CN107541533A - 一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，该方法包括菌丝多糖多肽的物理方法与酶解相结合的高效提取、乙醇沉淀分离、左旋咪唑和高浓度乙醇分别沉淀纯化、复合免疫增强注射剂的配伍制剂等步骤。可与疫苗混合或配合注射剂提高动物免疫，生产效率高，相对生产成本低。本发明开发的松乳菇菌丝多糖基于其组成单糖较简单，可以进一步分解制备稀有功能性单糖，工艺简单。

Description

一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法。

背景技术

食药真菌功能物质：食药真菌中富含蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素及微量元素等营养物质外,还含有大量多糖、多肽、核苷、萜类等活性物质，其中分离和纯化产物,表现出很强的抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗细菌和抗其它寄生虫功能,还有治疗糖尿病、心血管病和高胆固醇症的作用，具有防病、治病和调节人体生理机能的功效。近年来国内外学者们对食用菌中的活性物质的研究十分火爆，尤其对食用菌中的生物活性多糖、活性蛋白多肽的研究越来越多，食用菌作为保健食品进入了人民大众的生活中。随着大型真菌发酵工艺的成熟，对药食真菌活性物质的提取从子实体转向发酵菌丝体。

多糖：多糖又称聚多糖(polysaccharidc),由单糖聚合成，聚合度大于10的极性大分子，分子量为数万至数百万，是构成生命活动的4大基本物质之一，是自然界含量最丰富的生物聚合物，几乎存在于所有生物体中。多糖与生命的多种生理功能密切相关，不仅为生物提供骨架结构和能量来源，还参与细胞各种生理过程的调节。许多功能性多糖具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒、抗癌和免疫调节等功能。真菌多糖是重要的一类，系从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出来的，包括酵母多糖、香菇多糖、裂殖多糖、灵芝多糖、黑木耳多糖、灰树花多糖等。

多糖与蛋白质一样结构分子复杂，蛋白质由20种氨基酸组成，而多糖由上百种单糖(单糖按碳原子数分为3、4、5、6碳糖，按官能团分为酮糖和醛糖，酮糖和醛糖基于手性碳原子可形成2ⁿ个对映体…等)，通过不同的糖苷键(α—1，4；β—1，3；β—1，4；β—1，6；α—1，6等糖苷键)构建成含10个以上单糖(自然界多糖多为80—100个单糖组成)的结构物；其结构有直链型和支链型，进而形成不同的立体结构。因此，多糖种类繁多，性质千差万别。多糖的理化性质分析包括分子量测定和结构分析，前者因多糖分子量不均一性而比较困难，通常所测得的分子量一般只能是一种统计平均值；后者有化学方法(酸水解法、甲基化反应、碱降解法)和物理分析法(红外光谱、核磁共振、质谱、气相色谱、紫外光谱等)。还有，比旋光测定常用作α或β苷键的判断，X射线衍射分析法、激光喇曼光谱法、热谱法等用来分析多糖链的结构。近年来，对天然多糖的分子组分及结构有不少研究，但多糖结构的研究起步比蛋白质研究晚，且测定方法更复杂，难度更大。因此，至今许多重要多糖的组成结构不清，或不同的测定存在差异，如贵红2003年报道的松乳菇子实体多糖为葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖等单糖^[12]，但丁祥等2012年的专利报道是甘露糖与木糖以3:1组成^[24]，二者差异很大。

多糖在自然动植物中以游离或结合(蛋白聚糖和脂多糖)状态存在，大多数多糖呈水溶性，其提取方法大多采用水浸提(冷浸或热浸)或辅助(超声波、微波、酶解、稀酸或稀碱等)水浸提等；但由于多糖的存在形式与自身性质的不同，对同一样品不同方法的提取效果差别极大。通常水+辅助方法提取的提取率比单一水提取的高，而谢红旗2007年报道超声波和微波辅助热水浸提香菇多糖的效果，比单用热水浸提的效果差，提取率和提取纯度均降低。另外，稀酸、稀碱、微波、超声波和酶可提高提取率，但也可降解多糖，影响其活性，陈卫云2011报道超声微波酶解法提取的荔枝多糖(LCP)的抗氧化能力、促进脾淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤能力等活性显著高于热水法提取的LCP(P≤0.05)。另外，方法一样，如处理条件不当，亦可影响其活性，何传波等2013报道酶解和微波处理得到的海带多糖样品比常规水浴浸提的样品的抗氧化活性有所提高；但随着酶用量的增加和微波萃取时间的延长,抗氧化活性呈现下降趋势。刘育玲等2010报道：酶解条件和冰乙醇用量对茶多糖的提取效率有较大的影响,获得茶多糖的高提取效率(54.70％)与获得茶多糖的高降糖活性(葡萄糖激酶相对酶活比值达3.97)所需条件不同。

关于多糖的分离纯化，植物多糖与蛋白质一样结构复杂，具有一、二、三、四级结构。由于多糖的生物活性与其化学结构有着重要的关系，为了得到单一分子量的纯多糖，选择一种恰当的分离纯化方法非常重要(舒任庚等2011)。多糖分离常用沉淀法(乙醇、丙酮等有机溶剂)沉淀，再用Sevage法去除蛋白；纯化常用色谱法，包括凝胶柱(Sephadex、Sepharase、活性炭等)和子交换柱(DEAE纤维素等)等色谱法，各类色谱介质(填充剂)种类很多，性质不同，处理方法(条件)也不同，应根据多糖的理化性质及分子大小等进行选择适合的色谱柱，并摸索其分离条件(洗脱剂种类及pH值、流速、分离柱的径高比、分离温度等)。这些方法的不足主要是大多只考虑多糖，而对样品中其它功能物质的利用缺乏。其实大活性多糖多为多组分的复合多糖，在分离纯化中最主要的是除蛋白质，目前去除蛋白质的方法最有效的是Sevage法。而该方法需多次用有机溶剂处理，存在工艺复杂和产品及环境污染等问题。

