CN1182249C - 外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，属于1，3-丙二醇的生物合成技术领域，其特征在于，它利用1，3-丙二醇生物合成过程中需要消耗一定量还原当量的特性，在发酵培养基或在厌氧发酵过程中添加适量的还原剂，增强菌体中还原当量(NADH2)的积累，促进底物甘油沿还原途径代谢，提高1，3-PD的合成浓度和转化率。本发明操作简单，不增加额外的设备和人工，仅通过较低的附加投入，提高了生物利用率，获得了较高的产物合成浓度和转化率，降低了发酵成本。
Description
技术领域：
外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，属于1，3-丙二醇的生物合成技术领域。
背景技术：
1，3-丙二醇(英文名1，3-propanediol，简称1，3-PD)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业。
1，3-PD的生产技术难度大、成本高，目前，工业上主要采用化学合成法和生物合成法来进行1，3-丙二醇的生产。化学合成法具有污染环境、原料不可再生等缺点，因此，各国都致力于开发生物合成法生产1，3-PD的技术。1，3-丙二醇的生物合成法是一种具有广阔应用前景的方法，它可以利用再生资源甘油、葡萄糖等，选择性高，操作条件温和，生产清洁，对环境无污染，符合21世纪可持续发展的需要，因而越来越受到重视，生物合成法生产1，3-PD已成为当前研究的热点。
生物合成法生产1，3-PD主要以甘油为底物，转化1，3-PD所需的微生物主要是厌氧或兼性厌氧菌，其中，克来伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae L1)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)和丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)是转化率较高的三种菌，它们对底物甘油和产物1，3-丙二醇具有较高的耐受力，因此具有较高开发价值和应用前景。这些菌株转化甘油的共同特点是歧化作用的酶系是由结构类似的调节子调控，由于该调节子受二羟基丙酮(DHA)诱导，因此称为dha调节子。通过二羟丙酮(dha)途径，甘油沿氧化和还原两条路径代谢，以维持细胞的氧化还原平衡。氧化途径主要包括步骤：1)甘油经甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，GDH)催化，生成2-羟基丙酮(DHA)，此酶为厌氧酶，以NAD+为辅酶；2)DHA在ATP及2-羟基丙酮激酶(Dihydroxyacetone kinase)的作用下，生成磷酸二羟基丙酮(DHAP)；3)DHAP进一步代谢生成丙酮酸，然后代谢成各种小分子产物。氧化途径合成生物能ATP和还原当量NADH2，并伴随着微生物细胞的生长。甘油的还原途径有两步酶反应：1)甘油脱水酶(Glycerol dehydrogenase，GDHt)在辅酶B12存在下将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)；2)在NADH2存在下，3-HPA在1，3-丙二醇脱氢酶(1，3-Propanedioldehydrogenase，PDDH)催化下生成1，3-PD。还原途径消耗氧化途径生成的过量NADH2，使微生物细胞内的还原物质达到平衡。
目前生物合成法生产1，3-PD存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低等问题，导致缺乏市场竞争力而无法大规模应用。其中，甘油转化率较低是导致其生产成本居高不下的一个重要因素。目前解决甘油转化率低的问题主要是采用双底物协同发酵方法，例如以葡萄糖为辅助碳源，菌体以葡萄糖为生长碳源用于能量合和细胞生长，同时转化甘油生成1，3-PD，可以使1，3-PD的转化率大大提高。Sylvie等人通过调节混合培养基中葡萄糖/甘油的比例来研究底物还原性程度，发现确实对1，3-丙二醇合成有影响，而且以葡萄糖作辅助底物可以提高甘油的转化率。以葡萄糖、乳糖等第二碳源与甘油配成复合底物虽然在不同程度上提高了甘油的转化率，但是由于葡萄糖、乳糖等目前常用复合底物的还原态均低于甘油，所以用其来提高培养基合成NADH2的能力是要以大量消耗底物为代价的。
经过甘油沿氧化和还原两条路径代谢的研究表明，提供给还原途径的还原当量(NADH2)越多，1，3-PD合成也越多。在目前的文献中，对1，3-丙二醇生物转化过程的代谢途径研究方面的文献较多，但将代谢网络分析应用于实际工艺研究的报导尚未见到。
发明内容：
本发明利用1，3-丙二醇生物合成过程中需要消耗一定量还原当量(1mol NADH2/mol1，3-PD)的特性，在发酵培养基或在厌氧发酵过程中添加适量的还原剂，增强菌体中还原当量(NADH2)的积累，促进底物甘油沿还原途径代谢，提高1，3-PD的合成浓度和转化率。本发明操作简单，不增加额外的设备和人工，仅通过较低的附加投入，提高了生物利用率，从而获得了较高的产物合成浓度和转化率，降低了发酵成本。
本发明含有制备用于培养克氏肺炎杆菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入克氏肺炎杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在所述发酵培养基中加入浓度为40mg/L～150mg/L的Vitamin C还原剂。
