CN104628549B - 一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法 - Google Patents

一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法。本发明采用如下技术方案：一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法，其特征在于：包括有以下步骤，一、发酵液盐析除杂，二、？PEG／Na2SO4双水相系统建立，三、萃取发酵液丁酸单因素实验，四、响应面优化实验，五、多级萃取，六、PEG回收，七、蒸馏分离丁酸，通过采用上述步骤，本发明针对现有技术存在的不足，提供一种，具有低能耗、操作简单、重复利用萃取剂等优点的新型的用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法。

Description

一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法
技术领域
本发明涉及一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法。
背景技术
丁酸是一种医药、食品、农业等方面有着广泛应用的重要的化工原料，生产丁酸主要有微生物发酵法和化学法，微生物发酵法生产丁酸原料来源广泛、条件温和、能耗低，更易满足食品和医药级产品的要求，但是，发酵法存在丁酸浓度低、纯化处理量大等问题，实现工业化生产的成本较高，已报道的丁酸分离方法主要有成盐法、蒸馏法、离子交换法和盐萃取法等。而双水相萃取法未见报道，本文以丁酸菌为发酵菌种生产丁酸，采用饱和硫酸钠盐沉淀发酵液中的糖类和含氮化合物，然后用聚乙二醇（PEG）/硫酸钠双水相萃取法萃取发酵液中的丁酸，具有低能耗、操作简单、重复利用萃取剂等优点。考察不同的双水相萃取体系对丁酸萃取率的影响因素，并对相关条件进行单因素和响应面法系统研究，对粗丁酸通过蒸馏除去乙酸，以期建立一条从发酵液中高效提取丁酸的新工艺。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种，具有低能耗、操作简单、重复利用萃取剂等优点的新型的用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法。
实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法，其特征在于：包括有以下步骤，
一、发酵液制备及预处理，丁酸菌种为本实验室保存，培养基：葡萄糖32-38g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母膏3-7g/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，FeSO4·7H2O0.5-0.9g/L，K2HPO41-5g/L。发酵温度为30-38℃，搅拌转速120-170r/min，pH值5-6,采用葡萄糖补料流加，初始葡萄糖质量浓度为,32-38g/L，当糖质量浓度降至8-12g/L时，补料至糖质量浓度为32-38g/L，按上述操作重复补料发酵至产物质量浓度不再提高，底物不再消耗时，停止发酵实验，将发酵液于4000-6000r/min离心8min以上，除去菌体及其他固形物，上清液即为发酵液；
二、发酵液盐析除杂，发酵液中加入硫酸钠使发酵剩余的糖类和含氮化合物产生沉淀，过滤后将滤渣洗涤两次以上，取得的滤液加入PEG形成双水相；
三、PEG／Na2SO4双水相系统建立，利用Albertsson浊点法滴定法测定双水相相组成，在280K-300K的水浴锅中进行滴定操作，测定并制作由PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000与Na2SO4溶液形成的各体系相图，称取一定量的40％质量浓度的PEG溶液于烧杯中，定量滴加40％质量浓度的Na2SO4溶液，振荡，滴至混合物体系出现浑浊状态，显示已形成不溶的两相，按照式(1)和式(2)算出此时PEG和Na2SO4在系统中的质量分数，即得相图中的一个点，