多肽(polypeptide)：是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸以不同的组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同的肽类的总称。多肽是源于蛋白质的多功能化合物，但肽的营养和生理功能优于蛋白质(大分子蛋白质)和氨基酸。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，科学发现，几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等均与活性多肽密切相关。特别是一些低肽不仅有比蛋白质更好的消化吸收性能,还具有活化细胞免疫、节植物神经系统、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、改善心血管功能和抗衰老等生理活性等生理机能。

生物活性肽无论是从结构还是从功能来说，生物活性肽都是自然界中存在种类最多，功能最复杂的一类化合物，广泛的存在于细菌、真菌、植物和动物中。目前报道较多的是从植物蛋白或动物蛋白酶解物中提取分离得到的活性肽，如大豆蛋白多肽等；而食用真菌活性肽的研究仅局限于灵芝肽、姬松茸肽、云芝肽、茶树菇肽等。湖南工业研究所^[16]从灵芝粉中分离到4个肽，并首次发现灵芝肽具有提高人体耐缺氧能力的活性；1984年上海师范大学杨庆尧教授首次从培养的云芝深层菌丝体中提取出云芝糖多肽(polysaccharopeptide，PSP)，是云芝的主要活性成分，具有很强的免疫调节作用，为抗肿瘤的免疫调节辅助药物。2004年焦迎春^[22]等用两次葡聚糖凝胶色谱法从姬松茸菌丝体中提取到肽类物质,分析测定表明,姬松茸菌丝体活性肽是一种具有高F值(22.5)的寡肽,其分子量在1500～30000U之间。

近年来，国外越来越多的学者开始研究食用菌中的活性肽的分离提取与纯化方法，1997年，何慧^[17]等人将发酵灵芝粉的水和醇提取物上离子交换树脂柱,依次用酸性、中性、碱性淋洗液洗脱分组,得酸溶性、水溶性和碱溶性的肽类化合物；其中碱溶性的肽对羟基自由基的抑制作用最强(高达81％)。2001年，孙慧^[18]等采用Cu—SephadexG—25柱层析法和超滤膜过滤法，将灵芝的水提取物中的小肽与游离氨基酸有效地分离。2008年，宋万杰^[21]首次采用超高压提取技术提取云芝菌丝体中活性肽，得率为3.23％，他还将云芝菌丝体以中性、酸性和碱性三种蛋白酶水解，获得三种酶解多肽，以中性蛋白酶的酶解率最高。2008年，孙红娜^[27]对茶树菇降血压活性肽进行了分离提取研究。2009年刘莹采用单因素和正交试验，以水提醇沉的方法来获取褐蘑菇子实体中的活性肽类物质。洒威^[24]等和焦迎春^[23]先后对姬松茸子实体和菌丝体中活性肽提取工艺进行初步研究,优化了活性肽提取条件。但目前食药真菌活性多肽、多肽等活性物质的提取制备多为单一成分提取，不同功能物质的综合提取鲜为报道。

免疫增强剂：免疫增强剂(immunopotentiator)是指单独使用或与抗原联用(俗称免疫佐剂)均能增强机体免疫应答的物质。免疫增强剂通过不同的作用方式，如增强巨噬细胞活性，增强抗原物质的免疫原性和稳定性，促进抗体的合成与分泌等，从而增强机体特异性、非特异性免疫。现已证明，具有免疫增强作用的物质不下几十种，按其作用的先决条件可分为三类:(1)免疫替代剂，用来代替某些具有免疫增强作用的生物因子的药物，如胸腺肽、转移因子、干扰素、白细胞介素—2(IL—2)、中药免疫增强剂、多糖等；(2)免疫恢复剂，能增强被抑制的免疫功能，但对正常免疫功能作用不大，如左旋咪唑；(3)免疫佐剂，是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型，如氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾等。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂是目前动物试验中最常用佐剂。佐剂的研究是疫苗研究过程中的重要组成部分。目前除了弗氏佐剂以外还没有任何一种佐剂能够对体液和细胞免疫系统同时发挥很有效的免疫激活作用。但弗氏佐剂能够引起注射部位组织的损伤和长时间的痛苦，因而只能用于对抗原的初期免疫应答研究及免疫血清或抗体的制备，不适合作为疫苗的组成成分使用。此外，在疫苗制备过程中选择哪一种佐剂还主要取决于所要获得的保护性免疫应答反应。有些佐剂以激发体液免疫应答反应为主，也有些佐剂则对细胞免疫应答反应具有很强的激活作用。

