CN101418320B - 一种生产丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产丁醇的方法。该生产丁醇的方法，包括用发酵培养基发酵丁醇产生菌得到丁醇的步骤，所述方法中包括从发酵产物中萃取丁醇的步骤。本发明方法通过液液萃取和气提使丁醇等从发酵产物中及时分离，从而降低发酵产物对发酵反应的抑制作用，在不额外增加设备的基础上，提高了丁醇原位分离效率，降低了丁醇产物抑制，提高了发酵效率。因此，本发明方法解决了目前丙酮丁醇发酵中出现的产物抑制、丁醇的生产强度和生产效率均较低、回收成本较高的问题，适合于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产丁醇的方法。
背景技术
丁醇是一种用途十分广泛的重要精细化工原料，广泛用于各种塑料和橡胶制品的生产及其它有机化合物的制造；生物丁醇的无腐蚀性、低蒸气压、与汽油具有相当热值的优点，使其具备了替代车用汽油的必要条件，BP公司日前正在和DuPont公司合作开发新一代生物燃料，美国也将用生物燃料如生物柴油、乙醇和生物丁醇替代部分石油基汽油或柴油订为国策。所以市场上对生产丁醇的需求越来越高。
生产丁醇的传统方法为ABE发酵，是使用丙酮丁醇梭菌生产丙酮和丁醇。上个世纪20年代许多国家都能够以ABE发酵商业运行生产丙酮和丁醇，二战后，随着化学合成技术的快速发展，ABE发酵走向衰退。现今随着石油化工成本的升高，ABE发酵生产丁醇重新恢复了生机。但是，传统ABE发酵存在一些难以解决的问题：高成本的生长培养基，生产过程中低浓度丁醇对生产菌种的高毒性，以及由此带来的低产物浓度的高成本回收问题。虽然已有一些通过诱变、原生质体融合和基因工程等手段对现有菌种进行改良，一定程度上提高了生产菌的底物利用率，拓宽了底物利用范围，增强生产菌的丁醇耐受性。但是丁醇对发酵菌种的高毒性抑制问题一直没有得到解决，使得丁醇分批发酵产量仍难超过12-14g/L。
除了从菌种自身角度进行生产优化外，另外一种提高产量及生产强度的方法便是从细胞外的环境中寻找突破口，改造传统分批发酵工艺以解决丁醇毒性及回收问题。细胞回收系统和固定化细胞反应器使生产强度得到提高，但是这种高生产强度常伴随低产量、低糖利用率等问题，即便通过回收发酵流出物提高残糖转化率，ABE发酵的产物抑制问题——丁醇毒性问题仍然难以使丁醇发酵浓度超过14g/L。
为了克服以上困难，一些原位分离抑制产物的耦合发酵工艺开始出现。这些工艺包括：气提发酵，液液萃取发酵，渗透萃取发酵，渗透蒸发-发酵耦合工艺。渗透萃取和渗透蒸发分别是基于膜分离技术上的萃取和蒸发，通过控制丁醇等目标产物优先通过膜，实现减小产物抑制的目标，具有高效、低能耗的优势，但是，膜的化学稳定性差、机械强度弱、价格较高等特点、成为制约其发展的瓶颈。气提法和液液萃取法是分别用惰性气体和有机溶剂对产物丁醇进行原位提取的技术。气提法的原理是：当发酵产生的气体(CO2和H2)或外界通入的N2经过发酵罐时，这些气体携带并冷却浓缩发酵产物丁醇于另一个容器，又重新被循环利用回到发酵罐，以携带更多的丁醇，因此，溶液组分被不断气提到气相中，使产物抑制及时被消除。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产丁醇的方法。
本发明所提供的生产丁醇的方法，包括用发酵培养基发酵丁醇产生菌得到丁醇的步骤，所述方法中包括从发酵产物中萃取丁醇的步骤。
所述萃取丁醇的方法包括向所述发酵的反应体系中加入丁醇萃取剂的步骤。
所述萃取丁醇的方法还可包括向所述发酵的反应体系中通入惰性气体的步骤。
所述向所述发酵的反应体系中加入丁醇萃取剂的方法为自所述发酵开始时计起第0-30小时加入，优选为第12-30h，最优选为第24h；所述向所述发酵的反应体系中通入惰性气体的方法为自所述发酵开始时计起第0-30小时加入，优选为第12-30h，最优选为第24h。
所述丁醇萃取剂与所述发酵培养基的体积比为1:2-1:10，优选为1：5。
本发明所用的丁醇萃取剂可以为对生产菌种毒性较小的且与水相不互溶的溶剂构成，只要有机溶剂满足以下条件即可：对水相细胞的毒性越小越好，对于丁醇的萃取率达到50％以上且高于对丙酮和乙醇的萃取率，尽量节省有机相用量。所述丁醇萃取剂具体可以是油醇和癸醇以1:1-10:1体积比组成的混合物，最佳的是油醇和癸醇以4：1体积比混合组成的混合物。
所述通入惰性气体的方式为间歇通入或连续通入。
