CN109608558A

CN109608558A - 一种天然植物多糖的提取方法

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Publication number: CN109608558A
Application number: CN201910024070.3A
Authority: CN
Inventors: 彭军; 胡栋; 吴家强; 王涛; 徐煜琳; 朱迎春; 赵情
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-04-12

Abstract

本发明提供了一种天然植物多糖的提取方法，属于天然产物制备领域。该提取方法包括：将分泌细胞壁降解酶的产酶菌接种至产酶发酵培养基后，再加入天然植物粉末进行孵育发酵，将所得的发酵液与醇溶液混合、沉淀。该提取方法极大的简化了天然植物多糖的提取步骤，降低了提取费用，提高了天然植物多糖的提取效率，且避免使用乙醚、氯仿等有毒有害试剂，有利于将天然植物多糖大量应用在畜牧业中。

Description

一种天然植物多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及天然产物制备领域，具体而言，涉及一种天然植物多糖的提取方法。

背景技术

植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖。研究发现，植物多糖具有明显的促生长作用，提高药物疗效和抗原免疫应答的能力，且能激活免疫细胞。植物多糖的主要来源是从富含多糖的天然植物中提取得到，即为天然植物多糖。

现有的天然植物多糖提取方法主要为水煎煮提取法、物理化学法提取法等。在这类提取方法中，均存在提取步骤复杂、所需费用高，且使用了氯仿、乙醚、正丁醇等有毒有害试剂，严重制约了天然植物多糖在畜牧业中大量推广使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天然植物多糖的提取方法，该方法极大的简化了天然植物多糖的提取步骤，提高了天然植物多糖的提取效率。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种天然植物多糖的提取方法，其包括：

将分泌细胞壁降解酶的产酶菌接种至产酶发酵培养基后，再加入天然植物进行孵育发酵，将所得的发酵液与醇溶液混合、沉淀。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述产酶菌包括地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、里氏木霉菌、绿色木霉菌和日本曲霉中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，每升产酶发酵培养基按重量份数计包括：

(NH)₂SO₄3-5份、KH₂PO₄1-3份、MnSO₄·7H₂O 0.1-1份、蛋白胨7-13份以及牛肉膏3-7份。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述细胞壁降解酶纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述天然植物包括黄芪、松花、枸杞、银耳、猴头菇、香菇、灵芝和虫草中的至少一种。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述产酶菌在产酶发酵培养基上的接种量为0.5-1.5％。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述加入所述天然植物进行孵育发酵的步骤包括：

将灭菌后的天然植物粉末与接种有产酶菌的产酶发酵培养基按照质量体积比5-15：1混合，于30-45℃、150-300rpm下孵育12-60h。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述将发酵液与醇溶液混合、沉淀的步骤包括：

将发酵液与醇溶液按照体积比1：3-6混合，于2-8℃下静置4-12h，离心、洗涤。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在将发酵液与醇溶液混合、沉淀后还包括：用孔径为0.15-0.30μm的滤膜进行过滤。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述醇溶液为质量分数为70-100％的乙醇溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：

本发明提供的这种天然植物多糖的提取方法，将天然植物与含有细胞壁降解酶的产酶发酵培养基混合孵育过程中，细胞壁降解酶会水解植物细胞壁中富含的纤维素或木质素，从而破坏植物细胞壁，使位于细胞内的天然植物多糖快速溶出。且，在该方法中，所使用的细胞壁降解酶是直接通过产酶菌发酵所得，细胞壁降解酶的活性好，催化效率高，从而有助于进一步提高天然植物多糖的提取效率。

该提取方法极大的简化了天然植物多糖的提取步骤，降低了提取费用，提高了天然植物多糖的提取量，且避免使用乙醚、氯仿等有毒有害试剂，有利于将天然植物多糖大量应用在畜牧业中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为地衣芽孢杆菌在不同发酵时间对三种植物多糖的提取量比较(其中，PPPS为松花粉、BPPPS为破壁松花粉、APS为黄芪粉，下同)；