免疫增强剂之间的联合应用如同中药组方，具有广阔的发展前景。国家病毒学研究所侯云德教授等，在应用黄芪粗提液与干扰素a2b联合用药上，成功地研制出了复方干扰素合剂，显示黄芪与干扰素在体内体外均有协同作用，可以提高抗流行性感冒效果，降低发病率70％。多糖(葡聚糖)可以增强高等哺乳动物血浆内补体系统的溶菌功能，促进细胞毒性T细胞的分化、促进由B细胞分化的浆细胞产生专一性抗体功能、能促进白细胞介素—1、白细胞介素—2的分泌进而提高免疫能力。多肽可以提高动物的免疫功能，如胞壁二肽(G⁺菌细胞壁提取)诱导淋巴细胞增殖、提高巨噬细胞的吞噬力，提高T细胞活性；复方多肽核酸液对细胞免疫和体液免疫均有较强的增强作用。多糖多肽联合使用将可大大提高免疫效果，左旋咪唑具有对受损免疫功能的修复作用，三者联合制备佐剂对当前不少规模养殖畜禽免疫功能低下，疫苗免疫提呈能力低的现实，将可产生理想的效果，成为新型高效免疫增强剂(佐剂)。

免疫增强剂(佐剂)是提高和保障动物疫苗免疫效果的重要辅助剂，目前，佐剂市场产品有限，尤其是新产品少。

现有多糖、多肽大多从动植物及微生物中提取制备，生产方式多为单一开发，或是多糖，或是多肽，生产效率低，生产成本高；本发明以大型真菌菌丝体发酵，同时制备多糖与多肽产品，大大提高生产效率，降低生产成本。

现有市场多糖与多肽多为单一产品与口服剂，功能有限，生物利用率低；许多多糖和多肽在功能上有相类似互补性，特别是在免疫调节上，二者具有互补性；因此，本专利研究开发食药真菌菌丝多糖与多肽复合注射剂，用作免疫增强剂(佐剂)，为提高动物免疫力提供新的产品。

现有从天然物中制备的多糖、多肽，由于原料来源不同和工艺差别，大多成分不清或不稳定，从而影响功效；本发明以食药真菌菌丝发酵制备多糖与多肽，其菌种与生产工艺可控制，并测定其组成成分，保障功效的稳定性。

现有多糖多肽的提取与纯化工艺复杂，效率低，成本高，很难在生产中应用；本专利采用复合工艺提取，结合产品特点，采用新型纯化剂与锌工艺，大大简化纯化工艺，提高纯化效率，满足产品质量要求。

我国菌物资源丰富，很多食(药)用菌中含有多种生物活性物质，如多糖多肽具有多种抗病保健功能，可用于医疗保健，也可用于动物疾病的防治。但目前对食(药)用真菌活性成分与药理作用的关系及作用机理的研究还处于初级阶段，鉴于食(药)用真菌的食用价值和保健价值，有必要进行深入研究。随着研究的不断深入，食(药)用菌的应用更为广泛；以及当代先进技术的应用，其生物活性物质的提取工艺会越来越成熟；但目前单一成分的提取生产成本较高，且造成资源的浪费，因此食(药)用真菌成分的综合提取与开发利用将会展示出更为美好的前景。

关于多肽，目前报道较多的是从动植物中提取，或用植物蛋白或动物蛋白酶解制备，而食(药)用真菌活性肽的研究仅局限于灵芝肽、姬松茸肽、云芝肽、茶树菇肽等少量品种，且其多肽功能的多样性研究较少，尤其在免疫调节和抗病毒方面的研究欠缺。

关于多糖，目前的提取与分离纯化方法较为复杂，尤其是去除蛋白质麻烦，如Sevage法等有机溶剂法需要多次，且要用有机溶剂，不适应工业化生产；氯化钙等、氯化钠等法效率低，多糖损失大；大孔吸附树脂等柱层析法生产效率低，且生产成本高。本发明应用具有免疫增强功能的左旋咪唑作为去除蛋白质的沉淀剂，既可有效的沉淀蛋白，残留左旋咪唑又可增强免疫效果，无需除去，操作方便。其次是脱色，活性炭脱色多糖损失大，且后处理过滤难，本发明用过氧化氢脱色，方便、效率高、多糖损失率低。

目前食(药)用菌多糖与多肽的分离提取工艺中，彼此分割，互相排斥(提取多糖去除蛋白，提取多肽去除多糖)，影响提取率，且造成资源上的浪费；本发明在多糖提取的同时提取多肽，大大提高了资源的有限利用率。

在测定多肽氨基酸序列的方法中，常用的Edman降解法不能测定修饰的氨基酸和N端封闭的测序问题，本发明以HPLC—MC/MC对分离纯化多肽的氨基酸序列进行测定；测定多糖分子方法还不很成熟，尤其是分子量测定大多为平均分子质量测定，对多糖组分的测定困难，本发明以常规高效凝胶过滤色谱法(HPGPC)测定，加分段积分计算能较好地求得组分及其分子量。

多糖与多肽的功能大多具有相似性，尤其在免疫调节上，不但二者具有相似的作用，且有互补性(多糖对体液免疫的调节作用强，多肽对细胞免疫调节的作用强)；但目前大多数应用研究为单一种类的应用研究；研究多糖与多肽复合制剂，进行效果测定具有重要意义。

目前多肽多肽的免疫调节剂多为口服制剂，研究开发注射剂有利于提高生物利用率，方便给药，可与疫苗同用，解决动物免疫反应低下，免疫效果差的问题。

发明内容

本发明旨在开发提高免疫力的注射剂，提供一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法包括如下步骤：

(1)菌丝发酵物的制备：以液态深层发酵方法培养松乳菇、金针菇、香菇、猴头菇、松茸等食药真菌菌丝，25-30℃，100-180r/min培养2-4d，制备食药真菌菌丝发酵物，包括菌丝与发酵液。