所述间歇通入的方式为每隔2-24小时通入一次，每次通入的时间为1-12小时，每次通入的速度为0.1-1.5L气体/min；所述连续通入的方式为以0.1-1.5L气体/min的速度连续通入；
所述间歇通入的方式比较优选为：每隔4-20小时通入一次，每次通入的时间为2-10小时，每次通入的速度为0.5-1.0L气体/min；所述连续通入的方式为以0.5-1.0L气体/min的速度连续通入；
所述间歇通入的方式最优选为：每隔12h通入一次，每次通入的时间为1h，每次通入的速度为0.6L气体/min；
所述连续通入的方式优选为：以0.3L气体/min的速度连续通入。
所述惰性气体为氮气、氢气、氦气或二氧化碳气体；本发明所用的丁醇产生菌可以是生产丁醇为主、包括丙酮、乙醇中的任意一种或两种产物的梭菌，如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)及Clostridium saccharobutylicum等。
本发明方法中所述发酵的温度可为35-39℃，优选为37℃；所述发酵的反应体系的pH值可为4.5-5.5，优选为5；所述发酵优选为静置发酵。
本发明方法中，所述发酵还包括如下步骤：自发酵开始时计起，第36小时时向所述反应体系中补充加入葡萄糖；补充加入的葡萄糖在发酵液中的浓度最好为65g/L。
本发明所用的培养基可以是玉米培养基、秸秆培养基，或葡萄糖培养基等与油相不互溶的培养基。
本发明的丁醇萃取剂对丁醇的选择性好、萃取效率高，同时对发酵菌株伤害较小。
本发明利用丁醇在某些有机溶剂中溶解度远大于在水中溶解度的特性，建立了液液萃取原位分离丁醇的发酵工艺，同时根据丁醇具有一定挥发性的特点，建立了通入一定量惰性气体以携带丁醇从发酵液中分离的发酵工艺。本发明方法将上述两种工艺集成在一起，建立了萃取气提耦合的丁醇发酵工艺。该方法通过液液萃取和气提使丁醇等从发酵产物中及时分离，而菌体和发酵原料保留在发酵水相中，从而降低发酵产物对发酵反应的抑制作用，在不额外增加设备的基础上，提高了丁醇原位分离效率，降低了丁醇产物抑制，提高了发酵效率，降低生产成本。另外，本发明所使用的萃取剂对丁醇的选择性萃取效率较高，发酵体系中丁醇被优先萃取到有机相中，乙醇和丙酮的萃取率较低，终产物中丁醇比例较高，从而提高目的产物的得率。
实验证明，本发明方法中每升发酵液中得到的丁醇产量比传统发酵工艺高11.93g，而且丁醇在所有产物(丁醇、丙酮和乙醇)中的比例也提高了5.0％，在回收的气体中未检测出丁醇，表明丁醇在惰性气体的带动下几乎全部进入到萃取剂中，从而减少了从回收产物中提取丁醇的步骤，进一步简化了生产操作、降低了成本。
因此，本发明方法解决了目前丙酮丁醇发酵中出现的产物抑制、丁醇的生产强度和生产效率均较低、回收成本较高的问题，适合于推广应用。
附图说明
图1为丁醇标准品气相色谱图。
图2为丁醇发酵有机相气相色谱图。
图3为丁醇标准品液相色谱图。
图4为丁醇发酵水相液相色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。
下述实施例中，所用的能生产丁醇的菌株为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(CGMCC №.2287)(中国专利CN101250496)。
酵母粉购自英国0X0ID公司(目录号1023098)，蛋白胨购自英国0X0ID公司(目录号594566)，牛肉膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，玉米粉购自普通超市。
所用的种子培养基(RCM)的组成：每升培养基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g，淀粉10.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH 6.8。培养温度为37℃。
所述发酵培养基如下二种：
CGM培养基的组成为：每升培养基含KH2PO4，0.75g；K2HPO4·3H2O，0.75g；MgSO4·7H2O，0.4g；MnSO4·H2O，0.01g；FeSO4·7H2O，0.01g；NaCl，1.0g；酵母粉，5.0g；(NH4)2SO4，2.0g；葡萄糖，65g。
玉米淀粉培养基的组成为：每100mL水中加入8.0g玉米粉，加热糊化。
实施例1、以CGM培养基液液萃取-连续气提发酵
