CN101487029B - 一种微生物催化生产正丁酸的方法和装置 - Google Patents
一种微生物催化生产正丁酸的方法和装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种微生物催化生产正丁酸的方法及其装置。该方法包括制备微生物悬浮液、微生物细胞固定化、固定化的梭菌催化生产正丁酸以及正丁酸的在线分离和提取步骤，该微生物催化生产正丁酸的装置包括发酵罐、固定化反应器、萃取装置和反萃取装置。本发明有效缓解了终产物的抑制效应，提高了在线萃取效率，降低了萃取剂对微生物的毒性，实现了丁酸的连续生产，使微生物催化生产丁酸向工业化方向发展。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程与发酵技术领域，具体涉及一种微生物催化生产正丁酸的方法及装置。
背景技术
正丁酸(CH3CH2CH2COOH，butyrate，以下简称丁酸)在工业上有着多种用途，作为化工原料，用于制造丁酸纤维素、合成丁酸酯；在食品行业，可直接添加在乳制品中以提高奶油风味，其酯类也在食品和香水中作为香料广泛使用。同时，丁酸作为短链脂肪酸(short-chainfatty acid，SCFA)是人和其它单胃动物肠上皮细胞的优选能量来源，可以抑制肠炎发生，能维持和促进恢复肠道的正常功能(Gibson，et al.Carcinogenesis 1999，20：539-544；Hijova，et al.Bratisl Lek Listy，2007，108(8)：354-358；Hamer，et al.AlimentaryPharmacology & Therapeutics.2008，27(2)：104-119)。近年来研究还表明，丁酸是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)的抑制剂，能诱导肿瘤细胞的分化和凋亡，而具有抗癌作用(Davie.Journal of Nutrition，2003，133(Suppl.7)：2485S-2493S)。因此，丁酸在胃肠炎、癌症、白血病等治疗方面具有很好的应用潜力。目前已有多个丁酸的前体药物被合成和研究，以解决丁酸在体内因代谢过快导致的效果偏低的问题(Entin-Meer，et al.Molecular Cancer Therapeutics，2005，4(12)：1952-1961；Brioschi，et al.Molecules.2008，13(2)：230-254；Rephaeli，et al.Drug Development Research，2000，50：379-391)。此外，还有研究报道，丁酸对土传病原真菌和线虫具有较强的抑制或杀灭作用，有可能成为合成土壤熏蒸剂的替代品(Browning，et al.Soil Biology and Biochemistry，2006，38(2)：401-404)。
丁酸的生产可分为化学合成和微生物催化。化学合成主要有正丁醛氧化法、丙烯羰基化法，前者工艺简单、成本低，已成为目前主要生产方法。这种基于石油的化学合成方法，众所周知的能源危机将予之带来挑战。而随着丁酸及其衍生物在生物相关领域功用的不断发现和实际应用，消费者又日趋青睐生物源制品，微生物催化生产的丁酸产品的价值将会不断增加，并高于化学合成的丁酸产品。因此，微生物催化生产丁酸具有较大的发展潜力。
