油酯形式在脂肪和脂肪油中天然存在，或者可通过水解脂肪或通过合成获得。术语脂肪酸可描述单独的化学物质或脂肪酸的混合物。此外，术语脂肪酸可涵盖游离脂肪酸。
本文所用术语“脂肪醇”是指具有C4-C22碳原子的脂肪链的醇，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。
如本文所用，术语“脂肪醛”是指具有C4-C22碳原子的脂族链的醛，所述脂族链为饱和的或不饱和的。
本文所用术语“脂肪酰胺”是指具有C4-C22碳原子的长脂肪链的酰胺，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的
本文所用术语“脂肪酸酯”是指具有C4-C22碳原子的长脂肪链的酯，其中的脂肪链为饱和的或不饱和的。
如本文所用，“天然油”指获取自植物(例如生物质)或动物的脂质。如本文所用，“植物来源的油”具体地指获取自植物的脂质。“脂质”常可与“油”和“酰基甘油酯”同义使用。天然油包括但不限于牛脂油、玉米油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油和植物油共混物。
如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，并且是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。
如本文所用，“重组微生物”指诸如细菌或酵母的微生物，它们利用重组DNA技术进行修改，例如通过工程化宿主细胞以包含生物合成途径如生物合成途径，从而产生醇如丁醇。
本发明提供通过催化水解来源于生物质的油甘油酯获得的提取剂和生产所述提取剂的方法。具体地讲，可使用催化剂如酶将生物质油中的甘油酯催化水解成脂肪酸。脂肪酸可作为用于从发酵液体培养基中对产物醇(诸如丁醇)进行原位移除的提取剂。因此，本发明还提供了通过使用提取剂进行的提取发酵而制备产物醇(诸如丁醇)的方法，所述提取剂从生物质油中产生。本发明还提供了在发酵前将存在于原料浆液中的油催化水解成脂肪酸的方法，从而将所述油转化成脂肪酸，并且可减小ISPR提取剂的分配系数随时间降低(这归因于在发酵容器中存在油)的程度。此外，通过水解原料油获得的脂肪酸可用作ISPR提取剂，其具有的发酵醇分配系数大于原料油的发酵醇分配系数。可在水解之前分离原料油与原料浆液，并将其用作ISPR提取剂，或者可在原料浆液中将油水解成脂肪酸。此外，作为ISPR提取剂的脂肪酸可用于替代、或添加到常规的外源提取剂(例如油醇或油酸)中，从而降低与外源提取剂相关联的原材料费用。
本发明将根据所述图进行描述。图1示出了根据本发明的实施方案生产发酵性醇的示例性的工艺流程图。如图所示，可将原料12导入液化容器10的入口并进行液化以产生原料浆液16。原料12包含提供可发酵碳源(例如可发酵糖如葡萄糖)的可水解淀粉，并且可为以下生物质：例如但不限于黑麦、小麦、玉米、甘蔗、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料、或它们的混合物，或换句话讲可来源于生物质。在一些实施方案中，原料12可为分级生物质的一种或多种组分，并且在其它实施方案中，原料12可为碾磨过的未分级生物质。在一些实施方案中，原料12可为玉米，例如干磨的、未分级的玉米籽粒，并且不溶解的固体可包括胚芽、纤维、和谷蛋白。不溶解的固体是原料12的不可发酵部分。对于本文图示实施方案讨论的目的，原料12将通常被描述为碾磨形成的未分级玉米，其中不溶解的固体尚未从中分离出来。然而，应当理解本文所述的示例性方法和体系可经修改用于不同的原料，无论其是否经过分级，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。在一些实施方案中，原料12可为高油酸玉米，使得来源于其中的玉米油是高油酸玉米油，其油酸含量为至少约55重量％的油酸。在一些实施方案中，在高油酸玉米油中的油酸含量可为至多约65重量％，与之相比在正常玉米油中的油酸含量为约24重量％。高油酸油可提供用于本发明方法的一些优点，因为水解所述油提供了接触发酵液体培养基的、具有高油酸含量的脂肪酸。在一些实施方案中，所述脂肪酸或它们的混合物包含不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸的存在降低熔点，提供处理方面的优点。不饱和脂肪酸中，那些单不饱和脂肪酸，即，具有单个碳-碳双键的脂肪酸，可提供相对于不进行适当加热的熔点和方法所考虑的氧化稳定性的优点。
液化原料12的方法涉及将原料12中的淀粉水解成包括例如糊精和低聚糖在内的糖，并且是一种常规方法。可使用工业上通常利用的任何已知的液化方法以及相应的液化容器，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。可单独或组合使用此类方法。在一些实施方案中，可利用所述酶方法并且可将适用的酶14，例如α-淀粉酶，导入液化容器10的入口。也可将水导入液化容器10。在一些实施方案中，也可将糖化酶如葡糖淀粉酶导入液化容器10中。在附加的实施方案中，也可将脂肪酶导入液化容器10以催化油的一种或多种组分转化成脂肪酸。
液化原料12产生的原料浆液16包括糖、油26和来源于生物质的不溶解的固体，原料12从生物质中形成。在一些实施方案中，所述油的量为约0重量％至至少约2重量％的发酵液体培养基组合物。在一些实施方案中，所述油的量为至少约0.5重量％的原料。原料浆液16可从液化容器10的出口排出。在一些实施方案中，原料12是玉米或玉米籽粒，并且因此原料浆液16是玉米醪浆液。
可将催化剂42加到原料浆液16中。催化剂42能够将油26中的甘油酯水解成游离脂肪酸(FFA)28。例如，当原料12是玉米时，则油26是原料的组分玉米油，并且游离脂肪酸28是玉米油脂肪酸(COFA)。因此，在将催化剂42导入原料浆液16后，油26中的至少一部分甘油酯被水解成FFA 28，产生具有FFA 28和催化剂42的原料浆液18。水解油26获得的酸/油组合物通常为至少约17重量％FFA。在一些实施方案中，水解油26获得的酸/油组合物为至少约20重量％FFA，至少约25重量％FFA，至少约30重量％FFA，至少约35重量％FFA，至少约40重量％FFA，至少约45重量％FFA，至少约50重量％FFA，至少约55重量％FFA，至少约60重量％FFA，至少约65重量％FFA，至少约70重量％FFA，至少约75重量％FFA，至少约80重量％FFA，至少约85重量％FFA，至少约90重量％FFA，至少约95重量％FFA，或至少约99重量％FFA。在一些实施方案中，在发酵容器中的脂肪酸(例如羧酸)的浓度超出水相中的溶解度限制并导致产生包含有机相和水相的两相发酵混合物。在一些实施方案中，在发酵液体培养基中的羧酸(脂肪酸)浓度通常不大于约0.8g/L并且受液体培养基中的羧酸(脂肪酸)溶解度的限制。
在一些实施方案中，催化剂42可为一种或多种酶，例如水解酶如脂肪酶。使用的脂肪酶可来自任何来源，包括例如梨头霉属、无色杆菌属、气单胞菌属、产碱菌属、链格孢属、曲霉属、无色杆菌属、出芽短梗霉、芽孢杆菌属、白僵菌属、环丝菌属、假丝酵母属、色杆菌属、鬼伞属、镰孢属、地霉属、汉逊酵母属、腐质霉属、Hyphozyma、乳杆菌、绿僵菌属、毛霉、丛赤壳属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、假单胞菌属、丝核菌属、根毛霉属、根霉、红冬孢酵母属、红酵母属、糖酵母属、Sus、掷孢酵母属、嗜热真菌属、Thiarosporella、木霉属、轮枝孢属、和/或耶氏酵母属菌株。在一个优选的方面，脂肪酶的来源选自布氏犁头霉(Absidiablakesleena)、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、解毒无色杆菌(Achromobacteriophagus)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、芸苔生链格孢(Alternaria brassiciola)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus strearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、Brochothrix thermosohata、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)(皱褶假丝酵母(Candida rugosa))、副解脂假丝酵母(Candida paralipolytica)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶A、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B、欧诺比假丝酵母(Candida ernobii)、畸形假丝酵母(Candida deformans)、粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinerius)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、茄病镰孢(Fusarium solani)、茄病镰孢(Fusarium solani pisi)、小麦黄色镰孢(Fusarium roseum culmorum)、帚状地霉(Geotricum penicillatum)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、短小腐质霉(Humicola brevispora)、短小腐质霉高温变种(Humicola brevis var.thermoidea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、圆弧青霉(Penicilliumcyclopium)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、青霉属I(Penicillium sp.I)、青霉属II(Penicilliumsp.II)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱假单胞菌(与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)同义)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、解脂臭味假单胞菌(Pseudomonas mephiticalipolytica)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、苗床假单胞菌(Pseudomonasplantari)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)、和威斯康星假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopusmicrosporus)、结节根霉(Rhizopus nodosus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、红酵母(Rhodotorula glutinis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、芝谷掷孢酵母(Sporobolomyces shibatanus)、野猪(Sus scrofa)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus(以前称为Humicola lanuginose))、Thiarosporellaphaseolina、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在另一个优选的方面，脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomcyces lanuginosus)脂肪酶、曲霉属(Aspergillus sp.)脂肪酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)脂肪酶、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)脂肪酶、娄地青霉(Penicillium roqueforti)脂肪酶、沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶、爪哇毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶、产碱菌属(Alcaligenes sp.)脂肪酶、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶、畸形假丝酵母(Candida deformans)脂肪酶、来自白地霉(Geotrichum candidum)的脂肪酶A和B、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)脂肪酶、赤球丛赤壳(Nectria haematococca)脂肪酶、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)脂肪酶、德氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、(Rhizopus arrhizus)脂肪酶、和米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶。适用作酶催化剂42的合适商用脂肪酸制剂包括但不限于100L、100L、2000T、CALB L、CALA L、和Palatase 20000L，它们购自Novozymes，或来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、米赫毛霉(Mucor miehei)、猪胰(hog pancreas)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)或曲霉属(Aspergillus)，它们购自SigmaAldrich。
磷脂酶是水解磷脂酯键的酶，但是多种磷脂酶也能够水解甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯(酯酰水解酶(LAH)活性)。如本文所用，术语“磷脂酶”涵盖具有任何磷脂酶活性的酶，例如裂解甘油磷酸酯键(催化甘油磷酸酯键的水解)的酶，例如在油如原油或植物油中的酶。本发明的磷脂酶活性能够生成水可提取的磷酸化碱和甘油二酯。磷脂酶活性可包括磷脂酶C(PLC)活性；PI-PLC活性、磷脂酶A(PLA)活性如磷脂酶A1或磷脂酶A2活性；磷脂酶B(PLB)活性如磷脂酶B1或磷脂酶B2活性，包括溶血磷脂酶(LPL)活性和/或溶血磷脂酶-转酰基酶(LPT A)活性；磷脂酶D(PLD)活性如磷脂酶D1或磷脂酶D2活性；和/或马铃薯块茎特异蛋白(patatin)活性或它们的任何组合。术语“磷脂酶”也涵盖具有溶血磷脂酶活性的酶，其中这种酶的两个底物是2-溶血磷脂胆碱和H2O，并且其中它的两个产物是甘油磷酸胆碱和甲酸酯。磷脂酶A1(PLA1)酶除去1-位脂肪酸以产生游离脂肪酸和1-溶血-2-酰基磷脂。磷脂酶A2(PLA2)酶除去2-位脂肪酸以产生游离脂肪酸和1-酰基-2-溶血磷脂。PLA1和PLA2酶可为细胞内或细胞外的、膜结合的或可溶解的。磷脂酶C(PLC)酶除去磷酸部分以产生1，2-二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)酶产生1，2-酰基甘油磷酸和碱基。本发明使用的磷脂酶可获取自多种生物来源，例如但不限于镰孢属内的丝状真菌菌种，如菌株大刀镰孢(F.culmorum)、异孢镰孢菌(F.heterosporum)、茄病镰孢(F.solani)、或尖孢镰孢菌(F.oxysporum)；或者曲霉属内的丝状真菌菌种，例如菌株泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)。用于本发明的还有疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)磷脂酶变体如市售产品Ultra(Novozymes A′S，Denmark)。一种或多种磷脂酶也可以冻干粉、固化或水溶液形式施用。
在一些实施方案中，在水解甘油酯的至少一部分之后可使催化剂42失活。本领域已知的任何方法可用于使催化剂42失活。例如，在一些实施方案中，催化剂42可通过加热失活，调节反应物料的pH至其中催化剂42被不可逆的失活的pH下使其失活，和/或加入能够选择性地使催化剂活性失活的化学或生物化学物质来使其失活。如图1的实施方案所示，例如将加热q施用于原料浆液18，从而使催化剂42失活。加热q可在将原料浆液18输送进发酵容器30之前施用于原料浆液18。热处理过的原料浆液18(具有失活的催化剂42)然后与微生物32一起被导入发酵容器30，从而被包括在发酵容器30内的发酵液体培养基中。作为另外一种选择，将原料浆液18输送进发酵容器30并当其处于发酵容器中、用微生物32接种发酵容器之前经受加热q。例如，在一些实施方案中，可通过用加热q将原料浆液18加热到至少约75℃至少约5分钟，至少约75℃至少约10分钟，至少约75℃至少约15分钟，至少约80℃至少约5分钟，至少约80℃至少约10分钟，至少约80℃至少约15分钟，至少约85℃至少约5分钟，至少约85℃至少约10分钟，或至少约85℃至少约15分钟来完成催化剂的失活处理。在一些实施方案中，在经过加热q后，在导入发酵容器30之前(或当在发酵容器中施用加热q的情况下，在接种发酵容器之前)将原料浆液18冷却至合适发酵的温度。例如，在一些实施方案中，原料浆液18的温度在与发酵液体培养基接触之前为约30℃。
当希望防止催化剂42在发酵容器中用脂肪酸28酯化醇时，催化剂42的失活是优选的。在一些实施方案中，通过用有机酸(例如脂肪酸)和催化剂(例如脂肪酶)酯化发酵培养基中的产物醇来生产醇酯是所期望的，这在以下共有的、共同未决的申请中进行了进一步描述：提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,429；提交于2010年9月2日的美国临时申请61/379,546；和提交于2011年2月7日的美国临时申请61/440,034；它们全部全文以引用方式并入本文。例如，对于丁醇生产，发酵容器中的活性催化剂42(经由浆液18导入)能够催化丁醇与脂肪酸28(经由浆液18导入)酯化，原位形成脂肪酸丁酯(FABE)。
构造发酵容器30以发酵浆液18，产生产物醇如丁醇。具体地讲，微生物32代谢浆液18中的可发酵糖并分泌产物醇。微生物32选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。在一些实施方案中，微生物32可为细菌如大肠杆菌。在一些实施方案中，微生物32可为发酵重组微生物。所述浆液可包括糖，例如低聚糖和水的形式，并且可包含小于约20g/L的单体葡萄糖，更优选地小于约10g/L或小于约5g/L的单体葡萄糖。用于测定单体葡萄糖量的适用方法是本领域熟知的。本领域已知的此类适用方法包括HPLC。
在一些实施方案中，浆液18经受糖化过程以将浆液18中的复合糖(例如低聚糖)裂解成能够被微生物32容易地代谢的单糖。可使用工业上通常利用的任何已知的糖化方法，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。在一些实施方案中，同步糖化和发酵(SSF)可如图1所示在发酵容器30内发生。在一些实施方案中，可将酶38如葡糖淀粉酶导入发酵容器30中的入口以将淀粉或低聚糖裂解成能够被微生物32代谢的葡萄糖。
任选地，可将乙醇33供应于发酵容器30，将其包括在发酵液体培养基中。在一些实施方案中，当使用具有丁醇生物合成途径的重组微生物作为产丁醇的微生物32时，微生物32可能需要补充2-碳底物(例如乙醇)以存活并生长。因此，在一些实施方案中，可将乙醇33供应于发酵容器30。