图2为黄孢原毛平革菌在不同发酵时间对三种植物多糖的提取量比较；

图3为葡聚糖(≥10⁴)HPLC测定结果；

图4为地衣芽孢杆菌发酵松花粉后多糖提取物的HPLC测定结果；

图5为地衣芽孢杆菌发酵破壁松花粉后多糖提取物的HPLC测定结果；

图6为地衣芽孢杆菌发酵黄芪后多糖提取物的HPLC测定结果；

图7为黄孢原毛平革菌发酵破壁松花粉后多糖提取物的HPLC测定结果；

图8为黄孢原毛平革菌发酵破壁松花粉后多糖提取物的HPLC测定结果；

图9为黄孢原毛平革菌发酵黄芪后多糖提取物的HPLC测定结果；

图10为三种提取方法分别对三种植物多糖的最佳提取量比较，其中，(Waterextraction(WE)为水提法、Physicochemical extraction(PE)为物理化学法、Fermentation extraction with Bacillus licheniformis(FEbl)为地衣芽孢杆菌发酵法；

图11为三种植物多糖分别采用三种提取方法的最佳多糖提取量比较，其中，(Water extraction(WE)为水提法、Physicochemical extraction(PE)为物理化学法、Fermentation extraction with Bacillus licheniformis(FEpc)为黄孢原毛平革菌发酵法；

图12为黄芪发酵液中三种纤维素酶活性；

图13为松花粉发酵液中三种纤维素酶活性；

图14为破壁松花粉发酵液中三种纤维素酶活性；

图15为黄芪发酵液中两种木质素酶活性；

图16为松花粉发酵液中两种木质素酶活性；

图17为破壁松花粉发酵液中两种木质素酶活性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式提供一种天然植物多糖的提取方法，其包括：

步骤S1：将分泌细胞壁降解酶的产酶菌接种至产酶发酵培养基后，再加入天然植物进行孵育发酵，得到发酵液。

进一步地，产酶菌包括产酶菌包括地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、里氏木霉菌、绿色木霉菌和日本曲霉中的至少一种。

地衣芽孢杆菌，是一种高活性微生物菌种，具有繁殖能力快，形成芽孢多，抗逆性强的特点。其能够产生包括细胞壁降解酶在内的多种活性酶。

白腐菌，是属于担子菌亚门的真菌，其具有能够降解木质素、半纤维素和纤维素的特性。其中，黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium Burdsall)是白腐真菌的一种，具有极强的酵解木质素的作用。

进一步地，细胞壁降解酶包括纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶中的至少一种。

纤维素酶是一种能够催化纤维素生成寡糖或单糖的复合酶。主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶等组成。微生物来源的纤维素酶能够有效转化不溶性的纤维素成葡萄糖，且能够破坏天然植物的细胞壁提高植物多糖的产量。地衣芽孢杆菌在培养过程中会产生纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶等多种细胞壁降解酶。

木质素是自然界含量仅次于纤维素的一类异质多晶、高度分支的有机聚合物。木质素降解酶是指能够分解木质素的一组酶的总称。木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。黄孢原毛平革菌在培养过程中能够分泌木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。

进一步地，每升产酶发酵培养基按重量份数计包括：

(NH)₂SO₄3-5份、KH₂PO₄1-3份、MnSO₄·7H₂O 0.1-1份、蛋白胨7-13份以及牛肉膏3-7份，余量为水。

或者，按重量份数计包括：(NH)₂SO₄3.5-4.5份、KH₂PO₄1.5-2.5份、MnSO₄·7H₂O0.3-0.8份、蛋白胨8-12份以及牛肉膏4-6份，余量为水。

或者，按重量份数计包括：(NH)₂SO₄4份、KH₂PO₄2份、MnSO₄·7H₂O 0.5份、蛋白胨10份以及牛肉膏5份，余量为水。

进一步地，培养产酶菌的步骤包括：

将产酶菌按照0.5-1.5％的接种量接种于灭菌后的产酶发酵培养基上，再按照质量体积比5-15：1加入灭菌后的天然植物粉末，混匀后，于30-45℃、150-300rpm下孵育12-60h。

