CN110004202B - 一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法，将乳酸菌和己酸菌混合后按体积比10％的接种量接种到新鲜含碳水化合物的待发酵底物中进行厌氧培养，即得到含己酸的发酵液；所述乳酸菌的群落总数为1.0×109cfu/ml，所述己酸菌的群落总数为1.5×109cfu/ml；所述乳酸菌和己酸菌按体积比1:1000～100000进行混合，本发明中微生物合成己酸的底物范围广，可以降低生物质合成己酸的生产成本，工艺简单可行，适于工业化生产。

Description

一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及微生物合成己酸方法上的改进。
背景技术
己酸作为一种中链脂肪酸，是一种重要的化工原料，广泛应用于食品香料、酿酒、医药化工和生物燃料等领域。
己酸的生产方法可分为化学合成、天然产物中提取和微生物催化合成三种。比较起来，微生物催化合成己酸，是采用可再生资源(如，蔗糖、乙醇和乳酸等)作为原料，其产品(己酸)也不存在应用领域的限制，生产过程也不受原料来源等地域限制，因而具有更好的工业化潜力。
中链脂肪酸(C6～C8)的生物合成是一个碳链延长过程，主要是微生物通过β氧化的逆循环途径，对短链脂肪酸(如乙酸和丁酸)进行碳链延长，合成6～8个碳的中链脂肪酸。这一途径的代表菌株为克氏梭菌(Clostridium klyuveri)，主要以乙醇为能源底物先合成4个碳的丁酸，进一步再合成6个碳的己酸。目前该菌合成己酸的最高产量为12.8g/L,但由于该菌生长缓慢、培养困难，限制了其进一步的工业化应用；其次，我们最近的研究发现窖泥微生物可以利用乳酸合成己酸，并且分离到具有这一代谢途径的纯菌株，即“乳酸型”产己酸菌，其利用乳酸合成己酸的浓度可达到16.6～19g/L(CN201710092267.1和ZL201511025819.4)，具有较高的工业化潜力。但是，当微生物利用乙醇或乳酸作为底物合成己酸时，由于乙醇和乳酸是完全溶于水，二者的提纯成本较高，会间接提高合成己酸的生产成本。自然界中也有少数微生物(如，巨球菌Megasphaera elsdenii和Clostridiumsp.BS-1)，可以直接通过葡萄糖、果糖或半乳糖醇发酵合成己酸，但是具体代谢途径不清楚，过程控制较困难，且己酸积累浓度不高(7.0～10.9g/L)；此外，在最近公开的一份专利中(CN107363076A)，我们公开了一种有机废弃物资源化处理的方法，所述方法包括利用乳酸菌将废弃有机质(如，剩余污泥、餐厨果蔬垃圾、畜禽粪便、秸秆、食品发酵废水等)分解产生乳酸，然后调节pH 5.5～6.5，然后通过连续工艺加入长期驯化的微生物反应器中，利用合成链脂肪酸的微生物菌群将其中的乳酸转化为己酸。该工艺减少了乳酸的提取过程，可有效降低合成己酸的生产成本。该工艺为两段式偶联工艺，即第一阶段的乳酸发酵采用批次发酵，第二阶段己酸合成采用连续发酵，中间需要调节pH，且发酵周期相对较长。如何在一个反应器实现廉价有机质(如，糖蜜)直接转化为己酸是本申请专利要解决的问题。
糖蜜是制糖工业的副产品，其中主要含有大量可发酵蔗糖，是制糖业的主要副产品之一。糖蜜价格低廉(250～300元/吨)，年产量350万吨(2018)，主要用于乙醇发酵。由于环保成本高，糖蜜酒精厂开工率低，生产积极性普遍不高。而己酸市场价格为乙醇的5～10倍，且较乙醇溶解度低，提取成本大大低于乙醇，可大幅降低运行成本，提高收益，是有望替代乙醇发酵的新工艺。
本发明所述微生物合成己酸的方法是通过乳酸菌与“乳酸型”产己酸菌的共培养，直接从糖蜜、葡萄糖和蔗糖等富含碳水化合物的廉价生物质原料合成高附加值的己酸，具有较大的发展潜力和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法。本发明所涉及的方法是以糖类(如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等)或含富上述糖类的廉价生物质或废弃物为底物，通过乳酸菌与“乳酸型”产己酸菌的共培养与代谢途径偶联，合成高附加值的己酸。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：