然而，已经令人惊讶地发现其中游离脂肪酸(例如FFA 28)存在于发酵容器中的本发明方法可允许减少乙醇33的量，其通常供应于给定的重组微生物，不损害所述重组微生物的活力。此外，在一些实施方案中，本发明的方法在不补充乙醇的情况下提供的醇(例如丁醇)产率可比得上当补充乙醇33时可达到的产率。这通过下文实施例1-14中给出的比较实施例进行进一步展示，当脂肪酸而不是乙醇存在于发酵容器中时，丁醇产率可大于当既没有脂肪酸又没有乙醇存在于发酵容器中时的丁醇产率。因此，在一些实施方案中，补充的乙醇33的量与常规方法相比减少。例如，加到发酵容器中用于微生物所需的2-碳底物补充的典型乙醇的量为约5g/L无水乙醇(即，每升发酵培养基5g无水乙醇)。在一些实施方案中，所述丁醇发酵未补充任何乙醇33。在后一种情况下，将乙醇33的流从发酵容器中完全移除。因此，在本发明的一些实施方案中，减少或消除与补充乙醇33相关联的成本，以及与乙醇33的贮藏罐以及在丁醇发酵期间将其供应于发酵容器相关联的不便是可能的。
此外，无论是否补充乙醇，在一些实施方案中，利用发酵期间存在的脂肪酸，本发明的方法可提供较高的微生物32葡萄糖摄取速率。可将脂肪酸导入发酵容器30作为羧酸28、从供应油26中水解、和/或来源于浆液16的组分生物质油的水解。2010年7月28日提交的共同未决的共有美国临时专利申请61/368,451中描述了通过发酵方法生产产物醇的方法，其中在所述方法的步骤中产生了游离脂肪酸并且其在发酵容器中接触微生物培养物以改善微生物生长速度和葡萄糖消耗，所述专利申请全文以引用的方式并入本文。
在发酵容器30中，醇由微生物32产生。可利用原位产物移除(ISPR)来从发酵液体培养基中除去产物醇。在一些实施方案中，ISPR包括液-液提取。可根据美国专利公开申请公布2009/0305370所述的方法进行液-液提取，其公开内容全文并入本文。美国专利公开申请公布2009/0305370描述了生产并使用液-液提取从发酵液体培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括接触发酵液体培养基与与水不混溶的提取剂以形成包含水相和有机相的两相混合物的步骤。所述提取剂通常可为有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、甘油三酯、以及它们的混合物，其与发酵液体培养基接触并形成包含水相和有机相的两相混合物。所述提取剂也可为有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C4-C22脂肪醇、C4-C28脂肪酸、C4-C28脂肪酸酯、C4-C22脂肪醛、C4-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物，其与发酵液体培养基接触并形成包含水相和有机相的两相混合物。来自浆液18的游离脂肪酸28也可用作ISPR提取剂28。例如，当游离脂肪酸28是玉米油脂肪酸(COFA)时，ISPR提取剂28是COFA。ISPR提取剂(FFA)28接触发酵液体培养基并形成包含水相34和有机相的两相混合物。存在于发酵液体培养基中的产物醇优先分配到有机相中以形成包含醇的有机相36。在一些实施方案中，发酵容器30具有一个或多个入口用于接纳一种或多种附加的ISPR提取剂29，其形成包含水相和有机相的两相混合物、以及分配到有机相中的产物醇。
可从发酵容器30中以流39的形式将两相混合物移出并导入容器35，其中包含醇的有机相36从水相34中分离出来。利用本领域已知的方法将含醇的有机相36与两相混合物流39的水相34分离，所述方法包括但不限于虹吸、抽吸、滗析、离心、利用重力分离器、膜辅助的相分裂等等。可将全部或部分水相34再循环到发酵容器30中用作发酵培养基(如图所示)，或者将其弃去并换用新培养基，或者进行处理以移除任何残余的产物醇并随后再循环到发酵容器30中。然后在分离器50中处理包含醇的有机相36以回收产物醇54，然后通常可将所得贫醇提取剂27与来自浆液18的新FFA 28一起和/或与新提取剂29一起再循环到发酵容器30中，进一步提取产物醇。作为另外一种选择，可将新FFA 28(来自浆液18)和/或提取剂29持续加入发酵容器以替换在两相混合物流39中移除的ISPR提取剂。
在一些实施方案中，任何附加的ISPR提取剂29可为外来有机提取剂例如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它们的混合物。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可为羧酸，并且在一些实施方案中，ISPR提取剂29可为脂肪酸。在一些实施方案中，羧酸或脂肪酸可具有4至28个碳，在其它实施方案中4至22个碳，在其它实施方案中8至22个碳，在其它实施方案中10至28个碳，在其它实施方案中7至22个碳，在其它实施方案中12至22个碳，在其它实施方案中4至18个碳，在其它实施方案中12至22个碳，并且在其它实施方案中12至18个碳。在一些实施方案中，ISPR提取剂29是一种或多种以下脂肪酸：壬二酸、癸酸、辛酸、蓖麻油、椰子油(即，天然存在的脂肪酸的组合，包例如括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、己酸、花生酸、油酸和亚油酸)、二聚体、异硬脂酸、月桂酸、亚麻籽酸、肉豆蔻酸、油酸、橄榄、棕榈油、棕榈酸、棕榈仁、花生油、壬酸、蓖麻油酸、癸二酸、大豆油、硬脂酸、妥尔油、牛脂油、#12羟基硬脂酸、或任何种子油。在一些实施方案中，ISPR提取剂29是一种或多种二酸、壬二酸、二聚体和癸二酸。因此，在一些实施方案中，ISPR提取剂29可为两种或更多种不同脂肪酸的混合物。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可为脂肪酸，其来源于得自天然油的甘油酯的化学或酶水解。例如，在一些实施方案中，ISPR提取剂29可为游离脂肪酸28′，其如下文通过图5的实施方案所述通过酶水解天然油如生物质脂质获得。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可为脂肪酸提取剂，其选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸甲酯、脂肪酸的低级醇酯、脂肪酸二醇酯、羟基化甘油三酯、以及它们的混合物，如例如提交于2010年7月28日的共有的、共同未决的美国临时申请61/368,436所述，通过化学转化天然油如生物质脂质获得。在此类实施方案中，用于生产提取剂29的生物质脂质可来自相同或不同的生物质来自，原料12从其中获得。例如，在一些实施方案中，用于生产提取剂29的生物质脂质可来源于大豆，而原料12的生物质来源是玉米。可使用任何可能的提取剂29对原料12的不同生物质来源的组合，这对本领域的技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，附加的ISPR提取剂29包括COFA。
原位提取发酵可以成批模式或连续模式在发酵容器30中进行。对于原位提取发酵，有机提取剂可在形成两相发酵培养基的发酵开始时接触发酵培养基。作为另外一种选择，有机提取剂可在微生物达到期望的生长量之后与发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可通过测定培养物的光密度确定。此外，有机提取剂可在发酵培养基中的产物醇含量达到预选含量时接触发酵培养基。在生产丁醇的情况下，例如ISPR提取剂可在丁醇浓度达到将对微生物产生毒性的浓度之前的某一时间接触发酵培养基。在所述发酵培养基与所述ISPR提取剂接触之后，丁醇产物分配至所述提取剂，降低了包含所述微生物的水相中的浓度，从而限制了生产丁醇的微生物在抑制性的丁醇产品中的暴露。
所使用的ISPR提取剂的体积依赖于多种因素，包括所述发酵培养基的体积，所述发酵容器的尺寸，丁醇产物在所述提取剂中的分配系数，以及发酵模式的选择，如下所述。提取剂的体积可为发酵容器工作容积的约3％至约60％。取决于提取效率，在发酵培养基中的丁醇的水相滴度可为例如约1g/L至约85g/L，约10g/L至约40g/L，约10g/L至约20g/L，约15g/L至约50g/L或约20g/L至约60g/L。在一些实施方案中，在酯化醇后的所得发酵液体培养基可包含游离的(即，未酯化的)醇，并且在一些实施方案中，当产物醇是丁醇时，在酯化醇后的发酵液体培养基中的游离醇浓度不大于1g/L、3g/L、6g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、25g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L或60g/L，或者当产物醇是乙醇时，在酯化醇后的发酵液体培养基中的游离醇浓度不大于15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、25g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L或100g/L。不受理论的约束，据信用提取发酵方法可获得较高的丁醇滴度，部分地是由于有毒的丁醇产物从发酵培养基中的移除，从而保持了其水平低于对所述微生物有毒的水平。
在原位提取发酵的分批模式中，将一定体积的有机提取剂加入到发酵容器中并且提取剂在该过程期间不被除去。该模式需要较大体积的有机提取剂以最小化发酵培养基中抑制的丁醇产物的浓度。因此，发酵培养基的体积相对更少，所生产的产物的量也比采用上述连续模式时所获得的更少。例如，分批模式中提取剂的体积在一个实施方案中可为发酵容器工作容积的20％至约60％，并且在另一个实施方案中约30％至约60％。
汽提(未示出)可与ISPR提取剂同时采用以从发酵培养基中除去产物醇。
在图1的实施方案中，从发酵培养基中原位提取产物醇，分离分离容器35中产生的两相混合物39。在一些实施方案中，如下文所述的图2和3的实施方案所示，两相混合物39的分离可发生在发酵容器中，其中包含醇的有机相流36直接从发酵容器30中排出。水相流34也可直接从发酵容器30中排出，进行处理以移除任何残余的产物醇并再利用，或者将其弃去并用新的发酵培养基替换。通过有机提取剂提取产物醇可在从发酵液体培养基中移除微生物或不移除微生物的情况下进行。微生物可通过本领域已知的方法从发酵液体培养基中移除，所述方法包括但不限于过滤或离心。例如，水相流34可包括微生物32如酵母。微生物32可容易地与水相流分离，例如在离心机(未示出)中分离。然后将微生物32再循环到发酵容器30中，其随着时间可提高醇生产的产率，从而导致醇生产的效率提高。
在连续模式的原位提取发酵中，在一个实施方案中提取剂的体积可为约3％至约50％的发酵容器工作体积，在另一个实施方案中约3％至约30％，在另一个实施方案中3％至约20％；在另一个实施方案中3％至约10％。由于产物被不断地从反应器中移除，只需较小体积的提取剂就能允许较大体积的发酵培养基的使用。
作为原位提取发酵的替代方案，所述产物醇可从发酵容器30的发酵液体培养基下游提取得到。在此类情况下，可从发酵容器30中移出发酵液体培养基并将其导入容器35。然后可将提取剂28导入容器35并接触发酵液体培养基以在容器35中获得两相混合物39，然后将其分成有机相36和水相34。作为另外一种选择，可将提取剂28加到分离容器(未示出)的发酵液体培养基中，然后将其导入容器35。
作为非限制性的预示实例，根据图1的实施方案，可标称包含约4重量％玉米油的碾磨过的完整玉米(作为原料12)的含水悬浮液可用淀粉酶(作为液化酶14)在约85℃至120℃下处理30分钟至2小时，并且所得液化醪16冷却至65℃和30℃之间，并用0.1ppm至10ppm(在一些实施方案中，0.5ppm至1.0ppm)脂肪酶(作为催化剂42)在pH 4.5至7.5(在一些实施方案中，介于pH 5.5和6.5之间)下处理足够的时间以将至少30％至高达至少99％的脂质中的可用脂肪酸内容物转化成游离脂肪酸。任选地，可加热液化的和经脂肪酶处理的醪18以在发酵之前使脂肪酶42失活。醪18可冷却至约30℃(例如使用换热器)并被加载到发酵容器30中，其量为约25％至30重量％的干玉米固体。在发酵期间加入葡糖淀粉酶(作为糖化酶38)以糖化液化醪18，这可导致葡萄糖产生。所得发酵液体培养基可包含比可存在于使用尚未用脂肪酶42处理过的液化醪的发酵液体培养基中的玉米油量显著更少的玉米油量(例如约1.2重量％的玉米油)。具体地讲，脂肪酶42处理可导致玉米油脂质26(甘油三酯(TG))转化成作为FFA 28的COFA(以及一些甘油二酯(DG)或甘油一酯(MG))，降低脂质26在任何ISPR提取剂29(例如油醇)中的积聚速率，并且在ISPR期间将COFA 28溶解到有机相36中降低丁醇在有机相36中的分配系数的程度将不与将脂质(TG)溶解到有机相36中导致的分配系数降低程度一样多。
在一些实施方案中，可修改图1的体系和方法使得原料浆液16(具有油26)和催化剂42被导入并在发酵容器30中接触以产生浆液18(具有FFA 28)。然后可提高发酵容器温度以使催化剂42热失活。然后可降低发酵容器温度，并且可用微生物32接种发酵容器，从而可发酵浆液18的糖以产生产物醇。
在一些实施方案中，可修改图1的体系和方法使得发酵容器30中的同步糖化和发酵(SSF)被在发酵容器30之前的分离糖化容器60(参见图2)取代，这对本领域的技术人员而言将是显而易见的。因此，可在SSF方法的发酵之前或发酵期间糖化浆液18。用于水解原料油26的催化剂42可在糖化酶38之前、之后、或同时导入，这一点也将是显而易见的。因此，在一些实施方案中，酶38和催化剂42的添加可为分步的(例如先加入催化剂42，然后加入酶38，或者相反地加入它们)或基本上同步的(即，恰好与人或机器一下添加花费的时间相同的时间，或者一种酶/催化剂紧接着其他催化剂/酶加入，其时间为人或机器两下添加花费的时间)。
例如，如图2的实施方案所示，可修改图1的体系和方法使得发酵容器30中的同步糖化和发酵(SSF)被在发酵容器30之前的分离糖化容器60取代。图2基本上与图1相同，不同的是包含分离的糖化容器60，其接纳酶38，并且将催化剂42导入液化的糖化原料流62。将原料浆液16与酶38如葡糖淀粉酶一起导入糖化容器60，从而在浆液16中的低聚糖形式的糖可降解成单糖。液化的糖化原料流62流出其中导入催化剂42的糖化容器60。原料流62包括单糖、油26和来源于原料的不溶解的固体。导入催化剂42以水解油26，产生具有游离脂肪酸28和催化剂42的液化糖化原料浆液64。
作为另外一种选择，在一些实施方案中，催化剂42可与糖化酶38一起加入以同步产生葡萄糖并将油脂质26水解成游离脂肪酸28。可分步(例如先加入催化剂42，然后加入酶38，或者相反地加入它们)或同步添加酶38和催化剂42。作为另外一种选择，在一些实施方案中，可将浆液62导入发酵容器，同时将催化剂42直接加到发酵容器30中。
在图2的实施方案中，将加热q施用于原料浆液64，从而使催化剂42失活，并且然后将热处理过的浆液64与产醇微生物32一起导入发酵容器30，所述微生物代谢单糖以产生产物醇(例如丁醇)。作为另外一种选择，将浆液64输送进发酵容器30并当其处于发酵容器中、用接种微生物32之前经受加热q。
如上文图1所述，游离脂肪酸28也可用作ISPR提取剂，其优先地从水相中分配产物醇。在一些实施方案中，也可将一种或多种附加的ISPR提取剂29导入发酵容器30中。两相混合物的分离在发酵容器30中发生，从而包含醇的有机相流36和水相流34直接排出发酵容器30。作为另外一种选择，两相混合物的分离可在图1的实施方案中提供的分离容器35中进行。图2的实施方案的剩余工艺运行与图1相同，并且因此将不再详述。
在本发明的其他实施方案中，来源于原料12的油26可在液化之前或期间被催化水解成FFA 28。例如在图3的实施方案中，可将具有油26的原料12与催化剂42一起输送进液化容器10以将油26中的至少一部分甘油酯水解成FFA 28。酶14(例如α-淀粉酶)水解原料12中的淀粉，也可将其导入容器10以产生液化原料。可分步或同步进行酶14和催化剂42的添加。例如，可导入催化剂42，并且然后在已经水解了至少一部分油26之后可导入酶14。作为另外一种选择，可导入酶14，并且然后可导入催化剂42。液化方法可涉及施用加热q。在此类实施方案中，优选在液化之前或期间导入催化剂42，这时工艺温度低于使催化剂42失活所需的温度，以便油26可被水解。随后施用加热q可实现液化和使催化剂42失活的双重目的。
在任何情况下，在液化容器10中将在原料12中的油26转化成FFA 28，使得两相原料浆液18流出液化容器10。两相浆液18包括有机相FFA 28以及糖、水和水相的不溶解的固体。在一些实施方案中，水相可包括来自油中的甘油酯类向脂肪酸转化的甘油(glycerin)。在一些实施方案中，可在引入发酵容器30前从所述流18中移除这些甘油(如果存在)。
参见图3，两相流18在发酵容器30中接触发酵液体培养基以形成两相混合物。在发酵容器30中，通过SSF产生的产物醇分配到包括FFA 28的有机相中。作为另外一种选择，在一些实施方案中，可修改所述方法以包括与图2相关的讨论的分离糖化容器。两相混合物的分离在发酵容器30中发生，从而包含醇的有机相流36和水相流34直接排出发酵容器30。作为另外一种选择，两相混合物的分离可在图1的实施方案中提供的分离容器35中进行。任选地，可将一种或多种另外的提取剂29导入发酵容器30以形成有机相，其将产物醇从水相中优先地分配出来。可将含醇有机相36导入分离器50以回收产物醇54并任选地再利用回收的提取剂27，如图1所示。图3的实施方案的其它方法操作与前文所述的附图相同，并且因此将不再详述。
在包括如图1-3所示的前文所述实施方案在内的一些实施方案中，可在将原料浆液导入发酵容器30之前从其中除去不溶解的固体。例如，如图4的实施方案所示，将原料浆液16导入分离器20的入口，将其构造用于排放固体相或湿饼24形式的不溶解的固体。例如，在一些实施方案中，分离器20可包括加压过滤器、真空过滤器、或用于从原料浆液16中分离不溶解的固体的离心机。任选地，在一些实施方案中，也可构造分离器20以移除原料浆液16中存在的一些或基本上全部油26。在此类实施方案中，分离器20可为本领域已知的任何适用的分离器，其用于从含水原料流中移除油，包括但不限于虹吸、滗析、抽吸、离心、使用重力沉降器、膜辅助的相分裂等。剩余的原料包括糖和水，将其以含水流22的形式排放到发酵容器30中。
在一些实施方案中，分离器20除去油26而不是不溶解的固体。因此，输送进发酵容器30的含水流22包括不溶解的固体。例如在一些实施方案中，分离器20包括三相卧螺离心机20，其搅拌或旋转原料浆液16以产生包含含水层(包含糖和水)(即，流22)、含有不溶解的固体(即，湿饼24)的固体层、和油层(即，油流26)的离心产物。在这种情况下，催化剂42可接触移除的油26以产生FFA 28的流，其包括催化剂42，如图4所示。然后可将加热q施用于FFA28的流，从而使催化剂42失活。然后可将FFA 28的流和失活的催化剂42与流22及微生物32一起导入发酵容器30。作为另外一种选择，可将FFA 28和活性催化剂42从容器40输送进发酵容器30，并且随后在发酵容器中活性催化剂42可在接种微生物32之前经受加热q并失活。
FFA 28可用作ISPR提取剂28并在发酵容器30中形成两相混合物。通过SSF产生的产物醇分配到通过FFA 28形成的有机相36中。在一些实施方案中，也可将一种或多种附加的ISPR提取剂29导入发酵容器30中。因此，油26(例如来自原料的油)可被催化水解成FFA28，从而降低脂质在ISPR提取剂中的积聚速率，同时也产生ISPR提取剂。有机相36可在容器35中与两相混合物39的水相34分离。在一些实施方案中，如图2和3所述的实施方案所示，两相混合物39的分离可发生在发酵容器中，其中包含醇的有机相流36直接从发酵容器30中排出。可将有机相36导入分离器50以回收产物醇54并任选地再利用回收的提取剂27，如图1所示。图4的实施方案的剩余工艺运行与图1相同，并且因此将不再详述。