优选地，产酶菌在产酶发酵培养基上的接种量为0.7-1.3％，或者为0.8-1.1％。

优选地，加入天然产物的质量与产酶发酵培养基的体积之比为：5-15：1，或者为7-13：1，或者为9-11：1。

优选地，培养条件为：在33-42℃、180-260rpm下孵育24-60h。或者，培养条件为：在35-39℃、200-240rpm下孵育24-48h。

进一步地，天然植物包括黄芪、松花，以及其它富含植物多糖的天然植物，例如香菇和灵芝等。

黄芪，为豆科植物蒙古黄芪的根，是一种常用中药，具有补气固表、托毒排脓、利尿、生肌的功效。黄芪中富含多种植物多糖，例如己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等。从黄芪中提取的植物多糖，称为黄芪多糖，其可以作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。

松花，为松科植物马尾松Pinus massoniana Lamb.、油松Pinus tabulaeformisCarr.、赤松Pinus densiflora Sieb.et Zucc.、黑松Pinus thunbergii Parl.等的花粉，具有祛风、益气、收湿、止血的功效，松花粉中饱含丰富的营养成分和活性物质,是天然微型营养库,堪称“花粉之王”,其可以全面调理人体各个系统,对人类健康大有裨益。研究表明，松花粉多糖是保持松花粉特效的主要营养成分之一，具有免疫增强的功能。发明人研究发现，在提取松花粉多糖的过程中，将松花粉进行破壁处理后(即破壁松花粉)后，能够显著提高松花粉的提取量。

步骤S2：将步骤S1中的发酵液与醇溶液混合，沉淀，得到天然植物多糖。

进一步地，该提取步骤包括：将发酵液与醇溶液按照体积比1：3-6混合，于2-8℃下静置4-12h，离心、洗涤。

其中，醇溶液优选为乙醇溶液，更为优选的为70-100％的乙醇溶液，或者80-100％的乙醇溶液。

进一步地，上述在将发酵液与醇溶液混合、沉淀后还包括：用孔径为0.15-0.30μm的滤膜进行过滤，以除去菌体，得到更为纯净的植物多糖。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

本实施例提供一种天然植物多糖的提取方法，其包括以下步骤：

A.配制产酶发酵培养基：

按照如下配方配制产酶发酵培养基：(NH)₂SO₄4g、KH₂PO₄2g、MnSO₄·7H₂O 0.5g、蛋白胨10g和牛肉膏5g，用去离子水定容至1L，调节溶液PH至7.2，高温灭菌。

B.接种及培养：

将地衣芽孢杆菌按照1％的接种量接种于产酶发酵培养基中，再按照10g/L的质量体积比加入灭菌后的黄芪粉，混匀后，于37℃、220rpm下孵育48h，得到发酵液。

C.提取多糖：

将发酵液离心后，取上清液，并按照1：4的体积比与无水乙醇溶液混合，混匀后，置于4℃下静置8h，将所得沉淀经离心后，依次用80％的乙醇和水洗涤3次，再用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，除去菌体，得到黄芪多糖。

实施例2

A.配制产酶发酵培养基：

按照如下配方配制产酶发酵培养基：(NH)₂SO₄5g、KH₂PO₄1g、MnSO₄·7H₂O 0.1g、蛋白胨7g和牛肉膏3g，用去离子水定容至1L，调节溶液PH至7.0，高温灭菌。

B.接种及培养：

将地衣芽孢杆菌按照1.5％的接种量接种于产酶发酵培养基中，再按照15g/L的质量体积比加入灭菌后的黄芪粉，混匀后，于30℃、300rpm下孵育12h，得到发酵液。

C.提取多糖：

将发酵液离心后，取上清液，并按照1：3的体积比与70％的乙醇溶液混合，混匀后，置于2℃下静置4h，将所得沉淀经离心后，依次用60％的乙醇和水洗涤3次，再用孔径为0.30μm的滤膜进行过滤，除去菌体，得到黄芪多糖。

实施例3

A.配制产酶发酵培养基：

按照如下配方配制产酶发酵培养基：(NH)₂SO₄3g、KH₂PO₄3g、MnSO₄·7H₂O 1g、蛋白胨13g和牛肉膏7g，用去离子水定容至1L，调节溶液PH至7.2，高温灭菌。