一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法，将乳酸菌和己酸菌混合后按体积比10％的接种量接种到新鲜含碳水化合物的待发酵底物中进行厌氧培养，即得到含己酸的发酵液；
所述乳酸菌的群落总数为1.0×109cfu/ml，所述己酸菌的群落总数为1.5×109cfu/ml；所述乳酸菌和己酸菌按体积比1:1000～100000进行混合。
优选的，所述乳酸菌为乳酸菌种子液，所述乳酸菌种子液为将乳酸菌菌种接种到MRS培养基中，30～37℃培养至获得OD600为1.0～1.2的种子液。
优选的，所述己酸菌为己酸菌种子液，己酸菌种子液为将己酸菌菌种接种到含有CM液体培养基的厌氧发酵瓶中，30～35℃培养至获得OD600为1.2～1.5的种子液。
优选的，所述乳酸菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、耐酸乳酸杆菌及乳酸片球菌中的至少一种。
优选的，所述己酸菌指能够利用乳酸为底物合成己酸的细菌。
优选的，所述己酸菌为瘤胃梭菌Clostridium sp.CPC-11和Clostridium sp.CPB6中的至少一种。
优选的，所述乳酸菌和己酸菌按体积比1:100000进行混合。
优选的，所述含碳水化合物的待发酵底物中含有碳酸钙。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明中通过乳酸菌和己酸菌共培养的方法从葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和糖蜜等富含碳水化合物的廉价生物质原料中合成己酸，大大拓宽了用于生物合成己酸的底物范围。
2.本发明中通过乳酸菌和己酸菌共培养的方法可实现在一个反应器里将富含碳水化合物的底物合成己酸，不需要提取中间产物乳酸，可减少两段式发酵中间调节pH的工艺环节；同时，本发明还可以降低乳酸提纯的成本，从而降低生物质合成己酸的生产成本，工艺简单可行，适于工业化生产。
3.本发明中通过乳酸菌和己酸菌共培养的方法从可再生生物质合成己酸，其终产物(己酸)及其衍生酯类(如己酸乙酯)不受应用领域的限制，既可以作为食品添加剂，直接用于食品、酿酒和医药等要求标准较高的领域；也可以作为进一步合成生物柴的油前体原料，用于生物能源等一般领域。
4.本发明中通过乳酸菌和己酸菌共培养的方法，微生物以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和糖蜜等富含碳水化合物的底物合成的己酸浓度高。
具体实施方式
实施例1
乳酸菌和己酸菌的培养
乳酸菌的培养
将同型发酵类乳酸菌接种到MRS培养基中，30～37℃培养3小时，获得OD600为1.0～1.2的种子液。其中同型发酵类乳酸菌指利用葡萄糖经过糖酵解(EMP)发酵，只生成乳酸这一种代谢产物的乳酸菌。
其中，MRS培养基为：牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6。
乳酸菌种子液：将乳酸菌以体积比为1％的接种量接种到新鲜的MRS培养基中，30～37℃培养3小时，获得OD600为1.0～1.2的种子液。接种过程中，接种液中乳酸菌群落总数为：1.0×109cfu/ml。
己酸菌的培养
将“乳酸型”产己酸菌按体积比5％接种到含有液体培养基CM的厌氧发酵瓶中，30～35℃厌氧培养24小时，得到OD600为1.2～1.5的种子悬液。其中，“乳酸型”产己酸菌指利用乳酸合成己酸的微生物，以此区别其他的产己酸菌；接种过程中，“乳酸型”产己酸菌的接种群落总数为1.5×109cfu/ml。