(2)多糖多肽提取：菌丝发酵物→研磨或高压均浆破碎菌丝→加0.05-0.2％(w/v)的复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1.5：2-3)进行第一次酶解(PH5,50℃,2-3h),90℃灭活10-20min；用中性蛋白酶(木瓜蛋白酶等)第二次酶解(pH7.0，50℃，2-3h，用酶量32万U/100ml),→微波(120S～180S)或超声波(400W，50-60℃,40-60min)处理→过滤→4000-5000rpm离心10-20min,得多糖与多肽粗提取液；

(3)多糖多糖分离：粗提液减压浓缩，加乙醇至乙醇体积百分比浓度为70—75％，搅匀，静止沉淀过夜，使提取液中的多糖和多肽初步分离，得作为沉淀物的粗多糖和作为上清液的粗多肽；

(4)多糖多肽纯化：

1)粗多糖的纯化：将乙醇沉淀物水溶解，4号垂溶漏斗过滤后取滤液；加盐酸左旋咪唑使其体积百分比浓度为0.1—0.5％，煮沸15min，静置过夜，使蛋白与盐酸左旋咪唑结合沉淀，取上清液，280nm处测定无蛋白，离心；将上清液用碱调PH至7—8，按体积加入2—8％过氧化氢(w/v),于50—70℃脱色2—3h；加石油醚和氯仿分次萃取脱脂、脱色和残存左旋咪唑；超滤除菌和大分子物质；于60—80℃减压浓缩或纳滤膜过滤浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥，或超滤后直接喷雾干燥，制得无菌纯化真菌多糖。

2)粗多肽的纯化：取乙醇沉淀的上清液低温减压回收乙醇，再用体积百分比浓度为80％、85％、90％、95％的乙醇依次沉淀，至无沉淀(大分子蛋白、多糖等)后，于50—70℃减压回收乙醇；如有脂肪存在(香草醛比色法、尼罗红染色法检测)，再经乙醇、丙酮、乙醚分步脱脂；配制成水溶液，加0.5-1.5％活性炭脱色(搅拌2h，静置10min)，超滤除菌和大分子物质；滤液经纳滤膜过滤浓缩或50—70℃减压浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥；制得无菌纯化真菌多肽。

(5)复合免疫增强剂配伍制剂：

1)粉针制剂：将纯化无菌真菌多糖：多肽按质量比(2—5)：(1—5)配伍，无菌分装，制得药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强粉针剂。也可按质量百分比加1-5％盐酸左旋咪唑(注射用)制备左旋咪唑多糖多肽粉针。临用时用注射用水或生理盐水配制。

2)水针制剂：将纯化多糖：多肽按质量比(2—5)：(1—5)取样，配制成10-30％(w/v)水溶液，超滤膜过滤，在无菌条件下分装于经高压消毒的药瓶内，巴氏消毒老化一体机中进行巴氏消毒，制备多糖多肽注射液。或将多糖多肽溶液中再加入0.1-1.0％(W/V)盐酸左旋咪唑，并用盐酸(作稳定剂)下调PH值1-2(至PH4-6.5)，溶解混匀，过滤，分装，消毒，制备左旋咪唑多糖多肽注射液。

(6)应用：多糖多肽免疫增强剂可单独应用以改善提高动物免疫力，也可与疫苗混合或配合使用以增强免疫效果

下面对本发明做进一步说明:

本发明中，用综合提取、分离、纯化工艺，从天然生物中同时制备高纯度的多糖与多肽，大大提高资源的利用率与经济效益；去除蛋白是提取多糖纯化的关键也是难点，如常规的多糖纯化采用sevage法去蛋白，需要用大量的氯仿、正丁醇等有机试剂；造成造成环境污染，且效率低，成本高；项目首创用盐酸左旋咪唑脱蛋白(无需清除残存左旋咪唑，可留作免疫增强剂)，效率高，且工艺简单；去除糖是提取多肽分离纯化的关键与难点，常规采用硼酸络合法除糖，需要用大量的硼砂等，均可造成环境污染，本发明利用多糖与多肽功能的互补增效性，制备复合制剂，可省略除糖工艺。松乳菇多糖糖组分的测定，兰贵红2003年报道的松乳菇子实体多糖为葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖等单糖^[12]，但定丁祥侯等2012年报道是甘露糖与木糖以3:1组成，二者差异很大。关于菌丝体多糖组分研究尚未见报道，项目分析测定其菌丝多糖的组成单糖与多糖组分及分子量。松乳菇多肽，无论菌丝体还是子实体多肽的分子组成，均未见报道，本专利运用HPLC—MC/MC法首次测定松乳菇多肽的氨基酸序列与分子量大小。测定松乳菇菌丝胞内与胞外的五种主要多肽，含6—13个氨基酸组成，其分子量在691.36—1369.75之间，为寡肽。松乳菇菌丝多糖多肽的活性功能研究，尤其是多肽的研究系首次报道；多糖与多肽对免疫功能作用的研究多为正常动物免疫功能的改善提高，而对免疫损伤的保护与修复研究也很少。多糖、多肽用作免疫调节剂，常为口服散剂，本发明制备复合注射剂，同时添加左旋咪唑，增强免疫活性功能。多糖的应用一般作为活性物质应用，而本发明发现松乳菇多糖分子组成的特殊性(胞外多糖有阿拉伯糖组成的纯多糖，胞内多肽由阿拉伯糖与甘露糖组成的二元多糖)，提出作为功能性稀有单糖制备原料，解决阿拉伯糖制备难(常规用强酸或强碱水解木质素制备)，生产成本高(阿拉伯胶制备)的问题。