（1）
（2）
式中p——在某单相点时硫酸钠在系统中的总量，g；
q——在某单相点时PEG在系统中的总量，g；
w——在某单相点时水在系统中的总量，g；
a——在某单相点时硫酸钠的质量分数，％；
b——在某单相点时PEG的质量分数，％。
四、萃取发酵液丁酸单因素实验，取丁酸发酵液，根据步骤三的成相规律加入3.5-4.5倍丁酸发酵液的PEG和硫酸钠，混合均匀，恒温下静置分相，成相后分别取上下相液体，以丁酸在双水相的上相中的得率为指标，采用气相色谱AgilentGC6820测定丁酸质量分数，色谱参数为：HP-INNOWAX毛细管柱；FID检测器；载气：高纯氮；进样口温度220-270℃，FID检测器温度220-270℃；采用外标法，进样量0.3-0.5μL；丁酸的出峰时间分别为1.4-1.7min，物质的含量由峰面积与标准曲线计算，
上述公式中，Y为丁酸在上相中的萃取率，C1、C2为双水相体系中下相丁酸的质量浓度，单位为mg/mL，V1、V2为双水相系统上、下相体积，单位为mL；
五、响应面优化实验，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素实验结果，选取对丁酸在双水相中分配行为影响较大的三个因素，分别用X1，X2，X3代表，其中X1为PEG6000的质量，X2为Na2SO4浓度，X3为温度，以丁酸在上相中的得率为响应值(Y)进行实验。
六、多级萃取，发酵液经一次萃取，下相中还含有较多的丁酸，把下相放入双水相再进行萃取，合并多级的上相萃取液，可得到较高的丁酸萃取率。
七、PEG回收，收集的双水相上相洗脱液加入碘溶液,使PEG沉淀，过滤沉淀。
八、蒸馏分离丁酸，根据丁酸和乙酸的沸点不同，通过蒸馏分离得到纯的丁酸。
通过采用上述方案，本发明提供一种具有低能耗、操作简单、重复利用萃取剂等优点的新型的用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法。
下面结合附图和实施方式对本发明做进一步描述。
附图说明
图1为本发明响应面试验设计图；
图2为本发明PEG／Na2SO4双水相体系在298.15K时双节曲线图；
图3为本发明反映不同PEG分子量对丁酸得率的影响图；
图4为本发明反映不同质量分数的PEG6000对丁酸得率的影响图；
图5为本发明反映不同Na2SO4的质量分数对丁酸得率的影响图；
图6为本发明反映不同温度对丁酸得率的影响图；
图7为本发明反映不同pH对丁酸得率的影响图；
图8为本发明反映响应面分析试验及结果图；
图9为本发明反映模型回归方程方差分析影响图；
图10为本发明反映模型回归系数显著性检验和结果影响图；
图11为本发明反映三维响应面变量（X1:PEG6000浓度；X2:Na2SO4浓度；X3:温度）对响应值Y影响图；
图12为本发明反映二维等高线图变量（X1:PEG6000浓度；X2:Na2SO4浓度；X3:温度）对响应值Y影响图；
图13为本发明反映多级萃取对丁酸总萃取率的影响图；
图14为本发明反映双水相成份测影响图。
具体实施例
如图1—图14所示，一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法，包括有以下步骤：
一、发酵液制备及预处理，丁酸菌种为本实验室保存，培养基：葡萄糖32-38g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母膏3-7g/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，FeSO4·7H2O0.5-0.9g/L，K2HPO41-5g/L。发酵温度为30-38℃，搅拌转速120-170r/min，pH值5-6,采用葡萄糖补料流加，初始葡萄糖质量浓度为,32-38g/L，当糖质量浓度降至8-12g/L时，补料至糖质量浓度为32-38g/L，按上述操作重复补料发酵至产物质量浓度不再提高，底物不再消耗时，停止发酵实验，将发酵液于4000-6000r/min离心8min以上，除去菌体及其他固形物，上清液即为发酵液；