本发明的另一种方案是，含有制备用于培养克氏肺炎杆菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入克氏肺炎杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加Vitamin C还原剂，所述Vitamin C还原剂在发酵液中的浓度为40mg/L～150mg/L。
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本发明的另一种方案是，含有制备用于培养克氏肺炎杆菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入克氏肺炎杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加Vitamin E还原剂，所述Vitamin E还原剂在发酵液中的浓度为10mg/L～60mg/L。
实验证明，使用本发明提出的外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，能够大大提高1，3-丙二醇的最终浓度，提高产物转化率，降低发酵成本，达到了预期目的。
具体实施方式：
实施例1是以Vitamin C作为还原剂
菌种：克来伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)
培养基
LB固体培养基：每升体积培养基含酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH7.0。
种子培养基：每升体积培养基含葡萄糖20g，K2HPO4.3H2O 4.45g，KH2PO4 1.3g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，CaCO3 2.0g，酵母粉1.0g，微量元素溶液I 2.0ml，Fe2+溶液1.0ml，pH7.0。
发酵培养基：每升体积培养基含甘油20g，K2HPO4.3H2O 4.45g，KH2PO4 1.3g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4.7H2O 0.2g，CaCO3 2.0g，酵母粉1.0g，微量元素溶液I 5.0ml，Fe2+溶液1.0ml，pH7.0。灭菌后添加还原剂Vitamin C，使Vitamin C在发酵培养基中的浓度为40mg/L。
其中，微量元素I的组成(mg/L)：MgSO4.4H2O 100，ZnCl2 70，Na2MoO4.2H2O35，H3BO3 60，CoCl2.6H2O 200，CuSO4.5H2O 29.28，NiCl2.6H2O 25，37％HC10.9ml
发酵过程：
步骤1：菌种活化
由菌种保藏斜面挑取一环Klebsiella pneumoniae L1菌苔接入LB固体斜面进行活化，37℃培养12小时后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，37℃培养12小时后获得单菌落。
步骤2：种子培养
种子培养在300mL三角瓶中进行，装液量为50mL。从步骤1的LB平板上挑取一个单菌落于预先灭菌的装有50mL培养基的300mL三角瓶中，37℃，180rpm转速，摇床培养10h，使菌体浓度达到OD650在2～4左右。
步骤3：厌氧发酵合成1，3-丙二醇
取2.5mL种子发酵液于预先灭菌的装有50mL发酵培养基的150mL厌氧摇瓶中(接种量5％)，37℃，150rpm转速，通入N2，水浴摇床培养。中间每隔8～12h取样3mL，测菌体浓度、底物甘油浓度及1，3-丙二醇合成浓度。厌氧培养24h后补加2％甘油。
实验结果
本发酵周期的时间为50小时，最终测得产物1，3-丙二醇的浓度为10.2mg/L。比不加入还原剂的对照组提高了2％。
下述5组实验仅改变了发酵培养基中Vitamin C的浓度，其它条件不变，实验结束后最终得到表1中的6组数据，其中对照组是指在同等条件下，不加还原剂得到的结果。
| 方案 | 对照组 | 添加40mg/LVC | 添加60mg/LVC | 添加80mg/LVC | 添加100mg/LVC | 添加120mg/LVC | 添加150mg/LVC12 |
| 1，3-丙二醇浓度(g/L) | 10 | 10.2 | 11 | 11.5 | 11.7 | 11.8 | |
| 提高程度 | / | 2％ | 10％ | 15％ | 17％ | 18％ | 20％ |
表1
从表1中可看出，在发酵培养基中，当发酵培养基中Vitamin C的浓度为40～150mg/L时，能够使1，3-PD的最终浓度提高2％～20％。
实施例2是在发酵过程中菌体生长的指数期初期(约5小时，OD6500.5)加入VC还原剂，在发酵培养基中不加还原剂，其它条件不变；
实施例3是在发酵过程中菌体生长的指数期中后期(10-20小时，OD6501.5-2.0)加入VC还原剂，在发酵培养基中不加还原剂，其它条件不变；
实验结束后得到表2中的以下数据
| 方案 | 对照 | 添加40mg/LVC | 添加60mg/LVC | 添加80mg/LVC | 添加100mg/LVC | 添加120mg/LVC | 添加150mg/L VC | ||||||
| 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | ||