目前功能性单糖大多从动植物组织中经复杂工艺提取制备，生产成本高；本发明开发的松乳菇菌丝多糖基于其组成单糖较单一，可以进一步分解制备稀有功能性单糖，工艺简单，生产效率高，相对生产成本低。

附图说明

图1为混合标准单糖的PMP衍生物HPLC图；图中：1.PMP,2.阿拉伯糖(Arab),3.甘露糖(Man),4.鼠李唐(Rha),5.葡萄糖(Glc)，6.木糖(Xyl),7.半乳糖(Gal)；

图2为胞内菌丝多糖水解衍生物色谱图；

图3为胞外多糖水解衍生物色谱图；

图4为胞外多糖GPC曲线图；

图5为胞内多糖曲线图；

图6为胞外多肽Sephadex G—25柱层析图；

图7为胞外多肽(未凝胶柱脱糖)HPLC图；

图8为G—25层析胞外多肽P1的HPLC图；

图9为G—25层析胞外多肽P2的HPLC图；

图10为第一次C₁₈反相HPLC图；

图11为第二次C₁₈反相HPLC P1峰图；

图12为第二次C₁₈反相HPLC P2峰图；

图13为第二次C₁₈反相HPLC P3峰图。

具体实施方式

1.食药真菌菌丝多糖多肽制备方法：

(1)菌丝发酵物的制备：以液态深层发酵方法培养松乳菇、金针菇、香菇、猴头菇、松茸等食药真菌菌丝，制备食药真菌菌丝发酵物，包括菌丝与发酵液。发酵条件见表1.1：

表1.1 食药真菌菌丝液态发酵物制备

(2)菌丝发酵的处理：取液体发菌丝发酵物(菌丝与发酵液)经研磨和高压均浆处理，使菌丝体破碎，多糖多肽释放；加0.05-0.2％(w/v)的复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1.5：2-3)进行第一次酶解(PH5,50℃,2-3h),80-90℃灭活10-20min；用中性蛋白酶(木瓜蛋白酶等)第二次酶解(pH7.0，50℃，2-3h，用酶量32万U/100ml),使高分子糖和蛋白质降解成小分子多糖多肽(寡糖、寡肽)，90℃灭活10-20min；微波(120S～180S)或超声波(400W，50-60℃,40-60min)处理，使组织内多糖多肽充分释放；过滤，离心(4000-5000rpm，10-20min),得多糖与多肽粗提取液；

(3)多糖多肽分离(乙醇沉淀法)：根据多糖醇溶性低，小分子多肽醇溶性高的特点，用70—75％浓度的乙醇沉淀，使多糖和多肽初步分离，得粗多糖(沉淀物)和粗多肽(上清液)；

(4)多糖多肽纯化：

1)粗多糖的纯化：将乙醇沉淀物水溶解，3-4号垂溶漏斗过滤后取滤液；加盐酸左旋咪唑使其体积百分比浓度为0.1—0.5％，煮沸15min，静置过夜，使蛋白与盐酸左旋咪唑结合沉淀，取上清液，280nm处测定无蛋白，离心；将上清液用碱调PH至7—8，按体积加入2—8％过氧化氢(w/v),于50—70℃脱色2—3h；加石油醚和氯仿分次萃取脱脂、脱色和残存左旋咪唑；超滤除菌和大分子物质；于60—80℃减压浓缩或纳滤膜过滤浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥，或超滤后直接喷雾干燥，制得无菌纯化真菌多糖。

2)粗多肽的纯化：取乙醇沉淀的上清液低温减压回收乙醇，再用体积百分比浓度为80％、85％、90％、95％的乙醇依次沉淀，至无沉淀(大分子蛋白、多糖等)后，于50—70℃减压回收乙醇；如有脂肪存在(香草醛比色法、尼罗红染色法检测)，再经乙醇、丙酮、乙醚分步脱脂；配制成水溶液，加0.5-1.5％活性炭脱色(搅拌2h，静置10min)，超滤除菌和大分子物质；滤液经纳滤膜过滤浓缩或50—70℃减压浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥；制得无菌纯化真菌多肽。

(5)综合试验：试验对5种食药真菌发酵菌丝进行多糖多肽的提取与分离纯化试验，其结果(三次试验的平均值)见表1.2。

表1.2 食药真菌菌丝发酵物多肽与多肽分步提取与分步分离纯化的效果

注：复合膜为纤维素酶(F):果胶酶(G):蛋白酶(D)＝1:2:1.5；表中上行为多糖，下行为多肽。

2、多糖多肽制备主要影响因子的测定

(1)乙醇去除粗多肽液中大分子蛋白和多糖效果的测定：纯化多肽的关键是去除蛋白与多糖，多糖不影响项目产品效果，蛋白一般具有抗原性而影响免疫，因此本试验测定不同浓度乙醇沉淀去除蛋白的效果：取菌丝提取物经70％乙醇分离沉淀的上清液，浓缩后，再用75-90％乙醇沉淀，以纸层析法测定蛋白质的去除效果，见表2.1。

表2.1 乙醇分级沉淀去除粗多肽液中蛋白的试验结果

真菌多肽类别	75％乙醇第1次沉淀	85％乙醇第2次沉淀	90％乙醇第3次沉淀
				松乳菇多肽	含蛋白	含蛋白	无蛋白
香菇多肽	含蛋白	无蛋白
				猴头菇多肽	含蛋白	含蛋白	无蛋白