微生物催化生产丁酸是一个厌氧过程。能产丁酸的微生物主要包括梭菌属(Clostridium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、八叠球菌属(Sarcina)、真杆菌属(Eubacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、巨球形菌属(Megasphaera)、产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、溃蚀密螺旋体(Treponema phagedenis)、不解糖消化链球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)。其中前三个属是研究最多的微生物，而用梭菌发酵丁酸产量相对较高、稳定性较好，被认为最具商业化潜力。
梭菌是革兰氏阳性厌氧芽孢菌，丁酸梭菌(C.butyricum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、巴斯德梭菌(C.pasteurianum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)等是产丁酸的代表种，而这些种也常被用来发酵生产溶剂(丙酮、丁醇)、1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PDO)、气体(H2)等(Durre.Applied microbiologyand biotechnology，1998，49(6)，639-648；Lin，et al.International Journal ofHydrogen Energy，2007，32(12)：1728-1735)。梭菌在纯CO2、N2或二者的混合气体中，pH4.5-7.0、35-37℃的条件下均能很好地生长，但产酸和产溶剂的pH值并不相同(Van Andel，et al.Applied Microbiology and Biotechnology，1985，23：21-26.)；可利用的碳源很广泛，包括多种己糖、戊糖以及它们的寡糖和多糖，因此可利用面粉、淀粉、马铃薯废料、乳清、糖蜜、甚至纤维素来进行发酵(Grobben，et al.Appl Microbiol Biotechnol，1993，39：494-498.；Vandak，et al.World Journal of Microbiology and Biotechnology，1995，11(3)：363；Vandak，et al.Folia Microbiol，1995，40：32-42)。
丁酸发酵的影响因素主要有培养基料、pH值、细胞生长速率、发酵模式等。尽管梭菌能利用广泛的碳源，但不同菌株对碳源的利用能力存在较大差异。对于菌体生长，总体上单糖优于其它糖，葡萄糖、果糖、木糖等是较好的碳源。许多产丁酸的梭菌同时也能产溶剂，pH值不受控的发酵过程表现为先产酸后产溶剂，pH值在二者的转换中起着重要的作用，当pH值降至5.0以下时，即进入产溶剂高峰，因此pH控制对于丁酸发酵非常关键。一般认为pH6.0是合适的发酵pH值。细胞生长速率对丁酸的选择性也有着重要影响。高生长速率意味着细胞需要更多的能量(ATP)，这时乙酸就会产生；生长速率很低时，细胞需能少，乳酸则将产生；因此适当控制细胞生长速率，可提高丁酸的选择性。批式发酵、补料批式发酵、连续发酵等发酵模式常用于丁酸发酵的研究中。此外，也有应用细胞固定化技术的报道(USPat.5563069)。
目前利用梭菌催化生产丁酸，存在几个重要的限制因素，如产物选择性差和终产物的抑制效应，特别是终产物的抑制效应使丁酸浓度的提高存在困难。抑制效应主要来自未解离的丁酸，其临界抑制浓度约为50mmol/L(Heuvel，et al.Biotechnol Tech，1992，6：33-38)，因此使丁酸浓度保持在抑制水平以下是非常重要的。稀释无疑能满足这一条件，但过低的丁酸浓度使下游分离提取的效率更低。将产物分离与发酵过程相耦合才是可行的思路。这种“在线”或原位分离方法，不仅使产物在产生时即得到分离，有效缓解了产物抑制效应，而且也简化了后期提纯的步骤。