将C.acetobutylicum SMB-1CGMCC №.2287接种于RCM培养基，于37℃温箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。
将上述获得的发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L CGM培养基的7L发酵罐中进行发酵。控制发酵罐中pH值为5.0(发酵初始不控制pH，当发酵液pH降到5.0之后，通过自动流加4mol/L的NaOH自动控制pH在5.0)，发酵温度为37℃，发酵方式为静止发酵。从发酵开始时计起，发酵24h后，向反应体系中加入0.6L由油醇和癸醇(油醇和癸醇体积比为4：1)混匀组成的有机溶剂(有机溶剂与发酵培养基的体积比为1：5)，同时，通过发酵罐底部的通气管道通入氮气，氮气流速为0.3L/min，连续通气；发酵36h时补加葡萄糖，使其在发酵液中的浓度为65g/L，继续发酵至60h停止。得到的发酵液中下层为水相和上层为有机相。
取2ml有机相发酵液，用气相色谱法检测其中丁醇、丙酮和乙醇的含量。取2ml水相发酵液，用高效液相色谱法测量产物中丁醇、丙酮和乙醇的含量。
气相色谱法：样品前处理方法为：将2ml有机相发酵液8000rpm离心5min，得到2ml上清液，将上清液用0.22μm的有机滤膜过滤后，得到2ml样品，作为色谱检测样品；色谱条件为：岛津GC-2019气相色谱仪，氢焰离子化检测器；程序升温：70℃保留5min，70-130℃升温速度10℃/min，保留5min，130-230℃升温速度20℃/min，保留20min；Agilent DB-WAX30m*0.25mm气相色谱柱；载气为氢气，流速14ml/min；检测温度250℃，进样温度250℃。丁醇标准品购自Sigma公司(目录号：4C006217)；在如上色谱条件下标准品中丁醇的保留时间为11.6分钟，其图谱如图1所示(A表示丁醇，B表示丙酮，C表示乙醇)；有机相发酵液的图谱如图2所示(A表示丁醇，B表示丙酮，C表示乙醇)。
高效液相色谱法：样品前处理方法为：将2ml水相发酵液12000rpm离心1min，得到2ml上清液，将上清液用0.22μm的有机滤膜过滤后，得到2ml样品，作为色谱检测样品；色谱条件为：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad AminexHPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H2SO4，流速0.5ml/min。丁醇标准品购自Sigma公司(目录号：4C006217)；在如上色谱条件下标准品中丁醇的保留时间为40.9分钟，其图谱如图3所示(A表示丁醇，B表示丙酮，C表示乙醇)；发酵液水相的图谱如图4所示(A表示丁醇，B表示丙酮，C表示乙醇)。
根据上述测定结果，换算为发酵液中丁醇浓度：C＝Cw+Co*0.6/3.3(C表示发酵液中丁醇浓度，Cw和Co分别为发酵水相和有机相的丁醇检测浓度；发酵结束时，发酵水相总体积3.3L，有机相体积0.6L)。
实验设3次重复，结果见表1。表1中总溶剂是指丁醇、丙酮和乙醇的和。
实施例2、以CGM培养基液液萃取-间歇气提发酵
发酵种子液的培养与实施例1中所述相同。
将上述获得的发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L CGM培养基的7L发酵罐中进行发酵。控制发酵罐中pH值为4.5(发酵初始不控制pH，当发酵液pH降到4.5之后，通过自动流加4mol/L的NaOH自动控制pH在4.5)，发酵温度为35℃，发酵方式为静止发酵。从发酵开始时计起，发酵12h后，向反应体系中加入0.3L由油醇和癸醇(油醇和癸醇的体积比为1：1)混匀组成的有机溶剂(发酵培养基与有机溶剂的体积比为10：1)，同时，通过发酵罐底部的通气管道通入氮气，通气时间为12小时，氮气流速为0.6L/min，此后每隔24小时通一次氦气，每次通气的时间及气体流速都与上述相同；发酵36h时补加葡萄糖，使其在发酵液中的终浓度为65g/L，继续发酵至60小时停止。得到的发酵液中下层为水相和上层为有机相。
按照实施例1中所述方法检测有机相发酵液和水相发酵液中丁醇、丙酮和乙醇的含量。
实验设3次重复，结果见表1。
实施例3、以玉米淀粉培养基液液萃取-间歇气提发酵
发酵种子液的培养与实施例1中所述相同。