(2)左旋咪唑去除多糖液中蛋白质效果的测定

纯化多糖关键是去除蛋白，试验测定左旋咪唑沉淀多糖液中蛋白的效果：取松乳菇菌丝纯化多糖液，加入5％(w/v)的牛血清蛋白，溶解后，分装5管，分别添加0—1.0％(w/v)盐酸左旋咪唑，80℃水浴30分钟，冷藏沉淀1晚，280nm处测定上清液中蛋白含量。结果(表2.2)显示：0.1—1.0％的盐酸左旋咪唑完全沉淀5％浓度的牛血清蛋白。

表2.2 盐酸左旋咪唑沉淀蛋白其上清液中蛋白质测定结果

盐酸左旋咪唑％(w/v)	1.0	0.5	0.2	0.1	0.0(对照)
						样品(沉淀上清液)	无蛋白	无蛋白	无蛋白	无蛋白	5.00％

(3)不同酸对多肽液中添加盐酸左旋咪唑稳定性的影响

盐酸左旋咪唑可以沉淀蛋白质，为了消除对多肽的影响，测定添加不同酸对多肽液的稳定性。取香菇菌丝纯化多肽粉，分别用PH6的盐酸溶液、柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液和醋酸—醋酸钠缓冲液配制12％的多肽液，装试管中，80℃水浴1小时，4℃放置一周，观察沉淀产生情况。结果(表2.3)显示，盐酸可有效地阻止沉淀的产生。

表2.3 PH6的不同酸性溶液对多肽液中添加左旋咪唑的稳定性影响

溶解液	柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液	醋酸—醋酸钠缓冲液	盐酸溶液	蒸馏水
					沉淀	微量	微量	无	少量

3、免疫增强剂的制备：

3.1 粉针剂的制备：将纯化无菌真菌多糖、真菌多肽按质量比(2—5)：(1—5)配伍，无菌分装，制得药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强粉针剂。也可按质量百分比再加1-5％盐酸左旋咪唑(注射用)制备左旋咪唑多糖多肽粉针。临用时用注射用水或生理盐水配制。

3.2 水针注射液的制备

(1)多糖溶液配制：称取纯化多糖用注射用水配制成适当浓度(10—35％，W/V)，备用。

(2)多肽溶液配制：称取纯化多肽，用有用注射用水配制成适当浓度(10—35％，W/V)的溶液，用2Mol盐酸下调pH值1—2至pH4—6.5，加入0.5—2％的盐酸左旋咪唑(W/V)溶解，备用。

(3)复合免疫增强剂配制：将上述多糖溶液与多肽盐酸左旋咪唑溶液，按比混合均匀，测定多糖、多肽和盐酸左旋咪唑浓度，使浓度为2—5：1—3：0.1—1.0，备用。

(4)消毒与灭菌：复合多糖多肽盐酸左旋咪唑溶液经0.2nm超滤膜过滤除菌，在无菌添加下分装于经高压消毒的药瓶内，进行巴氏消毒，经多糖、多肽、左旋咪唑含量检测和无菌检测合格，即免疫增强剂。

试验制备5种食药真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂，各三批，其理化性状测定如表3.1：

表3.1 三批不同食药真菌免疫增强剂理化性状检测结果

4、多糖、多肽免疫学试验测定：

(1)试验动物及处理：试验用环磷酰胺(CP)和氢化可的松(HY)，按25mg/kg体重注射小鼠，每天2次，连续14天，使其免疫功能抑制；在此同时，试验鼠用松乳菇多肽注射剂或多糖多肽混合注射剂以大、中、小三个剂量注射小鼠，每天1次，连续14天；另外，用松乳菇菌丝多糖粉剂按高、中、低三个剂量拌料饲喂小鼠(试验设计见表4.1)。两个试验均设空白对照。

(2)试验方法与结果：试验结束时取样，按标准方法测定各项免疫器官及其功能，以评价多糖、多肽、多肽多糖复合物对小鼠免疫功能的影响；结果显示：松乳菇菌丝多糖、多肽均对小鼠因免疫抑制剂造成的免疫损害有很好的保护与修复功能，无论是对免疫器官，还是对细胞免疫和体液免疫均有很强的作用，大、中、小剂量都有显著的作用(P＜0.05)，尤其以中剂量为宜，多糖与多肽复合有加强作用。松乳菇菌丝多糖拌料口服对正常鼠的免疫有显著作用(P＜0.05)，其作用随剂量的增加而提高，以中剂量为宜。结果见表4.2。

表4.1 试验动物分组与处理

表4.2 松乳菇菌丝多糖多肽对小鼠免疫功能受损修复与提高的影响

5.松乳菇菌丝多糖分子测定

(1)多糖组成单糖的测定

1)胞外多糖样品制备：液体松乳菇菌丝体液体发酵物，过滤离心，分离菌丝与发酵液；发酵液倒入3倍体积的无水乙醇中，4℃静置过夜后，5000r/min，离心10min，取沉淀。将沉淀加入一定量的纯净水中溶解，用sevag法除蛋白，置50℃烘干，即得胞外多糖样品。

2)胞内多糖样品制备：菌丝体用纯水洗涤后匀浆，加入木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，50℃酶解3h，80℃灭活酶，超声波处理，4000r/min离心10min；收集上清液，加入乙醇沉淀，将沉淀用sevage法除蛋白，置于50℃烘干，即得菌丝多糖样品。