当经由离心机20移除湿饼24时，在一些实施方案中，当原料是玉米时，来自原料12的一部分油如玉米油保留在湿饼24中。一旦已经从离心机20中排出了水溶液22，可用附加的水在离心机中洗涤湿饼24。洗涤湿饼24将回收存在于湿饼中的糖(例如低聚糖)，并且可将回收的糖和水再循环到液化容器10中。在洗涤后，可通过任何合适的已知方法干燥湿饼20以形成干酒糟可溶物(Dried Distillers′ Grains with Solubles，DDGS)。由在离心机20中形成的湿饼24形成DDGS具有多个优点。因为不溶解的固体不进入发酵容器中，提取剂和/或产物醇如丁醇不被捕集在DDGS中，它不经受发酵容器的条件，并且它不接触发酵容器中存在的微生物。所有这些有益效果使它更易于加工和销售DDGS，例如以动物饲料形式加工和销售。在一些实施方案中，油26不与湿饼24分开排出，而是将油26包括在湿饼24中，作为它的一部分，并且最终存在于DDGS中。在此类情况下，所述油可与DDGS分开并且转化成ISPR提取剂29，随后用于相同或不同的醇发酵方法。经由离心从原料16中移除不溶解的固体的方法和体系在提交于2010年6月18日的共有的、共同未决的美国专利公开申请61/356,290中详述，该申请全文以引用方式并入本文。
在其他实施方案中(未示出)，糖化可在分离的糖化容器60(参见图2)中发生，所述容器位于分离器20和液化容器10之间，这对本领域的技术人员来说将是显而易见的。
在如图所示的其他实施方案中，例如在图5的实施方案中，将天然油26′供应于容器40，催化剂42也被供应于该容器，从而将油26′中的至少一部分甘油酯水解以形成FFA28′。可随后使催化剂42失活，例如通过施用加热q使其失活。然后将来自包含FFA 28′和使催化剂42失活的容器40的产物流与其中包含原料油26的含水原料流22一起导入发酵容器30，并且在一些实施方案中，以前已经通过分离器20移除了不溶解的固体(参见例如图4的实施方案)。也将糖化酶38和微生物32导入发酵容器30，从而通过SSF产生产物醇。
作为另外一种选择，可将油26′和催化剂42直接输送进发酵容器30，其中将油26′水解成FFA 28′，而不是使用容器40。随后活性催化剂42可经受加热q并在接种微生物32之前，在发酵容器中失活。作为另外一种选择，可将FFA 28′和活性催化剂42从容器40输送进发酵容器30，并且随后在发酵容器中活性催化剂42可在接种微生物32之前经受加热q并失活。在此类实施方案中，可将包括油26的原料浆液16，而不是其中移除了油26的流22输送进发酵容器30并接触活性催化剂42。因此活性催化剂42可用于将油26水解成FFA 28，从而减少提取剂分配系数随时间的损失和/或降低，这归因于在发酵容器中存在油。
在一些实施方案中，可修改图5的体系和方法使得发酵容器30中的同步糖化和发酵被在发酵容器30之前的分离糖化容器60取代，这对本领域的技术人员而言将是显而易见的(参见例如图2的实施方案)。
在一些实施方案中，天然油26′可为牛脂油、玉米油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油、植物油共混物、以及它们的混合物。在一些实施方案中，天然油26′是两种或更多种天然油的混合物，例如棕榈油和大豆油的混合物。在一些实施方案中，天然油26′是植物来源的油。在一些实施方案中，植物来源的油可来源于发酵过程中可利用的生物质，但这是不一定的。生物质可来自从中获取原料12(如图5所示的流22)的相同或不同来源。因此，例如在一些实施方案中，油26′可来源于玉米，而原料12可为甘蔗。例如，在一些实施方案中，油26′可来源于玉米，并且原料12的生物质来源也是玉米。可使用任何可能的油26′对原料12的不同生物质来源的组合，这对本领域的技术人员来说将是显而易见的。
FFA 28′也可用作ISPR提取剂28′以形成包含水相和有机相的两相混合物，其中在发酵培养基中产生的产物醇优先分配到由ISPR提取剂28′构成的有机相中。在一些实施方案中，如上文图1所述，也可将一种或多种附加的ISPR提取剂29导入发酵容器30中。有机相36可在容器35中与两相混合物39的水相34分离。在一些实施方案中，如图2和3所述的实施方案所示，两相混合物39的分离可发生在发酵容器中，其中包含醇的有机相流36直接从发酵容器30中排出。可将有机相36导入分离器50以回收产物醇54并任选地再利用回收的提取剂27，如图1所示。图5的实施方案的剩余工艺运行与图1相同，并且因此将不再详述。
在本发明的一些实施方案中，存在于原料12中的生物质油可在醇发酵后的步骤中转化成FFA 28。然后可将FFA 28导入发酵容器中作为ISPR提取剂28。例如，在图6的实施方案中，液化原料12以产生原料浆液16，其包括来源于原料的油26。原料浆液16也可包括来自原料的不溶解的固体。作为另外一种选择，不溶解的固体可经由分离器如离心机(未示出)分离自浆液16。原料浆液16包含油26，将其直接导入包含发酵液体培养基的发酵容器30，所述发酵液体培养基包括糖化酶38和微生物32。产物醇通过发酵容器30中的SSF产生。作为另外一种选择，在一些实施方案中，可修改所述方法以包括与图2相关的讨论的分离糖化容器。
将ISPR提取剂29导入发酵容器30以形成两相混合物，并且通过将产物醇分配到ISPR提取剂29的有机相将其分离。油26也分配到有机相中。两相混合物的分离在发酵容器30中发生，从而包含醇的有机相流36和水相流34直接排出发酵容器30。作为另外一种选择，两相混合物的分离可在图1的实施方案中提供的分离容器35中进行。有机相流36包括油26，将其导入分离器50以从提取剂29中回收产物醇54。所得贫醇提取剂27包括回收的提取剂29和油26。提取剂27接触催化剂42，从而水解油26中的至少一部分甘油酯以形成FFA 28。然后可将加热q施用于包括FFA 28的提取剂27以在再循环到发酵容器30中之前使催化剂42失活。此类再循环的提取剂流27可为独立流或与新制备的提取剂流29一起的混合流。随后从发酵容器30中取出包含醇的有机相36，其除产物醇和来自新导入的原料浆液16的附加油26之外，随后可包括FFA 28和ISPR提取剂29(作为新提取剂29和再利用的提取剂27)。然后可以与上述方式相同的方式处理有机相36以回收产物醇，并且在接触催化剂42以水解附加的油26后再循环到发酵容器30中。在一些实施方案中，当发酵方法随时间进行时，使用制备的ISPR提取剂29可分阶段进行，因为方法本身可产生FFA 28作为制备的ISPR提取剂，用于提取产物醇。因此，ISPR提取剂可为再循环的提取剂27与FFA 28的流。
因此，图1-5提供了涉及发酵方法的方法和体系的多个非限制性实施方案、和由水解来源于油26的生物质产生的FFA 28、以及由催化水解天然油26′如植物来源的油产生的FFA 28′，它们可用作ISPR提取剂28和28′以在提取发酵中移除产物醇。
在一些实施方案中，包括如图1-6所述的任何前述实施方案，在发酵容器30中的发酵液体培养基包括至少一种重组微生物32，其经基因修饰(即，经遗传工程化)以经由生物合成途径产生丁醇，所述生物合成途径从至少一种可发酵碳源产生丁醇。具体地讲，重组微生物可在包含合适碳底物的发酵液体培养基中生长。附加的碳底物可包括但不限于：单糖如果糖；低聚糖如乳糖、麦芽糖、或蔗糖；多糖如淀粉或纤维素；或它们的混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦麦芽。其他碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。
另外，碳底物也可以是已被证明可以被代谢转化成关键生化中间产物的诸如二氧化碳的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体也已知可以利用多种其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，第7版(1993)，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属的多种菌种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153：485-489，1990)。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并将仅受限于生物体的选择。
尽管预期以上提及的所有碳底物以及它们的混合物均是适用的，但是在一些实施方案中，对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者是它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。蔗糖可来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源，包括谷物如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外，可发酵的糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维素的或木质纤维素的生物质，例如，如美国专利申请公布2007/0031918 A1中所述，该专利以引用方式并入本文。除适宜的碳源(来自含水流22)外，发酵液体培养基必需包含适宜的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和其他成分，如本领域的技术人员所知，适宜于培养物的生长和提升酶途径，其包含二羟酸脱水酶(DHAD)。
借助生物合成途径生产丁醇的重组微生物可包括以下菌属中的一种：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、或酵母属(Saccharomyces)。在一个实施方案中，重组微生物可选自大肠杆菌(Escherichia coli)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一个实施方案中，重组微生物为克拉布特里阳性酵母，其选自酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属、德克酵母属(Dekkera)、球拟酵母属(Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、以及假丝酵母属的一些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、芽殖酵母(Saccharomyces mikitae)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和光滑假丝酵母(Candida glabrata)。例如，利用微生物以及生产丁醇的微生物的发酵生产丁醇是已知的并且在例如美国专利公开申请公布2009/0305370中公开，该文献以引用方式并入本文。在一些实施方案中，微生物包含丁醇生物合成途径。合适的异丁醇生物合成途径是本领域已知的(参见例如美国专利公开申请公布2007/0092957，其以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，微生物中的异源性多核苷酸编码至少一个、至少两个、至少三个、或至少四个多肽，它们催化途径中底物到产物的转化。在一些实施方案中，微生物中的异源性多核苷酸编码所有多肽，它们催化途径中底物到产物的转化。在一些实施方案中，所述微生物包含减少或消除了的丙酮酸脱羧酶活性。基本上不含丙酮酸脱羧酶活性的微生物在美国专利申请公布2009/0305363中进行了描述，其以引用方式并入本文。
本文提供了某些菌株的构建，包括在实施例中使用的那些。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株BP1083(“NGCI-070”)的构建
所述菌株BP1064来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340；Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6和GPD2。用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1，如美国临时申请61/246,844所述)和pLH468(SEQ ID NO：2)转化BP1064以形成菌株NGCI-070(BP1083，PNY1504)。
缺失，即完全移除整个编码序列，通过与PCR片段同源重组而创建，所述PCR片段包含靶基因的上游和下游同源区以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。其侧翼为的G418抗性标记，用Cre重组酶移除。通过同源重组移除所述URA3基因以创建无痕缺失，或如果侧翼为loxP位点则用Cre重组酶移除。
所述无痕的缺失步骤是改编自Akada等人(Yeast 23：399-405，2006)。一般来讲，每个无痕缺失的PCR盒是通过重叠PCR组合四个片段A-B-U-C得到的。所述PCR盒包含可选的/反可选的标记，URA3(片段U)，其包含原生CEN.PK 113-7D URA3基因，连同启动子r(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)。片段A和C每个长500bp，它们对应于紧接靶基因上游的500bp(片段A)和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因下游的500bp并用于通过同源重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒整合到染色体时生成作为对应片段B的直接重复序列使用PCR产物ABUC盒，首先将URA3标记整合进基因组，然后通过同源重组从基因组中切除。初始整合删除了除3′的500bp之外的基因。在切除时，也删除了所述基因3′的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合，将要整合的基因包含在PCR盒的片段A和B之间。
UR A3缺失
为删除内源URA3编码区，ura3：：loxP-kanMX-loxP盒以PCR扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO：3)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼序列为loxP位点，允许Cre重组酶参与重组并移除标记。使用DNA聚合酶(New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物BK505与BK506(SEQ ID NO：4和5)完成PCR。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。利用标准遗传学技术将所述PCR产物转化到CEN.PK 113-7D中(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，第201-202页)并且转化子在30℃包含G418(100μg/mL)的YPD上选择。采用PCR验证筛选的转化子的正确整合，所用引物为LA468和LA492(SEQ ID NO：6和7)并命名为CEN.PK 113-7DΔura3：：kanMX。
HIS3缺失
用于无痕HIS3缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板，用Yeast/Bact试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。HIS3片段A使用以下引物进行扩增：引物oBP452(SEQ ID NO：14)，和引物oBP453(SEQ ID NO：15)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP454(SEQ ID NO：16)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQ ID NO：17)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP456(SEQ ID NO：18)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQ ID NO：19)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP458(SEQ ID NO：20)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQ ID NO：21)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQ ID NO：14)和oBP455(SEQ ID NO：17)进行扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ IDNO：18)和oBP459(SEQ ID NO：21)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。HIS3 ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO：14)和oBP459(SEQ ID NO：21)进行扩增。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：kanMX的感受态细胞，并用HIS3 ABUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种至缺乏尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP460(SEQ ID NO：22)和oBP461(SEQ IDNO：23)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：kanMXΔhis3：：URA3。
从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记
所述KanMX标记通过转化CEN.PK 113-7DΔura3：：kanMXΔhis3：：URA3与pRS423：：PGAL1-cre(SEQ ID NO：66，如美国临时申请61/290,639中所述)而移除，使用Frozen-EZYeast Transformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)并在30℃接种至缺乏组氨酸和尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。转化子在30℃的辅以1％的半乳糖的YP上生长～6个小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记切除，并在30℃接种至YPD(2％葡萄糖)平板上以复苏。分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种至包含5-氟-乳清酸(5-FOA，0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长和接种至YPD中以移除pRS423：：PGAL1-cre质粒。检测分离物中KanMX标记和URA3标记的丢失，并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板、和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测，检测pRS423：：PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP450(SEQID NO：24)和oBP451(SEQ ID NO：25)对于Δura3以及引物oBP460(SEQ ID NO：22)和oBP461(SEQ ID NO：23)对于Δhis3所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。
PDC6缺失