CM培养基为：酪蛋白胨10g，酵母粉3g,碳酸氢钠4g,半胱氨酸0.5g,磷酸氢二钾0.45g,磷酸二氢钾0.45g,氯化钠1.0g,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1g,氯化钙0.1g,氯化血红素1.0mg,乳酸钠5.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液10ml，用蒸馏水将培养基定容至1000ml。其中：
微量元素溶液(L)：FeCl2.4H2O 1.5g；CoCl2.6H2O 0.19g；MnCl2.4H2O 0.1g；ZnCl20.07g；NaMO4.2H2O 0.036g；NiCl2.6H2O 0.024g；H3BO3 0.006g；CuCl2.2H2O 0.002g；HCl(25％solution)10ml。
维生素溶液(L)：p-氨基苯甲酸0.04g；生物素0.01g；烟酸0.1g；B5 0.05g；B60.15g；B1 0.1g；B12 0.05g；D.L-硫辛酸0.03g；B2 0.03g；叶酸0.01g。
本实施例中，所述乳酸菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、耐酸乳酸杆菌及乳酸片球菌中的至少一种。所述己酸菌为Clostridium sp.CPC-11和Clostridium sp.CPB6中至少一种。其中，Clostridium sp.CPC-11在专利：利用乳酸产己酸的瘤胃梭菌及其用途(201511025819.4)中公开；Clostridium sp.CPB6在专利：一株瘤胃菌及其应用(201710092267.1)中公开。
下述实施例中均是利用乳酸菌和己酸菌共培养合成己酸。在共培养体系中，乳酸菌首先利用糖类发酵产生乳酸，然后己酸菌利用乳酸菌的代谢产物-乳酸合成己酸。
实施例2
利用乳酸菌与己酸菌共培养发酵葡萄糖生产己酸。
将实施例1中获得的两种种子悬浮液分别按植物乳杆菌：己酸菌＝1:1000、植物乳杆菌：己酸菌＝1:10000及植物乳杆菌：己酸菌＝1:100000的比例进行混合，其中，植物乳杆菌为Lactobacillus plantarum，DSM-20174；己酸菌为Clostridium sp.CPB6。然后将混合液以体积比10％的接种量接入新鲜GYP发酵培养液中，在厌氧发酵罐中30～35℃厌氧培养5～7天，得到含己酸的发酵液，发酵液中己酸的浓度分别为15.3g/L、15.5g/L及16.9g/L。该己酸发酵液经蒸馏、精馏等提取工艺获得高纯度食品级己酸。
其中，葡萄糖发酵培养液(GYP)为：葡萄糖70g,酵母粉3.0g，蛋白胨10g,乙酸钠3.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.1g,碳酸氢钠2.0g,L-半胱氨酸0.5g，乳酸钠5.0ml，碳酸钙30g，微量元素溶液(同实例1)1ml，维生素溶液(同实例1)10ml,用蒸馏水将培养液定容至1000mL，pH值6.5。
本实施例中，植物乳杆菌和己酸菌共培养，植物乳杆菌首先利用葡萄糖为底物，发酵产生乳酸，然后己酸菌以乳酸为底物进一步合成己酸。此过程中，不需要提取中间产物乳酸，可减少两段式发酵中间调节pH的工艺环节以及乳酸提纯的成本，降低生物合成乳酸的生产成本，工艺过程简单可行。
本实施例中，植物乳杆菌反应过程中不断产生乳酸，从而使培养液中的PH逐渐降低，培养液中pH降低到一定值时可能会导致反应停滞。本实施例中，GYP发酵培养液中加入碳酸钙，碳酸钙沉淀在液体培养基底部，碳酸钙中的碳酸根离子会缓慢与乳酸反应，中和培养基中的pH，促进反应正向进行，且此过程不会产生有毒有害物质，不会对含己酸的发酵液产生影响。
实施例3
利用乳酸菌与己酸菌共培养发酵蔗糖生产己酸。
将实施例1中获得的两种种子悬浮液分别按植物乳杆菌：己酸菌＝1:1000、植物乳杆菌：己酸菌＝1:10000及植物乳杆菌：己酸菌＝1:100000的比例进行混合，其中，植物乳杆菌为Lactobacillus plantarum，DSM-20174；己酸菌为Clostridium sp.CPB6。然后将混合液以体积比10％的接种量接入新鲜SYP发酵培养液中，在厌氧发酵罐中30～35℃厌氧培养5～7天，得到含己酸的发酵液，发酵液中己酸的浓度分别为13.9g/L、14.3g/L及15.3g/L。该己酸发酵液经蒸馏、精馏等提取工艺获得高纯度食品级己酸。