B.接种及培养：

将地衣芽孢杆菌按照0.5％的接种量接种于产酶发酵培养基中，再按照5g/L的质量体积比加入灭菌后的黄芪粉，混匀后，于45℃、150rpm下孵育60h，得到发酵液。

C.提取多糖：

将发酵液离心后，取上清液，并按照1：6的体积比与90％的乙醇溶液混合，混匀后，置于8℃下静置12h，将所得沉淀经离心后，依次用90％的乙醇和水洗涤3次，再用孔径为0.15μm的滤膜进行过滤，除去菌体，得到黄芪多糖。

实验例

下面结合实验数据对本发明实施例提供的天然植物多糖的提取方法进行评价。

一.实验过程：

a.主要试验材料

地衣芽孢杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京)；黄孢原毛平革菌(北纳创联生物技术有限公司，江苏昆山)；松花粉(白山市明隆特产有限公司，吉林白山)；破壁松花粉(祥云岩松生物科技有限公司，云南大理)；黄芪粉(昆明轩庆生物科技有限公司，云南昆明)；外切β-葡聚糖酶(Exo-1,4-β-D-glucanase；Cx)、内切β-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-D-glucanase；C1)、β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase)活性测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，上海)；蛋白胨，牛肉膏；分光光度计，酶标仪，高效液相色谱仪，琼脂粉，氯化钠，浓硫酸，苯酚，(NH)₂SO₄，KH₂PO₄，MnSO₄·7H₂O，高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，离心机，无水乙醇，生理盐水，葡萄糖，多聚糖，比色管，DNS显色剂，水浴锅，振荡器，比色皿，PH计，圆底烧瓶，回流器，索氏提取器，旋转蒸发仪，乙醚，Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝5:1(V/V))，血常规仪，加热搅拌器。

b.配制产酶发酵培养基：

按照如下配方配制产酶发酵培养基：(NH)₂SO₄4g、KH₂PO₄2g、MnSO₄·7H₂O 0.5g、蛋白胨10g和牛肉膏5g，用去离子水定容至1L，调节溶液PH至7.2，充分搅拌混匀，分装于15ml试管中，在121℃、101KPa下高压蒸汽灭菌20min。

c.接种及培养：

分别将地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌按照1％的接菌量接种于装有产酶发酵培养基的试管中，按照10g/L的质量加入经过灭菌的天然植物粉末(提前100℃灭菌1h)，上下颠倒混匀。在本实验例中，采用松花粉、破壁松花粉和黄芪粉作为天然植物粉末。

将接种完成后的培养基放入恒温震荡摇床中，设置为37℃、220/min，分别培养12h、24h、36h及48h，每组设置3个平行对照并做好标记，共计4组。

d.多糖的提取：

将每组经过培养的试管取出，将菌液移至Eppendorf离心管并于12000r/min离心5min，取2ml上清液加入15ml离心管中，加8ml无水乙醇至总体积为10ml并充分将混合液颠倒混匀，将13ml试管置于4℃冰箱中静置过夜沉淀多糖。将静置沉淀过夜的试管取出并于4000r/min离心5min，弃上清液保留沉淀；在试管中加入80％的乙醇溶液至体积为10ml，离心洗涤沉淀于4000r/min，弃上清液保留沉淀，共计洗涤3次；添加无菌水至洗涤之后用0.22μm的除菌滤器过滤多糖溶液，装有多糖沉淀的试管中至体积为10ml，将试管置于37℃中水浴10min至沉淀完全溶于无菌水中，即得到植物多糖溶液。

二、样品粗多糖的含量测定：

1.测定方法：

a.多糖标准曲线的制作

准确吸取葡萄糖标准使用液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml置于25ml比色管中，补水至2ml，加入5％苯酚溶液1ml，充分混匀，小心加入浓硫酸10ml，在振荡器上小心混匀，置沸水浴中2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处以空白试剂为参比，1cm比色管测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