用于无痕PDC6缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板，用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC6片段A使用以下引物进行扩增：引物oBP440(SEQ ID NO：26)，和引物oBP441(SEQ ID NO：27)，其包含与PDC6片段B的5′端同源的5′尾。PDC6片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP442(SEQ IDNO：28)，其包含与PDC6片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP443(SEQ ID NO：29)，其包含与PDC6片段U的5′端同源的5′尾。PDC6片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP444(SEQ ID NO：30)，其包含与PDC6片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP445(SEQ ID NO：31)，其包含与PDC6片段C的5′端同源的5′尾。PDC6片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP446(SEQ ID NO：32)，其包含与PDC6片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP447(SEQ ID NO：33)。使用PCRPurification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。PDC6片段AB通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQ ID NO：26)和oBP443(SEQ ID NO：29)进行扩增。PDC6片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQ ID NO：30)和oBP447(SEQ ID NO：33)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。PDC6ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQ ID NO：26)和oBP447(SEQ ID NO：33)进行扩增。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3的感受态细胞，并用PDC6 ABUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种至缺乏尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有pdc6敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：34)和oBP449(SEQID NO：35)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3。
CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种至包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：34)和oBP449(SEQ ID NO：35)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC6编码区的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO：36)和oBP555(SEQ ID NO：37)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6并命名为BP891。
PDC1缺失ilvDSm整合
所述PDC1基因被删除并被ilvD替换，其编码区来自变异链球菌(Streptococcusmutans)ATCC No.700610。所述A片段接着ilvD编码区，其来自变异链球菌(Streptococcusmutans)，对于用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒使用High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)进行扩增并用NYLA83(如本文和美国临时申请61/246,709所述)基因组DNA作为模板，所述基因组DNA用 Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC1片段A-ilvDSm(SEQ ID NO：141)使用以下引物进行扩增：引物oBP513(SEQ ID NO：38)，和引物oBP515(SEQ ID NO：39)，其包含与PDC1片段B的5′端同源的5′尾。用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段用High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和作为模板的CEN.PK 113-7D基因组DNA进行扩增，用 Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。PDC1片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP516(SEQ IDNO：40)，其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3′端同源的5′尾，和引物oBP517(SEQ ID NO：41)，其包含与PDC1片段U的5′端同源的5′尾。PDC1片段U使用以下引物进行扩增：引物oBP518(SEQID NO：42)，其包含与PDC1片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP519(SEQ ID NO：43)，其包含与PDC1片段C的5′端同源的5′尾。PDC1片段C扩增使用以下引物进行扩增：引物oBP520(SEQID NO：44)，其包含与PDC1片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP521(SEQ ID NO：45)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP517(SEQ ID NO：41)进行扩增。PDC1片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQ ID NO：42)和oBP521(SEQ ID NO：45)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。PDC1 A-ilvDSm-BUC盒(SEQ ID NO：142)通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并用引物oBP513(SEQ ID NO：38)和oBP521(SEQ ID NO：45)进行扩增。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6的感受态细胞，并用PDC1 A-ilvDSm-BUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种至缺乏尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。具有pdc1敲除ilvDSm整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC1基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC1编码区的特异性引物为oBP550(SEQ ID NO：48)和oBP551(SEQ ID NO：49)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc 1：：ilvDSm-URA3。
CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种至包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记移除通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：46)和oBP512(SEQ ID NO：47)，所用的基因组DNA用 Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm并命名为BP907。
PDC5缺失sadB整合
所述PDC5基因被删除并被sadB编码区替换，所述编码区来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。对于PDC5缺失-sadB整合的PCR盒的一个片段首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。
pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含处于多克隆位点(MCS)内的URA3基因，其来自酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。pUC19包含pMB1复制子和一个编码β-内酰胺酶的基因，该基因负责在大肠杆菌中的复制与选择。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。
所述DNA涵盖了URA3编码区，连同URA3编码区上游250bp和下游150bp，所述序列来自酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)，使用High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)，CEN.PK 113-7D基因座DNA使用以下引物进行扩增：引物oBP438(SEQ ID NO：12)，其包含BamHI、AscI、PmeI和FseI，和oBP439(SEQ ID NO：13)，其包含XbaI、PacI和NotI限制性位点。基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。在使用BamHI和XbaI消化后，所述PCR产物和pUC19(SEQID NO：143)用T4DNA连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过PCR和测序确认，所用引物为oBP264(SEQ ID NO：10)和oBP265(SEQ ID NO：11)。
所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5A-sadB-BUC PCR盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQ ID NO：67)作为模板，所用引物为oBP530(SEQ ID NO：50)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP531(SEQ ID NO：51)，其包含与PDC5片段B的5′端同源的5′尾。PDC5片段B使用以下引物进行扩增：引物oBP532(SEQID NO：52)，其包含与sadB的3′端同源的5′尾，和引物oBP533(SEQ ID NO：53)，其包含PmeI限制性位点。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。sadB-PDC5片段B通过重叠PCR生成，通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530(SEQ IDNO：50)和oBP533(SEQ ID NO：53)进行扩增。在用合适的酶消化后，所得PCR产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。sadB-片段B-片段U扩增以所得质粒作为模板，所用引物为oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP546(SEQ ID NO：55)，其包含与PDC5片段C的5′端同源的5′尾。PDC5片段C使用以下引物进行扩增：引物oBP547(SEQ ID NO：56)，其包含与PDC5 sadB-片段B-片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(SEQ ID NO：57)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠PCR生成，通过混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO：54)和oBP539(SEQ ID NO：57)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。PDC5 A-sadB-BUC盒(SEQ IDNO：144)通过扩增PDC5 sadB-片段B-片段U-片段C生成，所用引物为oBP542(SEQ ID NO：58)，其包含与原生PDC5编码序列上游50个核苷酸同源的5′尾，和oBP539(SEQ ID NO：57)。使用PCR Purification试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5 A-sadB-BUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation IITM试剂盒(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)。转化混合物在30℃接种至缺乏尿嘧啶辅以1％乙醇(无葡萄糖)的葡萄糖的合成完全培养基上。具有pdc5敲除sadB整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。来自分离物的PDC5基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC5编码区的特异性引物为oBP552(SEQ ID NO：61)和oBP553(SEQ ID NO：62)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB-URA3。
CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB-URA3过夜生长在YPD(0.1％乙醇)中并在30℃接种至合成完全培养基上，辅以乙醇(无葡萄糖)并包含5-氟-乳清酸(0.1％)，以选择失去了URA3标记的分离物。所述PDC5缺失、sadB整合以及标记移除是通过PCR确认的，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：59)和oBP541(SEQ ID NO：60)，所用的基因组DNA用Yeast/Bact.试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB并命名为BP913。
GPD2缺失
为删除内源的GPD2编码区，gpd2：：loxP-URA3-loxP盒(SEQ ID NO：145)以PCR扩增自loxP-URA3-loxP模板DNA(SEQ ID NO：68)。loxP-URA3-loxP包含(ATCC No.77107)URA3标记，其侧翼序列为loxP重组酶位点。使用DNA聚合酶(New England BioLabsInc.，Ipswich，MA)和引物LA512与LA513(SEQ ID NO：8和9)完成PCR。所述每个引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。所述PCR产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶的辅以1％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。采用PCR验证筛选的转化子的正确整合，所用引物为oBP582和AA270(SEQ ID NO：63和64)。
所述URA3标记的循环是通过转化pRS423：：PGAL1-cre(SEQ ID NO：66)并在30℃接种至缺乏组氨酸，辅以1％的乙醇的合成完全培养基上。将转化子划线接种至辅以1％的乙醇的，并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，并且在30℃孵育以选择失去了URA3标记的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长在YPE(1％乙醇)上以移除pRS423：：PGAL1-cre质粒。所述缺失和标记移除通过PCR确认，所用引物为oBP582(SEQ ID NO：63)和oBP591(SEQ ID NO：65)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadBΔgpd2：：loxP并命名为PNY1503(BP1064)。
用质粒pYZ090(SEQ ID NO：1)和pLH468(SEQ ID NO：2)转化BP1064以形成菌株NGCI-070(BP1083；PNY1504)。
菌株NYLA74、NYLA83和NYLA84的构建
酿酒酵母内源PDC1和PDC6基因的插入失活。PDC1、PDC5和PDC6基因编码丙酮酸脱羧酶的三种主要异构酶，如下文所述：
pRS425：：GPM-sadB的构建
克隆编码来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的丁醇脱氢酶(SEQID NO：70)的DNA片段(公开于美国专利公开申请公布2009/0269823)。这个基因编码区称为sadB，用于仲醇脱氢酶(SEQ ID NO：69)，它使用来自木糖氧化无色杆菌(A.xylosoxidans)基因组DNA的标准条件进行扩增，所述基因组DNA使用试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，按照用于革兰氏阴性菌生物的推荐规程，分别使用正向和反向引物N473和N469(SEQ ID NO：74和75)进行制备。将PCR产物-Blunt克隆至4BLUNT(InvitrogenTM，Carlsbad，CA)，从而得到pCR4Blunt：：sadB，然后将该质粒转入大肠杆菌Mach-1细胞。随后从四个克隆中分离质粒并确认序列。
sadB编码区从pCR4Blunt：：sadB中PCR扩增得到。PCR引物包含附加的5’序列，其将与酵母GPM1启动子和ADH1终止子(N583和N584，以SEQ ID NO：76和77提供)重叠。然后使用“缺口修复”方法在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Ma等人，Gene 58：201-216，1987)中如下克隆PCR产物。包含GPM1启动子(SEQ ID NO：72)、来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的kivD编码区(SEQ ID NO：71)、和ADH1终止子(SEQ ID NO：73)的酵母-大肠杆菌穿梭载体pRS425：：GPM：：kivD：：ADH(描述于美国专利公开申请公布2007/0092957 A1的实施例17中)用BbvCI和PacI限制性酶消化以释放kivD编码区。将大约1μg剩余的载体片段与1μg sadB PCR产物一起转化进酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株BY4741中。在缺乏亮氨酸的合成完全培养基上选择转化子。生成pRS425：：GPM-sadB的合适重组事件通过使用引物N142和N459(SEQ ID NO：108和109)的PCR来确认。