其中，蔗糖发酵培养液(SYP)为：蔗糖66g,酵母粉3.0g，蛋白胨10g,乙酸钠3.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.1g,碳酸氢钠2.0g,L-半胱氨酸0.5g，乳酸钠5.0ml，碳酸钙30g，微量元素溶液(同实例1)1ml，维生素溶液(同实例1)10ml,用蒸馏水将培养液定容至1000mL，pH值6.5。
本实施例中，植物乳杆菌和己酸菌共培养，植物乳杆菌首先利用蔗糖为底物，发酵产生乳酸，然后己酸菌以乳酸为底物进一步合成己酸。此过程中，不需要提取中间产物乳酸，可减少两段式发酵中间调节pH的工艺环节以及乳酸提纯的成本，降低生物合成乳酸的生产成本，工艺过程简单可行。
本实施例中，植物乳杆菌反应过程中不断产生乳酸，从而使培养液中的pH逐渐降低，培养液中pH降低到一定值时可能会导致反应停滞。本实施例中，SYP发酵培养液中加入碳酸钙，碳酸钙沉淀在液体培养基底部，碳酸钙会缓慢与乳酸反应，中和培养基中的pH，促进反应正向进行，且此过程不会产生有毒有害物质，不会对含己酸的发酵液产生影响。
实施例4
利用乳酸菌与己酸菌共培养发酵糖蜜生产己酸。
将实施例1中获得的两种种子悬浮液分别按植物乳杆菌：己酸菌＝1:1000、植物乳杆菌：己酸菌＝1:10000及植物乳杆菌：己酸菌＝1:100000的比例进行混合，其中，植物乳杆菌为Lactobacillus plantarum，DSM-20174；己酸菌为Clostridium sp.CPB6。然后将混合液以体积比10％的接种量接入新鲜MYP发酵培养液中，在厌氧发酵罐中30～35℃厌氧培养5～7天，得到含己酸的发酵液，发酵液中己酸的浓度分别为14.1g/L、14.6g/L及15.7g/L。该己酸发酵液经蒸馏、精馏等提取工艺获得高纯度食品级己酸。
其中，糖蜜发酵培养液(MYP)为：糖蜜100g,酵母粉3.0g，蛋白胨10g,乙酸钠3.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.1g,碳酸氢钠2.0g,L-半胱氨酸0.5g，乳酸钠5.0ml，碳酸钙30g，微量元素溶液(同实例1)1ml，维生素溶液(同实例1)10ml,用蒸馏水将培养液定容至1000mL，pH值6.5。
本实施例中，植物乳杆菌和己酸菌共培养，植物乳杆菌首先利用糖蜜为底物，发酵产生乳酸，然后己酸菌以乳酸为底物进一步合成己酸。此过程中，不需要提取中间产物乳酸，可减少两段式发酵中间调节pH的工艺环节以及乳酸提纯的成本，降低生物合成乳酸的生产成本，工艺过程简单可行。
本实施例中，植物乳杆菌反应过程中不断产生乳酸，从而使培养液中的pH逐渐降低，培养液中pH降低到一定值时可能会导致反应停滞。本实施例中，MYP发酵培养液中加入碳酸钙，碳酸钙沉淀在液体培养基底部，碳酸钙会缓慢与乳酸反应，中和培养基中的pH，促进反应正向进行，且此过程不会产生有毒有害物质，不会对含己酸的发酵液产生影响。
实施例5
利用乳酸菌与己酸菌共培养发酵麦芽糖生产己酸。
将实施例1中获得的两种种子悬浮液分别按植物乳杆菌：己酸菌＝1:1000、植物乳杆菌：己酸菌＝1:10000及植物乳杆菌：己酸菌＝1:100000的比例进行混合，其中，植物乳杆菌为Lactobacillus plantarum，DSM-20174；己酸菌为Clostridium sp.CPB6。然后将混合液以体积比10％的接种量接入新鲜MSYP发酵培养液中，在厌氧发酵罐中30～35℃厌氧培养5～7天，得到含己酸的发酵液，发酵液中己酸的浓度分别为15.1g/L、15.5g/L及16.0g/L。该己酸发酵液经蒸馏、精馏等提取工艺获得高纯度食品级己酸。