萃取发酵和渗透萃取发酵是主要的耦合形式。萃取发酵是在发酵过程中加入萃取剂，使发酵液中的产物不断进入有机相，从而达到即时分离的效果。渗透萃取发酵是三相发酵，即萃取剂为中间层，一侧为发酵液，另一侧为反萃取剂，产物从发酵液进入萃取剂相，然后被反萃到反萃取剂中，萃取剂起到液态膜的作用。目前也有研究报道尝试将萃取发酵或渗透萃取发酵应用到丁酸发酵中，使终产物的抑制效应得到一定的缓解(Zigov，et al.Process Biochemistry，1999，34(8)：835-843)。
尽管已取得了上述这些认识和发展，目前利用梭菌催化生产丁酸，仍有几个方面的问题没有解决：(1)不能在保持高转化率的同时实现连续发酵生产丁酸，(2)萃取剂的萃取效率较低，且对微生物具有毒性。
能源问题已日益突出，石油作为主要能源形式将成为日益稀缺的产品，给基于石油的化学合成法生产丁酸带来挑战，因此必须发展利用可再生能源生产丁酸的方法，来补充或替代现有基于石油的化学合成方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种微生物催化生产正丁酸的方法，该方法能有效解决丁酸发酵的终产物抑制效应问题，在保持高转化率的同时实现连续发酵生产丁酸，使微生物催化生产丁酸向工业化阶段发展。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种微生物催化生产正丁酸的方法，包括以下步骤：
1)向含灭菌的梭菌培养基的发酵罐中通入氮气或二氧化碳或二者的混合气体，使液体培养基的氧化还原电位降至-40mV以下后接种梭菌，35-37℃厌氧培养24-48小时，得到2-6OD的菌悬液；
2)将步骤1)所得菌悬液泵入温度维持在35-37℃的固定化反应器中，使梭菌吸附在固定化载体上，直到发酵罐中的菌悬液浓度不再下降；
3)用碳氮源浓缩液和氨水调节发酵罐中的发酵液，使碳源质量浓度维持在0.5-10％，氮源质量浓度维持在0.1-5％，pH维持在5.5-6.5，将调整后的发酵液连续泵入固定化反应器中，梭菌将发酵液转变成正丁酸，得到含正丁酸的发酵液；
4)步骤3)所得含正丁酸的发酵液进入萃取装置，正丁酸被萃取到萃取剂中，得到含正丁酸的萃取剂，发酵液回到发酵罐中；
5)步骤4)所得含正丁酸的萃取剂进入反萃取装置，正丁酸被反萃取到反萃取剂中，得到含正丁酸的反萃取剂，反萃取后的萃取剂回到萃取装置中；
6)步骤5)中正丁酸浓度达到或接近饱和时，经盐析得到正丁酸，反萃取剂回到反萃取装置中。
优选地，本发明梭菌是酪丁酸梭菌或丁酸梭菌；
优选地，步骤3)所述发酵液的碳源质量浓度维持在1-5％，氮源质量浓度维持在0.5-2％，pH维持在5.8～6.2。
优选地，步骤4)中所述萃取剂是由三辛基叔胺和油醇或三癸基叔胺和油醇组成，其中三辛基叔胺或三癸基叔胺约占15％体积，油醇约占85％体积；步骤5)中所述反萃取剂为6N NaOH水溶液；步骤6)中通过NaCl或HCl进行盐析。
本发明的另一目的是提供一种微生物催化生产正丁酸的装置。采取了以下技术方案：
一种微生物催化生产正丁酸的装置，包括发酵罐、固定化反应器、萃取装置和反萃取装置，所述发酵罐、固定化反应器和萃取装置通过循环管路依次连通，萃取装置和反萃取装置通过循环管路相互连通。
本发明的有益效果在于：
(1)通过发酵与产物分离耦合，使正丁酸得到及时的分离，而培养料液中正丁酸的浓度一直处于较低水平的状态，有效破除或缓解了正丁酸终产物的抑制效应；
(2)通过固定化反应器、萃取装置、发酵罐之间构成循环回路，实现了连续发酵，且发酵不受或很少受终产物丁酸的抑制；
(3)通过选择合适的萃取剂，降低了萃取剂对微生物的毒性，且萃取剂具有较高萃取效率(分配系数大于8)；