3)单糖测定(柱前衍生HPLC法)：多糖经三氟乙酸(TFA)水解，用衍生化试剂1—苯基—3—甲基—5—吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化后，进行高效液相色谱分析(流动相：改良乙腈—醋酸盐缓冲液pH＝6.0)。结果表明，松乳菇胞外多糖由阿拉伯糖均一单糖组成；松乳菇菌丝多糖由阿拉伯糖、甘露糖组成，其百分比为阿拉伯糖(Arab)88.5％、甘露糖(Man)11.5％。见图1—3和表5.1、5.2。

通过图1与图2对比分析可知，松乳菇菌丝胞内多糖由阿拉伯糖和甘露糖；图1与图3对比分析可知，松乳菇菌丝胞外多糖由阿拉伯糖组成。松乳菇胞内菌丝多糖与松乳菇胞外多糖定量分析结果见表5.1与表5.2。

表5.1 松乳菇胞内菌丝多糖单糖组分的出峰时间及含量

表5.2 松乳菇胞外多糖单糖组分的出峰时间及含量

(2)多糖组分与分子量测定

1)用GPC法测定多糖平均分子量：色谱条件为流动相：0.1N硝酸钠；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；称取样品多糖(胞内多糖和胞外多糖样品)用流动相配制成0.1mg/ml的溶液，进样量20ul，测得多糖样品的保留时间，利用标准曲线(系列葡聚糖标准品相对分子质量的对数对洗脱体积进行回归处理)求得多糖总的相对分子质量(见表5.3和图4—5)。

表5.3 松乳菇菌丝胞内与胞外多糖GPC测定结果

2)多糖组分及其含量分析：对胞外多糖和胞内多糖的保留时间进行分段积分，求得不同分子量多糖组分及含量比例，结果(见表5.4和表5.5)显示：胞外多糖重均分子量(Mw)在1700—3500的中小分子多糖组分占72.4％；Mw为13862—29902大分子多糖约占10.12％；为7191中分子多糖占10.79—228318以上的大分子月占5.99％，其余3327—32408的中分子多糖占16.71％。

表5.4 胞外多糖GPC曲线分段积分

	保留时间	Mn	Mw	Mp	Mz	面积	％面积
								1	20.417	27459	29902	20136	33397	52274	2.83
2	21.100	13324	13862	10052	14439	134461	7.29
								3	21.783	6896	7191	5017	7494	199042	10.79
4	22.467	3352	3501	2505	3658	274634	14.89
								5	22.807	1596	1683	1772	1769	1059994	57.48
6	23.367	759	895	1003	838	123614	6.70

注：Mn:数均分子量；Mw:重均分子量；Mp:锋位分子量；Mz:Z均分子量

表5.5 胞内多糖GPC曲线分段积分

	保留时间	Mn	Mw	Mp	Mz	面积	％面积
								1	18.833	171726	228318	100729	354275	105275	3.02
2	19.517	68278	71162	50281	74168	103594	2.97
								3	20.417	30178	32408	20136	34751	179922	5.15
4	20.717	13950	14542	14842	15142	152808	4.38
								5	21.100	7126	7427	10052	7742	123403	3.54
6	22.467	3169	3327	2505	3508	127064	3.64
								7	22.850	1551	1631	1696	1711	1692837	48.50
8	23.367	252	464	1003	670	1005381	28.81

注：Mn:数均分子量；Mw:重均分子量；Mp:锋位分子量；Mz:Z均分子量

6.松乳菇菌丝多肽分子测定

(1)多肽的提取与纯化：菌丝体发酵后，经过滤离心分离菌丝与发酵液，供制备胞外多肽和胞内多肽。

1)胞外多肽的制备与纯化：发酵液用75％乙醇沉淀，取上清液制备粗胞外多肽，经Sephadex G—25凝胶柱柱层析/C₁₈反相高效液相色谱纯化，获得2个峰(P1峰、P2峰)的纯化胞外多肽，见图6—9。

2)胞内多肽的制备与纯化：菌丝体经蒸馏水洗涤干净，均浆、超声、纤维素酶+果胶酶酶解、再超声、过滤、离心、乙醇沉淀，取上清液制备粗胞内多肽；C₁₈反相高效液相色谱2次纯化，获得3个峰(P1峰、P2峰和P3峰)的纯化胞内多肽，见图10—13。

(2)多肽测序：

运用HPLC—MC/MC对分离纯化的松乳菇胞内与胞外多肽样品的氨基酸序列进行测定，确定其一级结构及分子量大小；串联质谱获得肽的碎片离子质谱图，根据肽的碎片离子质谱图信息，通过蛋白质序列数据检索，得出蛋白质序列信息。测定结果显示：松乳菇菌丝的5种主要胞内与胞外多肽,最少的由6个氨基酸组成，最多的由13个氨基酸组成，其分子量在691.36—1369.75之间，根据多肽的定义^[14]，均为寡肽。

表6.1 松乳菇菌丝液体发酵多肽分子HPLC—MC/MC法测定结果

测定多肽编号	氨基酸序列	分子量
			菌丝胞内多肽1(N1)	GMVELK	691.36
菌丝胞内多肽2(N2)	WWDGEGSNGGK	1191.49
			菌丝胞内多肽3(N3)	DITVPAGETLNLK	1369.75
菌丝胞外多肽1(W1)	QPTPIQRK	949.53
			菌丝胞外多肽2(W2)	LPVLYVFGR	1062.62