二、发酵液盐析除杂，发酵液中加入硫酸钠使发酵剩余的糖类和含氮化合物产生沉淀，过滤后将滤渣洗涤两次以上，取得的滤液加入PEG形成双水相；
三、PEG／Na2SO4双水相系统建立，利用Albertsson浊点法滴定法测定双水相相组成，在298.15K水浴锅中进行滴定操作，测定并制作由PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000与Na2SO4溶液形成的各体系相图，准确称取2.0g40％PEG溶液于烧杯中，定量滴加40％的Na2SO4溶液，振荡，滴至混合物体系出现浑浊状态，显示已形成不溶的两相，按照式(1)和式(2)算出此时PEG和Na2SO4在系统中的质量分数，即得相图中的一个点，
（1）
（2）
式中p——在某单相点时硫酸钠在系统中的总量，g；
q——在某单相点时PEG在系统中的总量，g；
w——在某单相点时水在系统中的总量，g；
a——在某单相点时硫酸钠的质量分数，％；
b——在某单相点时PEG的质量分数，％。
四、萃取发酵液丁酸单因素实验，取经过预处理的丁酸发酵液20mL，根据步骤二的成相规律加入一定量的PEG和硫酸钠，混合均匀，恒温下静置分相，由于PEG／硫酸钠双水相相行为受PEG分子量及质量分数、硫酸钠质量分数、温度、pH、盐等多种因素的影响，所以考察这些因素，成相后分别取上下相液体，以丁酸在双水相的上相中的得率为指标，采用气相色谱AgilentGC6820测定丁酸质量分数，色谱参数为：HP-INNOWAX毛细管柱(30m*0.323mm*0.50μm)；FID检测器；载气：高纯氮；进样口温度250℃，FID检测器温度250℃；采用外标法，进样量0.4μL；丁酸的出峰时间分别为1.55min，物质的含量由峰面积与标准曲线计算，
Y为丁酸在上相中的萃取率，C1、C2为双水相体系中下相丁酸的质量浓度，单位为mg/mL，V1、V2为双水相系统上、下相体积，单位为mL；
五、响应面优化实验，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素实验结果，选取对丁酸在双水相中分配行为影响较大的三个因素，分别用X1，X2，X3代表，其中X1为PEG6000的质量，X2为Na2SO4浓度，X3为温度，以丁酸在上相中的得率为响应值进行实验，如图1所述。
六、多级萃取，发酵液经一次萃取，下相中还含有较多的丁酸，把下相放入双水相再进行萃取，合并多级的上相萃取液，可得到较高的丁酸萃取率；
七、PEG回收，收集的双水相上相洗脱液加入碘溶液,使PEG沉淀，过滤沉淀。
八、蒸馏分离丁酸，根据丁酸和乙酸的沸点不同，通过蒸馏分离得到纯的丁酸。
分析测定，
第一、PEG含量测定，碘沉淀法测定上下相PEG浓度，吸取10.0mL的0.01mol／L碘溶液于烧杯中，在搅拌下缓慢加人浓度范围为0.04—0.2g／L的PEG溶液5mL，静置5min。倒入比色皿，在750nm处测定吸光度，根据吸光度与PEG浓度的线性方程Y1=-0.0006+1.085x得出PEG含量。
第二、硫酸钠含量测定，根据硫酸根离子与钡离子沉淀原理，配制不同浓度的硫酸钠溶液，向其中加入氯化钡溶液，比浊法确定硫酸钠含量。
第三、糖类化合物测定，取上下相液体，用蒽酮比色法测定糖类浓度，再根据所构建双水相系统的上下相的体积以及两者测出的浓度，计算双水相上下层总糖的比值。
第四、含氮化合物测定，取上下相液体，用过硫酸钾消解紫外分光光度法测定蛋白质浓度、再根据所构建双水相系统的上下相的体积以及两者测出的浓度，计算双水相上下层蛋白质的比值。
结果与分析