所得标准曲线的方程式为：y＝7.4104x-0.0126，R²＝0.9904，符合标准曲线的要求。

b.样品粗多糖的测定

准确吸取待测多糖溶液1ml置于25ml比色管中，补水至2ml。然后按a步骤的方法测定吸光度值。再根据标准曲线算出葡萄糖质量。最后再依据式I得到从植物中提取得到的粗多糖的质量。

式I中：

X—样品中粗多糖的含量[mg/100g(ml)]；

m1—样品测定液中葡萄糖的质量；

m2—样品质量(g或ml)；

V1—样品提取液总体积(ml)；

V2—沉淀粗多糖所用样品提取液体积(ml)；

V3—粗多糖溶液体积(ml)；

V4—测定用样品液体积(ml)。

c.样品中还原糖的测定：

准确吸取1.00mg·mL^-1的葡萄糖标准溶液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL依次加入到25mL比色管中，再分别加入3mL的3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀，分别置于沸水浴中煮沸6min显色。取出，立即冷却，加入蒸馏水稀释至刻度线。以蒸馏水代替葡萄糖标准溶液作试剂空白。在487nm波长下用分光光度计测量上述各溶液的吸光度A。

以葡萄糖含量(微克数)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，所得标准曲线的方程式为：y＝7.4104x-0.0126，R2＝0.9904，符合标准曲线的要求。

吸取上述待测多糖溶液1ml置于25ml比色管中，向其中加入3mL的3,5-二硝基水杨酸溶液，采用同样的方法，于最大吸收波长487nm处测定吸光度。利用标准曲线的线性方程可以求出样品中还原糖的含量。

d.样品多糖的含量：

由于样品粗多糖中可能含有一定数量的还原糖，会干扰最后的结果，所以将样品粗多糖的质量减去其中还原糖含量，即为样品多糖的含量。

e.HPLC法鉴定样品多糖

精密称量分子量为10⁴右旋糖酐标准物质，加入蒸馏水配制成5g·L^-1右旋糖酐标准物质的标准溶液，使用0.45ul的微孔滤膜过滤备用。采用HPGPC，流动相为0.1mol·L^- ¹NaSO₄水溶液，柱温50℃，流速0.5mL·min^-1，示差折光检测器。以右旋糖苷标准溶液标定色谱柱，进样量20ul，观察试验结果的曲线图。取样品上清液20ul同法进行试验，观察试验结果的曲线图并与右旋糖苷标准溶液的结果进行对比。

2.植物多糖的测定结果：

A.采用地衣芽孢杆菌对松花粉、破壁松花粉和黄芪粉多糖的发酵提取结果：

将地衣芽孢杆菌分别接种于含松花粉(PPPS)、破壁松花粉(BPPPS)和黄芪粉(APS)的产酶发酵培养基中，在12h、24h、36h和48h四个时间点进行发酵并取样测定多糖提取量，计算数据并作图和统计分析，结果如图1所示。

由图1可见，松花粉的多糖提取量在12-36h内持续增加，36h时达到高峰，最高提取量为3.08g/100g。36h的多糖含量显著高于12h、24h(P<0.05)，而36h和48h之间无显著性差异(P>0.05)。破壁松花粉发酵液中多糖提取量在12h和24h无显著性差异(P>0.05)；发酵液中多糖含量在36-48h迅速提高，48h时达到最高值8.43g/100g，36h和48h的提取量显著高于12h和24h(P<0.05)，而二者之间无显著性差异(P>0.05)。对比松花粉和破壁松花粉的提取结果，可知松花粉在经过破壁处理后，松花多糖的提取量显著提高，这主要是因为在细胞壁破碎后松花细胞相对分离，增加了细胞壁降解酶与植物细胞的接触概率以及接触面积，促使细胞壁内的纤维素、木质素或半纤维素溶解，促进了其细胞内部的多糖成分释放、析出。