7.临床应用免疫试验

猪免疫试验：20头90日龄的大长杂生长猪，随机分为2组，每组10头，第一组每只皮下注射松乳菇菌丝多糖多肽免疫增强剂10ml，同时注射猪瘟疫苗2ml，为实验组；第二组每只注射疫苗2ml，作为对照组。2组猪21天后，每组随机抽取8头前腔静脉采血，供试验测定。

(1)抗体检测：分离试验猪血清，ELISA法测定抗体，其操作方法以及结果判定参照试剂盒(IDEXX的ELISA试剂盒，批号分别为：99—43220 C945)说明书进行。结果(表7.1)显示，实验组抗体水平显著高于对照组(P 0.05)。

表7.1 试验猪猪瘟抗体水平的测定分析

备注：阳性率>40指被检血清阻断率>40％，保护率>60指被检血清阻断率>60％。

(2)细胞免疫测定(MTT法)：用猪淋巴细胞分离液(天津灏翔)离心分离出外周血单个核细胞(PBMC)，于完全RPM1640培养基(HyClone)中，37℃5％CO₂培养48分离外周血淋巴细胞(PBL)并计数后(约为1.13*10⁶个/ml)；将细胞加入96孔细胞板中，每孔100μL，于37℃5％CO₂培养48h后，MTT法处理，用酶标仪测定OD490nm值，计算增殖指数(ZI)： 结果显示试验组细胞免疫功能显著增强，T淋巴细胞增殖活性显著高于对照组(见表7.2)

表7.2 MTT法测定试验猪T淋巴细胞活性(增殖指数)

测定样本数	实验组	对照组	培养液组	ZI值※
					各6头份	0.0780±0.0042	0.0755±0.0031	0.0682±0.0014	1.3311±0.1931

注：※差异显著(P∠0.05)。

Claims (2)

1.一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)菌丝发酵物的制备：以液态深层发酵方法培养松乳菇、金针菇、香菇、猴头菇、松茸等食药真菌菌丝，25-30℃，100-180r/min培养2-4d，制备食药真菌菌丝发酵物，包括菌丝与发酵液。

(2)多糖多肽提取：菌丝发酵物→研磨或高压均浆破碎菌丝→加0.05-0.2％(w/v)的复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1.5：2-3)进行第一次酶解(PH5,50℃,2-3h),80-90℃灭活10-20min；用中性蛋白酶(木瓜蛋白酶等)第二次酶解(pH7.0，50℃，2-3h，用酶量32万U/100ml),→微波(120S～180S)或超声波(400W，50-60℃,40-60min)处理→过滤→4000-5000rpm离心10-20min,得多糖与多肽粗提取液；

(3)多糖多肽分离：粗提液减压浓缩，加乙醇至乙醇体积百分比浓度为70—75％，搅匀，静止沉淀过夜，使提取液中的多糖和多肽初步分离，得作为沉淀物的粗多糖和作为上清液的粗多肽；

(4)粗多糖多肽纯化：

1)粗多糖的纯化：将乙醇沉淀物水溶解，4号垂溶漏斗过滤后取滤液；加盐酸左旋咪唑使其体积百分比浓度为0.1—0.5％，煮沸15min，静置过夜，使蛋白与盐酸左旋咪唑结合沉淀，取上清液，280nm处测定无蛋白，离心；将上清液用碱调PH至7—8，按体积加入2—8％过氧化氢(w/v),于50—70℃脱色2—3h；加石油醚和氯仿分次萃取脱脂、脱色和残存左旋咪唑；超滤除菌和大分子物质；于60—80℃减压浓缩或纳滤膜过滤浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥，或超滤后直接喷雾干燥，制得无菌纯化真菌多糖。

2)粗多肽的纯化：取乙醇沉淀的上清液低温减压回收乙醇，再用体积百分比浓度为80％、85％、90％、95％的乙醇依次沉淀，至无沉淀(大分子蛋白、多糖等)后，于50—70℃减压回收乙醇；如有脂肪存在(香草醛比色法或尼罗红染色法检测)，再经乙醇、丙酮、乙醚分步脱脂；配制成水溶液，加0.5-1.5％活性炭脱色(搅拌2h，静置10min)，超滤除菌和大分子物质；滤液经纳滤膜过滤浓缩或50—70℃减压浓缩后进行冷冻干燥或真空干燥；制得无菌纯化真菌多肽。

(5)复合免疫增强剂配伍制剂：

1)粉针制剂：将所得的无菌纯化真菌多糖、真菌多肽按质量比(2—5)：(1—5)配伍，无菌分装，制得药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强粉针剂。也可按质量百分比加1-5％盐酸左旋咪唑(注射用)制备左旋咪唑多糖多肽粉针。临用时用注射用水或生理盐水配制。

2)水针制剂：将纯化多糖多肽按质量比(2—5)：(1—5)取样，配制成10-30％(w/v)水溶液，超滤膜过滤，在无菌条件下分装于经高压消毒的药瓶内，巴氏消毒老化一体机中进行巴氏消毒，制备多糖多肽注射液。或将多糖多肽溶液中再加入0.1-1.0％(W/V)盐酸左旋咪唑，并用盐酸(作稳定剂)下调PH值1-2(至PH4-6.5)，溶解混匀，过滤，分装，消毒，制备左旋咪唑多糖多肽注射液。

2.应用：多糖多肽免疫增强剂可单独应用以改善提高动物免疫力，也可与疫苗混合或配合使用以增强免疫效果。