pdc6：：PGPM1-sadB整合盒和PDC6缺失的的构建：
通过将来自pRS425：：GPM-sadB(SEQ ID NO：78)的GPM-sadB-ADHt片段(SEQ IDNO：79)与来自pUC19-URA3r的URA3r基因相连制备pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t-URA3r整合盒。pUC19-URA3r(SEQ ID NO：80)包含来自pRS426(ATCC No.77107)的URA3标记，该标记侧翼为75bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记移除。以pRS425：：GPM-sadB和pUC19-URA3r质粒DNA作为模板，使用DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物114117-11A至114117-11D(SEQ ID NO：81、82、83和84)，以及114117-13A和114117-13B(SEQ ID NO：85和86)，通过重叠延伸PCR(SOE PCR)(如Horton等人，Gene77：61-68所述，1989)将上述两种DNA片段相连。
SOE PCR的外侧引物(114117-13A和114117-13B)包含5′和3′～50bp分别与PDC6启动子和终止子的上游和下游区域同源的区域。利用标准的遗传学技术(Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)，将完整的盒PCR片段转入了BY4700(ATCC No.200866)，并且将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上。使用引物112590-34G和112590-34H(SEQ ID NO：87和88)，以及112590-34F和112590-49E(SEQ ID NO：89和90)通过PCR筛选转化体，以确定在带有PDC6编码区的缺失的PDC6基因座的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记移除。得到的经过鉴定的菌株具有下列基因型：BY4700pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t。
pdc1：：PPDC1-ilvD整合盒和PDC1缺失的构建：
利用SOE PCR(如Horton等人，Gene 77：61-68，1989所述)，通过将来自pLH468(SEQID NO：2)的ilvD-FBA1t片段(SEQ ID NO：91)与来自pUC19-URA3r的URA3r基因相连制备pdc1：：PPDC1-ilvD-FBA1t-URA3r整合盒，其中所述SOE PCR以pLH468和pUC19-URA3r质粒DNA作为模板，使用DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物114117-27A至114117-27D(SEQ ID NO：111、112、113和114)进行。
SOE PCR的外侧引物(114117-27A和114117-27D)包含5′和3′～50bp与PDC1启动子的下游区域和PDC1编码序列的下游区域同源的区域。利用标准的遗传学技术(Methods inYeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)，将完整的盒PCR片段转入了BY4700 pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t，并且将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上。使用引物114117-36D和135(SEQ ID NO：92和93)，以及引物112590-49E和112590-30F(SEQ ID NO：90和94)通过PCR筛选转化体，以确定在带有PDC1编码序列的缺失的PDC1基因座的整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记移除。得到的经过鉴定的菌株“NYLA67”具有下列基因型：BY4700 pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t pdc1：：PPDC1-ilvD-FBA1t。
HIS3缺失
为了删除内源HIS3编码区，his3：：URA3r2盒以PCR扩增自URA3r2模板DNA(SEQ IDNO：95)。URA3r2包含来自pRS426(ATCC No.77107)URA3标记，该标记侧翼为500bp的同源重复序列，以允许体内同源重组和URA3标记移除。使用DNA聚合酶(New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物114117-45A与114117-45B(SEQ ID NO：96和97)完成PCR，其产生～2.3kb的PCR产物。所述每个引物的HIS3部分来源于HIS3启动子上游5′区和编码区下游3′区，使得URA3r2标记的整合导致HIS3编码区的替换。利用标准遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，第201-202页)，将PCR产物转化到NYLA67中，并将转化体在30℃培养于不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上。通过在30℃下将转化子重复接种至缺乏组氨酸并补充有2％葡萄糖的合成完全培养基上来筛选转化子以验证整合正确。通过按照标准规程在30℃下置于补充有2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上再利用URA3r标记。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的被抑制确认了标记移除。得到的经过鉴定的菌株NYLA73具有下列基因型：BY4700 pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1tpdc1：：PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3。
pdc5：：kanMX整合盒和PDC5缺失的构建：
利用DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物PDC5：：KanMXF与PDC5：：KanMXR(SEQ ID NO：98和99)，从菌株YLR134W染色体DNA(ATCCNo.4034091)PCR扩增了pdc5：：kanMX4盒，产生了～2.2kb PCR产物。所述每个引物的PDC5部分来源于PDC5启动子上游5′区和编码区下游3′区，使得kanMX4标记的整合导致PDC5编码区的替换。利用标准遗传技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将PCR产物转化到NYLA73中，并且在补充1％乙醇和遗传霉素(200μg/mL)的YP培养基上，在30℃下选择转化体。使用引物PDC5kofor和N175(SEQ ID NO：100和101)，通过PCR筛选转化体以验证在带有PDC5编码区替换的PDC基因座的正确整合。经过鉴定的正确的转化体具有下列基因型：BY4700 pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t pdc1：：PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3 pdc5：：kanMX4。该菌株命名为NYLA74。
将质粒载体pRS423：：CUP1-alsS+FBA-budA和pRS426：：FBA-budC+GPM-sadB转化进NYLA74以产生产丁二醇菌株(NGCI-047)。
将质粒载体pLH475-Z4B8(SEQ ID NO：140)和pLH468转化进NYLA74以产生产异丁醇菌株(NGCI-049)。
HXK2(己糖激酶II)的缺失：
利用DNA聚合酶(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)和引物384与385(SEQ ID NO：102和103)，从URA3r2模板(如上所述)PCR扩增了hxk2：：URA3r盒，产生了～2.3kb PCR产物。所述每个引物的HXK2部分来源于HXK2启动子上游5′区和编码区下游3′区，使得URA3r2标记的整合导致HXK2编码区的替换。利用标准遗传技术(Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)将PCR产物转化到NYLA73中，并且在缺乏尿嘧啶且补充2％葡萄糖的合成完全培养基上，在30℃下选择转化体。使用引物N869和N871(SEQ ID NO：104和105)，通过PcR筛选转化体以验证在带有HXK2编码区替换的HXK2基因座的正确整合。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对所述URA3r2标记进行回收利用。通过将来自上述5-FOA平板的菌落接种至SD-URA培养基上，生长的抑制确认了标记移除，并且使用引物N946和N947(SEQ ID NO：106和107)，通过PCR来验证正确的标记移除。得到的经过鉴定的菌株命名为NYLA83，其具有下列基因型：BY4700 pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t pdc1：：PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2。
pdc5：：kanMX整合盒和PDC5缺失的构建：
如上所述通过PCR扩增pdc5：：kanMX4盒。将PCR片段转化到NYLA83中并如上所述选择和筛选转化子。经过鉴定的正确的转化体命名为NYLA84，其具有下列基因型：BY4700pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t pdc1：：PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2 pdc5：：kanMX4。
利用标准的遗传学技术(Methods in Yeast Genetics，2005，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，将质粒载体pLH468和pLH532同时转入了菌株NYLA84(BY4700 pdc6：：PGPM1-sadB-ADH1t pdc1：：PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2 pdc5：：kanMX4)，并将所得“产丁醇菌株NYLA84”在30℃培养于不含组氨酸和尿嘧啶且补充了1％乙醇的合成完全培养基上。
表达载体pLH468
构建了用于在酵母中表达DHAD、KivD和HADH的pLH468质粒(SEQ ID NO：2)并在美国专利公开申请公布2009/0305363中进行了描述，该文献以引用方式并入本文。构建pLH486以包含：嵌合基因，其具有来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的ilvD基因编码区(nt位置3313-4849)，所述表达DHAD编码区从酿酒酵母FBA1启动子(nt 2109-3105)接着FBA1终止子(nt 4858-5857)；嵌合基因，其具有密码子优化的马肝乙醇脱氢酶编码区(nt6286-7413)，所述表达ADH编码区从酿酒酵母GPM1启动子(nt 7425-8181)接着ADH1终止子(nt 5962-6277)；以及嵌合基因，其具有来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的密码子优化的kivD基因编码区(nt 9249-10895)，所述表达KivD基因编码区从TDH3启动子(nt10896-11918)接着TDH3终止子(nt 8237-9235)。
基于在酿酒酵母中的表达优化的密码子，由DNA2.0，Inc.(Menlo Park，CA)合成乳酸乳球菌酮异戊酸脱羧酶(KivD)和马肝脏醇脱氢酶(HADH)编码区(分别是SEQ ID NO：71和118)，并且提供于质粒pKivDy-DNA2.0和pHadhy-DNA2.0中。所编码的蛋白质分别为SEQ IDNO：117和119。构建了KivD和HADH单独的表达载体。为了装配pLH467(pRS426：：PTDH3-kivDy-TDH3t)，用AscI和SfiI酶消化载体pNY8(SEQ ID NO：121；也称为pRS426.GPD-ald-GPDt，描述于美国专利公开申请公布2008/0182308的实施例17中，该申请以引用方式并入本文)用AscI和SfiI酶消化，从而切除GPD启动子和ald编码区。用5’引物OT1068和3’引物OT1067(SEQ ID NO：123和124)对来自pNY8的TDH3启动子片段(SEQ ID NO：122)进行了PCR扩增，以在5’端加上一个AscI位点，并在3’端加上一个SpeI位点。将所述经AscI/SfiI消化的pNY8载体片段，与经AscI和SpeI消化的TDH3启动子PCR产物，以及分离自载体pKivD-DNA2.0的包含经密码子优化的kivD编码区的SpeI-SfiI片段相连接。这种三方连接产生了载体pLH467(pRS426：：PTDH3-kivDy-TDH3t)。通过限制性图谱和测序对pLH467进行验证。
pLH435(pRS425：：PGPM1-Hadhy-ADH1t)来源于载体pRS425：：GPM-sadB(SEQ IDNO：78)，它在美国临时申请61/058,970的实施例3中进行了描述，该文献以引用方式并入本文。pRS425：：GPM-sadB是具有嵌合基因的pRS425载体(ATCC No.77106)，该嵌合基因包含GPM1启动子(SEQ ID NO：72)、来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的丁醇脱氢酶编码区(sadB；DNA SEQ ID NO：69；蛋白质SEQ ID NO：70：公开于美国专利公开申请公布2009/0269823)、和ADH1终止子(SEQ ID NO：73)。pRS425：：GPMp-sadB在所述sadB编码区的5′和3′端分别包含BbvI和PacI位点。通过利用引物OT1074和OT1075(SEQ ID NO：126和127)进行定点诱变，在上述sadB编码区的5’端加上了一个NheI位点，从而产生载体pRS425-GPMp-sadB-NheI，该载体通过测序验证。用NheI和PacI消化pRS425：：PGPM1-sadB-NheI以释放出sadB编码区，并将来自载体pHadhy-DNA2.0的包含经密码子优化的HADH编码区的NheI-PacI片段与上述经消化的质粒连接，从而得到pLH435。
用SacI和NotI消化了酵母载体pRS411(ATCC No.87474)，并在三方连接反应中，将上述经消化的载体与来自pLH467的包含PTDH3-kivDy-TDH3t盒的SacI-SalI片段和来自pLH435的包含PGPM1-Hadhy-ADH1t表达盒的SalI-NotI片段相连接，以将KivD和HADH表达盒组合于同一载体中。这样就产生了载体pRS411：：PTDH3-kivDy-PGPM1-Hadhy(pLH441)，该载体经过了限制性图谱验证。
为了构建下游的异丁醇途径：ilvD、kivDy和Hadhy中的全部三种基因的一种共表达载体，使用描述于美国专利申请公布2010/0081154中的pRS423 FBA ilvD(链球菌的)(SEQ ID NO：128)作为IlvD基因的来源。这种穿梭载体包含在大肠杆菌中共生所需的F1复制起点(nt 1423至1879)和在酵母中复制所需的2微米起点(nt 8082至9426)。该载体含有FBA1启动子(nt 2111至3108；SEQ ID NO：120)和FBA终止子(nt 4861至5860；SEQ ID NO：129)。此外，它还携带用于在酵母中进行选择的His标记(nt 504至1163)和用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性标记(nt 7092至7949)。来自变异链球菌(Streptococcusmutans)UA159(ATCC#700610)的ilvD编码区(nt 3116至4828；SEQ ID NO：115；蛋白质SEQID NO：116)位于上述FBA启动子和FBA终止子之间，从而构成了一个用于表达的嵌合基因。此外，ilvD编码区还融合了lumio标签(nt 4829-4849)。
第一步是用SacI和SacII将pRS423FBA ilvD(Strep)(也叫做pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(变异链球菌(Streptococcus mutans))-Lumio)线性化(并利用T4 DNA聚合酶将SacII位点平末端化)，从而得到全长为9,482bp的载体。第二步是用SacI和KpnI(利用T4 DNA聚合酶将KpnI位点平末端化)从pLH441分离出kivDy-hADHy盒，得到6,063bp的片段。将该片段与来自pRS423-FBA(SpeI)-IlvD(变异链球菌(Streptococcus mutans))-Lumio的9,482bp载体片段相连接。如此产生了载体pLH468(pRS423：：PFBA1-ilvD(Strep)Lumio-FBA1t-PTDH3-kivDy-TDH3t-PGPM1-hadhy-ADH1t)，该载体经过了限制性图谱和测序确认。
pLH532的构建
构建pLH532质粒(SEQ ID NO：130)以在酵母中表达ALS和KARI。pLH532是一种包含下列嵌合基因的pHR81载体(ATCC No.87541)：1)CUP1启动子(SEQ ID NO：139)，来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶编码区(AlsS；SEQ ID NO：137；蛋白质SEQ ID NO：138)和CYC1终止子2(SEQ ID NO：133)；2)ILV5启动子(SEQ ID NO：134)，Pf5.IlvC编码区(SEQ ID NO：132)和ILV5终止子(SEQ ID NO：135)；以及3)FBA1启动子(SEQ ID NO：136)，酿酒酵母KARI编码区(ILV5；SEQ ID NO：131)；和CYC1终止子。
所述Pf5.IlvC编码区系一段编码来自荧光假单胞菌的KARI的序列，其被描述于美国专利申请公布2009/0163376中，该专利以引用方式并入本文。
上述Pf5.IlvC编码区是基于针对在酿酒酵母中的表达优化的密码子，利用DNA2.0，Inc.(Menlo Park，CA；SEQ ID NO：132)合成的。
pYZ090的构建
pYZ090(SEQ ID NO：1)基于pHR81(ATCC No.87541)主链被构建成包含具有得自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的alsS基因编码区的嵌合基因(nt位点457-2172)，它从酵母CUP1启动子(nt 2-449)开始表达并后接CYC1终止子(nt 2181-2430)以表达，并且具有得自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的ilvC基因编码区的嵌合基因(nt 3634-4656)，它从酵母ILV5启动子(2433-3626)开始表达并后接ILV5终止子(nt 4682-5304)以表达KARI。
pYZ067的构建