将上述获得的发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L玉米淀粉培养基的7L发酵罐中进行发酵。发酵温度为39℃，发酵方式为静止发酵。从发酵开始时计起，发酵30h后，向反应体系中加入1.5L由油醇和癸醇(油醇和癸醇的体积比为10：1)混匀组成的有机溶剂(发酵培养基与有机溶剂的体积比为2：1)，同时，通过发酵罐底部的通气管道通入氢气，通气时间为1h，氢气流速为1.5L气体/min，此后每隔4小时通一次气，每次通气的时间及气体流速都与上述相同；发酵36h时补加葡萄糖，使其在发酵液中的终浓度为65g/L，继续发酵至60h停止。得到的发酵液中下层为水相和上层为有机相。
按照实施例1中所述方法检测有机相发酵液和水相发酵液中丁醇、丙酮和乙醇的含量。
实验设3次重复，结果见表1。
实施例4、以玉米淀粉培养基传统丁醇发酵
将C.acetobutylicum SMB-1用RCM培养基于37℃温箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。
将上述获得的发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L玉米淀粉培养基的7L发酵罐中进行发酵。不控制pH，发酵温度为37℃，发酵方式为静止发酵。发酵36h时补加葡萄糖，使其在发酵液中的终浓度为65g/L，继续发酵至60h停止。利用高效液相色谱法对发酵液取样测量产物丁醇、丙酮和乙醇的含量。
高效液相色谱法检测方法同实施例1中所述一致。
实验设3次重复，结果见表1。
表1、萃取气提耦合发酵丁醇结果
| 发酵工艺 | 丁醇(g/L发酵液) | 丙酮(g/L发酵液) | 乙醇(g/L发酵液) | 总溶剂(g/L发酵液) | 丁醇在总溶剂中的比例(％) |
| 传统丁醇发酵(实施例4) | 12.3 | 3.9 | 1.3 | 17.5 | 70.3 |
| 实施例1 | 24.9 | 5.7 | 2.5 | 33.1 | 75.2 |
| 实施例2 | 23.7 | 5.3 | 2.3 | 31.3 | 75.7 |
| 实施例3 | 24.1 | 5.5 | 2.5 | 32.1 | 75.1 |
| 提高 | 11.93 | 1.6 | 1.13 | 14.67 | 5.0 |
结果表明，本发明的加入萃取剂和通入惰性气体的发酵工艺中，每升发酵液中得到的丁醇产量比传统发酵工艺高11.93g，而且丁醇在所有产物(丁醇、丙酮和乙醇)中的比例也提高了5.0％。
Claims (5)
1.一种生产丁醇的方法，包括用发酵培养基发酵丁醇产生菌得到丁醇的步骤，其特征在于：所述方法中包括从发酵产物中萃取丁醇的步骤；
所述萃取丁醇的步骤包括向所述发酵的反应体系中加入丁醇萃取剂和向所述发酵的反应体系中通入惰性气体的步骤；
向所述发酵的反应体系中加入丁醇萃取剂的方法为自所述发酵开始时计起第12-30小时加入；向所述发酵的反应体系中通入惰性气体的方法为自所述发酵开始时计起第12-30小时加入；
所述丁醇萃取剂与所述发酵培养基的体积比为1∶2-1∶10；
所述丁醇萃取剂为油醇和癸醇以1∶1-10∶1的体积比组成的混合物；
所述通入惰性气体的方式为间歇通入或连续通入；
所述间歇通入的方式为每隔2-24小时通入一次，每次通入的时间为1-12小时，每次通入的速度为0.1-1.5L气体/min；所述连续通入的方式为以0.1-1.5L气体/min的速度连续通入；
所述惰性气体为氮气、氢气、氦气或二氧化碳气体；所述丁醇产生菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：向所述发酵的反应体系中加入丁醇萃取剂的方法为自所述发酵开始时计起第24小时加入；向所述发酵的反应体系中通入惰性气体的方法为自所述发酵开始时计起第24小时加入。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述丁醇萃取剂与所述发酵培养基的体积比为1∶5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述丁醇萃取剂为油醇和癸醇以4∶1的体积比组成的混合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述间歇通入的方式为：每隔12h通入一次，每次通入的时间为1h，每次通入的速度为0.6L气体/min；
所述连续通入的方式为：以0.3L气体/min的速度连续通入。
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