黄芪发酵液中多糖含量从12h至48h处于稳定状态，36h达到最高含量5.78g/100g，四个时间点多糖含量无显著性差异(P>0.05)。

B.采用黄孢原毛平革菌对松花粉、破壁松花粉和黄芪粉多糖的发酵提取结果：

将黄孢原毛平革菌分别接种于含松花粉、破壁松花粉和黄芪粉的产酶发酵培养基中，在12h、24h、36h和48h四个时间点进行发酵并取样测定多糖提取量，计算数据并作图和统计分析，结果如图2所示。

由图2可知，松花粉的多糖提取量在12h-48h内没有显著变化，四个时间点的多糖提取量无显著差异(P>0.05)，最高平均值为4.66g/100g。

破壁松花粉发酵液中多糖提取量在12h和24h无显著性差异(P>0.05)；发酵液中多糖含量在36-48h迅速提高，48h时达到最高值11.59g/100g，48h的提取量显著高于其他三个时间的多糖提取量(P<0.05)。

黄芪发酵液中多糖含量从12h至36h处于稳定状态，48h达到最高含量9.98g/100g，此时的多糖提取量显著高于其他三个时间的提取量(P<0.05)。

通过对比图1和图2可知，在同等条件下，黄孢原毛平革菌对松花粉、破壁松花粉和黄芪粉中的多糖提取量及提取效率均远高于地衣芽孢杆菌。

C.HPLC测定多糖提取物：

采用糖专用分析柱，以10⁴分子量的葡聚糖为标准，流动相为水，流速0.6mL/min，检测器为示差检测器，柱温为70℃，检测限为0.03g/L。葡聚糖的HPLC色谱图如图3所示。根据测定数据计算得到线性方程为Y＝109779.6X-903.3，相关系数r＝0.9999。

采用地衣芽孢杆菌为产酶菌提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉多糖所得的多糖检测结果分别如图4、5、6所示。葡聚糖标准HPLC检测中峰值的区域与松花粉、破壁松花粉及黄芪发酵液中多糖产物区域相同，由此说明通过该方法所得到的松花粉、破壁松花粉和黄芪多糖提取物的主要成分为多糖。

采用黄孢原毛平革菌为产酶菌提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉多糖所得的多糖检测结果分别如图7、8、9所示。同理，说明通过该方法所得到的松花粉、破壁松花粉和黄芪多糖提取物的主要成分为多糖。

三.不同提取方法的对比：

采用现有技术中的水提法和物理化学法做对照，与地衣芽孢杆菌发酵法、黄孢原毛平革菌发酵法进行对比，对松花粉、破壁松花粉和黄芪粉这三种植物样本进行提取。

A.现有技术的实验方法：

水煮法提取多糖称取植物粉末20g放于200ml圆底烧瓶中并加6倍量去离子水，加热回流1.5h，过滤得到滤液并再次加热回流过滤，一共重复3次得最终提取液，加蒸馏水补充提取液为200ml，取5ml(相当于0.5g黄芪粉)，加蒸馏水定容至50ml，摇匀，再取2.5ml加蒸馏水定容至25ml，摇匀即为供试品溶液，从供试品溶液中准确吸取1ml于具塞试管中，按前述方法测定吸光度，计算样品粗多糖的含量及供试品溶液中还原糖的含量，最终得出植物多糖的含量。

物理化学法提取多糖植物粉末2kg，将植物粉末包成20g的独立小包，用乙醚和索氏提取器抽提脂肪。将除脂后的植物粉末收集到烧杯中与去离子水按体积比1:15的比例混合并加入0.3％的胃蛋白酶，在50℃让植物粉末与胃蛋白酶充分反应2h。然后与去离子水按1:10比例互溶后置于1000ml大烧杯中，85℃热水浸提8h(过程中伴随蒸发随时添加去离子水，每半小时搅拌一次)，4℃沉淀过夜；以滤网过滤上清，然后置于500ml离心机以5000-8000rpm4℃离心5min，弃去沉淀取上清分装到500ml玻璃瓶中；将得到的上清在旋转蒸发仪上以200rpm、60℃减压浓缩至四分之一体积，分装至500ml玻璃瓶中，将浓缩液用Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝5:1(V/V))除蛋白，然后置于500ml离心机以5000-8000rpm4℃离心15min，重复两次，最后用4倍体积的无水乙醇使多糖沉淀，冷冻干燥后得到植物多糖。采用同法测定植物多糖含量。