(4)通过细胞固定化技术，避免了微生物与萃取剂的直接接触，进一步减少了萃取剂对微生物的毒性，延长了反应器的有效运行时间；
(5)通过对发酵液碳氮源的调节，使固定化微生物的生长速率控制控制在合适的水平，盐析后正丁酸的纯度达到90％以上。
附图说明
图1是本发明微生物催化生产正丁酸的工艺图；
附图标记：1、发酵罐(1a、排气管；1b、温度探头；1c、pH探头)；2、固定化反应器；3、萃取装置；4、反萃取装置；5、反萃取剂接收罐；6、盐析罐；7、储料罐；8、酸碱瓶；9、菌液分离装置；10、萃取剂储存罐；11、反萃取剂储存罐。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容，因此，本发明的保护范围包括并不仅限于所举之例。
实施例1本发明微生物催化生产正丁酸的装置
参见附图1，本发明发酵生产正丁酸的装置包括：发酵罐1、固定化反应器2、萃取装置3、反萃取装置4、反萃取剂接收罐5、盐析罐6，以及储料罐7、酸碱瓶8、菌液分离装置9、萃取剂储存罐10、反萃取剂储存罐11以及连接它们管路、泵阀门等。
其中固定化反应器是一个由固定化载体以一定折叠方式充满的密闭容器，固定化载体由固定化载体材料缠绕在支架上组成。支架可以是片状或网状不锈钢或玻璃；固定化载体材料可以是纤维如棉布等，也可以是合成高分子聚合物如聚乙烯醇等。
整个装置的液体流向形成多个不同的循环回路：在微生物固定化阶段，固定化反应器2与发酵罐1直接构成循环回路；在催化产丁酸时，固定化反应器2中含正丁酸的发酵液经菌液分离装置9后，菌体经管路回到发酵罐1，构成循环回路；液体进入萃取装置3的中空纤维膜内管，再经管路回到发酵罐1，构成循环回路；萃取剂从中空纤维膜的外侧穿过萃取装置3，经管路进入反萃取装置4，由中空纤维膜内管穿过反萃取装置4，经管路构成循环回路；直到反萃取剂接收罐5中的正丁酸浓度达到或接近饱和时，经管路进入盐析罐6，循环回路中减少的反萃取剂由反萃取剂储存罐10补充；反萃取剂由中空纤维膜外侧进入并按中空内管流向相反的方向穿过反萃取装置4，含正丁酸的反萃取剂，经管路进入反萃取剂接收罐5，接收罐的反萃取剂经管路回到反萃取装置4继续反萃取，形成循环回路。
实施例2本发明所述微生物催化生产正丁酸的方法
步骤如下：
(1)制备种子液
种子培养基装瓶后，在其上覆盖一层约5～10mm厚的液体石蜡，121℃，高压灭菌20min，接种酪丁酸梭菌，于35-37℃静止培养48hr后得到种子液备用。
种子培养基配方如下：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、牛肉膏5g/L、硝酸铵1g/L、硫酸亚铁0.03g/L、乙酸钠3g/L、氯化钠5g/L、可溶性淀粉1g/L、半胱氨酸0.5g/L，pH7.0。
(2)制备微生物悬浮液
将梭菌培养基装入发酵罐，121℃，高压灭菌25min，冷却后，通入氮气，使培养基的氧化还原电位降至-40mV以下。通过无菌操作，按液体培养基5wt％的接种量将种子液迅速接入发酵罐，通入氮气，使培养基的氧化还原电位重新降至-40mV以下。调节发酵罐温度至35℃，搅拌速度120转/分钟，pH值控制在6.0左右，培养约36小时，使菌体密度OD600达到3～5。
梭菌培养基配方如下：葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、酵母提取物5g/L、牛肉膏5g/L、硝酸铵1g/L、硫酸亚铁0.03g/L、乙酸钠3g/L、氯化钠5g/L、可溶性淀粉1g/L，pH7.0。
(3)微生物细胞的固定化
发酵罐中酪丁酸梭菌的菌体密度达到要求后，通过泵将微生物悬浮液经管路从下端泵入固定化反应器中，固定化反应器的温度维持在35-37℃。固定化载体使用棉布，棉布缠绕在不锈钢片上，以平行折叠的方式填满反应器，片层之间有固定的空隙，利于液体通过。微生物悬浮液穿过反应器时，通过棉布的吸附作用使酪丁酸梭菌固定在棉布上，进而形成一个稳定的生物膜；未吸附的酪丁酸梭菌及液体从固定化反应器上端经管路回到发酵罐中，如此循环，直到发酵罐中微生物悬浮液的菌体密度不再下降为止。