构建pYZ067以包含以下嵌合基因：1)得自变异链球菌(S.mutans)UA159的ilvD基因编码区(nt位点2260-3971)，该标记从酵母FBA1启动子(nt 1161-2250)开始表达，后接FBA终止子(nt 4005-4317)，用于表达二羟酸脱水酶(DHAD)，2)马肝ADH(nt 4680-5807)编码区，它从酵母GPM启动子(nt 5819-6575)开始表达，后接ADH1终止子(nt 4356-4671)，用于表达醇脱氢酶，和3)得自乳酸乳球菌(Lacrococcus lactis)(nt 7175-8821)的KivD基因编码区，它从酵母TDH3启动子(nt 8830-9493)开始表达，后接TDH3终止子(nt 5682-7161)，用于表达酮异戊酸脱羧酶。
pRS423：：CUP1-alsS+FBA-budA和pRS426：：FBA-budC+GPM-sadB和pLH475-Z4B8的 构建
pRS423：：CUP1-alsS+FBA-budA和pRS426：：FBA-budC+GPM-sadB和pLH475-Z4B8的构建在美国专利公开申请公布2009/0305363中进行了描述，该文献以引用方式并入本文。
此外，尽管本发明的多个实施方案已如上描述，但是应当理解它们仅以举例的方式存在并不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围下能够对其进行形式和细节的多种变型。因此，本发明的广度和范围应不受任何上述示例性实施方案的限制，但应仅仅根据以下权利要求及其等同物限定。
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。
实施例
以下非限制性实施例将进一步示出本发明。应当理解，虽然以下实施例涉及作为原料的玉米和作为羧酸的COFA，在不脱离本发明的前提下，可使用其他生物质来源作为原料和除COFA之外可用作羧酸的酸。此外，虽然以下实施例涉及丁醇和丁酯生产，在不脱离本发明的前提下，可生产其他醇包括乙醇和醇酯。
如本文所用，使用的缩写含义如下：如本文所用，使用的缩写含义如下：“g”指克，“kg”指千克，“L”指升，“mL”指毫升，“μL”指微升，“mL/L”指毫升每升，“mL/min”指毫升每分钟，“DI”指去离子，“uM”指微米，“nm”指纳米，“w/v”指重量/体积，“OD”指光密度，“OD600”指在波长600nM的光密度，“dcw”指干细胞重量，“rpm”指每分钟转数，“℃”指摄氏度，“℃/min”指每分钟摄氏度，“slpm”指标准升每分钟，“ppm”指每百万份数，“pdc”指丙酮酸脱羧酶酶数。
一般方法
种子瓶生长
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株经工程化以从碳水化合物源中产生异丁醇，该菌株缺失pdc1、缺失pdc5、并且缺失pdc6，它在种子烧瓶中从冷冻培养物生长至0.55-1.1g/L干细胞重量(OD600 1.3-2.6-Thermo HeliosαThermo Fisher ScientificInc.，Waltham，Massachusetts)。所述培养物在以300rpm旋转的培养箱中在26℃下生长。所述冷冻培养物之前在-80℃贮存。第一种子烧瓶培养基的组成是：
3.0g/L右旋糖
3.0g/L无水乙醇
3.7g/L ForMediumTMSynthetic Complete Amino Acid(Kaiser)Drop-Out：
无HIS，无URA(参考号DSCK162CK)
6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base，无氨基酸(No.291920)
将来自第一种子烧瓶培养物的十二毫升样品转移到2L烧瓶中并在30℃下以300rpm旋转的培养箱中生长。第二种子烧瓶具有220mL的以下培养基：
30.0g/L右旋糖
5.0g/L无水乙醇
3.7g/L ForMediumTMSynthetic Complete Amino Acid(Kaiser)Drop-Out：
无HIS，无URA(参考号DSCK162CK)
6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base，无氨基酸(No.291920)
0.2M MES缓冲液滴定至pH 5.5-6.0
所述培养物生长至0.55-1.1g/L干细胞重量(OD600 1.3-2.6)。在这一细胞浓度加入30mL包含200g/L蛋白胨和100g/L酵母提取物的溶液。然后加入300mL 0.2uM过滤除菌的Cognis，将90-95％油醇加到烧瓶中。所述培养物在收获之前继续生长至＞4g/L干细胞重量(OD600＞10)并加到发酵中。
发酵准备
初始发酵容器准备
向带玻璃夹套的2L发酵容器(Sartorius AG，Goettingen，Germany)加水至66％的液化重量。pH探针(Hamilton Easyferm Plus K8，部件号：238627，Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzerland)通过Sartorius DCU-3 Control Tower Calibration菜单进行校准。零在pH＝7时校准。跨度在pH＝4时校准。然后通过不锈顶板将探针置于发酵容器中。也将溶解氧探针(pO2探针)通过顶板置于发酵容器中。用于递送营养素、种子培养物、提取溶剂、和碱的管与顶板相连并且末端被箔封。T将整个发酵容器置于Steris(SterisCorporation，Mentor，Ohio)高压釜中并在液体循环中灭菌30分钟。
从高压釜中移出发酵容器并置于负载传感器上。将夹套水供应和回流管线分别连接到壳水和清洁排水上。将冷凝器冷却水的进水管和排水管连接到7℃运行的6-L再循环温浴上。将从发酵容器中导气的排气管连接到传送管上，所述传送管与Thermo质谱仪(PrimadB，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Massachusetts)相连。将喷洒管与供气管相连。将加入营养素、种子培养物、提取溶剂、和碱的管向下通过泵或夹住闭合。
用热电偶和室水循环环流反应器将发酵容器温度控制在55℃。润湿的玉米籽粒(#2马齿种黄玉米)用带1.0mm筛网的锤磨机碾碎，然后将所得碾碎的全玉米籽粒加入发酵容器，其加入量为29-30％(干玉米固体重量)的液化反应物料。
液化前的脂肪酶处理
将脂肪酶原液加到发酵容器中使最终脂肪酶浓度为10ppm。将发酵容器保持在55℃，300rpm，并且用0.3slpm N2填充上部空间6小时以上。在完成脂肪酶处理后，如下所述进行液化(液化)。
液化
将α-淀粉酶按照其说明书表单加入发酵容器，同时该发酵容器以300-1200rpm无菌混合，可通过喷射器将罐装N2以0.3slpm加入。温度设置点从55℃变为85℃。当温度为80℃以上时，开始液化烹煮并将液化循环保持在80℃以上90-120分钟。在完成液化循环后将发酵容器温度设置点设为30℃的发酵温度。将N2从喷射器中再导入顶部空间以防止起泡，不加入化学消泡剂。
液化后的脂肪酶处理
在液化循环结束后将发酵容器温度设为55℃而不是30℃。通过当需要时成块加入酸或碱将pH人工控制在pH＝5.8。将脂肪酶原液加到发酵容器中使最终脂肪酶浓度为10ppm。将发酵容器保持在55℃，300rpm，并且用0.3slpm N2填充上部空间6小时以上。在完成脂肪酶处理后，将发酵容器温度设为30℃。
脂肪酶加热失活处理(加热失活处理方法)
将发酵容器温度保持在80℃以上15分钟以上以使脂肪酶失活。在完成热失活处理后，将发酵容器温度设为30℃。
接种前的营养物质添加
在接种之前将乙醇(6.36mL/L，接种后体积，200proof，无水)加入发酵容器。在接种之前加入硫胺素，其最终浓度为20mg/L，并且在接种之前还加入100mg/L烟酸。
在接种前加入油醇或玉米油脂肪酸
在接种后立即加入1L/L(接种后体积)油醇或玉米油脂肪酸。
发酵容器接种
当将N2加入发酵容器时，将发酵容器pO2探针校准至零。用以300rpm喷射的无菌空气对发酵容器pO2探针的跨度进行校准。在第二种子烧瓶为＞4g/L干细胞重量后接种发酵容器。从培养箱/振荡器中移出摇瓶5分钟，以使油醇相和水相发生相分离。将水相(110mL)转移到无菌的接种瓶中。将种菌通过蠕动泵泵送到发酵容器中。
发酵容器运行条件
在整个生长和生产阶段所述发酵容器在30℃下运行。在不加入任何酸的情况下允许pH从5.7-5.9下降至对照设置点5.2。用氢氧化铵控制pH用于pH＝5.2的残留物生长和生产阶段。通过喷射器将无菌空气以0.3slpm加入发酵容器中以供残留物的生长和生产阶段。通过Sartorius DCU-3 Control Box PID控制环流反应器，使用最低设置在300rpm和最高设置在2000rpm的搅拌器设置pO2以控制在3.0％。通过加入α-淀粉酶(葡糖淀粉酶)进行液化玉米醪的同步糖化和发酵来供应葡萄糖。一旦淀粉可用于糖化，葡萄糖保持过量(1-50g/L)状态。
分析
气体分析
在Thermo Prima(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，Massachusetts)质谱仪上分析过程气体。这是相同的工艺气体，它是无菌的，并且然后被加到每个发酵容器中。在相同质谱仪上分析每个发酵容器的废气。这个Thermo Prima dB在每周一早上6：00am具有校准检查运行。通过与质谱仪相关联的Gas Works v1.0(Thermo Fisher ScientificInc.，Waltham，Massachusetts)软件进行定期的校准检查。校准气体用于：
在校准循环期间用其他已知的瓶装气体检查二氧化碳，结果为5％和15％。用其他已知的瓶装气体检查氧气，结果为15％。基于对每个发酵容器的废气的分析，使用质谱仪的摩尔分数分析和进行发酵容器的气体流量(质量流控制器)测量汽提的异丁醇、消耗的氧气、和排入废气中的二氧化碳的量。计算每小时的放气速率，然后合并整个发酵期间的该速率。
生物质测量
用1X PBS将0.4％的台盼蓝以1∶5稀释在氯化钠(VWR BDH8721-0)中，制备0.08％的台盼蓝溶液。从发酵容器中取出1.0mL的样品并置于1.5mL Eppendorf离心管中，在Eppendorf，5415C中以14,000rpm离心5分钟。在离心后，用带有20-200μL BioHit移液管尖的m200 Variable Channel BioHit移液管移除顶部的溶剂层。仔细操作以免移除溶剂层和含水层之间的层。一旦移除了溶剂层，使用设置在2700rpm的重悬样品。
需要进行一系列稀释以达到理想的浓度，用于血球计数器计数。如果OD为10，进行1∶20的稀释以达到0.5OD，这将提供理想的细胞量，每个方格计数为20-30。为了减少由于玉米固体带来的不精确稀释，需要用切过的100-1000μL BioHit移液管尖进行多倍稀释。从尖端切除大约1cm以增大开口，这会防止尖端堵塞。对于1∶20的最终稀释，用发酵样品和0.9％氯化钠溶液进行初始1∶1的稀释。然后用之前的溶液(即，初始的1∶1稀释液)和0.9％氯化钠溶液(第二稀释液)进行1∶1的稀释，随后用第二稀释液和台盼蓝溶液进行1∶5的稀释。在每次稀释之间涡旋处理样品并将切过的尖端浸入0.9％氯化钠和台盼蓝溶液中。
将盖片仔细地置于血球计数器(Hausser Scientific Bright-Line 1492)顶部。用带有2-20μL BioHit移液管尖的m20 Variable Channel BioHit移液管取出等分试样(10μL)最终的台盼蓝稀释液并注入血球计数器。将血球计数器置于40x放大倍数的ZeisAxioskop 40显微镜上。中央的象限分成25个方格，然后对两个室的四个角和中央方格计数并记录。在对两个室计数后，取平均值并乘以稀释因数(20)，然后乘以25，这是血球计数器中的象限内的方格数，然后除以0.0001mL，这是进行计数的象限的体积。这个计算的总数是每mL细胞数。
在水相中的发酵产物的LC分析
冷藏样品备用于加工。从冷藏处移出样品并使其达到室温(大约一小时)。用带有100-1000μL BioHit移液管尖的m1000 Variable Channel BioHit移液管转移大约300μL样品到0.2um离心过滤器(MF改型尼龙离心过滤器)中，然后使用Eppendorf，5415C以14,000rpm离心五分钟。大约200μL过滤样品被转移到1.8自动取样小瓶中，其具有带聚合物底的250μL玻璃小瓶插入件。在用设为2700rpm的涡旋处理样品前用带有PTFE隔膜的螺帽盖上小瓶。
然后在Agilent 1200系列LC上运行样品，该设备配有二元蠕动泵、真空脱气机、加热柱室、样品冷却系统、UV DAD检测器和RI检测器。所用的柱为Aminex HPX-87H，300×7.8，其带有Bio-Rad Cation H refill，30×4.6防护柱。柱温为40℃，移动相为0.01N硫酸，流速为0.6mL/min，流动40分钟。结果示于表1中。
表1：水相中的发酵产物的保留时间
在溶剂相中的发酵产物的GC分析
冷藏样品备用于加工。从冷藏处移出样品并使其达到室温(大约一小时)。用带有100-1000μL BioHit移液管尖的m1000 Variable Channel BioHit移液管转移大约150μL样品到1.8自动取样小瓶中，其具有带聚合物底的250μL玻璃小瓶插入件。用带有PTFE隔膜的螺帽盖上小瓶。
然后样品在Agilent 7890A GC上运行，该设备带有7683B喷射器和G2614A自动取样器。所述柱为HP-InnoWax柱(30m×0.32mm ID，0.25μm的膜)。载气为氦气，流速为1.5mL/min，在45℃用恒定顶压测量；喷射器分流为1∶50，温度为225℃；炉温为45℃1.5分钟，以10℃/min从45℃升温至160℃，持续0分钟，然后以35℃/min升温至230℃，持续14分钟，运行时间为29分钟。火焰离子化检测器将在260℃、40mL/min的氦气补气条件下使用。结果示于表2中。
表2：溶剂相中的发酵产物的保留时间。
分析其脂肪酸丁酯的样品在带有7683B喷射器和G2614A自动取样器的Agilent6890 GC上运行。所述柱是HP-DB-FFAP柱(15米×0.53mm ID(Megabore)，1-微米薄膜厚度柱(30m×0.32mm ID，0.25μm的膜)。载气为氦气，流速为3.7mL/min，在45℃用恒定顶压测量；喷射器分流为1∶50，温度为225℃；炉温为100℃2.0分钟，以10℃/min从100℃升温至250℃，然后保持在250℃9分钟，运行时间为26分钟。火焰离子化检测器将在300℃、40mL/min的氦气补气条件下使用。使用以下GC标准物(Nu-Chek Prep；Elysian，MN)确认脂肪酸异丁酯产物的同一性：异丁基棕榈酸酯、异硬脂酸丁酯、异油酸丁酯、异丁基亚油酸酯、异丁基亚麻酸酯、异丁基花生酸酯。
实施例1-14描述了可用于受权利要求书保护的方法的不同发酵条件。例如一些发酵在液化前经受脂肪酶处理，并且其他发酵在液化后经受脂肪酶处理。在其他实施例中，所述发酵经受热失活处理。在发酵后，测量有效的异丁醇滴度(有效异丁醇滴度)，即，每升液体体积产生的异丁醇总克数。结果示于表3中。
实施例1-(对照)
实验标识符2010Y014包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例2
实验标识符2010Y015包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后脂肪酶处理方法、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例3
实验标识符2010Y016包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后脂肪酶处理方法、接种前营养素加入方法(不同的是不含乙醇)、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例4
实验标识符2010Y017包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后热失活处理方法、接种前营养素加入方法(不同的是不含乙醇)、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例5
实验标识符2010Y018包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后脂肪酶处理方法(不同的是在液化后仅加入7.2ppm脂肪酶)、液化后热失活处理方法、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例6-(对照)
实验标识符2010Y019包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后热失活处理方法、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例7-(对照)
实验标识符2010Y021包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化前脂肪酶处理方法、液化方法、液化期间热失活处理方法、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例8
实验标识符2010Y022包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例9
实验标识符2010Y023包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后脂肪酶处理方法、非热失活处理、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后的0.1-1.0小时之间将由粗制玉米油制成的玉米油脂肪酸加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例10
实验标识符2010Y024包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化前脂肪酶处理方法、液化方法、液化期间热失活处理、接种前营养素加入方法(不同的是不加入乙醇)、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后0.1-1.0小时之间将油醇加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实旋例11
实验标识符2010Y029包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化前脂肪酶处理方法、液化方法、液化期间热失活处理方法、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后的0.1-1.0小时之间将由粗制玉米油制成的玉米油脂肪酸加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例12
实验标识符2010Y030包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化前脂肪酶处理方法、液化方法、液化期间热失活处理、接种前营养素加入方法(不同的是不加入乙醇)、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后的0.1-1.0小时之间将由粗制玉米油制成的玉米油脂肪酸加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例13-(对照)
实验标识符2010Y031包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后脂肪酶处理方法、非热失活处理、接种前营养素加入方法(不同的是不加入乙醇)、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后的0.1-1.0小时之间将由粗制玉米油制成的玉米油脂肪酸加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
实施例14