1、PEG／Na2SO4双水相系统的相图，在Na2SO4分别与PEG1000、PEG2000、PEG4000和PEG6000四种不同分子量聚合物形成的4个双水相体系，以实验测得的双水相体系中双节线上两组分浓度以散点形式显示，如图2，随着PEG分子量的增大，每个体系双水相区域面积均呈现扩增趋势，PEG与硫酸钠双水相的形成原因，可能是由于PEG与硫酸钠之间的分子空间阻碍作用，无法相互渗透，当二者浓度达到一定值时便分成不互溶的两相，能否形成双水相，其机理取决于混合熵增和分子间作用力两个因素。双节线相图2的结果可知，PEG6000／Na2SO4在较低的PEG6000和Na2SO4质量分数时能形成双水相。
2、萃取发酵液丁酸单因素实验结果
2.1PEG相对分子质量(Mw)对丁酸萃取影响
根据相图2选择合适PEG／Na2SO4质量分数，至少要在能形成双水相范围内，即图2各曲线的右上方，以15%的PEG和15%的Na2SO4分别组成双水相体系，温度为30℃、pH4的条件下，考察丁酸的分配情况，见图3。不同PEG分子量的双水相中，上相中主要是PEG，下相中主要是硫酸钠，随着PEG分子量的增大，影响丁酸在两相中的分配。从图3可以看出，丁酸的分离纯化结果最优的是PEG6000的双水相中，所以选取PEG6000／Na2SO4作为研究对象。
2.2不同质量分数的PEG6000对丁酸萃取影响，在25℃、pH为4、Na2SO4质量分数为10%下PEG6000质量分数由15％增大到35％，考察丁酸的分配情况，结果见图4。在PEG6000的质量分数低于25%时，随着PEG浓度增加，体系中的疏水性增强，PEG相与丁酸间的羟基形成氢键，分子间的作用力增强，使丁酸分配更多到富含PEG的上相，起到分离纯化的作用；在PEG6000的质量分数为25%时丁酸的得率最高，达90.77%。当PEG6000的质量分数高于25%时，可能由于聚乙二醇间相互结合的氢键增多，影响了其羟基与丁酸之间结合成氢键，从而使丁酸进入上层达到饱和，随着溶液的增多反而减少，所以选择PEG6000的质量分数为25%为宜。
2.3硫酸钠的质量分数对丁酸萃取影响，在25℃、pH4、PEG6000质量分数为25%下硫酸钠质量分数由8%增大到13%分别组成双水相体系考察丁酸的分配情况，结果见图5。随着Na2SO4质量分数的增加，使丁酸分配更多到富含上相，在9%Na2SO4时达到最大87.88%，主要是由于Na2SO4是亲水性的盐，且主要分布在下相，增大Na2SO4的质量分数，可以减少上相中水的量，从而减少了上相的体积，但过多的Na2SO4量也会使上下相配比造成影响，从而影响萃取率。
2.4温度对丁酸萃取影响，在pH为4、25%PEG6000和9%硫酸钠下温度由20℃增大到60℃分别组成双水相体系考察丁酸的分配情况，结果见图6。在室温30℃下，丁酸的得率最大为87.88%，而随着温度的升高，得率逐渐减小。温度低于30℃时，不利于传质，温度升高后，PEG在水中的溶解度升高，造成下相体积稍微有所增大，所以选择最合适的温度是30℃。
2.5pH值对丁酸分配的影响，在温度30℃、25%PEG6000和9%硫酸钠下pH由2.5增大到4.5分别组成双水相体系考察丁酸的分配情况，结果见图7。由于pH较大时溶液呈现中碱性，丁酸呈现丁酸盐而不利于与PEG形成氢键进入上相，所以都在酸性溶液中进行，当pH值为3时，丁酸的得率最大为89.70%，pH值改变了双水相体系中离子数之比和界面电势，从而影响了两相之间的电位差，导致了上下相比的变化，从而影响萃取率。
3响应面试验结果及分析
3.1丁酸分离纯化的响应面结果分析，根据响应面试验设计，结合单因素实验分析结果，pH在2.5-4之间对发酵液丁酸萃取率波动不大，选取对发酵液丁酸萃取率影响较大的三因素：PEG6000浓度为X1、Na2SO4浓度为X2、温度为X3，以萃取率Y为因变量，试验结果见图8。
通过SAS软件得到响应变量Y和变量之间的四元二次多项式表示如下：
Y=90.8833+1.7638X1-3.9775X2-2.5263X3-5.4517X1 2+5.2225X1X2-6.2242X2 2-2.9400X1*X3-3.5375X2X3-3.1967X3 2
3.2响应面法试验结果分析，根据试验结果，采用SAS软件对所得数据进行回归分析，回归分析结果见图9和图10。