(4)固定化的酪丁酸梭菌催化生产正丁酸
从储料罐中将2～20倍的碳氮源浓缩液泵入发酵罐，使发酵罐中发酵液的碳源浓度维持在0.5～10wt％，氮源浓度维持在0.1～5wt％，以氨水调节pH，使pH维持在约6.0；发酵罐的培养基料以一定速率泵入固定化反应器中，固定化的酪丁酸梭菌连续将发酵液转变成正丁酸，产生含正丁酸的发酵液。
(5)产物正丁酸的在线分离
含正丁酸的发酵液经菌液分离装置进行菌液分离，菌体经管路回到发酵罐，含正丁酸的液体由中空纤维膜的中空内管进入萃取装置进行萃取。萃取剂是三辛基叔胺与油醇的混合物，三辛基叔胺约15体积％，油醇约85体积％。萃后液体经管路回到发酵罐，进而进入固定化反应器继续被催化产生正丁酸。
(6)正丁酸的提取
含正丁酸的萃取剂从萃取装置中经管路由中空纤维膜的中空内管进入反萃取装置，同时，6N氢氧化钠水溶液由中空纤维膜外侧进入并按中空内管流向相反的方向穿过反萃取装置，正丁酸从萃取剂中进入氢氧化钠水溶液中。再生(反萃取后)的萃取剂经管路回到萃取装置继续萃取，形成循环回路。
含正丁酸的氢氧化钠水溶液，经管路进入反萃取剂接收罐，接收罐的氢氧化钠水溶液经管路回到反萃取装置继续反萃取，直到接收罐的氢氧化钠水溶液中正丁酸浓度达到或接近饱和时，经管路进入盐析罐，在盐析罐中加入盐酸进行盐析，上层析出的即为正丁酸。反应器连续运行两周，正丁酸产量达到320g/L，产品纯度91％，生产效率达7.86g/(L·h)。
Claims (5)
1.一种微生物催化生产正丁酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)向含灭菌的梭菌培养基的发酵罐中通入N2和/或CO2，使液体培养基的氧化还原电位降至-40mV以下后接种梭菌，35-37℃厌氧培养24-48小时，得到2-6OD的菌悬液；所述梭菌是酪丁酸梭菌；
2)将步骤1)所得菌悬液泵入温度为35-37℃的固定化反应器中，使梭菌吸附在固定化载体上，未吸附的梭菌及液体从固定化反应器上端经管路回到发酵罐中，如此循环，直到发酵罐中悬浮液的菌体密度不再下降；
3)用碳氮源浓缩液和氨水调节发酵罐中的发酵液，使碳源质量浓度维持在0.5-10％，氮源质量浓度维持在0.1-5％，pH维持在5.5-6.5，将调整后的发酵液泵入固定化反应器中，梭菌将发酵液转变成正丁酸，得到含正丁酸的发酵液；
4)步骤3)所得含正丁酸的发酵液进入萃取装置，正丁酸被萃取到萃取剂中，得到含正丁酸的萃取剂，发酵液回到发酵罐中；
5)步骤4)所得含正丁酸的萃取剂进入反萃取装置，正丁酸被反萃取到反萃取剂中，得到含正丁酸的反萃取剂，反萃取后的萃取剂回到萃取装置中；
6)步骤5)反萃取剂中的正丁酸浓度达到或接近饱和时，经盐析得到正丁酸，反萃取剂回到反萃取装置中。
2.根据权利要求1所述的微生物催化生产正丁酸的方法，其特征在于：步骤3)中所述发酵液的碳源质量浓度维持在1-10％，氮源质量浓度维持在0.5-5％，pH维持在5.8～6.2。
3.根据权利要求1所述的微生物催化生产正丁酸的方法，其特征在于：步骤4)中所述萃取剂由三辛基叔胺和油醇或三癸基叔胺和油醇组成，所述三辛基叔胺或三癸基叔胺占萃取剂的体积百分比为14-16％。
4.根据权利要求1所述的微生物催化生产正丁酸的方法，其特征在于：步骤5)中所述反萃取剂为6N NaOH水溶液。
5.根据权利要求1所述的微生物催化生产正丁酸的方法，其特征在于：步骤6)中所述盐析通过NaCl或HCl进行。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111026 |