实验标识符2010Y032包括：种子烧瓶生长方法、初始发酵容器制备方法、液化方法、液化后脂肪酶处理方法、非热失活处理、接种前营养素加入方法、发酵容器接种方法、发酵容器运行条件方法、和所有分析方法。在接种后的0.1-1.0小时之间将由粗制玉米油制成的玉米油脂肪酸加到单批中。所述产丁醇生物是NGCI-070。
表3：实施例1-14的发酵条件。
*“有效异丁醇滴度g/L”＝每升液体体积产生的异丁醇总克数
实施例15
实验标识符是GLNOR432A。来自冷冻小瓶的NYLA74(丁二醇生产者-NGCI-047)在250mL烧瓶中的25mL培养基中生长至～1OD。将预备种子培养物转移到2L烧瓶中并生长至1.7-1.8OD。两个烧瓶的培养基是：
3.0g/L右旋糖
3.0g/L无水乙醇
6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base，无氨基酸(No.291920)
1.4g/L Yeast Dropout Mix(Sigma Y2001)
10mL/L 1％w/v L-亮氨酸原液
2mL/L 1％w/v L-色氨酸原液
1L的Applikon发酵容器用60mL的种子烧瓶接种。发酵容器包含700mL的以下无菌培养基：
20.0g/L右旋糖
8.0g/L无水乙醇
6.7g/L Difco Yeast Nitrogen Base，无氨基酸(No.291920)
2.8g/L Yeast Dropout Mix(Sigma Y2001)
20mL/L 1％w/v L-亮氨酸原液
4mL/L 1％w/v L-色氨酸原液
0.5mL Sigma 204 Antifoam
0.8mL/L 1％w/v Ergesterol容液，1∶1：：Tween 80∶乙醇
保持残余葡萄糖高于50％w/w的葡萄糖溶液。通过搅拌将发酵容器的溶解氧浓度控制在30％。控制pH在pH＝5.5。用0.3slpm的无菌罐装空气喷射到发酵容器中。将温度控制在30℃。
实施例16
实验标识符是GLNOR434A。这个实施例与实施例15相同，不同的是在接种前加入3g油酸并加入3g棕榈酸。NYLA74(丁二醇生产者-NGCI-047)是生物催化剂。
图7示出在接纳脂肪酸的发酵容器中有较高的克每升葡萄糖消耗。方形代表接纳油酸和棕榈酸的发酵容器。圆形代表不接纳任何额外脂肪酸的发酵容器。
实施例17
实验标识符是GLNOR435A。所述实施例与实施例15相同，不同的是它用NYLA74(异丁醇生产者-NGCI-049)接种。
实施例18
实验标识符是GLNOR437A。所述实施例与实施例16相同，不同的是它用NYLA74(异丁醇生产者)(NGCI-049)接种。
图8示出在接纳脂肪酸的发酵容器中有较高的克每升葡萄糖消耗。方形代表接纳油酸和棕榈酸的发酵容器。圆形代表不接纳任何额外脂肪酸的发酵容器。
实施例19
实验标识符是090420_3212。这个实施例与实施例15相似地运行，不同的是它用产丁醇生物NYLA84(异丁醇生产者)接种。这种发酵在1L Sartorius发酵容器中运行。
实施例20
实验标识符是2009Y047。这个实施例与实施例16相似地运行，不同的是它用产丁醇生物NYLA84(异丁醇生产者)接种。这种发酵在1L Sartorius发酵容器中运行。
图9示出在接纳脂肪酸的发酵容器中有较高的克每升葡萄糖消耗。方形代表接纳油酸和棕榈酸的发酵容器。圆形代表不接纳任何额外脂肪酸的发酵容器。
表4示出加入+/-脂肪酸、最大光密度、和消耗的g/L葡萄糖。
表4
实施例21
脂肪酶处理液化玉米醪以同步糖化和发酵，同时使用油醇进行原位产物移除
分析取自如上文实施例1、2、和3所述的发酵运行的液体培养基和油醇样品的脂质重量％(衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)和游离脂肪酸重量％(FFA，衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)，这根据E.G.Bligh和W.J.Dyer(Canadian Journal of Biochemistry andPhysiology，37：911-17，1959，下文称为参考1)所述的方法进行。也分析在用100L(Novozymes)(10ppm 总可溶解蛋白(BCA蛋白分析，Sigma Aldrich))每kg液化反应物料，其包含30重量％的玉米籽粒粉)处理后，为三次发酵中的每一次制备的液化玉米醪的脂质重量％和FFA重量％。无脂肪酶被加到实施例1(对照)中的液化玉米醪中，并且如实施例2和3所述的发酵包含用脂肪酶(不加热使脂肪酶失活)处理过的液化玉米醪，它们是相同的，不同的是在实施例3中描述的发酵中不加入乙醇。
为如实施例2和3所述的发酵运行制备的在脂肪酶处理过的液化玉米醪中的％FFA分别是88％和89％，与之相比不进行脂肪酸处理时为31％(实施例1)。在70小时时(运行(EOR)末期)，在如实施例2和3(包含活性脂肪酶)所述的发酵运行的OA相中的FFA浓度分别为14％和20％，并且通过GC/MS测得脂质(以玉米油脂肪酸甲酯衍生物形式测量)由于脂肪酶催化的OA对COFA的酯化获得相应增加，其中COFA首先通过脂肪酶催化液化玉米醪中的玉米油水解产生。结果示于表5中。
表5：包含作为ISPR溶剂的油醇和活性脂肪酶的发酵的脂质和游离脂肪酸含量
实施例22
热失活脂肪酶处理的液化玉米醪中的脂肪酶以限制玉米油游离脂肪酸的油醇酯 产量
将自来水(918.4g)加到带夹套的2-L树脂釜中，然后加入474.6g湿重(417.6g干重)的碾碎的全玉米籽粒(在锤磨机上的1.0mm筛网中碾磨)，同时搅拌。将混合物加热至55℃，同时在300rpm下搅拌，并且用2N硫酸调节pH至5.8。向混合物加入14.0g的水溶液，其包含0.672g-FREDL(Palo Alto，CA)，并且将混合物的温度提高到85℃，同时在600rpm下搅拌，pH为5.8。在85℃下120分钟后，将混合物冷却至50℃并将45.0mL所得玉米醪的等分试样转移到50-mL聚丙烯离心管中并在-80℃冻存。
在第一反应中，如上所述制备的50g液化玉米醪在55℃下与10ppm100L(Novozymes)混合6小时，并且在85℃下不使脂肪酶失活保持1小时，将所述混合物冷却至30℃。在第二反应中，50g液化玉米醪在55℃下与10ppm混合6小时，然后加热至85℃保持1小时(使脂肪酶失活)，然后冷却至30℃。在第三反应中，不加入脂肪酶的50g液化玉米醪在55℃下混合6小时，并且不在85℃下加热1小时，将混合物冷却至30℃，加入38g油醇，并将所得混合物在30℃下搅拌73小时。在第四反应中，不加入脂肪酶的50g液化玉米醪在55℃下混合6小时，然后加热至85℃保持1小时，随后冷却至30℃。四种反应混合物中的每一种在6小时时取样，然后加入38g油醇，并且在30℃下搅拌所得混合物并在25小时和73小时取样。根据参考1所述的方法分析样品(液化醪和油醇(OA))的脂质重量％(衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)和游离脂肪酸重量％(FFA，衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)。
在加入OA前使脂肪酶热失活的第二反应OA相中的％FFA在25小时为99％并且在73小时为95％，与之相比当不使经脂肪酶处理过的液化玉米醪中的脂肪酶热失活时(第一反应)，％FFA在25小时和73小时分别仅为40％FFA和21％FFA。在不加入脂肪酶的两个对照反应中未观察到显著的％FFA改变。结果示于表6中。
表6：在存在或不存在活性或热失活脂肪酶的情况下液化玉米醪和油醇的混合物的脂质和游离脂肪酸含量
实施例23
使在脂肪酶处理过的液化玉米醪中的脂肪酶热失活以同步糖化和发酵，同时使用 油醇进行原位产物移除
如上所述在实施例4、5、和6中进行三次发酵。在发酵之前无脂肪酶被加到实施例4和6中的液化玉米醪中，并且用脂肪酶(使用7.2ppm的总可溶解蛋白)处理实施例5中描述的发酵中的液化玉米醪，随后立即进行热失活处理(以完全使脂肪酶失活)，并且随后在接种和发酵前加入营养素。为如实施例4和6所述的发酵运行制备的在脂肪酶处理过的液化玉米醪中的％FFA分别是31％和34％，与之相比不进行脂肪酸处理时为89％(实施例5)。经过表10列出的发酵过程，在三次发酵的任一次中的OA相中的FFA浓度不下降，包括包含热失活脂肪酶的发酵。在根据实施例5的发酵运行(在发酵前使脂肪酶热失活)的OA相中的％FFA在70小时为95％(运行末期(EOR))，与之相比其中不用脂肪酶处理液化玉米醪的剩余两次发酵(实施例4和6)中％FFA仅为33％FFA。结果示于表7中。
表7：包含作为ISPR溶剂的油醇和热失活脂肪酶的发酵的脂质和游离脂肪酸含量(在脂肪酶处理液化醪之后)
实施例24
在液化前用脂肪酶处理碾磨过的全玉米籽粒
将自来水(1377.6g)加到两个带夹套的2-L树脂釜中的每一个，然后加入711.9g湿重(625.8g干重)的碾碎的全玉米籽粒(在锤磨机上的1.0mm筛网中碾磨)到每个釜中，同时搅拌。将每个混合物加热至55℃，同时在300rpm下搅拌，并且用2N硫酸调节pH至5.8。向每个混合物加入21.0g水溶液，其包含1.008gL(Palo Alto，CA)。然后向一个混合物加入10.5mL100L溶液(21mg总可溶解蛋白，10ppm脂肪酶终浓度)的水溶液并向第二混合物加入1.05mL的100L溶液(2.1mg总可溶解蛋白，1.0ppm脂肪酶终浓度)的水溶液。在55℃下，在1小时、2小时、4小时和6小时从每个反应混合物中取出样品，然后将混合物的温度提高到85℃，同时在600rpm下搅拌并且pH为5.8，并且当混合物首次达到85℃时取样。在85℃下120分钟后，取样并将混合物冷却至50℃，并且将所得液化玉米醪的最终样品转移到50-mL聚丙烯离心管中；所有样品冻存在-80℃。
在两个分开的反应中，如上所述制备的10ppm脂肪酶处理过的液化玉米醪的50g样品或1.0ppm脂肪酶处理过的液化玉米醪的55g样品与油醇(OA)(38g)在30℃下混合20小时，然后将每个反应混合物中的液化醪和OA离心分离并根据参考1所述的方法分析每个相的脂质重量％(衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)和游离脂肪酸重量％(FFA，衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)。在液化期间使用使10ppm脂肪酶热失活制备的液化醪/OA混合物的OA相中的％FFA在20小时为98％，与之相比在液化期间使用使1.0ppm脂肪酶热失活制备的液化醪/OA混合物的OA相中的％FFA仅为62％FFA。结果示于表8中。
表8：在液化前使用脂肪酶处理玉米粉悬浮液情况下的液化玉米醪和油醇的混合物的脂质和游离脂肪酸含量(在液化期间使脂肪酶热失活)
实施例25
在液化前进行脂肪酶筛选以处理碾磨过的全玉米籽粒
在带瓶塞的烧瓶中，在55℃、pH 5.8下搅拌包含自来水(67.9g)和碾磨过的全玉米籽粒(35.1g湿重，使用带有1.0mm筛网的锤磨机碾磨)的七个反应混合物。从每个烧瓶中取出3-mL样品(t＝0小时)并将样品立即在干冰上冷冻，然后将包含其中一种以下脂肪酶(Novozymes)的1mg总可溶蛋白(在反应混合物中为10ppm最终浓度)的大约0.5mL 10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)加到其中一个烧瓶中：100L、100L、2000T、CALB L、CALA L、和Palatase 20000L；无脂肪酶被加到第七个烧瓶中。在带瓶塞的烧瓶中，在55℃下搅拌所得混合物，并且在1小时、2小时、4小时和6小时从每个反应混合物中取出3-mL样品，立即在干冰中冷冻直至根据参考1所述的方法分析其脂质重量％(衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)和游离脂肪酸重量％(FFA，衍生化成脂肪酸甲酯，FAME)，并且计算相对于每个样品测得的脂质和游离脂肪酸的总混合浓度计算游离脂肪酸含量百分比。结果示于表9中。
表9：在液化前在55℃使用脂肪酶处理碾磨过的全玉米籽粒的混合物的游离脂肪酸含量百分比(％FFA)
实施例26
在同步糖化和发酵之前用脂肪酶处理碾磨过的全玉米籽粒，同时使用油醇进行原 位产物移除
如上所述在实施例7、8、和10中进行三次发酵。对于如实施例7和10所述的发酵运行，将脂肪酶(10ppm的总可溶蛋白)加到玉米粉的悬浮液中并在液化前在55℃加热6小时以产生包含热失活脂肪酶的液化玉米醪。无脂肪酶被加到用于制备供实施例8所述发酵用的液化玉米醪的玉米粉的悬浮液中，但是所述悬浮液在液化前经受相同的55℃加热步骤。为如实施例7和10所述的发酵运行制备的在脂肪酶处理过的液化玉米醪中的％FFA分别是83％和86％，与之相比不进行脂肪酸处理时为41％(实施例8)。经过发酵过程，在三次发酵的任一次中的FFA浓度不下降，包括包含热失活脂肪酶的发酵。在根据实施例7和10的发酵运行(在发酵前使脂肪酶热失活)的OA相中的％FFA在70小时为97％(运行末期(EOR))，与之相比根据其中尚未用脂肪酶在液化前处理碾磨过的全玉米籽粒的实施例8的发酵运行％FFA仅为49％FFA。结果示于表10中。
表10：包含作为ISPR溶剂的油醇和热失活脂肪酶的发酵的脂质和游离脂肪酸含量(在溶剂前用脂肪酶处理玉米粉悬浮液)
实施例27
用脂肪酶处理碾磨过的全玉米籽粒或液化玉米醪以同步糖化和发酵，同时使用玉 米油脂肪酸(COFA)进行原位产物移除
如上所述在实施例9、11、12、13、和14中进行五次次发酵。对于如实施例9、13、和14所述的发酵运行，在液化后加入脂肪酶(10ppm的总可溶蛋白)并且不使脂肪酶热失活。对于如实施例9和14所述的发酵运行在接种前加入5g/L的乙醇，而如实施例13所述的发酵运行不加入乙醇。如实施例11和12所述的发酵运行在液化前加入10ppm总可溶蛋白到玉米粉的悬浮液中，导致在液化期间使脂肪酶热失活。对于如实施例11所述的发酵运行在接种前加入5g/L的乙醇，而如实施例12所述的发酵运行不加入乙醇。存在于包含活性脂肪酶的发酵的COFA相中的最终异丁醇(i-BuOH)总克数显著大于存在于包含无活性脂肪酶的发酵的COFA相中的最终i-BuOH总克数。存在于包含活性脂肪酶的发酵液体培养基中的最终异丁醇(i-BuOH)总克数仅略小于存在于包含无活性脂肪酶的发酵液体培养基中的最终i-BuOH总克数，使得i-BuOH的总产量(游离i-BuOH和COFA(FABE)异丁酯的组合)在存在活性脂肪酶的情况下显著大于在存在热失活脂肪酶的情况下获得的i-BuOH的总产量。结果示于表11和表12中。
表11：当存在(实施例9、13、和14)或不存在(实施例11和12)活性脂肪酶(COFA相分析)时在包含作为ISPR溶剂的玉米油脂肪酸(COFA)的发酵中游离异丁醇(i-BuOH)和COFA(FABE)异丁酯的产量的依赖性
表12：当存在(实施例9、13、和14)或不存在(实施例11和12)活性脂肪酶(发酵液体培养基分析)时在包含作为ISPR溶剂的玉米油脂肪酸(COFA)的发酵中游离异丁醇(i-BuOH)和COFA(FABE)异丁酯的产量的依赖性
实施例28
在脂肪酶催化反应中异丁-COFA酯浓度对水/COFA比率的依赖性
包含含水2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(0.20M，pH 5.2)、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、脂肪酶(100L；Novozymes)和由玉米油(表13)制备的玉米油脂肪酸的反应混合物在30℃下搅拌，并且在预设的时间点从每个反应混合物中取样，立即离心，并分离水层和有机层，并且分析异丁醇(i-BuOH)和玉米油脂肪酸的异丁酯(i-BuO-COFA)(表14)。
表13：将异丁醇(i-BuOH)转化成玉米油脂肪酸异丁酯(i-BuO-COFA)的反应条件
表14：存在于表13所述反应的含水级份(AQ)和有机级份(ORG)中的异丁醇(i-BuOH)和玉米油脂肪酸异丁酯(i-BuO-COFA)的重量
实施例29
在脂肪酶催化反应中异丁-COFA酯浓度对水/COFA比率的依赖性
包含含水2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(0.20M，pH5.2)、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)或正丁醇、脂肪酶(100L；Novozymes)和由玉米油(表15)制备的玉米油脂肪酸的反应混合物在30℃下搅拌，并且在预设的时间点从每个反应混合物中取样，立即离心，并分离水层和有机层，并且分析异丁醇(i-BuOH)或正丁醇(n-BuOH)和玉米油脂肪酸的异丁酯(BuO-COFA)(表16)。
表15：将异丁醇(i-BuOH)或正丁醇(n-BuOH)转化成玉米油脂肪酸丁酯(BuO-COFA)的反应条件
表16：存在于表15所述反应的含水级份(AQ)和有机级份(ORG)中的异丁醇(i-BuOH)或正丁醇(n-BuOH)和玉米油脂肪酸丁酯(BuO-COFA)的重量
实施例30
通过脂肪酶催化的异丁醇与油酸的反应生产异油酸丁酯
包含含水2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(0.20M，pH5.2)、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、脂肪酶(0ppm或10ppm100L；Novozymes)和油酸(Alfa Aesar)(表17)的反应混合物在30℃下搅拌，并且在预设的时间点从每个反应混合物中取样，立即离心，并分离水层和有机层，并且分析异丁醇(i-BuOH)和异油酸丁酯(i-BuO-oleate)(表18)。
表17：将异丁醇(i-BuOH)转化成异油酸丁酯(i-BuO-oleate)的反应条件
表18：存在于表17所述反应的含水级份(AQ)和有机级份(ORG)中的异丁醇(i-BuOH)和异油酸丁酯(i-BuO-COFA)的重量
实施例31
通过脂肪酶催化的异丁醇与油酸的反应生产异油酸丁酯
在30℃下搅拌反应混合物，其包含含水2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MES，0.20M，pH5.2)、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、油酸(Alfa Aesar)、和来自购自Novozymes的100L、100L、CALB L、CALA L、的脂肪酶(10ppm)、或来自购自SigmaAldrich的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、米赫毛霉(Mucor miehei)、猪胰(hog pancreas)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、南极假丝酵母(Candidaantarctica)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)或曲霉属(Aspergillus)的脂肪酶(10ppm)(表19)，并且在预设的时间点从每个反应混合物中取样，立即离心，并分离水层和有机层，并且分析异丁醇(i-BuOH)和异油酸丁酯(i-BuO-oleate)(表20)。
表19：将异丁醇(i-BuOH)转化成异油酸丁酯(i-BuO-oleate)的反应条件
表20：存在于表19所述反应的含水级份(AQ)和有机级份(ORG)中的异丁醇(i-BuOH)和异油酸丁酯(i-BuO-oleate)的重量
实施例32
通过磷脂酶催化的异丁醇与玉米油脂肪酸(COFA)的反应生产异丁COFA酯
包含含水2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(0.20M，pH5.3)、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、磷脂酶(磷脂酶A；SigmaAldrich，L3295-250)和由玉米油(表21)制备的玉米油脂肪酸的反应混合物在30℃下搅拌，并且在预设的时间点从每个反应混合物中取样，立即离心，并分离水层和有机层，并且分析异丁醇(i-BuOH)和玉米油脂肪酸的异丁酯(i-BuO-COFA)(表22)。