回归分析结果见图9和图10。由图10可知，校正决定系数R2为0.8574>0.8，说明实验方法可靠，模型的拟合度较好，可以用来替代真实的实验数据点进行分析。由图9可知，总模型和平方项Pr>F均小于0.1，说明总模型和平方项显著性较强。图10中Pr>︱t︳值反映影响的显著性及变量之间的相互作用关系，自变量一次项X2、X3的“Pr＞|t|”值小于0.1，说明Na2SO4浓度和温度对丁酸萃取率影响显著,而二次项X1*X1、X2*X2项“Pr＞|t|”值同样均小于0.1，说明PEG6000浓度、Na2SO4浓度这二个因素各自的叠加作用强，对实验结果影响显著。同时分析发现，这三个因素对实验的影响是非线性的。但是二次项X1*X2“Pr＞|t|”值小于0.1，说明PEG6000浓度和Na2SO4浓度这两者间的交互作用相对较强。
根据回归作出响应面图11和等高线图12，一个变量固定在其各自的零级，即中心值处，在另外两个连续变量下得到了丁酸萃取率，分析所得预测值被限制在最小的椭圆内。
图11三维响应面变量（X1:PEG6000浓度；X2:Na2SO4浓度；X3:温度）对响应值Y影响
图12为二维等高线图变量（X1:PEG6000浓度；X2:Na2SO4浓度；X3:温度）对响应值Y影响
由图11（a）和图12（a）分析，当X3=0时，X1增大，萃取率伴随PEG6000浓度在20%～26.22%范围内不断增大，Na2SO4浓度在8%～8.91%范围内不断增大，直到到达最大值后，PEG6000浓度和Na2SO4浓度继续增加，萃取率反而减小；当X2=0时，如图11（b）、图12（b）所示，随着PEG6000浓度在20%～26.22%范围内不断增大，温度在20℃～25.4028℃范围内不断增大，萃取率不断增大，直到到达最大值，随着两者继续增加，萃取率反而减小；图11（c）、图12（c）显示，在X1=0时，随着Na2SO4浓度在8%～8.91%范围内范围内不断增大，温度在20℃～25.4028℃范围内不断增大，萃取率不断增大，直到到达最大值，随着两者继续增加，萃取率反而减小。
由图11和图12得影响丁酸萃取率的三个因素中，影响程度X3>X2>X1。其中影响最大的因素为温度，随后依次为Na2SO4浓度和PEG6000浓度。得到萃取丁酸的最佳条件为PEG6000浓度为26.22%、Na2SO4浓度为8.91%和温度为25.4028℃，丁酸萃取率为91.8513%。
3.3丁酸最佳纯化条件的确定和试验验证，结合单因素和响应面结果，选取26%PEG6000、9%Na2SO4、温度25℃和pH为3，重复试验3次。得到丁酸平均萃取率为91.52±0.32%，与理论值基本相符，同时也说明响应面法适用于对发酵液丁酸的萃取纯化工艺进行回归分析和参数优化。
3.4多级萃取，发酵液经一次萃取，丁酸萃取率为91.52±0.32%，仍有丁酸留在萃余相中。为提高丁酸总收率，本文针对实际情况，对丁酸和乙酸初始质量浓度分别为38.62g/L和7.65g/L的发酵液进行三级萃取试验。由图13可知，经过2次萃取，丁酸萃取率由91.52%提高到95.35%，回收了大部分丁酸，继续第3次萃取后的萃取率提高幅度不大。另外，2次萃取后，乙酸萃取率有所减少，第3次萃取后，乙酸萃取率却提高了。这可能的原因是随着发酵液中分子态丁酸质量浓度降低，萃取剂对于乙酸的选择性提高。为了提高丁酸萃取率，并实现丁酸和乙酸的有效分离，同时减少萃取剂的使用，2次萃取是较佳的选择。
3.5双水相上下层成份的比较
从图14得知，双水相上层集中了较多的丁酸，较少的总糖和含氮化合物，主要是因为双水相上层含较多的PEG网状体系，使得丁酸通过氢键较好地融入其中，而下层含较多的Na2SO4的盐层，糖类和含氮化合物融入较多，这样取含丁酸较多而含较少总糖和蛋白质的双水相上层，由于在发酵丁酸的同时还含部分乙酸同时被萃取出来，最后根据两种沸点不同通过蒸馏得到较纯的丁酸。
4结论