B.地衣芽孢杆菌发酵法与水提法、物理化学法的对比：

采用水提法、物理化学法与地衣芽孢杆菌发酵法分别进行松花粉、破壁松花粉和黄芪粉三种植物多糖的提取，选取各种方法对应每种植物多糖的最高提取量，作图并进行统计分析，结果如图10所示。

由图10所示，水提法提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉的多糖量分别为2.18g/100g、2.70g/100g和2.29g/100g；物理化学法提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉的多糖量分别为4.33g/100g、4.64g/100g和4.39g/100g。物理化学法提取法所得的多糖提取量分别是水提法的1.99、1.72和1.92倍。地衣芽孢杆菌发酵法提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉后多糖量分别为3.08g/100g、8.43g/100g和5.78g/100g。多糖提取量分别是水提法的1.41、3.12和2.52倍；分别是物理化学法的0.71、1.82和1.31倍。

总体分析显示，水提法对PPPS、BPPPS和APS三种植物多糖的提取率无显著性差异(P>0.05)，物理化学法对PPPS、BPPPS和APS三种植物多糖的提取率无显著性差异(P>0.05)。然而，地衣芽孢杆菌发酵法对三种多糖的提取率差异显著(P<0.05)，以BPPPS和APS为最高，分别是水提法的3.12和2.55倍、物理化学法的1.82和1.31倍。除PPPS外，地衣芽孢杆菌发酵法对每种植物多糖的提取率显著高于水提法和物理化学法(P<0.05)，且物理化学法显著高于水提法(P<0.05)。

C.黄孢原毛平革菌发酵法与水提法、物理化学法的对比：

采用水提法、物理化学法与黄孢原毛平革菌发酵法分别进行松花粉、破壁松花粉和黄芪粉三种植物多糖的提取，选取各种方法对应每种植物多糖的最高提取量，作图并进行统计分析，结果如图11所示。

如图11所示，水提法提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉的多糖量分别为2.18g/100g、2.70g/100g和2.29g/100g。物理化学法提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉的多糖量分别为4.33g/100g、4.64g/100g和4.39g/100g。由物理化学法所得的多糖提取量分别是水提法的1.99、1.72和1.92倍。黄孢原毛平革菌发酵法提取松花粉、破壁松花粉和黄芪粉后多糖量分别为4.66g/100g、11.59g/100g和9.98g/100g。该方法的多糖提取量分别是水提法的2.14、4.29和4.35倍；分别是物理化学法的1.98、2.50和2.27倍。

总体分析显示，水提法对PPPS、BPPPS和APS三种植物多糖的提取率无显著性差异(P>0.05)，物理化学法对PPPS、BPPPS和APS三种植物多糖的提取率无显著性差异(P>0.05)。然而，黄孢原毛平革菌发酵法对三种多糖的提取率差异显著(P<0.05)，以BPPPS最高、其次为APS，分别是水提法的4.29和4.35倍、物理化学法的2.50和2.27。除PPPS外，黄孢原毛平革菌发酵法对每种植物多糖的提取率显著高于水提法和物理化学法(P<0.05)，物理化学法显著高于水提法(P<0.05)。

四.不同植物发酵液中细胞壁降解酶的活性：

A.纤维素酶活性的测定

分别取经过12h、24h、36h、48h的培养液在1000r/min离心20min取上清液进行测定其中的外切β-葡聚糖酶(Exo-1,4-β-D-glucanase)、内切β-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-D-glucanase)及β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase)的活性，具体操作步骤如下：

a.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

b.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

c.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

d.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

e.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

f.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

g.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

h.以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

B.三种地衣芽孢杆菌发酵液中纤维素酶的活性：

将地衣芽孢杆菌分别接种于含有松花粉、破壁松花粉和黄芪粉的产酶发酵培养基中，在12h、24h、36h和48h四个时间点进行发酵并取样测定β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase)、外切β-葡聚糖酶(Exo-1,4-β-D-glucanase；Cx)和内切β-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-D-glucanase；C1)活性，结果分别如图12、13、14所示。