表21：将异丁醇(i-BuOH)转化成玉米油脂肪酸异丁酯(i-BuO-COFA)的反应条件
表22：存在于表21所述反应的含水级份(AQ)和有机级份(ORG)中的异丁醇(i-BuOH)和玉米油脂肪酸异丁酯(i-BuO-COFA)的重量
实施例33
比较异丁醇在水和提取剂之间的分配系数
异丁醇水溶液(30g/L)与玉米油脂肪酸(COFA)、油酸、或玉米油甘油三酯混合，并且它们测得的分配系数相对于油醇测得的分配系数在表中报告。结果示于表23中。
表23：异丁醇(30g/L)在水和提取剂之间的相对分配系数
实施例34
来自玉米油的羟基化甘油三酯
向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈500mL烧瓶加入玉米油(50.0g)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰乙酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在一小时中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H2O2)。在60℃下搅拌所述混合物两小时，然后处理反应混合物：通过过滤除去树脂并且将滤过物在乙酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na2SO4上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得48.9g黄色油。对粗反应产物的1H NMR分析显示63％的双键受到环氧化。
A.玉米油羟化(63％羟化)
向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈500mL烧瓶加入玉米油(50.0g)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰乙酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在一小时中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H2O2)。在60℃下搅拌所述混合物两小时，然后处理反应混合物：通过过滤除去树脂并且将滤过物在乙酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na2SO4上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得48.9g黄色油。对粗反应产物的1H NMR分析显示63％的双键受到环氧化。
向500mL圆底烧瓶中加入环氧化玉米油(20.0g)、四氢呋喃(THF)(100.0mL)以及硫酸(50mL的1.7M水溶液)。在50℃下搅拌云雾状混浊混合物两小时并且随后通过在水(100mL)和乙酸乙酯(200mL)之间分配而进行处理。使用水(3×50mL)并随后使用浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na2SO4上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得19.9g深黄色油(63％羟化玉米油)。
B.玉米油羟化(47％羟化)
向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈500mL烧瓶加入玉米油(50.0g)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰乙酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在一小时中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H2O2)。在60℃下搅拌所述混合物一小时，然后处理反应混合物：通过过滤除去树脂并且将滤过物在乙酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na2SO4上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得49.8黄色油。对粗反应产物的1H NMR分析显示47％的双键受到环氧化。
向500mL圆底烧瓶中加入环氧化玉米油(20.0g)、THF(100.0mL)以及硫酸(50mL的1.7M水溶液)。在50℃下搅拌云雾状混浊混合物两小时并且随后通过在水(100mL)和乙酸乙酯(200mL)之间分配而进行处理。使用水(3×50mL)并随后使用浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na2SO4上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得19.2g深黄色油(47％羟化玉米油)。
C.玉米油羟化(28％羟化)
向装配以机械搅拌器和添加漏斗的三颈500mL烧瓶加入玉米油(50.0g)、甲苯(25.0mL)、Amberlyte IR-120树脂(12.5g)和冰乙酸(7.5g)。将所产生的混合物加热至60℃，并且随后在一小时中逐滴加入过氧化氢(41.8g处于水中的30％H2O2)。在60℃下搅拌所述混合物两小时，然后处理反应混合物：通过过滤除去树脂并且将滤过物在乙酸乙酯(75ml)和水之间进行分配(50mL)。层分离之后，使用饱和NaHCO3水溶液(50mL)和浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na2SO4上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得47.2黄色油。对粗反应产物的1H NMR分析显示28％的双键受到环氧化。
向500mL圆底烧瓶中加入环氧化玉米油(20.0g)、THF(100.0mL)以及硫酸(50mL的1.7M水溶液)。在50℃下搅拌云雾状混浊混合物两小时并且随后通过在水(100mL)和乙酸乙酯(200mL)之间分配而进行处理。使用水(3×50mL)并随后使用浓盐水(50mL)洗涤该有机层。在无水Na2SO4上干燥所述有机层，并且在真空中浓缩以获得20.3g深黄色油(28％羟化玉米油)。
分配系数测量
向5mL小瓶中加入0.910g 67％羟化玉米油以及0.910mL的3重量％iBuOH水溶液。用Vortex剧烈地搅拌所述两相混合物10分钟。在混合时，通过使用FisherScientific Centrific 228离心机(3300rpm)离心所述混合物10分钟而辅助层的分离。两个层各取样0.100g。使用乙二醇二乙醚的甲苯溶液稀释所述有机上层至1.00mL(10.1mg/mL)，并且使用乙二醇二乙醚的甲醇溶液稀释所述水层至1.00mL(10.2mg/mL)。使用校准的气相色谱仪(GC)测量两种相中的i-BuOH浓度。针对47％和28％的羟化玉米油重复相同的过程。由此而测得的分配系数对于67％羟化玉米油为3.2，对于47％羟化玉米油为2.3，并且对于28％羟化玉米油为2.1。
使用6％i-BuOH水溶液重复上述过程。所述分配系数对于67％-、47％-和28％-羟化玉米油分别为2.9、2.9和2.0。
实施例34
来自玉米油的脂肪酰胺加脂肪酸以及纯脂肪酰胺
玉米油与氢氧化铵水溶液进行反应，其方式类似于Roe等，J.Am.OilChem.Soc.29：18-22，1952的描述。将玉米油(0.818L，755g)置入1加仑不锈钢反应器中，其内加入了1.71L(1540g)氢氧化铵水溶液(28％的NH3)。将所述反应器加热至160℃同时进行搅拌，并且在该温度下维持7小时并加以搅拌，在此期间压力达到400psi。冷却所述反应器并且移除该产物(乳状白色固体)并使用乙酸乙酯清洗该反应器。将所述产物溶解于5L乙酸乙酯之中，并使用500mL水洗涤5次，各次的水均以H2SO4进行中和。随后在无水Na2SO4上干燥所述乙酸乙酯，并且在旋转蒸发器上移除该溶剂，留下浅褐色软固体。
CDCl3的13C NMR表明，所述产物包含约2∶1比率的脂肪酰胺与脂肪酸，并且所述玉米油向产物的转换是定量的。所述产物具有57-58℃的融点，但是以水进行饱和时下降约11℃。
根据Kohlhase等人，J.Am.Oil Chem.Soc.48：265-270，1971，使用无水氨以乙酸铵作为催化剂通过玉米油合成了纯玉米油脂肪酰胺。
将三克乙酸铵置于400mL的不锈钢振荡管中，其内加入了51.8g玉米油。随后加入无水氨(89.7g)并且密封所述反应器并在125℃下加热7小时，在此期间压力达到1300psi。冷却所述反应器并且移除所述浅色固体并使用乙酸乙酯清洗该反应器。随后，如上文脂肪酰胺/脂肪酸混合物的情况处理溶解于乙酸乙酯中的产物。
通过使用氢氧化钠进行的碱水解以玉米油合成脂肪酸。将圆底烧瓶(5L)装配以机械搅拌器、热电偶、加热罩、冷凝器和氮气阀。充以500g食品级玉米油、1L水和75g氢氧化钠。将混合物加热至90℃并维持三小时，在此期间其变成单一的粘稠乳液状单一相。在此期间结束时，TLC显示所述混合物内无残留玉米油。随后将所述混合物冷却至72℃并且将500mL的25％硫酸加入以酸化该混合物。其随后冷却至室温并且加入2L二乙醚。以3×1L的1％硫酸、1×1L的饱和浓盐水洗涤所述醚层，在MgSO4上干燥并过滤。通过旋转蒸发移除所述醚，并随后使用氮气净化所述油过夜，获得了470g黄色油，其部分地过夜结晶。通过AOCS方法Ca5a-40对游离脂肪酸的滴定显示95％的脂肪酸含量，其以油酸表达。通过将在1mL干吡啶中将104mg与100uL的N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行反应而对样品进行硅烷化。对所述硅烷化产物的气相色谱-质谱联用分析仪(GCMS)分析显示了16∶0、18∶2、18∶1、18∶0和20∶0酸的TMS衍生物的存在。
三种制备物：(1)来自氨水的玉米油脂肪酰胺与玉米油脂肪酸的2∶1混合物，(2)纯玉米油脂肪酰胺：纯玉米油脂肪酸的2∶1混合物，以及(3)纯玉米油脂肪酰胺：玉米油脂肪酸的1∶2混合物，全部针对其从3％的水溶液中提取异丁醇的能力进行了测试。在20mL闪烁瓶中将七百毫克各制备物加入包含3％异丁醇的2.1mL水中，并在30℃下置于旋转振荡器上过夜。在全部三种情况下，所述有机相在该温度下变成液体，这表明通过摄取异丙醇而使融点进一步降低。使用包含乙二醇二乙醚(10.068mg/mL)作为GC标准物的200μl甲苯或包含相同浓度乙二醇二乙醚的200μl异丙醇稀释五十微升的上层相。使用包含相同浓度乙二醇二乙醚的150μl甲醇和50μl异丙醇稀释五十微升的下层相。使用校准的GC测定两种相中的异丁醇浓度。所测得的分配系数如下：(1)为3.81，(2)为4.31，并且(3)为3.58。
在摇瓶中将脂肪酰胺/脂肪酸氨水制备物(1)以及通过将制备物(1)1∶1地混以纯玉米油脂肪酸(相当于1∶2的脂肪酰胺∶脂肪酸)而形成的制备物(1a)与发酵液体培养基在3份液体培养基对1份酰胺/酸混合物的比率下进行孵育，所述发酵液体培养基包含酵母菌属产丁醇菌株NGCI-070。制备物(1)是软固体，而制备物(1a)在30℃下是液体。在8.35g/L的葡萄糖浓度下起始，随后在孵育摇床上孵育所述摇瓶25小时，并且葡萄糖的消耗为时间的函数。表24显示，在两种比率下的脂肪酰胺/脂肪酸混合物对所述产丁醇菌株不具毒性，并且甚至表现出与油醇相比更高的葡萄糖摄取速度。
表24
实施例35
来自玉米油的脂肪醇
参照通过玉米油制备脂肪醇的上文方程IV的反应，在氮气下对装配以机械搅拌器、具有N2源的回流冷凝器、添加漏斗、内部热电偶和橡胶隔膜的22L圆底烧瓶进行直火干燥。将所述烧瓶充以132g(3.30摩尔)的95％氢化铝锂粉末，其在干燥的盒中称重并且加载入固体添加漏斗。使用冰浴冷却所述22L烧瓶，并通过套管将9.0升无水THF加入所述反应器。将所产生的浆液冷却至0-5℃，并将处于1.00升无水THF的956g(1.10摩尔)的玉米油溶液在2-3小时中逐滴加入，同时保持所述反应温度在5-20℃。在加入所述玉米油后，在常温下搅拌所述浆液过夜。当根据TLC色谱验证所述反应完成时，通过逐滴加入溶于370mL THF的130g水溶液而对其终止。随后加入130g 15％氢氧化钠水溶液，继之以加入400g水。剧烈搅拌所述混合物，同时加温至室温，并且产生了白色颗粒状固体。使用烧结玻璃过滤漏斗滤出所述固体，并以另外的THF进行洗涤。在旋转蒸发器上移除THF并且将该残余物吸收于3.00升乙酸乙酯中。使用2×1.00L水，1×1.00L浓盐水洗涤所述产物溶液，在Na2SO4上干燥，过滤并且在真空中浓缩以得到836g(97％)脂肪醇，其为黄色油。随后蒸馏所述粗脂肪醇混合物(140℃/1mmHg)，并用于下列分配系数实验。
分配系数实验
在五个5-mL小瓶中各加入1mL脂肪醇混合物以及1mL的3重量％iBuOH水溶液。使用Vortex分别剧烈地搅拌所述两相混合物10、20、30、40和60分钟。在混合时，通过使用Fisher Scientific Centrific 228离心机(3300rpm)离心所述混合物10分钟而辅助层的分离。两个层各取样0.100mL。使用乙二醇二乙醚的甲苯溶液稀释所述有机上层至1.00mL，并且使用乙二醇二乙醚的甲醇溶液稀释所述水层至1.00mL。使用校正GC测量两种相中的i-BuOH浓度。由此测得的分配系数为2.70。
对6重量％的i-BuOH浓度进行如上所述的相同的分配系数测量。由此测得的分配系数为3.06。
尽管本发明的多个实施方案已如上描述，但是应当理解它们仅仅以举例的方式存在，并且不受限制。对相关领域的技术人员将显而易见的是能够在不脱离本发明的实质和范围下能够对其进行形式和细节的多种变型。因此，本发明的广度和范围应不受任何上述示例性实施方案的限制，但应仅仅根据以下权利要求及其等同物限定。
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文至如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体且单独地指明为以引用方式并入的相同程度。

Claims (27)

1.方法，包括：
使包含水、可发酵碳源和油的生物质与一种或多种催化剂接触，从而通过一种或多种催化剂水解所述油的至少一部分以形成提取剂，其中所述可发酵碳源和所述油均来源于所述生物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物质包括玉米粒、玉米棒、作物残余物、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述油包含甘油酯，并且其中所述一种或多种催化剂水解所述甘油酯以形成脂肪酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述提取剂包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、或它们的混合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种催化剂选自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取剂对于产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于所述产物醇的分配系数。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括：
在水解所述油的至少一部分之后使所述催化剂失活。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括：
在通过一种或多种催化剂水解之前从所述生物质中分离所述油。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括：
在发酵容器中使所述生物质与发酵液体培养基接触；
发酵所述生物质的碳源以产生产物醇；以及
通过使所述液体培养基与所述提取剂接触，从所述发酵液体培养基中原位移除所述产物醇。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述产物醇是丁醇。
11.生产醇的方法，包括：
(a) 提供包含水、可发酵碳源和油的生物质；
(b) 液化所述生物质以产生液化的生物质；
(c) 使所述液化的生物质与一种或多种催化剂接触，从而水解所述油的至少一部分以形成提取剂；
(d) 使所述液化的生物质与能够将低聚糖转化成可发酵糖的糖化酶接触；
(e) 在发酵容器中使所述液化的生物质与发酵液体培养基接触；
(f) 发酵所述液化的生物质的碳源以产生产物醇；
(g) 通过使所述液体培养基与所述提取剂接触，从所述发酵液体培养基中原位移除所述产物醇；
并且任选地，步骤（c）和（d）同时发生。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物质包括玉米粒、玉米棒、作物残余物、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述油包含甘油酯，并且其中所述一种或多种催化剂水解所述甘油酯以形成脂肪酸。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述提取剂包括脂肪酸、脂肪酰胺、脂肪醇、脂肪酯、甘油三酯、或它们的混合物。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种催化剂选自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述提取剂对于所述产物醇的分配系数大于所述生物质的油对于所述产物醇的分配系数。
17.根据权利要求11所述的方法，还包括：
在水解所述油的至少一部分之后使所述催化剂失活。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述产物醇是丁醇。
19.组合物，包含：
(a) 能够产生醇的重组微生物；
(b) 可发酵碳源；
(c) 一种或多种能够将甘油酯水解成脂肪酸的催化剂；
(d) 包含甘油酯的油；和
(e) 脂肪酸。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述一种或多种催化剂选自酯酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述油是玉米油、牛脂油、卡诺拉油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鱼油、霍霍巴油、猪油、亚麻籽油、牛蹄油、奥蒂油、棕榈油、花生油、油菜籽油、稻米油、红花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻风树油和植物油共混物。
22.根据权利要求19所述的组合物，其中所述可发酵碳源和所述油来源于生物质。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述生物质包括玉米粒、玉米棒、作物残余物、玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、黑麦、小麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、谷物、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物。
24.根据权利要求19所述的组合物，还包含糖化酶。
25.根据权利要求18所述的组合物，还包含不溶解的固体。
26.根据权利要求18所述的组合物，还包含甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、甘油、单糖、低聚糖或醇中的至少一种或多种。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述醇是丁醇。
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