| 1，3-丙二醇浓度(g/L) | 10.0 | 10.2 | 10.3 | 11.0 | 11.5 | 11.8 | 12.0 | 12.0 | 12.2 | 12.2 | 12.5 | 12.3 | 12.5 |
| 提高程度 | / | 2％ | 3％ | 10％ | 15％ | 18％ | 20％ | 20％ | 22％ | 22％ | 25％ | 23％ | 25％ |
表2
从表2可看出，在菌体生长指数期的初期或中后期加入VC还原剂使，VC在发酵液中的浓度为40～150mg/L时，最终使1，3-丙二醇的浓度提高2％～25％。
实施例4是在发酵培养基中添加Vitamin E
由于Vitamin E(以下简称VE)是脂溶性液体，难溶于水，所以本发明将VE溶解在二甲基亚砜中(二甲基亚砜是VE的溶剂之一，也可以选择其它的溶剂如丙二醇、氮酮等)，形成1％(v/v)的溶液。取适量加入到灭好菌的发酵培养基中，使VE在培养基中的浓度为10mg/L，其余步骤与上述实施例的相同。实验结果，测得1，3-丙二醇的最终浓度为10.85g/L，比对照组增加了8.5％。
以下5组实验仅改变了VE在发酵培养基中的浓度，其余条件不变，最后得到表3中的数据：
| 方案 | 对照 | 添加10mg/L VE | 添加20mg/L VE | 添加40mg/L VE | 添加60mg/L VE |
| 1，3-丙二醇浓度(g/L) | 10 | 10.85 | 11.25 | 11.03 | 10.77 |
| 提高程度 | / | 8.50％ | 12.50％ | 10.30％ | 7.70％ |
表3
从表3中可看出，在发酵培养基中加入VE还原剂，使VE在发酵培养基中的浓度为10～60mg/L时，1，3-丙二醇的最终浓度可提高7.7～12.5％。
实施例5是在发酵过程中菌体生长的指数期初期(约5小时，OD6500.5)加入VE溶液，在发酵培养基中不加还原剂，其它条件不变；
实施例6是在发酵过程中菌体生长的指数期中后期(10-20小时，OD6501.5-2.0)加入VE溶液，在发酵培养基中不加还原剂，其它条件不变；
实验结束后得到表4的数据：
| 方案 | 对照 | 添加10mg/L VE | 添加20mg/L VE | 添加40mg/L VE | 添加60mg/L VE | ||||
| 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | 指数期初期 | 指数期中后期 | ||
| 1，3-丙二醇浓度(g/L) | 10.0 | 10.87 | 10.9 | 11.02 | 11.1 | 11.05 | 11.12 | 10.72 | 10.75 |
| 提高程度 | / | 8.70％ | 9％ | 10.20％ | 11％ | 10.50％ | 11.20％ | 7.20％ | 7.50％ |
表4
从表4可见，在菌体生长的指数期(初期或中后期)加入VE还原剂，使VE在发酵液中的浓度达到10～60mg/L时，能使1，3-丙二醇的最终浓度提高7.2％～11.2％。
本发明所加入的还原剂还可以是如：VA、β-胡萝卜素、还原型谷胱苷肽、腺苷蛋氨酸、二丁基羟基甲苯(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)等多种常用的还原剂。
Claims (4)
1、外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，含有制备用于培养克氏肺炎杆菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入克氏肺炎杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在所述发酵培养基中加入浓度为40mg/L～150mg/L的Vitamin C还原剂。
2、外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，含有制备用于培养克氏肺炎杆菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入克氏肺炎杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加Vitamin C还原剂，所述Vitamin C还原剂在发酵液中的浓度为40mg/L～150mg/L。
3、外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，含有制备用于培养克氏肺炎杆菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入克氏肺炎杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在所述发酵培养基中加入浓度为10mg/L～60mg/L的Vitamin E还原剂。
4、外源添加还原剂促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，含有制备用于培养克氏肺炎杆菌的发酵培养基，并往上述发酵培养基中接入克氏肺炎杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加Vitamin E还原剂，所述Vitamin E还原剂在发酵液中的浓度为10mg/L～60mg/L。
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