由图12和13可见，在黄芪发酵液和松花粉发酵液中，三种纤维素酶的活性的变化规律基本一致，即三种纤维素酶的活性在12-36h这段时间内逐渐升高，均在36h达到最高点，随后酶活呈下降趋势。但，黄芪发酵液中三种纤维素酶的活性均高于松花粉发酵液。

由图14可见，在破壁松花粉发酵液中，三种纤维素酶的活性均随着时间的延长呈现逐渐升高的趋势，在48h时达到最高点，且破壁松花粉发酵液中三种纤维素酶的活性均高于松花粉发酵液和黄芪发酵液。

C.三种黄孢原毛平革菌发酵液中木质素酶的活性：

将黄孢原毛平革菌分别接种于含有松花粉、破壁松花粉和黄芪粉的产酶发酵培养基中，在12h、24h、36h和48h四个时间点进行发酵并取样测定三种发酵液中木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase)和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase)的活性，测定方法与纤维素酶相同，测定结果分别如图12、13、14所示。

由图12可知，黄芪发酵液中两种木质素酶的活性呈现相同的趋势，在12-36h时，基本稳定；随后在培养至48h时，酶活急剧升高。

由图13可知，松花粉发酵液中两种木质素酶的活性呈现相同的趋势，且在36h时达到最高点，随后酶活呈下降趋势。但，黄芪发酵液中两种木质素酶的活性均高于松花粉发酵液。

图14可知，在破壁松花粉发酵液中，两种木质素酶的活性均随着时间的延长呈现逐渐升高的趋势，在48h时达到最高点，且破壁松花粉发酵液中两种木质素酶的活性均高于松花粉发酵液和黄芪发酵液。

在黄孢原毛平革菌发酵液和地衣芽孢杆菌发酵液中，松花粉发酵液、黄芪发酵液和破壁松花粉发酵液中的纤维素酶、木质素酶活性呈现明显的依次升高的趋势。这是因为松花破壁后细胞相对分离，增加了纤维素或木质素细胞壁降解酶与植物细胞的接触几率，促使其溶解，相对增加了细菌生长所需营养物质从而加速了细菌的增殖和细胞壁降解酶的分泌；而黄芪的胞壁厚度小于松花细胞壁，故其对应酶的分泌液相应提高。

综上所述，在该天然植物多糖的提取方法中，所使用的纤维素或木质素酶是直接通过产酶菌发酵所得，细胞壁降解酶的活性好、催化效率高，从而有助于进一步提高天然植物多糖的提取效率。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种天然植物多糖的提取方法，其特征在于，其包括：

2.根据权利要求1所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，所述产酶菌包括地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌、里氏木霉菌、绿色木霉菌和日本曲霉中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，每升所述产酶发酵培养基按重量份数计包括：

(NH)₂SO₄ 3-5份、KH₂PO₄ 1-3份、MnSO₄·7H₂O 0.1-1份、蛋白胨7-13份以及牛肉膏3-7份。

4.根据权利要求1所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，所述细胞壁降解酶包括纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，所述天然植物包括黄芪、松花、枸杞、银耳、猴头菇、香菇、灵芝和虫草中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，所述产酶菌在所述产酶发酵培养基上的接种量为0.5-1.5％。

7.根据权利要求1所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，加入所述天然植物进行孵育发酵的步骤包括：

将灭菌后的天然植物粉末与接种有所述产酶菌的所述产酶发酵培养基按照质量体积比5-15：1混合，于30-45℃、150-300rpm下孵育12-60h。

8.根据权利要求7所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，将所述发酵液与醇溶液混合、沉淀的步骤包括：

将所述发酵液与醇溶液按照体积比1：3-6混合，于2-8℃下静置4-12h，离心、洗涤。

9.根据权利要求7所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，在将所述发酵液与醇溶液混合、沉淀后还包括：用孔径为0.15-0.30μm的滤膜进行过滤。

10.根据权利要求8所述的天然植物多糖的提取方法，其特征在于，所述醇溶液为质量分数为70-100％的乙醇溶液。