其中，麦芽糖发酵培养液(MSYP)为：麦芽糖70g,酵母粉3.0g，蛋白胨10g,乙酸钠3.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.1g,碳酸氢钠2.0g,L-半胱氨酸0.5g，乳酸钠5.0ml，碳酸钙30g，微量元素溶液(同实例1)1ml，维生素溶液(同实例1)10ml,用蒸馏水将培养液定容至1000mL，pH值6.5。
本实施例中，植物乳杆菌和己酸菌共培养，植物乳杆菌首先利用麦芽糖为底物，发酵产生乳酸，然后己酸菌以乳酸为底物进一步合成己酸。此过程中，不需要提取中间产物乳酸，可减少两段式发酵中间调节pH的工艺环节以及乳酸提纯的成本，降低生物合成乳酸的生产成本，工艺过程简单可行。
本实施例中，植物乳杆菌反应过程中不断产生乳酸，从而使培养液中的pH逐渐降低，培养液中pH降低到一定值时可能会导致反应停滞。本实施例中，MSYP发酵培养液中加入碳酸钙，碳酸钙沉淀在液体培养基底部，碳酸钙会缓慢与乳酸反应，中和培养基中的pH，促进反应正向进行，且此过程不会产生有毒有害物质，不会对含己酸的发酵液产生影响。
本发明的一种通过乳酸菌与己酸菌共培养催化糖类物质合成己酸的方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料(如果糖、淀粉等碳水化合物及富含上述糖类的废弃有机物等)、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims (4)

1.一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法，其特征在于：将乳酸菌和己酸菌混合后按体积比10%的接种量接种到新鲜含碳水化合物的待发酵底物中进行厌氧培养，即得到含己酸的发酵液；
所述乳酸菌的群落总数为1.0×109cfu/ml，所述己酸菌的群落总数为1.5×109cfu/ml；所述乳酸菌和己酸菌按体积比1:1000～100000进行混合；所述乳酸菌为植物乳杆菌；所述己酸菌为瘤胃梭菌Clostridium sp.CPC-11和Clostridium sp.CPB6中的至少一种；
所述含碳水化合物的待发酵底物中含有碳酸钙。
2.根据权利要求1所述的一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法，其特征在于：所述乳酸菌为乳酸菌种子液，所述乳酸菌种子液为将乳酸菌菌种接种到MRS培养基中，30～37℃培养至获得OD600为1.0～1.2的种子液。
3.根据权利要求1所述的一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法，其特征在于：所述己酸菌为己酸菌种子液，己酸菌种子液为将己酸菌菌种接种到含有CM液体培养基的厌氧发酵瓶中，30～35℃培养至获得OD600为1.2～1.5的种子液。
4.根据权利要求1所述的一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法，其特征在于：所述乳酸菌和己酸菌按体积比1:100000进行混合。
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Optimization of Caproic Acid Production from Clostridium kluyveri H588 and its Application in Chinese Luzhou-flavor Liquor Brewing;Shoubao Yan 等;《Advance Journal of Food Science and Technology》;20150315;第7卷(第8期);第614-626页 *
基于新老窖泥的微生物菌群结构判定浓香型白酒生产中的主体己酸菌;任聪 等;《食品与发酵工业》;20190227;第44卷(第12期);第8-14页 *

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