发酵液中加入硫酸钠使发酵剩余的糖类和含氮化合物产生沉淀，过滤后的滤液加入PEG形成双水相，利用浊点法滴定法建立了较好的PEG6000／硫酸钠双水相系统，通过单因素和响应面法得该双水相系统获得最大发酵液中萃取丁酸的条件为选择PEG6000浓度为26%、Na2SO4浓度为9%、萃取温度25℃、pH3，得到丁酸萃取率为91.51±0.32%，再进行二级萃取使发酵液总糖以及含氮化合物大部分进入双水相下层，丁酸进入双水相上层的萃取率达95.35±0.32%，得到的混合酸经过蒸馏除去少量的乙酸从而得到较纯的丁酸，为发酵生产丁酸的提纯提供了新的途径。

Claims (1)

1.一种用PEG/Na2SO4双水相萃取发酵液丁酸的方法，其特征在于：包括有以下步骤，
一、发酵液制备及预处理，丁酸菌种为本实验室保存，培养基：葡萄糖32-38g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母膏3-7g/L，(NH4)2SO41.5-2.5g/L，FeSO4·7H2O0.5-0.9g/L，K2HPO41-5g/L，发酵温度为30-38℃，搅拌转速120-170r/min，pH值5-6，采用葡萄糖补料流加，初始葡萄糖质量浓度为32-38g/L，当糖质量浓度降至8-12g/L时，补料至糖质量浓度为32-38g/L，按上述操作重复补料发酵至产物质量浓度不再提高，底物不再消耗时，停止发酵实验，将发酵液于4000-6000r/min离心8min以上，除去菌体及其他固形物，上清液即为发酵液；
二、发酵液盐析除杂，发酵液中加入硫酸钠使发酵剩余的糖类和含氮化合物产生沉淀，过滤后将滤渣洗涤两次以上，取得的滤液加入PEG形成双水相；
三、PEG／Na2SO4双水相系统建立，利用Albertsson浊点法滴定法测定双水相相组成，在280K-300K的水浴锅中进行滴定操作，测定并制作由PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000与Na2SO4溶液形成的各体系相图，称取一定量的35-45％质量浓度的PEG溶液于烧杯中，定量滴加35-45％质量浓度的Na2SO4溶液，振荡，滴至混合物体系出现浑浊状态，显示已形成不溶的两相，按照式(1)和式(2)算出此时PEG和Na2SO4在系统中的质量分数，即得相图中的一个点，
（1）
（2）
式中p——在某单相点时硫酸钠在系统中的总量，g；
q——在某单相点时PEG在系统中的总量，g；
w——在某单相点时水在系统中的总量，g；
a——在某单相点时硫酸钠的质量分数，％；
b——在某单相点时PEG的质量分数，％；
四、萃取发酵液丁酸单因素实验，取丁酸发酵液，根据步骤三的成相规律加入3.5-4.5倍丁酸发酵液的PEG和硫酸钠，混合均匀，恒温下静置分相，成相后分别取上下相液体，以丁酸在双水相的上相中的得率为指标，采用气相色谱AgilentGC6820测定丁酸质量分数，色谱参数为：HP-INNOWAX毛细管柱；FID检测器；载气：高纯氮；进样口温度220-270℃，FID检测器温度220-270℃；采用外标法，进样量0.3-0.5μL；丁酸的出峰时间分别为1.4-1.7min，物质的含量由峰面积与标准曲线计算，
上述公式中，Y为丁酸在上相中的萃取率；C1、C2为双水相体系中下相丁酸的质量浓度，单位为mg/mL；V1、V2为双水相系统上、下相体积，单位为mL；
五、响应面优化实验，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素实验结果，选取对丁酸在双水相中分配行为影响较大的三个因素，分别用X1，X2，X3代表，其中X1为PEG6000的质量，X2为Na2SO4浓度，X3为温度，以丁酸在上相中的得率为响应值(Y)进行实验；
六、多级萃取，发酵液经一次萃取，下相中还含有较多的丁酸，把下相放入双水相再进行萃取，合并多级的上相萃取液，可得到较高的丁酸萃取率；
七、PEG回收，收集的双水相上相洗脱液加入碘溶液,使PEG沉淀，过滤沉淀；
八、蒸馏分离丁酸，根据丁酸和乙酸的沸点不同，通过蒸馏分离得到纯的丁酸。
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